aktywność ex vivo decitabiny w ostrych

Nowiny Lekarskie 2007, 76, 2, 130-133
MONIKA RICHERT, JAN STYCZYŃSKI
AKTYWNOŚĆ EX VIVO DECITABINY W OSTRYCH BIAŁACZKACH U DZIECI
EX VIVO ACTIVITY OF DECITABINE IN CHILDHOOD ACUTE LEUKEMIAS
Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii
Akademia Medyczna w Bydgoszczy
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Mariusz Wysocki
Streszczenie
Wstęp. Decitabina jest nowym lekiem cytostatycznym, analogiem nukleozydów pirymidynowych, stosowanym w terapii różnych
chorób nowotworowych.
Cel pracy. Celem pracy jest analiza aktywności decitabiny w komórkach ostrej białaczki limfoblastycznej i mieloblastycznej u dzieci
w warunkach ex vivo.
Metodyka. Do badań zakwalifikowano 22 dzieci z ostrymi białaczkami, w tym 17 z ostrą białaczką limfoblastyczną de novo, 3 z ostrą
białaczką mieloblastyczną de novo oraz 2 dzieci ze wznową ostrej białaczki limfoblastycznej. Cytotoksyczność decitabiny określono
w teście MTT. Dodatkowo oceniono korelację cytotoksyczności tego leku z innymi lekami przeciwbiałaczkowymi: prednizolonem,
winkrystyną, L-asparaginazą i cytarabiną.
Wyniki. Decitabina wykazała 14-krotnie większą cytotoksyczność wobec komórek ostrej białaczki limfoblastycznej niż wobec komórek ostrej
białaczki mieloblastycznej. Komórki białaczkowe wykazują oporność krzyżową wobec decitabiny i innych badanych leków przeciwbiałaczkowych,
z wyjątkiem cytarabiny.
Wnioski. Decitabina wykazuje dobrą cytotoksyczność wobec komórek ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci.
SŁOWA KLUCZOWE: ostra białaczka limfoblastyczna, dzieci, decitabina, oporność na cytostatyki.
Summary
Introduction. Decitabine is a new anticancer drug, analogue of pirymidine nucleoside, used in the therapy of various types of cancer.
Objective. Analysis of ex vivo activity of decitabine in childhood acute lymphoblastic and myeloblastic leukemia.
Methods. A total number of 22 children with acute leukemias, who were successfully tested for ex vivo drug resistance were qualified for the study, including 17 with acute lymphoblastic leukemia de novo, 3 with acute myeloblastic leukemia de novo and 2 acute
lymphoblastic leukemia at relapse. Cytotoxicity of decitabine was estimated by the MTT assay. Its antileukemic activity and activity of
prednisolone, vincristine, L-asparaginase and cytarabine were compared.
Results. Decitabine was 14-fold more cytotoxic against acute lymphoblastic leukemia cells than against acute myeloblastic leukemia.
Leukemic cells presented cross-resistance to decitabine and other tested antileukemic drugs with possible exception of cytarabine.
Conclusions. Decitabine shows relatively good ex vivo cytotoxicity against childhood acute lymphoblastic leukemia.
KEYWORDS: acute lymphoblastic leukemia, children, decitabine, drug resistance.
Wstęp
Decitabina (5-aza-2’-deeoxycytidine) jest jednym z
analogów nukleozydów pirymidynowych wykazującym
silne właściwości demetylujące in vitro (ryc. 1.) [1].
Ryc. 1. Wzór chemiczny decitabiny (z lewej) i cytarabiny.
Decitabina poprzez demetylację specyficznych
regionów genomu aktywuje geny sprzężone, reaktywuje
transkrypcję genów supresorowych i wszystkich, które
uległy czasowemu wyciszeniu w wyniku metylacji
DNA [2]. Wykazano, że dzięki wyżej wspomnianym
właściwościom decitabina ma duże znaczenie kliniczne
w terapii wielu chorób nowotworowych [3]. Decitabina,
jako nieodwracalny inhibitor metylotransferazy DNA,
znalazła już kliniczne zastosowanie w terapii zespołów
mielodysplastycznych oraz przewlekłych białaczek
szpikowych w fazie transformacji blastycznej [4-5].
Podanie decitabiny skutkuje u tych chorych poprawą jakości
życia, obniżeniem ryzyka transformacji białaczkowej,
zmniejszeniem cytopenii nawet w trzech liniach
komórkowych, wzrostem przeżywalności i zwiększeniem
częstotliwości remisji [6]. Dowiedziono, że decitabina
wykazuje swoistą cytotoksyczność w stosunku do komórek
Aktywność ex vivo decitabiny w ostrych białaczkach u dzieci
131
białaczkowych, hamując komórki w fazie S oraz fazach
G2 i M cyklu komórkowego [7]. W próbach klinicznych
wykazano również działanie mielosupresyjne decitabiny, w
związku z którym rozpatruje się jej wykorzystanie w terapii
zapobiegającej wznowom u pacjentów po allogenicznych
przeszczepach komórek macierzystych krwi obwodowej
[8–9]. Wymienione aspekty działania decitabiny sugerują,
iż jej zastosowanie może mieć kliniczne znaczenie w terapii
innych chorób nowotworowych.
poprzedniego odpowiednio w stosunku 1:4. Zakres
testowanych stężeń wynosił 0,48–500 μg/ml.
Cel pracy
Przygotowane odpowiednio pod względem stężenia
komórek białaczkowych próbki inkubowano na płytkach
96-dołkowych, do których wcześniej dodano po 20
ml roztworu cytostatyku do każdego dołka. Panele
poddano 96-godzinnej inkubacji temperaturze 37°C
w atmosferze wzbogaconej 5% CO2. Po zakończeniu
inkubacji do wszystkich dołków dodano po 10 µl
rozpuszczalnego bromku 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl2,5-difenyl tetrazolium (MTT, Sigma). Po upływie
kolejnych 4 godzin inkubacji w tych samych warunkach
doszło do redukcji żółtego MTT do nierozpuszczalnego
formazanu z wytworzeniem jego błękitnych kryształów.
Formazan następnie rozpuszczono w 80 µl izopropanolu
(Chemia Bydgoszcz). Po rozpuszczeniu kryształów
zmierzono gęstość optyczną każdej próby przy pomocy
czytnika ELISA (Assys GmbH, Eugendorf, Austria)
przy długości fali 550 nm oraz długości fali referencyjnej
720 nm. Komputerowo wyznaczono ilości komórek, które
przeżyły inkubację, a więc komórek opornych na dany lek;
a także obliczono stężenia cytostatyku, w którym ginie 50%
komórek białaczkowych (LC50, lethal concentration).
Przyjęto następujące kryteria ważności testu MTT:
1. Odsetek blastów w zawiesinie komórek na początku
testu: 90% w ALL, 75% w AML.
2. Odsetek blastów w zawiesinie po 96-godzinnej
inkubacji: 70%.
3. Gęstość optyczna (OD, optical density) badanych
komórek > 0,050.
Na badanie uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy
Akademii Medycznej w Bydgoszczy.
Celem pracy jest analiza aktywności decitabiny
w komórkach ostrej białaczki limfoblastycznej i
mieloblastycznej u dzieci w warunkach ex vivo.
Materiał
Do badań włączono 28 próbek komórek wyizolowanych
ze szpiku kostnego lub krwi obwodowej pobranego od
dzieci w momencie rozpoznania ostrej białaczki. W 6
przypadkach badanie zakończyło się niepowodzeniem.
Ostatecznie do analizy zakwalifikowano pochodzące od
22 dzieci (10 chłopców, 12 dziewczynek) w wieku 3–19
lat (średnia wieku – 7,4 lat). Wśród badanych znalazło się
17 dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną (ALL, acute
lymphoblastic leukemia) de novo, 2 dzieci z ALL we
wznowie oraz 3 z ostrą białaczką mieloblastyczną (AML,
acute myeloblastic leukemia) de novo.
Metodyka
Wykonano badanie oporności wyizolowanych
komórek białaczkowych ex vivo na cytostatyki w teście
przeżyciowym MTT. Ponieważ komórki białaczkowe
krwi obwodowej i szpiku nie różnią się pod względem
oporności [10], badania przeprowadzono na komórkach
krwi obwodowej lub szpiku, a otrzymane wyniki poddano
wspólnej analizie. Świeżo pobrane komórki poddano
izolacji na gradiencie stężeń (Gradisol L, Aqua Medica,
Łódź), a następnie inkubacji w obecności cytostatyków
o znanych stężeniach na podłożu RPMI 1640 (Sigma,
St Louis, USA), zawierającym dodatek termicznie
inaktywowanej surowicy cielęcej (Gibco, Wielka Brytania)
oraz insulinę (5 μg/ml), glutaminę (2 mM), gentamycynę
(200 μg/ml) i transferynę (5 μg/ml). Do badań użyto
zawiesiny o stężeniach komórek białaczkowych co
najmniej 2 x 106/ml.
Komórki
poddano
izolacji,
a
następnie
inkubacji
na
płytkach
96-dołkowych
w
obecności: decitabiny (Sigma, nr kat. A3656)
oraz następujących leków przeciwbiałaczkowych:
prednizolonu
(Fenicort,
Jelfa),
L-asparaginazy (Medac), winkrystyny (Oncovin, Lilly) i
cytarabiny (Alexan, Mack) (tab. 1.). Roztwór decitabiny
przygotowano poprzez rozpuszczenie w roztworze soli
fizjologicznej, tak aby najwyższym stężeniem na płytkach
było 500 μg/ml, a każde z 5 następnych mniejsze od
Tab. 1. Leki przeciwbiałaczkowe użyte w badaniach
Lek i producent
Prednisolone (Fenicort, Jelfa)
Vincristine (Gedeon Richter)
L-asparaginase (Medac)
Cytarabine (Cytosar, Upjohn)
Zakres badanych stężeń
0,007–250 µg/ml
0,019–20 µg/ml
0,0032–10 IU/ml
0,0097–10 µg/ml
Statystyka
Różnice pomiędzy grupami porównano testem
Manna-Whitneya. Za względną oporność (RR, relative
resistance) na dany lek przyjęto stosunek wartości median
LC50 badanych grup. Korelacje pomiędzy opornością na
różne leki określono testem Spearmana.
Wyniki
Wykonano 28 badań, z czego 6 prób (21,4 %) nie
powiodło się i komórki kontrolne nie przeżyły 96-godzinnej
inkubacji. W 22 przypadkach przeprowadzono test MTT,
spełniający kryteria ważności. Porównanie wartości LC50
decitabiny z wartościami LC50 pozostałych leków wyraźnie
wskazuje na większą oporność na decitabinę komórek
132
Monika Richert i inni
pochodzących od chorych z AML de novo w stosunku do
dzieci z ALL de novo (RR = 14, p = 0,064). Średnie stężenie,
w którym ginie 50% blastów w przypadku ALL de novo
wynosi: LC50 = 27,64 μg/ml; a w AML LC50 = 389,7 μg/ml
(ryc. 2.). We wznowie ALL stwierdzono znaczną rozpiętość
wyników LC50.
Ryc. 2. Porównanie wartości LC50 decitabiny w poszczególnych grupach.
Dodatkowo
określono
korelacje
pomiędzy
wrażliwością ex vivo na decitabinę i pozostałe badane
leki przeciwbiałaczkowe. W teście korelacji Spearmana
wykazano, że oporność na decitabinę koreluje z opornością
na prednizolon (p = 0021), L-asparaginazę (0,021) i
winkrystynę (p = 0,008), ale nie na cytarabinę (p = 0,622)
(tab. 2.). Zaobserwowano, że prednizolon, winkrystyna i
L-asparaginaza korelowały pomiędzy sobą pod względem
cyotoksyczności, nie obserwowano natomiast korelacji
pomiędzy tymi lekami i cytarabiną.
pomiędzy ALL a AML de novo.
Według dostępnych danych literaturowych, zastosowanie decitabiny wydaje się być również obiecujące w
terapii raka niedrobnokomórkowego płuc [12], raka
hepatokomórkowego wątroby [13], czy hormonalnie
zależnego raka prostaty [14]. W tych przypadkach decitabina
wywołuje nie tylko demetylację DNA, ale także hamuje
podziały komórek nowotworowych i zwiększa ekspresję
β-galaktozydazy, a także powoduje immunogenetyczną
oraz apoptotyczną śmierć komórek nowotworowych [13,
14]. Nie bez znaczenia jest również fakt, iż decitabina może
wpływać na zwiększenie stężenia Hb płodowej oraz poprawę
kliniczną u chorych z hemoglobinopatiamii, a zwłaszcza
niedokrwistością sierpowatokrwinkową [15].
Ponadto oporność na decitabinę komórek ostrej białaczki
mieloblastycznej wydaje się stanowić składową szerzej
pojętego problemu oporności komórkowej w tej chorobie.
Wyraźnie obserwowane korelacje istnieją bowiem między
lekami, które wykazują zupełnie odmienne mechanizmy
działania i punkty uchwytu. Czy zatem decitabinę można
uznać za obiecujący lek dla pacjentów z ALL de novo? Być
może na to pytanie pozwolą odpowiedzieć dalsze próby i
badania kliniczne.
Wnioski
1.Decitabinawykazuje14-krotniewiększącytotoksyczność
wobec komórek ostrej białaczki limfoblastycznej niż wobec
ostrej białaczki mieloblastycznej.
2. Cytotoksyczność decitabiny koreluje z
cytotoksycznością podstawowych leków stosowanych w
terapii ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci.
Tab. 2. Macierz korelacji Spearmana
decitabina
decitabina
prednizolon
winkrystyna
L-asparaginaza
cytarabina
r = 0,490
p = 0,021
r = 0,547
p = 0,008
r = 0,490
p = 0,021
r = 0,111
p = 0,622
prednizolon
winkrystyna
L-asparaginaza
cytarabina
r = 0,490
p = 0,021
r = 0,547
p = 0,008
r = 0,808
p < 0,001
r = 0,490
p = 0,021
r = 0,625
p = 0,002
r = 0,666
p = 0,001
r = 0,111
p = 0,622
r = 0,042
p = 0,852
r = 0,224
p = 0,316
r = 0,098
p = 0,665
r = 0,808
p < 0,001
r = 0,625
p = 0,002
r = 0,042
p = 0,852
r = 0,666
p = 0,001
r = 0,224
p = 0,316
r = 0,098
p = 0,665
Górna wartość przedstawia wartość współczynnika r korelacji Spearmana. Dolna wartość przedstawia wartość p wg testu Spearmana.
Dyskusja
Wyniki przeprowadzonych badań sugerują, że decitabina
wykazuje dobrą cytotoksyczność wobec komórek ostrej
białaczki limfoblastycznej u dzieci, a jednocześnie korelację
cytotoksyczności z innymi lekami stosowanymi w ostrej
białaczce limfoblastycznej. Ponieważ podobny trend
obserwowano we wcześniejszych badaniach dla innych
leków [11], wydaje się, iż oporność in vitro na cytostatyki w
ostrych białaczkach podkreśla różnice biologiczne istniejące
Piśmiennictwo
1. Lubbert M., Wijermans P., Kunzmann R. et al.: Cytogenetic
responses in high risk myelodysplastic syndrome following
low-dose treatment with DNA methylation inhibitor 5- aza-2’deoxycytidine. Br. J. Haematol., 2001, 111, 349-357.
2. Christman J.K.: 5-aza-2’-deeoxycytidine as inhibitor of DNA
methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene, 2002, 21, 5483-5495.
3. Karpf A.R., Moore B.C., Ririe T. et al.: Activation of the p53
DNA damage response pathway after inhibition of DNA
Aktywność ex vivo decitabiny w ostrych białaczkach u dzieci
methyltransferase by 5-aza-2’-deoxycytidine. Mol. Pharmacol.,
2001, 59, 751-757.
4. Wijermans P., Lubbert M., Verhoef G. et al.: Low-dose 5aza-2’-deeoxycytidine, a DNA hypomethylating agent for the
treatment of high-risk myelodysplastic syndrome: a multicancer phase II study in elderly patients. J. Clin. Oncol., 2000,
18, 956-962.
5. Aul C., Giagounidis A., Germing U. et al.: Myelodysplastische Syndrome Aktueller Stand der Diagnostik und Therapie. Med. Klin. (Munich), 2002, 97, 666-676.
6. Sacchi S., Kantarjian H.M., O’Brien S. et al.: Chronic myelogenous leukaemia in nonlymhoid blastic phase: analysis of
the results of first salvage therapy with three different treatment
approaches for 162 patients. Cancer, 1999, 86, 2632-2641.
7. Richel D.J., Colly L.P., Lurvink E. et al.: Comparison of the
antileukemic activity of 5-aza-2’-deoxycytidine and arabinosylcytosine in rats with myelocytic lekaemia. Br. J. Cancer, 1988,
58, 730-733.
8. Boogaerts M.A.: Stem cell transplatation and intensified
cytotoxic treatment for myelodysplasia. Curr. Opin. Hematol., 1998, 5, 465-471.
9. Giralt S., Davis M., O’Brien S. et al.: Studies of decitabine with
allogenic progenitor cell transplantation. Leukemia, 1997, 11,
suppl. 1, S32-S34.
10. Kaspers G.J.L., Veerman A.J.P., Pieters R. et al.: Mononuclear
cells contaminating leukaemic samples tested for cellular drug
resistance using the methyl-thiazol-tetrazolium assay. Br. J.
Cancer, 1994, 70, 1047-1052.
133
11. Wysocki M., Styczyński J., Dębski R. et al.: Drug resistance
profile in childhood acute lymphoblastic leukemia on
diagnosis and at relapse with respect to percentile values.
Report of Polish Pediatric Leukemia and Lymphoma Study
Group. Acta Haematol. Pol., 2002, 33, 341-350.
12. Momparler R.L., Ayoub J.: Potential 5-aza-2’-deoxycytidine a
potent inhibitor of DNA methylation for therapy of advanced
non-small cell lung cancer. Lung Cancer, 2001, 34, suppl. 4,
S111-S115.
13. Suh S.I., Pyun H.Y., Cho J.W. et al.: 5-aza-2’-deoxycytidine
leads to down regulation of abberant p16INK4A RNA
transcripts and restores the functional retinoblastoma protein
pathway in hepatocellular carcinoma cell lines. Cancer Lett,
2000, 160, 81-88.
14. Thibault A., Figg W.D., Bergan R.C. et al.: A phase II study of
5-aza-2’-deoxycytidine (decitabine) in hormone independent
metastatic prostate cancer. Tumori, 1998, 84, 87-89.
15. DeSimone J., Koshy M., Dorn L. et al.: Maintenance of
elevated fetal hemoglobin levels by decitabine during dose
interval treatment of sickle cell anemia. Blood, 2002, 99, 39053908.
Adres do korespondencji:
dr n. med. Jan Styczyński
Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii
ul. Curie-Skłodowskiej 9
85-094 Bydgoszcz
e-mail: [email protected]
tel.: 0601-222 131