Ćwiczenie XI

Ćwiczenie 6
Technika PCR
Celem ćwiczenia jest zastosowanie techniki PCR do amplifikacji fragmentu DNA z bakterii
R. leguminosarum bv. trifolii TA1 (RtTA1). Studenci przygotowują reakcję PCR
wykorzystując materiał genomowego DNA RtTA1 wyizolowany na drugich zajęciach.
Wydajność i skuteczność amplifikacji sprawdza się elektroforetyczne (elektroforeza w 1%
żelu agarozowym). Powielone fragmenty DNA zostaną poddane rekombinacji do wektora
plazmidowego na kolejnych zajęciach. W celu ułatwienia rekombinacji startery do reakcji
PCR wyposażono w sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne.
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej – objętość końcowa 50l
składnik (stęż. wyjściowe)
woda
DNA
10X stęż. bufor reakcyjny
25 mM MgCl2
2 mM dNTP
5 M starter Fw
5 M starter Fw
Polimeraza Taq (1U/l)
stęż. końcowe
500 ng
1X
2,5 mM
100-200 M
0,2-0,4 m
0,2-0,4 m
1-2 U
objętość (l)
xxx
xxx
5
5
3
2
2
1
uwagi!!!
najpierw woda
polimeraza Taq jako
ostatni składniki
mieszaniny
50 l
końcowa objętość
Profil termiczny reakcji
wstępna denaturacja
denaturacja
anealing starterów
elongacja
temperatura (˚C)
96
94
57
72
czas (s)
300
10
10
60
30 cykli
W międzyczasie przygotować 1,5% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z
ustawionym grzebieniem. Po zastygnięciu grzebień usunąć, a żel umieścić w aparacie do
elektroforezy i zalać 1x stężonym buforem TBE.
Po zakończeniu reakcji amplifikacji mieszaniny reakcyjne krótko zwirować, pobrać do nowej
próbówki Epp 10 µl mieszaniny do każdej dodać 2 µl buforu próbkowego i całość nanieść do
studzienek w żelu.
UWAGA!!! do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA (marker typu
drabinka). Prowadzić rozdział elektroforetyczny do momentu osiągnięcia przez barwnik 3/4
długości żelu. Po tym czasie żel wybarwić w roztworze bromku etydyny, obejrzeć w świetle
UV i poddać obraz analizie w celu ustalenia wydajności i specyficzności amplifikacji
fragmentu DNA.
Ćwiczenie 7
Izolacja DNA z żeli agarozowych
Wstęp
Zestaw opiera sie na zdolności wiązania siΠ DNA do złóż krzemionkowych w wysokich
stężeniach soli chaotropowych. Blok agarozy rozpuszczany jest w roztworze R7S,
zawierającym sól chaotropową. Następnie, po dodaniu izopropanolu, mieszanina nanoszona
jest na minikolumn ze specjalnym złożem krzemionkowym. DNA przechodząc przez złoże
osiada na nim, podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą nie wiążąc się. Po wypłukaniu z
kolumny resztek zanieczyszczeń, oczyszczone DNA wymywane jest z niej niskojonowymi
buforami lub wodą i nadaje się do bezpośredniego wykorzystania bez konieczności
precytpitacji.
Uwagi
1. Elektroforezę można przeprowadzić zarówno w buforze TAE, jak i TBE.
2. Zestaw umożliwia izolację fragmentów DNA w zakresie od 100 do 6000 par zasad.
3. Pojemność minikolumny do oczyszczania DNA wynosi 10 μg.
Protokół izolacji DNA
1. Wyciąć kawałek agarozy wraz z zawartym w nim DNA.
Uwaga: Całkowita masa wyciętego bloku nie powinna przekraczać 200 mg.
2. Przenieść do probówki eppendorfa i dodać 0.4 ml roztworu R7S.
3. Inkubować próbkę w 50 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy. Mieszać od czasu
do czasu przez odwracanie probówki.
4. Dodać 0.2 ml izopropanolu i wymieszać przez odwracanie probówki.
5. Krótko odwirować próbkę celem usunięcia resztek roztworu z wieczka i ścianek probówki.
6. Całość nanieść na minikolumnę do oczyszczania DNA i wirować 30 s przy 10 000 - 15 000
obr./min.
7. Wyciągnąć kolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do probówki.
Dodać do kolumny 0.6 ml roztworu płuczącego A1.
8. Wirować 30 s przy 10 000 - 15 000 obr./min.
9. Wyciągnąć kolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do probówki.
Dodać do kolumny 0.3 ml roztworu płuczącego A1.
10. Wirować 2 min. przy 10 000 - 15 000 obr./min.
11. Osuszoną kolumnę umieścić w nowej probówce eppendorfa i do złoża znajdującego się na
dnie kolumny dodać 30 - 50 μl buforu TE (10mM TrisHCl, 1mM EDTA pH 8.0) lub jałowej
wody destylowanej.
Uwaga: W momencie dodawania roztworu elucyjnego (TE lub woda) należy zwrócić uwagę
aby płyn całkowicie pokrył złoże. Powinno się go dodawać na środek kolumny, który dla
lepszej widoczności ograniczony jest niebieskim pierścieniem. Jeżeli część płynu elucyjnego
pozostanie na ściankach minikolumny, to elucja nie będzie wydajna. Elucja w 30 μl jest mniej
wydajna ale uzyskane DNA ma wyższe stężenie. Elucja w 50 μl jest bardziej wydajna
natomiast uzyskany preparat ma niższe stężenie.
12. Pozostawić na 3 min. w temperaturze pokojowej.
13. Wirować 1 min. przy 10 000 - 15 000 obr./min.
14. Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać w
lodówce do czasu dalszych analiz.
Sprawdzanie wydajności izolacji fragmentu DNA z żelu przez elektroforezę
Przygotowanie żelu agarozowego
 przygotować żelu agarozowy (o stężeniu odpowiednim dla wielkości uprzednio
wyizolowanego z żelu fragmentu DNA) w buforze elektroforetycznym 1X stęż. TBE.
Rozpuścić agarozę we wrzącej łaźni wodnej i gotować jeszcze przez co najmniej 10 min.
 ostudzić żel do temp. ok. 60ºC i wylać żel do rynienki tak aby ustawiony nad nią grzebień
został zanurzony w żelu i spowodował powstanie studzienek
 po zastygnięciu żelu (minimum 30 min) wyjąć grzebień i napełnić aparat buforem 1X
stęż. TBE do wysokości 5 mm nad powierzchnię żelu
Przygotowanie próbek DNA
Do sprawdzenia ilości wyizolowanego z żelu fragmentu DNA użyć 1/10 końcowej objętości,
która używana była do elucji DNA z kolumny: np. jeśli elucja była w 30 µl należy
sprawdzić 3 µl roztworu DNA.
Dla zwiększenia objętości i ograniczenia strat przy nakładaniu do próbki dodajemy kilka l
buforu TC lub wody. Do tak przygotowanej próbki dodajemy 6x stężonego buforu
obciążającego (do końcowego stężenia 1X).
Ćwiczenia 9
Klonowanie genów w wektorach plazmidowych
Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA powielonego techniką PCR na
poprzednich zajęciach do wektora plazmidowego. Etapy postępowania:
 Przygotowanie DNA wektora (pUC19 trawiony równocześnie dwoma enzymami
restrykcyjnymi)
 Przygotowanie fragmentu DNA amplifikowanego techniką PCR (trawienie równocześnie
dwoma enzymami restrykcyjnymi)
 przygotowanie reakcji ligacji DNA
 transformacja komórek kompetentnych E. coli DH5α)
 analiza zrekombinowanych klonów (izolacja plazmidowego DNA, analiza restrykcyjna i
elektroforeza w 1% żelu agarozowym lub PCR kolonijny).
1) Przygotowanie plazmidu pUC19 do klonowania – trawienie wektora dwoma
enzymami restrykcyjnymi
Poddajemy trawieniu ok. 500 ng pUC19 równocześnie dwoma enzymami restrykcyjnymi w
celu linearyzacji wektora oraz utworzenia „lepkich końców”.
Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną:
DNA pUC19
Ok. 500 ng
X l
Bufor Enzymu I
1 X stężony
1 l
Bufor Enzymu II
1 X stężony
1 l
Enzym I
10 U
1l
Enzym II
10 U
1l
H2O dejonizowana, jałowa
do końcowej objętości 20µl
Przeprowadzamy trawienie w temp. 37˚C przez min. 1 godz.
Efektywność trawienia sprawdzamy przez elektroforezę 5µl mieszaniny reakcyjnej w 1% żelu
agarozowym
2) Przygotowanie fragmentu DNA amplifikowanego techniką PCR i wyizolowanego z żelu
(trawienie dwoma enzymami restrykcyjnymi)
Poddajemy trawieniu dwoma enzymami restrykcyjnymi ok. 500 ng fragmentu DNA
amplifikowanego PCR, oczyszczonego po amplifikacji, w celu uwolnienia „lepkich
końców”.
Przygotowujemy mieszaninę reakcyjną:
fragment PCR-DNA
Ok. 500 ng
X l
Bufor Enzymu I
1 X stężony
1 l
Bufor Enzymu II
1 X stężony
1 l
Enzym I
10 U
1l
Enzym II
10 U
1l
H2O dejonizowana, jałowa
do końcowej objętości 20µl
Przeprowadzamy trawienie w temp. 37˚C przez min. 1 godz.
Efektywność cięcia sprawdzamy przez elektroforezę 5µl mieszaniny reakcyjnej w 1% żelu
agarozowym.
3) Łączenie cząsteczek DNA wektora z wyizolowanym z żelu DNA fragmentu PCR reakcja ligacji
Przy klonowaniu fragmentów DNA obowiązuje zasada molowego nadmiaru ilości
klonowanego fragmentu w stosunku do wektora. Mieszanina reakcyjna powinna mieć jak
najmniejszą objętość, co poprawia skuteczność ligacji.
Do reakcji ligacji używamy:
pUC19/strawiony dwoma enzymami
restrykcyjnymi:–125 ng DNA
4 µl mieszaniny reakcyjnej
fragment PCR/strawionego dwoma enzymami
restrykcyjnymi: - ok. 250 ng DNA
12 µl mieszaniny reakcyjnej
bufor ligazy (końcowe stężenie 1X)
2 µl
ligaza faga T4 (1U/l)
2 µl
UWAGA!!! Mieszaninę reakcyjną przygotowujemy w próbówkach Epp. 0,5 ml
Tak przygotowana mieszanina jest właściwą reakcją ligacji.
Oprócz niej przygotowuje się zwykle reakcję kontrolną, w której zamiast klonowanego
fragmentu dodaje się dejonizowaną sterylną H2O.
Reakcję ligacji przeprowadza się w temp. 12˚C przez ok. 16 godz.
Ćwiczenie 10
Wprowadzanie cząsteczek DNA do komórek bakteryjnych – transformacja.
Celem ćwiczenia jest wprowadzenie zrekombinowanego DNA uzyskanego na poprzednich
zajęciach do bakterii E. coli i wyselekcjonowanie na płytkach ze stałym podłożem
transformantów, które pobrały zrekombinowane cząsteczki plazmidu.
Transformacja jest procesem, w którym informacja genetyczna w postaci DNA jest
przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub pośrednictwa faga. DNA wyizolowany z
komórek dawcy jest aktywnie pobierany przez komórki biorcy.
Proces transformacji został opisany u wielu rodzajów bakterii: najwyższą częstość
uzyskuje się w obrębie tego samego gatunku (tak jest np. w przypadku bakterii z rodzaju
Haemophilus), znacznie niższą – między gatunkami. Wysoką aktywność transformującą
wykazuje dsDNA w formie liniowej. Wydajność transformacji zależy między innymi od
stężenia DNA i od kompetencji komórek biorcy. Zwiększenie stężenia DNA powyżej dawki
nasycającej nie powoduje wzrostu liczby transformantów. U wielu bakterii (Haemophilus,
Streptococcus, Bacillus) pobieranie DNA z otoczenia jest rezultatem ich naturalnego stanu
kompetencji.
Natomiast w przypadku szczepów Escherichia coli stan kompetencji bakterii uzyskuje
się na drodze indukcji chemicznej (traktowanie komórek bakteryjnych jonami wapnia).
Metoda wykorzystująca 0,1 M roztwór chlorku wapnia jest powszechnie stosowanym
sposobem otrzymania tzw. komórek kompetentnych. W tym stanie bakterii E. coli są
zdolne do pobierania z otoczenia cząsteczek kolistego DNA np. plazmidu.
Przygotowanie komórek kompetentnych:
1. Szczep Escherichia coli DH5α lub XL1-Blue odmłodzić przez dodanie 0,4 ml nocnej
hodowli bakterii do 40 ml jałowej pożywki LB.
2. Bakterie hodować w temperaturze 37˚C do uzyskania OD600 = 0,4.
3. Następnie hodowlę schłodzić przez umieszczenie kolby w łaźni lodowej na 5 min. Bakterie
osadzić przez wirowanie w jałowej próbówce (4000 obr./min., temp. 4ºC, 10 min).
4. Osad bakteryjny zawiesić w 10 ml zimnego, jałowego roztworu 0,05 M CaCl2. Całość
inkubować w łaźni lodowej przez 30 minut.
5. Bakterie osadzić przez ponowne wirowanie (4000 obr./min., temp. 4ºC, 10 min. ).
6. Osad bakteryjny zawiesić w 1 ml zimnego, jałowego roztworu CaCl2 (0,05M).
7. Bakterie są gotowe do użycia.
W celu zwiększenia wydajności transformacji inkubację w lodzie można przedłużyć do 12
godzin.
Transformacja komórek bakteryjnych zrekombinowanym DNA
1. Do jałowej próbówki z 0,1 ml zawiesiny komórek kompetentnych dodać pipetą
automatyczną całość mieszaniny ligacyjnej przygotowanej na poprzednich zajęciach.
Równolegle wykonać próby kontrolne:
 0,1 ml komórek kompetentnych – kontrola komórek – kontrola mutacji
spontanicznych
 0,1 ml komórek kompetentnych + kontrola ligacji (całość kontrolnej mieszaniny
ligacyjnej tj. wektor trawiony enzymami, poddawany ligacji bez wstawki)
 0,1 ml komórek kompetentnych + 2 µl plazmidu pUC19 nietrawionego – kontrola
kompetencji
 0,1 ml komórek kompetentnych + 5µl mieszaniny pUC19/Bam/Hind – kontrola
wydajności trawienia wektora
2. Po delikatnym wymieszaniu próbówkę inkubować w łaźni lodowej przez 30 – 40 minut.
3. Po tym czasie przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 42ºC i inkubować przez 2 minuty.
4. Dodać do próbówek 1 ml ogrzanej do 37ºC płynnej pożywki LB (bez antybiotyku). W celu
uzyskania ekspresji genów wprowadzonych do komórki, bakterie inkubować przez 45-60
minut wytrząsarce w temperaturze 37ºC.
5. Po tym czasie przenieść na płytki z podłożem LB zawierającym antybiotyk (podłoże
selekcyjne). W tym celu hodowle krótko odwirować (1 min, 13 tys RPM), usunąć supernatant
a osad zawiesić w 50 -100 l płynnej pożywki LB. Właściwą ligację wysiać na podłoże z
antybiotykiem z dodatkiem X-gal i IPTG. Pozostałe kontrole wysiać na podłoża uzupełnione
tylko antybiotykiem. Bakterie dokładnie rozprowadzić głaszczką na powierzchni podłoża
agarowego. Płytki inkubować przez 12-24 godzin w temperaturze 37ºC.
6. Po inkubacji w temperaturze 37ºC, policzyć kolonie, które wyrosły na wszystkich płytkach.
Obliczyć wydajność transformacji.
Analiza zrekombinowanych klonów.
1. Izolacja DNA plazmidowego i analiza restrykcyjna z użyciem enzymów flankujących
polilinker wektora pUC19.
2. PCR z kolonii z zastosowaniem starterów komplementarnych do fragmentu DNA lub
starterów uniwersalnych wektora (na kolejnych zajęciach).
Ćwiczenie 11
Analiza wyników klonowania - PCR kolonijny - część praktyczna
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych - część teoretyczna
Celem ćwiczenia jest potwierdzenie obecności w transformantach E. coli uzyskanych na
poprzednich zajęciach, zrekombinowanego plazmidu zawierającego sklonowany fragment
DNA bakterii RtTA1. Jednym ze sposobów szybkiego przeszukiwania zrekombinowanych
klonów jest tzw. PCR kolonijny, w którym jako źródło materiału genetycznego do
amplifikacji wykorzystujemy niewielką ilość bakterii pobranych bezpośrednio z płytki
selekcyjnej za pomocą sterylnej ezy lub końcówki pipety. Taki materiał biologiczny
poddajemy działaniu wysokiej temp. bezpośrednio w mieszaninie reakcyjnej zawierającej
wszystkie składniki niezbędne do powielania fragmentu DNA zrekombinowanego w
wektorze plazmidowym. W trakcie inkubacji w temp. 96ºC bakterie ulegają lizie uwalniając
materiał genetyczny, który stanowi matrycę do amplifikacji DNA w reakcji PCR.
Wykonanie:
Przygotować mieszaninę reakcyjną wg schematu podanego w tabeli.
(Należy pamiętać, że przygotowanie mieszaniny reakcyjnej rozpoczynamy od dodania H2O, a
enzym jest ostatnim składnikiem)
25 mM MgCl2
10 x stęż. bufor dla polimerazy Taq
2 mM dNTP
5 µM starter Fw
5 µM starter Rw
Polimeraza Taq
H2O
10 µl
10 µl
5 µl
4 µl
4 µl
4 µl
63 µl
Mieszaninę rozpiptetować po 20 l do małych (0,2 ml) próbówek Eppendorfa i dodać
sterylnie przy pomocy ezy niewielką ilość bakterii pobranych bezpośrednio z płytki.
Przeprowadzić reakcję PCR wg pokazanego poniżej profilu termicznego reakcji
Profil termiczny reakcji
temperatura (˚C)
czas (s)
wstępna denaturacja
96
240
denaturacja
94
15
25 cykli
przyłączanie starterów
57
15
elongacja
72
30-60*
* w zależności od długości fragmentu DNA sklonowanego w wektorze plazmidowym
Skuteczność amplifikacji sprawdzamy przez elektroforezę 15 µl mieszaniny reakcyjnej
w 1,5% żelu agarozowym w obecności markera typu drabinki.