Rola badań proteomicznych w diagnostyce klinicznej
Transkrypt
Rola badań proteomicznych w diagnostyce klinicznej
diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostic 2010 • Volume 46 • Number 4 • 411-414 Praca poglądowa • Review Article Rola badań proteomicznych w diagnostyce klinicznej The role of proteomic research in clinical diagnosis Anna Krzywonos Katedra i Zakład Analityki Medycznej, Akademia Medyczna we Wrocławiu Streszczenie: Proteomika, jest działem nauki analizującym proteom. Badania proteomiczne oparte są na metodach rozdziału białek, spektrometrii masowej oraz technikach bioinformatycznych, umożliwiających szybką analizę wielu białek jednocześnie, stanowiąc alternatywę dla dotychczasowej diagnostyki opartej na analizie pojedynczych markerów. Dzięki zastosowaniu technik proteomicznych opisano profil białkowy moczu - ureoproteom, jednocześnie trwają prace nad opisaniem i skatalogowaniem wszystkich białek ludzkiego organizmu. Summary: Proteomics is the science department analyzing proteome. Proteomic studies are based on the methods of protein separation, mass spectrometry and bioinformatics techniques, which allow rapid analysis of many proteins simultaneously, and there are an alternative to the current diagnosis which is based on an analysis of individual markers. By applying the proteomic techniques described profile of urinary proteins – ureoproteom, while working on describing and cataloguing all proteins in the human body. Słowa kluczowe: proteomika, proteom, spektrometria masowa Key words: proteomics, proteome, mass spectrometry Proteomika jako nauka (HUPO). W ramach The Human Kidney and Urine Proteome Po opublikowaniu w 2001 roku kompletnej sekwencji ge- Project utworzono bazę danych opisującą ureoproteom nomu człowieka [31] kolejnym wyzwaniem dla badaczy stało (tj. profil białkowy moczu). Jednocześnie trwają prace nad się stworzenie listy białek występujących w organizmie ludz- skatalogowaniem i opisaniem wszystkich białek ludzkiego kim określanej mianem proteomu. Termin ten wywodzi się organizmu oraz stworzeniem biblioteki ludzkich przeciwciał z angielskiego zwrotu PROTEins expressed by the genOME (Projekt Proteomu Ludzkiego). po raz pierwszy został wprowadzony w 1994 roku na konferencji w Sienie przez Marca Wilkinsa. Proteom to zbiór Działy proteomiki wszystkich białek kodowanych przez genom i produkowa- Wyróżniamy proteomikę ekspresyjną, proteomikę struktu- nych przez pojedynczą komórkę, tkankę czy też organ. Pro- ralną oraz proteomikę funkcjonalną. teomika zajmuje się analizą proteomu. Dziedzina pierwotnie Proteomika ekspresyjna poprzez charakterystykę ekspresji wywodząca się z genomiki, choć znacznie szersza i bardziej białek, umożliwia dokładniejsze zrozumienie i wieloetapową złożona. Proteomika zajmuje się gromadzeniem informacji identyfikację mechanizmów fizjologicznych i patologicznych dotyczących identyfikacji struktur białkowych, rozpoznawa- zachodzących w komórkach. Skupiając się na różnicach niem sekwencji białek a także, badaniem ich funkcji. Dotych- między białkami pochodzącymi z tkanek osób zdrowych czas stosowane techniki biochemiczne zajmowały się i chorych, pozwala na poszukiwanie i weryfikowanie marke- analizą pojedynczych białek. Systemy proteomiczne, umożli- rów chorobowych. wiają szybką analizę wielu białek jednocześnie. Dzięki Proteomika strukturalna zajmuje się na poznawaniem struk- nowoczesnym, gwałtownie rozwijającym się technikom pro- tury przestrzennej białek. Pozwala na zlokalizowanie miejsca teomicznym, coraz bardziej prawdopodobne wydaje się łączenia się leku z białkiem. wygenerowanie ludzkiego profilu białkowego [10]. Proteomika funkcjonalna ocenia stan aktywacji i wzajemne Organizacją koordynującą badania proteomiczne jest interakcje pomiędzy białkami. Zajmuje się również opracowy- powołana w 2001 roku Organizacja Proteomu Ludzkiego waniem technik wytwarzania i wprowadzania do organizmu 411 Rola badań proteomicznych w diagnostyce klinicznej nowych białek, w celu uzupełnienia ich niedoborów lub W badaniach ureoproteomu, najczęściej stosowanymi meto- braków. Proteomika funkcjonalna wykorzystuje głównie dami jonizacji cząsteczek są: elektrorozpylanie (ESI) oraz technologię MALDI-TOF/SELDI-TOF [2, 3]. MALDI (ang. Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation). Wykorzystuje się także cztery rodzaje analizatorów: analiza- Techniki wykorzystywane do analizy składu tor czasu przelotu (TOF), pułapkę jonową (IT), kwadrupol białek moczu (Quadrupole) oraz analizator cyklotronowego rezonansu jo- Analiza ureoproteomu stała się jedną z atrakcyjniejszych nów z fourierowską transformacją wyników (FT-ICR) [14, 29]. subdyscyplin proteomiki klinicznej. Ze względu na dostęp- Z uwagi na odwrotną zależność czułości pomiaru od masy ność, łatwość pobierania i przechowywania, mocz jest ideal- cząsteczki, mieszaniny białek po separacji za pomocą elek- nym materiałem do badań laboratoryjnych. Mocz, jako mate- troforezy żelowej, chromatografii cieczowej lub elektroforezy riał wykorzystywany w badaniach proteomicznych, stwarza kapilarnej poddane są wstępnemu trawieniu przez specy- jednak wiele trudności badaczom, które wynikają z niskiego ficzne proteazy, zazwyczaj trypsynę [29]. Technika, w której stężenia białek przy równoczesnym wysokim stężeniu soli, mieszanina peptydów tryptycznych poddawana jest roz- zmienności składu oraz braku powszechnie przyjętych działowi a następnie analizowana w spektrometrze mas metod analitycznych [5, 13]. Wykazano, że do analizy ureop- nazwana jest bottom-up. Alternatywę stanowi metodologia roteom najlepsza jest druga poranna próbka moczu bądź też top-down, w której do spektrometru wprowadza się niestra- przypadkowa, bezpośrednia próbka moczu pobrana ze środ- wione proteolitycznie białka lub peptydy nieprzekraczające kowego strumienia. Dobowa zbiórka moczu, oraz pierwsza jednak 50 kDa [1, 12, 29, 32]. poranna próbka moczu nie jest zalecana ze względu na obecność bakterii oraz komórek nabłonkowych pęcherza Jedną z częściej stosowanych konfiguracji spektrometrów moczowego [5]. Metody proteomiczne oparte są na kombi- mas, w której analizowana jest mieszanina peptydów nacji metod rozdziału białek, spektrometrii masowej oraz powstałych w wyniku degradacji proteolitycznej jest połącze- analizie numerycznej [13]. nie źródła jonów MALDI (laserowa desorpcja i jonizacja próbki wspomagana matrycą) i analizatora TOF (MALDI- W przypadku, kiedy mamy do czynienia ze złożonym mate- TOF). MALDI zalicza się do łagodnych sposobów jonizacji, riałem biologicznym jakim jest mocz, przed etapem jonizacji w której matryca separuje od siebie cząsteczki badanej sub- i pomiarem masy jonów, niezbędny jest wstępny rozdział stancji bez wywoływania rozkładu i przekazuje im zaabsor- próbki [29]. W tym celu najczęściej stosuje się rozdział elek- bowaną przez siebie energię desorpcji. Użycie matrycy troforetyczny, umożliwiający separację białek w zależności pośredniczącej w przekazywaniu energii do badanej sub- od masy i od ładunku. stancji, ułatwiającej jonizację próbki i umożliwiającej badanie substancji nielotnych, wielkocząsteczkowych i polarnych. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (2-D PAGE) Wytworzone w ten sposób jony są przyspieszane w polu umożliwia dokładne i dobrze odtwarzalne różnicowanie elektrycznym i kierowane do detektora [7]. wybarwionych białek obecnych w próbce badanej i próbce Odmianą opisanej techniki jest technologia SELDI-TOF kontrolnej. Wysoki koszt i czasochłonność procedury ograni- (technika powierzchniowej absorpcji/ jonizacji sprzężonej cza jednak jej zastosowanie jedynie do badań naukowych z detektorem czasu przelotu TOF). Opiera się na analizie [29, 32]. Elektroforeza kapilarna (CE) jest techniką częściej białek i peptydów zakotwiczonych na specjalnych macie- stosowaną pod kątem diagnostyki medycznej. Rozdział pep- rzach białkowych (ang. ProteinChip) o właściwościach złoża tydów odbywa się w buforze zawieszonym z cienkiej (25-100 chromatograficznego (w postaci taśmy aluminiowej wielkości μm) i długiej (0.5-1m) kapilarze, do której przyłożone zostało 10 × 80 mm). Współczesne metody mikrochemiczne pozwa- napięcie (30kV). Alternatywę dla rozdziału elektroforetycz- lają zaprojektować matrycę ProteinChip aktywną chemicznie nego stanowi chromatografia cieczowa (LC), w której pep- lub biochemicznie. Aktywna chemicznie matryca, wiąże tydy rozdzielane są ze względu na ich hydrofobowość [29]. określony typ białek np. o właściwościach hydrofobowych lub hydrofilowych. ProteinChip może także zawierać na Spektrometria masowa (MS): swojej powierzchni panel przeciwciał monoklonalnych skie- Zastosowanie spektrometrii masowej do analizy ureopro- rowanych np. przeciwko określonym antygenom czy recep- teomu pozwala na oznaczenie dużej liczby różnych pepty- torom – powierzchnie biochemiczne. Białka niespecyficzne dów w krótkim czasie. Umożliwia analizę zarówno białek jak i zanieczyszczenia obecne w próbce moczu są wymywane i peptydów o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej wystę- przy pomocy specjalnego buforu. Pod wpływem działania pujących w moczu nawet w niskim stężeniu. lasera ultrafioletowego wygenerowana jest energia desorpcji Pomimo ogromnej różnorodności technik spektrometrii ma- potrzebna do uzyskania peptydów pochodzących z badanej sowej schemat konstrukcji we wszystkich aparatach jest próbki w stanie gazowym. Pomiar przelotu badanych pepty- podobny. Głównymi elementami są: źródło jonów (które dów w rurze próżniowej (TOF) pozwala na ustalenie jonizują cząsteczkę), analizator (w którym zachodzi rozdział współczynnika masy do wartości ładunku elektrycznego, jonów za względu na masę i ładunek) oraz detektor. które zależą od rodzaju badanego peptydu (m/z). Należy 412 A. Krzywonos zaznaczyć, że uzyskane w tej technice widmo masowe nie Analiza ureoproteomu w diagnostyce klinicznej pozwala na identyfikację białek, gdyż ta technika nie daje chorób nerek możliwości analizy sekwencji peptydowej. Zastosowanie technik bazujących na spektrometrii maso- Dzięki narzędziom bioinformatycznym, informacje o inten- wej, przyczyniło się do wykrycia wielu potencjalnych bio- sywności sygnałów białkowych i ich masach cząsteczko- markerów chorób nerek, wliczając: ostre uszkodzenie nerek wych mogą być wykorzystane, jako markery diagnostyczne [19], gromerulopatię cukrzycową [15, 16, 17], zespół Fanco- i prognostyczne jednoznacznie identyfikujące proces choro- niego [4] oraz wrodzoną nefropatię zaporową [3]. bowy [7, 8, 22, 29]. Umożliwiają analizę i porównanie sek- Wczesna diagnostyka pacjentów cierpiących na nefropatię wencji aminokwasowych występujących w białkach z ist- IgA może zapobiec lub przynajmniej opóźnić rozwój schył- niejącą już bazą danych. W rezultacie, dostarczając kowej niewydolności nerek. Do chwili obecnej, diagnostyka informacji o strukturze i funkcji białka, pozwala na: przewi- opiera się jedynie na biopsji nerki. Zastosowanie technik dywanie struktury drugo- i trzecio-rzędowej białka, określe- elektroforezy kapilarnej i spektrometrii masowej pozwala nia własności fizyko-chemicznych na podstawie sekwencji wygenerować profil białkowy moczu różnicujący osoby reszt aminokwasowych, wyszukiwanie domen i motywów, zdrowe i chore, umożliwiając szybką i nieinwazyjną diagno- analizę potranslacyjnych modyfikacji, oraz wyszukiwanie stykę pacjentów cierpiących na nefropatie IgA. Haubitz wariantów i podobieństw do innych białek. i wsp. [9] wykrył obecność specyficznych profili białkowych związanych z przebiegiem choroby, nawet gdy poziom Białkowe markery chorób nowotworowych białka całkowitego w moczu nie odbiegał od wartości refe- układu moczowego rencyjnych [9, 13]. We wczesnym wykryciu chorób nowotworowych i w dal- Posługując się techniką SELDI-TOF, w moczu chorych szym ich monitorowaniu szczególną rolę odgrywają markery wykryto dwa białka (o masie cząsteczkowej 3340 i 3980 Da) nowotworowe. U osób zdrowych, substancje te nie wystę- których obecność pozwalała odróżnić aktywny proces tocz- pują lub są wykrywane w minimalnych ilościach, natomiast niowego zapalenia nerek od zmian nieaktywnych. W pro- mogą ujawniać się w komórkach nowotworu złośliwego. spektywnym badaniu te 2 nowe wskaźniki wcześniej niż tra- W diagnostyce chorób nowotworowych układu moczowego, dycyjne zapowiadały nawrót toczniowego zapalenia nerek, mocz ze względu na wysokie stężenie produktów wydziela- natomiast spadek ich wartości zwiastował remisję [18]. nych przez guz stanowi szczególną wartość diagnostyczną. Mocz pacjentów z nowotworami urologicznymi został prze- Proteomiczna diagnostyka chorób analizowany przy użyciu metod proteomiki [20]. niezwiązanych z układem moczowym Każdego roku w Europie, diagnozowane jest około 65 000 Wygenerowany profil białkowy moczu pozwala na nieinwa- nowych przypadków raka nerki (RCC). Mimo znacznych zyjną diagnostykę i monitorowanie chorób, także tych nie- postępów w zrozumieniu mechanizmów choroby, nadal nie związanych z układem moczowym. Unikalne zmiany w skład- udało się odkryć krążących biomarkerów dla raka nerki. zie białkowym moczu pozwalają na wykrycie zmian jeszcze W badaniu przeprowadzonym przez Vasudev i wsp. [30] do przed wystąpieniem objawów klinicznych [32]. badania moczu pacjentów z rakiem nerki wykorzystano Badanie ureoproteomu znalazło zastosowanie w diagnostyce techniki 2D PAGE i SM. Autorzy wykazali, że lizosomalna zaburzeń związanych z metabolizmem kostnym. Ivaska proteaza – katepsyna D jest potencjalnym biomarkerem i wsp. [12] badała formy proteomicze osteokalcyny wykorzys- raka nerki przydatnym w diagnostyce, rokowaniu lub moni- tując techniki spektrometrii masowej i N-końcowego sekwen- torowania pacjentów. Niezbędne są jednak dalsze badania cjonowania. Badając próbki moczu 75 letnich kobiet, wyka- w tym kierunku [24,30]. zano ujemną korelacje pomiędzy obecnością fragmentów Mocz pacjentów z rakiem prostaty również został poddany Gly7 oraz Asp14 osteokalcyny a gęstością mineralną szyjki analizie proteomicznej [6,23,27,28] Pionierskie badania kości udowej. Autorzy wskazując na potencjalne zastosowa- ureoproteomu przy użyciu 2-D elektroforezy przeprowadził nie pomiaru fragmentów osteokalcyny w moczu w prognozo- Edwards i wsp. [6], wskazując antygen raka gruczołu kroko- waniu złamań oraz diagnostyce osteoporozy. wego (PCA-1) jako kandydata na markera raka prostaty. Analiza proteomiczna moczu znalazła również zastosowanie Rechman i wsp [23] wykorzystując metody 2-D PAGE w ocenie ryzyka sercowo naczyniowego. Po przebadaniu i MALDI-TOF MS, zidentyfikowali kalgruline B/MPR-14 359 próbek moczu, brytyjscy naukowcy [35] zidentyfikowali w moczu pacjentów z rakiem prostaty. 15 polipeptydów, charakterystycznych dla profilu białkowego Saito i wsp. [25] analizowali skład białkowy moczu u pacjen- moczu osób z chorobą wieńcową. tów z rakiem pęcherza moczowego wykorzystując metody Poszukując białek markerowych, Ye i wsp. [34] analizowali rozdziału elektroforetycznego (2-D PAGE) i MS. Wykazano, zmiany potranslacyjne w profilu białkowym moczu kobiet że na podstawie rozdziału elektroforetycznego białek obec- z rakiem jajnika oraz pacjentek z łagodnymi zmianami nych w moczu pacjentów (metaloproteinazy 2 i 9 oraz fibro- w przydatkach. Autorzy wskazali na znaczącą rolę neuroto- nektyny) można ocenić poziomu inwazji guza a także na ksyny eozynofilowej oraz osteopontyny w diagnostyce raka monitorować nawroty choroby. jajnika [12, 34]. Wykazano, że mocz ze względu na mniejszą 413 Rola badań proteomicznych w diagnostyce klinicznej liczbę termolabilnych białek i peptydów, jest lepszym źródłem wskaźników raka jajnika w porównaniu do surowicy [34]. Podsumowanie 16. Choroba jest dynamicznym procesem modyfikującym ekspresję określonych genów przyczyniającym się do zmian w produkowanych i wydzielanych białkach. Pojedyncze markery charakteryzują się z reguły niską czułością i specyficznością, a ich wartość diagnostyczna nie może stanowić pew- 17. 18. nego kryterium rozpoznania i klasyfikacji choroby. Na podstawie analizy różnic w profilach białkowych osób chorych i zdrowych, możliwe jest określenie „odcisku palca” choroby, stanowiącego specyficzne zestawienie markerów 19. 20. białkowych dla danego schorzenia. Uwzględnia on stosunki jakościowe i ilościowe produkowanych peptydów i białek. Ten określony „wzór” („pattern”) ekspresji lub sekrecji, odzwierciedlający stan patologiczny stanowi alternatywę dla dotychczasowej diagnostyki opartej na oznaczeniu pojedynczych 21. 22. 23. markerów. Związana z medycznymi zastosowaniami proteomika stwarza nadzieje na opracowanie metod pozwalających na szybszą diagnozę oraz postęp w leczeniu wielu chorób. Piśmiennictwo: 1. Aebersold R, Mann M. Mass-spectrometry – based proteomics. Nature 2003; 422: 198-207. 2. Azad NS, Rasool N, Annunziata CM i wsp. Proteomics in clinical trials and practice: present uses and future promise. Mol Cell Proteomics 2006; 5: 1819-1829. 3. Bakun M, Imiela J, Dadlez M i wsp. Zaawansowana analiza białkomoczu. Co możemy wykryć za pomocą tandemowej spektrometrii masowej w badaniach proteomicznych? Nephrol Dial Pol 2008; 12: 137. 4. Cutillas PR, Chalkley RJ, Hansen KC i wsp. The urinary proteome in Fanconi syndrome implies specificity in the reabsorption of proteins by renal proximal tubule cells. Am J Physiol Renal Physiol 2004; 287: F353-F364. 5. Drożdż J. Od Tiseliusa do proteomiki – nowe perspektywy analizy składu białek moczu. In vitro Explorel 2007; 1: 15-22. 6. Edwards JJ, Anderson NG, Tollaksen SL i wsp. Proteins of human urine: Identification by two-dimensional electrophoresis of a new candidate marker for prostatic cancer. Clin Chem 1982; 28: 160-163. 7. González-Buitrago JM, Ferreira L, Lorenzo I i wsp. Urinary proteomics. Clin Chim Acta 2007; 375: 49-56. 8. Gundry RL, White MY, Murray CI i wsp. Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol 2009; 10: 25.1-25.23. 9. Haubitz M, Wittke S, Weissinger EM i wsp. Urine protein patterns can serve as diagnostic tools in patients with IgA nephropathy. Kidney Int 2005; 67: 2313-2320. 10. Hong ML, Jiang N, Gopinath S i wsp. Proteomics technology and therapeutics. Clin Exp Pharmacol Physiol 2006; 33: 563-568. 11. Hutchinson LM, Chang EL, Becker CM i wsp. Use of thymosin beta15 as a urinary biomarker in human prostate cancer. Prostate 2005; 64: 116-127. 12. Ivaska KK, Hellman J, Likojärvi J i wsp. Identification of novel proteolytic forms of osteocalcin in human urine. Biochem Biophys Res Commun 2003; 306: 973-980. 13. Klein JB, Thongboonkerd V. Overview of proteomics. Contrib Nephrol 2004; 141: 1-10. 14. Lewandowicz A. Proteomika w nefrologii – nowe perspektywy diagnostyki nieinwazyjnej? Nefrol Dial Pol 2009; 13: 15-21. 15. Meier M, Kaiser T, Herrmann A i wsp. Identification of urinary 414 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. protein pattern in type 1 diabetic adolescents with early diabetic nephropathy by a novel combined proteome analysis. J Diabetes Complications 2005; 19: 223-232. Mischak H, Coon JJ, Novak J i wsp. Capillary electrophoresismass spectrometry as a powerful tool in biomarker discovery and clinical diagnosis: an update of recent developments. Mass Spectrom Rev 2009; 28: 703-724. Mischak H, Kaiser T, Walden M i wsp. Proteomic analysis for the assessment of diabetic renal damage in humans. Clin Sci 2004; 107: 485-495. Mosley K, Tam FW, Edwards RJ i wsp. Urinary proteomic profiles distinguish between active and inactive lupus nephritis. Rheumatology 2006; 45: 1497-1504. Nguyen M. Early prediction of acute renal injury using urinary proteomics. Am J Nephrol 2005; 25: 318-326. O'Riordan E, Goligorsky MS. Emerging studies of the urinary proteome: the end of the beginning? Curr Opin Nephrol Hypertens 2005; 14: 579-585. Patterson SD, Aebersold RH. Proteomics: the first decade and beyond. Nat Gene 2003; 33: 311-332. Pisitkun T, Johnstone R, Knepper MA. Discovery of urinary biomarkers. Mol Cell Proteomics 2006; 5: 1760-1771. Rehman I, Azzouzi AR, Catto JW i wsp. Proteomic analysis of voided urine after prostatic massage from patients with prostate cancer: a pilot study. Urology 2004; 64: 1238-1243. Rogers MA, Clarke P, Noble J i wsp. Proteomic profiling of urinary proteins in renal cancer by surface enhanced laser desorption ionization of key issues affecting potential clinical utility. Cancer Res 2003; 63: 6971-6983. Saito M, Kimoto M, Araki T i wsp. Proteome analysis of gelatinbound urinary proteins from patients with bladder cancers. Eur Urol 2005; 48: 865-871. Sztefko K. Wykłady monograficzne z diagnostyki laboratoryjnej. Część 2. Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego 2007: 122-149. Theodorescu D, Wittke S, Ross MM i wsp. Discovery and validation of new protein biomarkers for urothelial cancer: a prospective analysis. Lancet Oncol 2006; 7: 230-240. Theodorescu D, Schiffer E, Bauer HW i wsp. Discovery and validation of urinary biomarkers for prostate cancer. Proteomics Clin Appl 2008; 2: 556-570. Thongboonkerd V. Practical points in urinary proteomics. Proteome Res 2007; 6: 3881-3890. Vasudev NS, Sim S, Cairns DA i wsp. Pre-operative urinary cathepsin D is associated with survival in patients with renal cell carcinoma. Br J Cancer 2009; 10: 1175-1182. Venter JC, Adams MD, Myers EW i wsp. The sequence of the human genome. Science 2001; 291: 1304-1351. Waksmański B, Olejek A. Proteomika w prognozowaniu wystąpienia raka jajnika: rzeczywistość i nadzieje. Przegląd Menopauzalny 2006; 6: 352-357. Wścisło G. Badanie profilu białek w raku nerki. www.rak-nerki.pl z dnia: 2010.04.01 Ye B, Skates S, Mok SC i wsp. Proteomic-based discovery and characterization of glycosylated eosinophil-derived neurotoxin and COOH-terminal osteopontin fragments for ovarian cancer in urine. Clin Cancer Res 2006; 12: 432-441. Zimmerli LU, Schiffer E, Zürbig P i wsp. Urinary proteomic biomarkers in coronary artery disease. Mol Cell Proteomics 2008; 7: 290-298. Adres do korespondencji: Katedra i Zakład Analityki Medycznej Akademia Medyczna we Wrocławiu ul. Pasteura 2, 50-367 Wrocław e-mail: [email protected] (Praca wpłynęła do Redakcji: 2010-06-18) (Praca przekazana do opublikowania: 2010-12-20)