Zapisz jako PDF

Spis treści
1 Wstęp
1.1 Uwzględniając cechy morfologiczne i fizjologiczne zespołów komórkowych
tworzących tkanki, wszystkie tkanki dzieli się na cztery grupy
1.2 Wśród metod biopsyjnych wyróżniamy między innymi
2 Technika histologiczna oraz mikroskopia
2.1 Technika histologiczna: utrwalanie i barwienie tkanek
2.1.1 Inne metody barwienia
3 Ćwiczenia. Mikroskop optyczny
Wstęp
Komórki: erytrocyt,
trombocyt, leukocyt.
Tkanka: krew
człowieka.
Narząd: serce.
Biopsja szpiku kostnego.
Biopsja mózgu.
Histologia jest nauką o rozwoju, budowie i funkcjach tkanek. Jest mikroskopową częścią anatomii.
Obejmuje ona także naukę o budowie i czynnościach komórki, a zatem cytologię. W przypadku
tkanek chorych nosi nazwę histopatologia. Mikroskopowe badanie chorej tkanki, jest ważnym
narzędziem w patologii anatomicznej, gdyż dokładne rozpoznanie raka i wielu innych chorób zwykle
wymaga badania histopatologicznego próbek.
Wyróżniamy:
histologię ogólną czyli naukę o ogólnej budowie i funkcjach wszystkich podstawowych tkanek
organizmu,
histologię szczegółową czyli naukę o mikroskopowej budowie narządów oraz układów
narządów,
histofizjologię czyli naukę o czynnościach tkanek (w powiązaniu z ich strukturą),
histochemię czyli naukę o metodach wybarwiania i wykrywania substancji chemicznych
zawartych w tkankach (stosuje się metody nie uszkadzające struktury badanego obiektu),
histopatologię czyli naukę o budowie i funkcjach tkanek organizmu w stanie chorobowym.
Człowiek składa się z przeszło 100 bilionów komórek różniących się pełnioną funkcją oraz budową.
Komórki wyspecjalizowane w pełnieniu określonej funkcji tworzą zespoły zajmujące wspólny obszar
w ciele zwany tkanką. W przypadku, gdy wszystkie komórki mają taką samą budowę, utworzona z
nich tkanka jest tkanką prostą (np. tkanka tłuszczowa). Gdy tkanka złożona jest z wielu różnych
komórek i substancji pozakomórkowej, mówimy o tkance złożonej. (np. tkanka nerwowa złożona z
komórek nerwowych, podporowych, immunologicznych i nabłonkowych).
Kilka tkanek zajmujących wspólne terytorium i pełniących skoordynowane funkcje tworzy narząd
(np. serce, żołądek, oko). Do wykonywania złożonych czynności, takich jak np. oddychanie czy
odżywianie nie wystarczy jeden narząd, ale potrzebny jest układ narządów (np. układ oddechowy,
układ krwionośny).
Uwzględniając cechy morfologiczne i fizjologiczne zespołów komórkowych
tworzących tkanki, wszystkie tkanki dzieli się na cztery grupy
1. Tkankę nabłonkową (komórki wyścielające jamy ciała, pokrywające powierzchnie a także
tworzące gruczoły),
2. tkankę łączną i podporową (komórki które wytwarzają substancję pozakomórkową mającą za
zadanie spajać różne typy innych tkanek i zapewniać podporę narządom),
3. tkankę mięśniową (komórki posiadające zdolność kurczenia się),
4. tkankę nerwową (komórki budujące nerwy, rdzeń kręgowy, mózg).
Obecnie istnieje wiele szybkich oraz bezpiecznych możliwości pobierania materiału biologicznego. W
przypadku tkanek, które są bardzo łatwo dostępne, takich jak skóra, tkankę pobiera się za pomocą
skalpela. Natomiast biopsja — rodzaj zabiegu diagnostycznego, będącego inwazyjną metodą
pobrania materiału biologicznego z przypuszczalnie zmienionych chorobowo tkanek — ma
zastosowanie w odniesieniu do narządów o trudniejszym dostępie (np. mózg, oko, tarczyca, węzeł
chłonny, pierś, płuca, wątroba, kości, szpik kostny).
Wśród metod biopsyjnych wyróżniamy między innymi
1. Biopsję wycinkową — fragmenty tkanki pobierane są chirurgicznie.
2. Biopsję aspiracyjną cienkoigłową (BAC lub punkcja) — w której próbka komórek pobierana jest
za pomocą cienkiej igły wprowadzonej do tkanki. Tkanka wprowadzana jest do strzykawki za
pomocą przyłożonego podciśnienia (pociągnięciu tłoka). Ten rodzaj biopsji dostarcza tylko
niewielką liczbę komórek do badania. W przypadku wykrycia komórek nowotworowych
pobranego materiału jest zbyt mało, aby można było określić jaki dokładnie charakter ma
wykryta zmiana. Biopsję cienkoigłową stosuje się do ustalenia rozpoznania wyczuwalnych i
niewyczuwalnych guzów.
3. Biopsję gruboigłową (oligobiopsja) — w której za pomocą grubej igły (średnica powyżej 1,2
mm!) pobierany jest cylindryczny wycinek tkanki. Stosuje się ją często w przypadku, gdy
biopsja cienkoigłowa dała wynik niejednoznaczny.
4. Biopsję wiertarkową — stosowaną najczęściej w diagnostyce kości. Zamiast igły stosuje się
trepany, które wprowadza się w szybki ruch obrotowy za pomocą silnika elektrycznego.
Uzyskany materiał jest większy niż w biopsji gruboigłowej i ma kształt walca.
Znajomość histologii a zatem prawidłowej budowy tkanek jest istotna, ponieważ pozwala na na
rozpoznanie struktur, które zmienione są chorobowo, a także umożliwia zrozumienie w jaki sposób
nieprawidłowości na poziomie fizjologicznym i biochemicznym prowadzą do rozwoju chorób. W
kolejnych rozdziałach omówione zostaną szczegółowo cechy oraz funkcje wszystkich tkanek
ludzkich, a także technika przygotowania materiału do badań mikroskopowych.
Technika histologiczna oraz mikroskopia
Technika histologiczna: utrwalanie i barwienie tkanek
Aby tkanki mogły być oglądane pod mikroskopem, muszą być najpierw odpowiednio utrwalone.
Pełna procedura wykonania preparatu od chwili pobrania wycinka struktury a do momentu
zamknięcia go szkiełkiem nakrywkowym trwa od kilku dni (w przypadku standardowych barwień
przeglądowych), aż do kilku miesięcy (np. impregnacja tkanki nerwowej). Odpowiednio
przechowywane preparaty (w miejscach, które są ciemne, chłodne i suche) potrafią zachować
odpowiednie barwy przez dziesiątki lat.
Aldehyd mrówkowy.
Wzór sumaryczny
CH2O
Wydzielone skrawki (od 0,1 do 10 mikrometrów), utrwalane są chemicznie przez zanurzenie w płynie
zwanym utrwalaczem (np. formalina lub etanol) lub fizycznie (za pomocą mikrofal). Pobrany wycinek
narządu trafia do płynu utrwalającego, aby zapobiec wystąpieniu komórkowych zmian nekrotycznych
i degeneracyjnych. Nekroza jest stopniową degradacją struktur komórkowych (m.in. denaturacją
białek), obrzmieniem cytoplazmy, dezintegracją błony komórkowej i chaotyczną inaktywacją
wszystkich szlaków biochemicznych, a także następuje pęcznieniem komórki (na skutek dostawania
się wody do komórki) lub przeciwnie jej obkurczenie. Towarzyszy jej wydostanie się zawartości
komórki (następuje rozpad komórki) do otaczającej ją przestrzeni międzykomórkowej, na skutek
utraty ciągłości błony komórkowej.
Badany materiał należy niezwłocznie umieścić w utrwalaczu (aby nie dopuścić nawet do
minimalnego wysuszenia). Standardowym utrwalaczem dla tkanek jest 4% roztwór wodny aldehydu
mrówkowego zbuforowany do pH = 7.2 (czyli 10% zbuforowana formalina), a materiału
cytologicznego 70% roztwór alkoholu etylowego. Szybkość penetracji 10% formaliny w tkance
wynosi około 4 mm/dobę. Ilość utrwalacza w naczyniu musi kilkukrotnie (5-8 razy) przewyższać
objętość nadsyłanego materiału, ponieważ utrwalacz zużywa się podczas utrwalania. Następnie
tkanka jest odwadniana w alkoholu aż woda zostanie całkowicie usunięta a tkanka zostanie
całkowicie przepojona alkoholem. W kolejnym kroku alkohol zastępuje się organicznym
rozpuszczalnikiem, mieszającym się zarówno z alkoholem jak i parafiną. Na tym etapie tkanka
zostaje zatapiana w parafinie, która przepaja całą tkankę. Ponieważ odbywa się to w temperaturze
parafiny nieco powyżej jej punktu topnienia, gdy temperatura parafiny obniża się do temperatury
pokojowej (16 stopni), parafina krzepnie dzięki czemu tkanka staje się twarda. Możliwe jest wtedy
pokrojenie tkanki na mikrotomie, a następnie umieszczenie jej pomiędzy szkiełkami.
Hematoksylina
Eozyna Y
Obraz mikroskopowy żywej tkanki jest bardzo mało kontrastowy (w rzeczywistości komórki są
bezbarwne), co jest spowodowane minimalnym załamaniem światła prze poszczególne tkanki i
komórki. Aby uzyskać większy kontrast pozwalający na obserwacje poszczególnych części
składowych zarówno tkanek jak i komórek, stosuje się odpowiednie metody barwienia. Barwienie
odbywać się może poprzez chemiczne wiązanie barwienia ze strukturami tkankowymi czy absorpcji
barwnika na powierzchni struktur.
Komórki tkanki wątroby człowieka
wybarwione: a) hematoksyliną i eozyną b) w
reakcji PAS c) solami srebra.
Najważniejszą techniką jest barwienie hematoksyliną i eozyną (H+E). Jest to tzw. topograficzne
barwienie przeglądowe, pozwalające ocenić całość struktury tkanki, poprzez kontrastowe
zabarwienie cytoplazmy i jader komórkowych. Hematoksylina jest substancją zasadową, która barwi
jądra komórkowe na kolor fioletowy/niebieski. Eozyna to kwaśna pochodna fluoresceiny. Najczęściej
stosuje się żółtawą eozynę Y barwiąca cytoplazmę na różowo/czerwono. Kolory zabarwionej
struktury:
jądro — niebiesko-granatowe,
cytoplazma — bladoróżowa,
włókna retikulinowe i błony podstawne — bladoróżowe lub bezbarwne,
włókna kolagenowe — ciemnoróżowe,
włókna elastynowe — bladoróżowe,
substancja międzykomórkowa w chrząstce szklistej — bladoróżowe,
śluz — bladoróżowy,
sarkoplazma — różowoczerwona,
włókna nerwowe — bladoróżowe,
włókna glejowe — bladoróżowe,
krwinki czerwone — ceglastoczerwone,
włóknik — ciemnoróżowy.
Po zabarwieniu preparat należy zabezpieczyć przed niekorzystnym wpływem otoczenia
(uszkodzeniem mechanicznym, wysychaniem, utlenianiem niektórych barwników). Do tego celu służy
tzw. zamykanie preparatów, czyli umieszczenie ich pomiędzy szkiełkiem podstawowym a
nakrywkowym i wypełnienie przestrzeni pomiędzy szkiełkami substancją. Substancja ta powinna
spełniać dwa następujące warunki:
1. powinna posiadać taki sam współczynnik załamania światła jak szkło (w celu uniknięcia
uginania i rozpraszania promieni świetlnych),
2. w temperaturze pokojowej powinna hermetycznie i trwale spajać szkiełka.
Istnieją też inne specyficzne techniki barwienia poszczególnych rodzajów tkanek i komórek. Techniki
impregnacji solami srebra czy złota pozwalają między innymi na wizualizację włókien nerwowych.
Inne metody barwienia
Barwienie van Giesona — metoda wykorzystująca kwas pikrynowy i kwaśną fuksynę. Metoda ta
barwi jądra na kolor bordowo-czarny lub czarny, kolagen (tkanka łączna włóknista) na kolor
różowy lub bordowy natomiast mięśnie, cytoplazmę, i fibryny (białko proste zbudowane
wyłącznie z aminokwasów) na żółto.
Barwienie srebrem — azotan srebra stosowany jest głównie do barwienia DNA oraz białek
(kolagenu typu II). W odpowiednich warunkach azotan srebra redukowany jest do czarnych
strąków metalicznego srebra. Zredukowane srebro przybiera kolor brązowy, stąd też w
miejscach związania srebra z DNA uwidaczniają się brązowe prążki. Metoda ta może być
nieznacznie modyfikowana w sytuacjach, kiedy wybarwiane są różne związki (choć schemat
jest niezmienny). Etapy barwienia:
utrwalenie — odwodnienie żelu (w celu zwiększenia jego reaktywności na działanie
kolejnych odczynników) i utrwalenie helisy DNA (zabezpiecza przed jego uszkodzeniem
w dalszych etapach). Stosuje się tu roztwory odwadniające (np. etanol oraz metanol),
przeprowadzenie reakcji utleniania DNA kwasem azotowym (w celu łatwiejszego
wiązania się DNA z barwnikiem),
za pomocą formaldehydu redukcja barwnika (rozpuszczalna sól azotanu srebra) do formy
metalicznej — zredukowane do formy metalicznej srebro wiąże się z DNA, tworząc
nierozpuszczalne sole,
opłukanie żelu z pozostałości niezwiązanego srebra (które podczas wywoływania daje
silne tło),
wywołanie — dalsza redukcja srebra formaldehydem, węglanem sodowym lub
tiosiarczanem sodu. Ponieważ zredukowane srebro przybiera kolor brązowy, w miejscach
związania srebra z DNA uwidaczniają się brązowe prążki,
zatrzymanie proces redukcji przy jednoczesnym utrwaleniu reakcji barwnej (stosując np.
kwas octowy obniżamy pH roztworu).
Barwienie PAS — metoda ta jest stosowana do wykrywania glikogenu (węglowodanu
typowego) w tkankach takich jak wątroba, serce i mięśnie szkieletowe. Metoda stosowana
często do uwidoczniana błony podstawnej. Kolory zabarwionej struktury:
jądro — niebieskie,
cytoplazma — bladoróżowa lub bezbarwna,
włókna retikulinowe i błony podstawne — bladoniebieskie do bezbarwnych,
włókna kolagenowe — bladoniebieskie do bezbarwnych,
włókna elastynowe — bladoniebieskie do bezbarwnych,
substancja międzykomórkowa w chrząstce szklistej — czerwonoróżowa,
śluz — czerwonoróżowy,
sarkoplazma — bladofioletowa,
włókna nerwowe — bladofioletowe,
włókna glejowe — bladofioletowe,
krwinki czerwone — jasnoczerwone,
włóknik — różowy.
Barwienie May-Grunwald-Giemsa — stosowane jest najczęściej do barwienia szpiku kostnego i
rozmazów krwi.
Barwienie przyżyciowe — w mikroskopii świetlnej próbki mogą być umieszczane w kropli
wody, nakryte szkiełkiem nakrywkowym i bezpośrednio oglądane pod mikroskopem. Taki
preparat nazywany jest przyżyciowym. Umożliwia badanie struktury żywych komórek a także
obserwację dynamicznych procesów które w nich zachodzą (unikając zaburzeń
spowodowanych śmiercią komórek i procesami, które po niej następują). Jest to barwienie
żywych komórek i tkanek barwnikami o bardzo małych stężeniach (1:10000 - 1:100000), które
nie są dla nich toksyczne (np. barwienie czerwienią obojętną, zielenią janusową, błękitem
metylenowym, karminem, saponiną). Barwniki te, obdarzone ładunkiem dodatnim, wiążą się do
ładunków ujemnych na składnikach komórkowych. Następuje odróżnienie komórek żywych od
martwych, które się zabarwiają (barwnik jest pochłaniany tylko przez komórki żywe).
Należy pamiętać, że PREPARAT HISTOLOGICZNY POKAZUJE jedynie OBRAZ STATECZNY, Z
MOMENTU JEGO UTRWALENIA. W ŻYWEJ TKANCE natomiast PROCESY SĄ DYNAMICZNE.
Ponadto, warto zauważyć, że preparaty są tylko wycinkiem dużego narządu, w którym struktury nie
będąc rozmieszczone równomiernie, mogą nie pojawić się w każdym skrawku. Ponadto obecna
technika histologiczna nie pozwala na uniknięcie powstawania artefaktów. Podczas przygotowywania
preparatów zmienia się wielkość, kształt i skład chemiczny składników tkankowych. Rozpuszczalniki
organiczne wypłukują tłuszcze obojętne (odkładane w cytoplazmie), natomiast roztwory wodne —
glikogen (wielocukier gromadzony w wątrobie i tkance mięśniowej).
Ćwiczenia. Mikroskop optyczny
Obserwacja tkanek wykonywana będzie za pomocą mikroskopu optycznego Bresser Biolux LCD
wyposażonego w 3,5" (8,9cm) wyświetlacz LCD, umożliwiający zachowywanie obrazu preparatów
oraz nagrania filmów. Wewnętrzna pamięć oraz dodatkowe gniazdo czytnika kart pamięci SD
pozwalają na rejestrację oraz proste przenoszenie zapamiętanych obrazów i filmów. Mikroskop
pozwala na wykonywanie zdjęć pojedynczych lub seryjnych (co 5 sekund). Trzy obiektywy (4x, 10x i
40x) w połączeniu matrycą o rozdzielczości 3 mln pikseli (typu CMOS) pozwalają uzyskać
powiększenia 40x, 100x i 400x (współczynnik powiększenia okularu LCD wynosi 10x). Ponadto,
czterokrotny zoom cyfrowy umożliwia uzyskanie powiększenia 1600x. Maksymalna rozdzielczość
uzyskiwanych zdjęć: 2048 x 1536 (inne dostępne rozdzielczości zdjęć: 640x480, 800x600, 1024x768,
1280x960, 1600x1200, 2048x1536).
Mikroskop optyczny Bressser. Budowa: 1. Monitor LCD; 2. Tubus; 3. Uchwyt
obiektywów; 4. Obiektywy; 5. Oświetlenie górne LED; 6. Pokrętło ustawiania ostrości; 7.
Pokrętło przesuwu stolika do przodu i tyłu; 8. Pokrętło przesuwu stolika w lewo i prawo;
9. Zespół oświetlacza; 10. Oświetlacz transmisyjny; 11.Zespół oświetlacza; 12. Podstawa;
13. Zestaw kolorowych filtrów; 14. Przełącznik wyboru trybu oświetlenia; 15. Pokrętło
regulacji natężenia oświetlenia
Mikroskop wyposażony jest w oświetlenie diodowe LED (230 V) oraz regulację natężenia dla
oświetlenia górnego i dolnego. Przełącznik wyboru rodzaju oświetlenia umożliwia badanie w świetle:
przechodzącym — możemy obserwować przedmioty przezroczyste. Podczas takiej obserwacji
światło pada od dołu przechodząc przez preparat na stoliku mikroskopu, zostaje następnie
powiększone przez soczewki obiektywu i matrycę okularu, a następnie dostaje się do naszego
oka; wiele mikroorganizmów żyjących w wodzie, części roślin i najmniejszych części
organizmów zwierzęcych charakteryzuje się naturalną przejrzystością, inne wymagają jednak
specjalnego spreparowania,
odbitym — podczas takiej obserwacji światło pada na obserwowany przedmiot, zostaje od
niego odbite i następnie dostaje się poprzez soczewkę do oka; gdy obserwujesz nie barwione
obiekty lub roztwory; zwykle przedmioty nieprzezroczyste, np. mniejsze zwierzęta, części
roślin, tkanek itd.,
jednoczesny wybór obu rodzajów oświetlenia — używanie obu rodzajów oświetlenia jest
wskazane podczas badania semi-kolorowych preparatów. Ten tryb nie jest zalecany dla
przepuszczających światło obiektów na szkiełkach mikroskopowych gdyż powoduje odbijanie
światła od preparatu.
Jeżeli przełącznik trybu oświetlenia ustawimy w położeniu "I", zapewni to podświetlenie preparatu
od dołu (światło przechodzące), w położeniu "II" — zapewni oświetlenie górne. położenie "III"
przełącznika zapewnia oba rodzaje oświetlenia jednocześnie. Różne tryby oświetlenia z regulacją
natężenia oświetlenia umożliwiają dobór odpowiednich dla danego preparatu warunków oświetlenia.
Obrotowy zestaw kolorowych filtrów poniżej stolika mikroskopu jest użyteczny podczas oglądania
jasnych, barwionych preparatów. W osi optycznej należy ustawić odpowiedni rodzaj filtra
uzależniony od obserwowanego obiektu. Kolorowe części obiektu (np. cząsteczki skrobi, pojedyncze
komórki) będą lepiej widoczne (poniższa galeria zdjęć przedstawia komórki cebuli przy zastosowaniu
różnych filtrów).
Aby umożliwić działanie oświetlenia elektrycznego, należy podłączyć kabel zasilający do gniazdka w
mikroskopie oraz do gniazdka zasilającego. Mikroskop jest dostosowany do napięcia zasilającego
220-230V. Następnie należy włączyć przełącznik umieszczony z tyłu mikroskopu i ustawić wymagane
natężenie oświetlenia za pomocą pokrętła regulacyjnego.