OCENA TOKSYCZNOŚCI WYBRANYCH PYRETROIDÓW DLA

Proceedings of ECOpole
Vol. 1, No. 1/2
2007
Anna KRZEPIŁKO1 i Agata ŚWIĘCIŁO1
OCENA TOKSYCZNOŚCI WYBRANYCH PYRETROIDÓW
DLA KOMÓREK DROŻDŻY Saccharomyces cerevisiae
METODĄ BARWIENIA
ASSESSING THE TOXICITY OF SELECTED PYRETHROIDS FOR
Saccharomyces Cerevisiae YEAST CELLS BY USING
STAINING METHODS
Streszczenie: Testy mikrobiologiczne są powszechnie stosowane do oceny toksyczności pestycydów.
W prezentowanej pracy zastosowano wybrane metody barwienia komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae do
oceny toksyczności pyretroidów. Dodatek do hodowli pyretroidów powoduje wzrost liczby komórek
wybarwionych błękitem metylenowym i safranią, co sugeruje uszkodzenie błony komórkowej. Stwierdzono, że
liczba wybarwionych komórek wzrasta wraz z zastosowaną dawką pyretroidu. Pyretroidy wpływają na stan
metaboliczny komórek, co potwierdzono za pomocą barwienia Live-Dead. Wraz ze wzrostem stężenia pyretroidu
spada liczba komórek aktywnie metabolizujących, natomiast zwiększa się liczba komórek martwych
i osłabionych, o małej aktywności metabolicznej. Barwnik RedoxSensor Red stosowany do badania potencjału
oksydoredukcyjnego komórek jest także przydatny do określenia toksyczności badanych pestycydów. Po inkubacji
z pyretroidami intensywność fluorescencji słabnie, co sugeruje zaburzenie homeostazy redoks w komórkach
drożdży. Przeprowadzone barwienia komórek drożdży mogą być stosowane jako szybki, wstępny test pozwalający
określić toksyczność pyretroidów.
Słowa kluczowe: drożdże, pyretroidy, barwienie
Pyretroidy są powszechnie stosowane jako insektycydy w rolnictwie i ochronie
sanitarnej. Wpływają na system nerwowy, powodując paraliż i śmierć owadów [1].
W licznych publikacjach naukowych szeroko opisano aktywność biologiczną, mechanizm
działania i toksyczność pyretroidów w stosunku do różnych organizmów. Organizmy
wodne z powodu dużej wrażliwości na pyretroidy są często stosowane jako biomarkery,
wskazujące na obecność tych pestycydów w środowisku.
Drożdże Saccharomyces cerevisiae, które są eukariotycznym jednokomórkowym
oranizmem, znalazły zastosowanie w badaniach nad toksycznością wielu związków, także
pestycydów [2]. Ribeiro i współpr. stwierdzili, że spośród pośród badanych
mikroorganizmów: Kluyveromyces marxianus, Pichia anomala, Candida utilis,
Schizosaccharomyces pombe i Saccharomyces cerevisiae, to właśnie S. cerevisiae okazały
się najbardziej wrażliwe na pestycydy, a test na przeżywalność komórek drożdży
S. cerevisiae może znaleźć zastosowanie do ilościowego określania toksyczności badanych
fungicydów [3]. Celem prezentowanej pracy jest ocena toksyczności wybranych
pyretroidów dla komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae za pomocą barwienia
barwnikami stosowanymi w mikroskopii klasycznej, jak błękit metylenowy, safranina,
i barwnikami stosowanymi w mikroskopii fluorescencyjnej, jak Live-Dead i RedoxSensor
Red.
1
Wydział Nauk Rolniczych w Zamościu, Akademia Rolnicza w Lublinie, ul. Szczebrzeska 102, 22-400 Zamość,
tel. 084 677 27 24, e-mail: [email protected]
166
Anna Krzepiłko i Agata Święciło
Materiał i metody
W badaniach wykorzystano szczep dziki drożdży SP4 (wt), o genotypie α leu1arg 4
[4]. Drożdże hodowano w pożywce płynnej YPG zawierającej: 10 g·dm–3 ekstraktu
drożdżowego, 10 g·cm–3 peptonu, 20 g·cm–3 glukozy. Hodowle logarytmiczne inkubowano
dwie godziny z różnymi stężeniami pyretroidów: 10, 25 i 50 µg·cm–3 bifentryny,
deltametryny, cypermetryny i alfametryny.
Barwienie błękitem metylenowym i safraniną przeprowadzono zgodnie z metodyką
podaną w [5], barwienie Live-Dead wykonano zgodnie [6], a barwienie RedoxSensor Red
według [7]. Wybarwione komórki drożdży obserwowano w mikroskopie Olympus
z przystawką do fluorescencji.
Wyniki
Dodatek do hodowli pyretroidów powodował wzrost liczby komórek drożdży
wybarwionych błękitem metylenowym i safranią, a ich liczba wzrastała wraz
z zastosowaną dawką pyretroidu (tab. 1). Przy stosowaniu mniejszych dawek pyretroidu
(10 µg·cm–3) obserwowano zróżnicowany wpływ badanych związków na liczbę
wybarwionych komórek, hodowle inkubowane z deltametryną charakteryzowały się
największym procentowym udziałem wybarwionych komórek, a w preparacie
z alfa-cypermetryną było ich najmniej. Przy największym zastosowanym stężeniu
(50 µg·cm–3) stwierdzono w przypadku wszystkich pestycydów dużą, blisko 85÷100%,
liczbę wybarwionych komórek. Barwienie błękitem metylenowym i safraniną umożliwiło
ocenę integralności błony komórkowej drożdży. Wynik ten sugeruje, że uszkodzona przez
pyretroidy błona komórkowa pozwala na swobodną dyfuzję barwnika do wnętrza komórki.
Tabela 1
Ocena toksyczności wybranych pyretroidów dla komórek drożdży metodą barwienia.
Rodzaj
barwienia
Stężenie
pyretroidu
[µg·cm–3]
Kontrola
Cypermetryna
10
25
50
Alfametryna
10
25
50
Deltametryna
10
25
50
Bifentryna
10
25
50
Błękit
metylenowy
Safranina
RedoxSensor
Red
Live-Dead
2
2,5
[%] komórek
aktywnych
metabolicznie
98,7
4,8
10
85,9
6,4
10
91
16,2
3,0
0,0
77,4
91,3
9,8
6,4
5,7
90,2
słaba
słaba
bardzo słaba
0,3
9,6
93,4
0
4,5
87,7
7,2
1,2
0,0
91,6
86,5
3,6
1,2
12,3
96,4
wyraźna
słaba
bardzo słaba
42,2
90,8
100
35,1
85,8
100
10,2
0,0
0,0
37,7
4,4
1,7
52,1
95,6
98,3
słaba
słaba
bardzo słaba
14,8
87,4
97,8
10,2
92,1
98,6
10,1
0,0
0,0
69,7
9,6
0,9
20,2
90,4
99,1
słaba
słaba
bardzo słaba
[%] komórek
wybarwionych
[%]
komórek
osłabionych
1,1
[%]
komórek
martwych
0,2
intensywność
fluorescencji
intensywna
Ocena toksyczności wybranych pyretroidów dla komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae…
167
Pyretroidy wpływają na stan metaboliczny komórek, co potwierdzono za pomocą
barwienia Live-Dead, które pozwala odróżnić komórki żywe, osłabione i martwe. Wraz ze
wzrostem stężenia pyretroidu spada liczba komórek aktywnie metabolizujących, które
zmieniają barwnik Fun-1 w cylindryczne struktury wewnątrz wakuoli, fluoryzujące na
czerwono. W preparatach inkubowanych z większymi dawkami pyretroidów zwiększa się
liczba komórek osłabionych, o małej aktywności metabolicznej. Cytoplazma tych komórek
fluoryzuje na zielono. Pojawiają się także liczne komórki martwe, które całe świecą
zielonożółtym jaskrawym światłem. Barwnik RedoxSensor Red jest stosowany do badania
potencjału oksydoredukcyjnego komórek. Barwnik ten tworzy fluoryzujący na czerwono
produkt, a intensywność jego fluorescencji zależy od potencjału oksydoredukcyjnego
cytosolu komórki [8]. Znalazł on zastosowanie do badania stresu oksydacyjnego
wywoływanego przez azbest [9]. Jest także przydatny do określenia toksyczności badanych
pestycydów, gdyż po inkubacji z pyretroidami intensywność fluorescencji słabnie, co
sugeruje zaburzenie homeostazy oksydacyjno-redukcyjnej w komórkach drożdży.
Przeprowadzone barwienia komórek drożdży mogą być stosowane jako szybki, wstępny
test, pozwalający określić toksyczność pyretroidów.
Wnioski
1.
2.
3.
Po inkubacji z pyretroidami zwiększa się liczba komórek drożdży wybarwionych
błękitem metylenowym i safraniną, co sugeruje, że błona komórkowa drożdży uległa
uszkodzeniu.
Pyretroidy wpływają na stan metaboliczny komórek drożdży. Za pomocą barwienia
Live-Dead potwierdzono, że zwiększa się liczba komórek osłabionych i martwych po
inkubacji z tymi pestycydami.
Po inkubacji z pyretroidami drożdże wybarwione RedoxSensor Red słabo fluoryzują,
co sugeruje zaburzenie homeostazy oksydacyjno-redukcyjnej w komórkach.
Podziękowanie
Praca finansowana ze środków budżetowych na naukę w latach 2005-2008 jako projekt
badawczy nr 2 P06T 09128.
Literatura
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
Bradberry S.M., Cage S.A., Proudfoot A.T. i Vale J.A.: Poisoning due to pyrethroids. Toxicol Rev., 2005,
24(2), 93-106.
Krzepiłko A.: Effect of deltamethrin on the antioxidant system of Saccharomyces cerevisiae yeast. Ecol.
Chem. Eng., 2007, 14(2),191-196.
Ribeiro I.C., Veríssimo I., Moniz L., Cardoso H., Sousa M.J., Soares A.M. i Leão C.: Yeasts as a model for
assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofluanid. Chemosphere, 2000,
41(10), 1637-1642.
Biliński T., Krawiec Z., Liczmański A. i Litwińska J.: Is hydroxyl radical generated by the Fenton reaction
in vivo? Biochem. Biophys. Res. Commun, 1985, 130(2), 533-539.
Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. PWN, Warszawa 1981, 173-175.
Millard P.J., Roth B.L., Thi H.P., Yue S.T. i Haugland R.P.: Development of the FUN-1 family of fluorescent
probes for vacuole labeling and viability testing of yeasts. Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63(7),
2897-2905.
Haugland R.P.: Handbook of fluorescent probes and research products, Ninth edition by R.P. Haugland.
Molecular Probes Inc., 1996, 599-671.
168
[8]
[9]
Anna Krzepiłko i Agata Święciło
Oksvold M.P., Skarpen E., Widerberg J. i Huitfeldt H.S.: Fluorescent histochemical techniques for analysis
of intracellular signaling. J. Histochem. Cytochem., 2002, 50(3), 289-303.
Shukla A., Jung M., Stern M., Fukagawa N.K., Tatjes D.J., Sawyer D., Van Houten B. i Mossman B.T.:
Asbestos induces mitochondrial DNA damage and dysfunction linked to the development of apoptosis. Amer.
J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 2003, 285(5), 1018-1025.
ASSESSING THE TOXICITY OF SELECTED PYRETHROIDS FOR
Saccharomyces cerevisiae YEAST CELLS USING STAINING
Summary: Microbiological assays are commonly used to assess the toxicity of pesticides. In this study selected
methods for staining Saccharomyces cerevisiae yeast cells were used to assess the toxicity of pyrethroids. Adding
pyrethroids to a culture causes an increase in the number of cells stained with methylene blue or safranin, which
suggests damage to the cell membrane. The number of stained cells was found to increase with the amount of
pyrethroid applied. Pyrethroids affect the metabolic state of cells, which was confirmed using Live-Dead staining.
As pyrethroid concentration is increased, there is a decrease in the number of metabolically active cells and an
increase in the number of dead ones and weakened ones with low metabolic activity. RedoxSensor Red stain, used
for testing the redox potential of cells, is also useful for determining the toxicity of these pyrethroids. After
incubation with pyrethroids fluorescence intensity decreases, which suggests a disturbance of redox homeostasis in
the yeast cells. These methods of staining yeast cells can be used as quick preliminary tests for determining the
toxicity of pyrethroids.
Keywords: yeast, pyrethroids, staining