PODŁOśA MIKROBIOLOGICZNE podstawowe cechy podłoŜy

PODŁOśA MIKROBIOLOGICZNE podstawowe cechy podłoŜy

PODŁOśA MIKROBIOLOGICZNE
Wzrost mikroorganizmów na uniwersalnym podłoŜu stałym
Escherichia coli i Micrococcus luteus
podstawowe cechy podłoŜy:
• źródło pierwiastków biogennych
• o odpowiednim pH, izotoniczne
• klarowne
• STERYLNE
poŜywka mikrobiologiczna moŜe być:
• uniwersalna
• wybiórcza
• róŜnicująca
• płynna
• półpłynna (0.6% agar-agar)
• stała (2% agar-agar)
MoŜemy odróŜnić te bakterie na uniwersalnym podłoŜu, gdyŜ jedna z nich,
Micrococcus luteus, wytwarza Ŝółty barwnik
Określanie ilości mikroorganizmów –
posiew na podłoŜe stałe
PodłoŜa róŜnicujące – podłoŜe MacConkey’a
Na tym podłoŜu bakterie
fermentujące laktozę (Escherichia
coli) produkują kwasy organiczne,
indykator pH zmienia kolor i
bakterie te rosną w postaci
czerwonych kolonii
Bakterie nie fermentujące laktozy
(Salmonella enteritidis) rozkładają
pepton obecny w podłoŜu bez
zmiany pH i rosną w postaci
Escherichia coli i Salmonella enteritidis
białych kolonii
Trzeba jednak pamiętać, Ŝe
• w skład mikroflory dorosłego człowieka
wchodzi ponad 400 gatunków mikroorganizmów,
z których 60% nie umiemy hodować w laboratorium
hodowla
bakterii
rozcieńczenie
9 ml
bulionu
1 ml próbki na płytki
zbyt duŜo
bakterii do
policzenia
liczba kolonii
Zalety bycia niewielkim
• szybsza wymiana substancji odŜywczych
i szkodliwych produktów metabolizmu
• większe tempo wzrostu
• większe rozmiary populacji
• większa zdolność akumulacji mutacji –
szybsza adaptacja do zmieniającego się środowiska
• w laboratorium umiemy hodować tylko około
5% mikroorganizmów obecnych w środowisku
Istnieje jednak dolna granica wielkości komórki
około 0.2 µm
1
spora
pseudogrzybnia substratowa
UKŁADY KOMÓREK
pseudogrzybnia
powietrzna
przegrody
ze sporami
Przemiana pokoleń –
Myxobacteriae
Przemiana pokoleń –
Streptomyces coelicolor
Przemiana pokoleń – Caulobacter sp.
komórka
ruchliwa
tworzenie ciała
owocowego
myksospory
komórka
osiadła
agregacja
kiełkowanie
głodzenie
Quorum sensing
(wyczuwanie liczebności)
Przemiana pokoleń–
Anabena sp.
Przemiana pokoleń –
Bdelovibrio sp.
• komórki wegetatywne
wiąŜą CO2
dostarczają organiczne
źródło węgla
uwolnienie nowych
komórek potomnych
błona (CM)
CM
CM
CM
przestrzeń
peryplazmatyczna
• heterocysty
wiąŜą N2
dostarczają NH3 jako
glutaminy
zróŜnicowanie komórek
jak u organizmów
wielokomórkowych
2
Lipidy błonowe u bakterii
Budowa komórki prokariotycznej
• kwasy tłuszczowe nierozgałęzione,
• rzadko wielonasycone
• brak steroli, są hopanoidy
błona cytoplazmatyczna
wiązanie estrowe
cholesterol
cytoplazma
i rybosomy
ściana
komórkowa
nukleoid
hopanoid
wiązanie ETEROWE
i archae
Lipidy u archae
• brak kwasów tłuszczowych
• są alkohole poliizoalkilowe,
często rozgałęzione
• czasem obecne sterole
Peptydoglikan (mureina) u bakterii
N-acetyloglukozamina
kw.N-acetylo
muraminowy
(β
β1,4)
dwuwarstwa
dwuetery glicerolu
Tworzy rodzaj siatki
wokół komórki
L-alanina
czteroetery diglicerolu
kw. D-glutaminowy
Archae:
pseudomureina
• wiązanie (β
β1,3)
• brak form D aa
kw. mezo-diamino
pimelinowy
D-alanina
monowarstwa
peptydoglikan
Ściana komórkowa
bakterii gramdodatnich
Struktura i funkcje kwasów tejchojowych
błona cytoplazmatyczna
białka związane ze
ścianą komórkową
• polisacharydy o negatywnym ładunku
kwasy tejchojowe
kwasy
lipotejchojowe
• nadają komórce negatywny ładunek
(ochrona przed toksycznymi
związkami hydrofobowymi)
peptydoglikan
• wiąŜą dwuwartościowe jony
(Ca2+ i Mg2+)
błona
cytoplazmatyczna
3
błona zewnętrzna
peptydoglikan
Ściana komórkowa
bakterii gramujemnych
Lipopolisacharyd (LPS)
błona cytoplazmatyczna
łańcuch O-specyficzny
poryna
rdzeń
lipid A
LPS
błona
zewnętrzna
lipoproteina
przestrzeń
peryplazmatyczna
peptydoglikan
błona
wewnętrzna
Błona zewnętrzna bakterii gramujemnych jest asymetryczna
Barwienie Grama
zalewamy utrwalony preparat fioletem
krystalicznym na 1 minutę
• wewnętrzna warstwa składa się z fosfolipidow
• zewnętrzna warstwa zbudowana jest głównie
z lipopolisacharydu (LPS)
dodajemy płynu Lugola
na 1 minutę
lipopolisacharyd
odbarwiamy
etanolem
fosfolipidy
dobarwiamy fuksyną
przez 30 sekund
fosfolipidy
kierunek ruchu losowy
Escherichia coli (G-) i
Staphylococcus aureus (G+)
Chemotaksja
Zmiana kierunku ruchu – urzęsienie peritrichalne
obrót rzęsek w prawo
„koziołkowanie”
ATRAKTANT
obrót rzęsek w lewo
ruch komórki
obrót rzęsek w lewo
ruch komórki
nowy kierunek ruchu jest przypadkowy
ukierunkowany ruch
• czas ruchu w kierunku atraktanta dłuŜszy
• czas ruchu w kierunku przeciwnym do atraktanta krótszy
4
Synteza rzęski bakteryjnej
Typy urzęsienia
flagelina
Gram +
Powstawanie endospory
Gram -
komórka
wegetatywna
sporulująca
komórka
dojrzała endospora
miejsce
inicjacji
replikacji
Replikacja DNA u Eukaryota - wielopunktowa
Replikacja DNA u Prokaryota –
jednopunktowa (struktura theta)
miejsca inicjacji replikacji
widełki
replikacyjne
nowo
syntezowany DNA
bąbelki replikacyjne
Archae
• niektóre posiadają 2 aktywne
• miejsca inicjacji replikacji
5
Fazy wzrostu populacji bakteryjnej
Podział komórki
bakteryjnej
wzrost – zwiększenie liczby komórek w populacji
• z jednej komórki powstają
dwie identyczne
(jedno pokolenie)
wykładnicza
lag
zamierania
stacjonarna
przegroda
• czas podziału róŜny minimum 20 minut dla
E. coli
gęstość optyczna
liczba Ŝywych
komórek
czas
Hodowla okresowa – fazy wzrostu
• faza lag – czas potrzebny komórkom na adaptację
do nowych warunków środowiska; bardzo wolny wzrost populacji
• faza wykładnicza – większość komórek w populacji dzieli się
dając początek dwóm komórkom; faza najszybszego,
równomiernego wzrostu
• faza stacjonarna – wzrost spowalnia się w miarę wyczerpania
ilości składników odŜywczych i nagromadzenia toksycznych
produktów przemiany materii; niektóre komórki giną, więc ilość
komórek w populacji jest stała
Faza stacjonarna
• najczęściej występuje w środowisku
• komórki znajdują się w odmiennym stanie fizjologicznym
podobnym do stanu komórek rosnących pod postacią
BIOFILMU
(wolne tempo wzrostu, duŜa odporność na niekorzystne warunki
środowiska)
• faza zamierania – wzrost ustaje; coraz więcej komórek
w populacji obumiera
FtsZ – homolog tubuliny
MreB, Mbl, ParM – homologi aktyny
• homologia ok.15% na
poziomie sekwencji
aminokwasów
• podobieństwo struktury
trzeciorzędowej
• homologia 10-18% na poziomie sekwencji aminokwasów
• podobieństwo struktury trzeciorzędowej
• polimeryzacja zaleŜna od GTP
• występuje:
• u większości bakterii i archae
• u eukaryota w plastydach
• w mitochondriach niektórych eukaryota
• polimeryzacja zaleŜna od ATP
• rola:
rozdział DNA plazmidowego i
chromosomowego
determinacja kształtu komórki
6
Wielkość genomu
Eukaryota
• 3 000 kb (2000)
mikrosporidia
• 12 000 (6000)
Saccharomyces cerevisiae
• 3 000 000 kb (30-35 tys)
człowiek
Prokaryota
• 600 kb (500)
Mycoplasma sp.
• 4700 kb (4000)
Escherichia coli
• 8000 kb (8000)
Mezorhizobium loti
• maksymalnie 12 000 kb
ok. 40% OFR o funkcji nieznanej
Mycobacterium tuberculosis
zawartość GC
26%
76%
Mycoplasma sp.
Micrococcus sp.
Ilość róŜnych chromosomów w komórce
•Vibrio sp.
2
•Agrobacterium sp. 3
Borelia burgdorferii
1 chromosom liniowy
5 plazmidów
• 3 liniowe (160-500 kb)
• 2 koliste (270 i 300 kb)
Rhodobacter sphaeroides
chromosom I (3 045 kb)
chromosom II (914 kb)
4 plazmidy po 100 kb
1 plazmid 42 kb
Ilość kopii chromosomu w komórce
•Escherichia coli
maks. 4
•Azotobacter vinelandii 4-40, maks. 80
•Methanococcus sp.
3-15
Eukaryota
1n, 2n do 500 w niektórych tkankach roślin
Chromosom bakteryjny –
kolisty
Chromosom Eukaryota
otwarte koło
superskręcone
u Archae
liniowe:
•Borelia sp.
•Streptomyces sp.
•Agrobacterium sp.
(1 liniowy i 1 kolisty)
•homologi histonów H1, H3 i H4
• tetramery histonowe tworzą nukleosom
białka
superskręcona
domena
• brak „ogonków” histonowych
• występują warianty histonów
Liczenie bakteriofagów
3 drogi wymiany informacji genetycznej u Prokaryota:
• transdukcja – bakteriofagi
wylewamy mieszankę
bakterii i bakteriofaga na plytkę
z poŜywką dla bakterii
• koniugacja – plazmidy koniugacyjne
• transformacja – bezpośrednio ze środowiska
inkubujemy
w cieplarce
przez noc
3% genów wolno Ŝyjących bakterii pochodzi od Archae lub Eukaryota
nawet do 24% genów u bakterii hypertermofilnych pochodzi
od hypertermofilnych Archae
łysinki
na murawie rosnących
bakterii obserwujemy
„łysinki”
7
Cykl lizogenny (infekcja) – bakteriofag λ
Cykl lityczny – bakteriofag T4
cząstka
fagowa
cząstka
fagowa
cykl lityczny
cykl lizogennyy
cząstka
transdukująca
cząstka
transdukująca
homologiczna rekombinacja
integracja faga do
genomu biorcy
integracja DNA do
genomu biorcy
profag
do komórek biorcy przekazywany jest dowolny
fragment genomu dawcy
transdukcja ogólna
podział komórki lizogennej
komórka lizogenna
Cykl lizogenny (indukcja) –
bakteriofag λ
Koniugacja
INDUKCJA
często
rzadko
• część DNA dawcy (czerwony)
wydziela się wraz z DNA faga
• plazmid wolny w cytoplazmie
• plazmid wbudowany w chromosom
• przekazywany DNA plazmidu
tzw. szczepy Hfr
• przekazywany DNA chromosomu
bakterii
• namnaŜanie cząsteczek
transdukujących
• do następnych komórek
przekazywane zawsze te same
fragmenty DNA dawcy
transdukcja specyficzna
Koniugacja
DAWCA
plazmid
• jedna nić DNA plazmidu
nacinana i przekazywana
do biorcy
• komplementarna nić DNA
dosyntezowywana zarówno
u biorcy jak i dawcy
pilus
BIORCA
chromosom
• plazmid wbudowany
w chromosom
tzw. szczepy Hfr
• do dawcy przekazywane są
geny chromosomowe
• geny plazmidowe przechodzą
na końcu
Gen C przekazywany pierwszy CW
• po transferze OBIE komórki
zawierają cząsteczkę plazmidu
Gen L przekazywany pierwszy CCW
Gen X przekazywany pierwszy CW
Gen C przekazywany pierwszy CCW
8
Koniugacyjna mapa chromosomu E.coli
Transformacja
• komórka dawcy DNA obumiera
• DNA uwalniany jest do środowiska
• komórka kompetentna pobiera DNA
do swego wnętrza
geny z jednej komórki są przekazywane
do drugiej bez kontaktu komórek
i bez pośrednictwa wirusów
• nie wszystkie gatunki bakterii mogą
pobierać DNA ze środowiska
• stan kompetencji moŜna wywołać
sztucznie w laboratorium
Quorum sensing – wykrywanie liczebności
Transformacja - Bacillus subtilis
•kompetencja indukowana
przez dwa feromony
9-10 aa oligopeptyd
pentapeptyd
•pobierana jedna nić DNA,
druga degradowana
produkcja
autoinduktora
wykrywanie
autoinduktora
indukcja transkrypcji
wydzielanie efektorów
• enzymów,
• antybiotyków,
• sideroforów
peptydy
laktony homoserynowe
Trends in Microb. (2002) 10: 365
Adaptacja komórek Bacillus sp. do zmiennych warunków środowiska
Prokaryota
Eukaryota
stan represowany
stan wyciszenia
STAN
PODSTAWOWY
NIERESTRYKCYJNY
Pro• promotory silne
• regulacja przez represję
• ruch i chemotaksja
• wydzielanie enzymów degradacyjnych
• wydzielanie antybiotyków
• stan kompetencji, pobieranie DNA
• sporulacja
Eu• promotory słabe
• regulacja przez aktywację
(zmiana struktury chromatyny)
RESTRYKCYJNY
stan przygotowania
stan aktywny
9
Homologiczna rekombinacja a naprawa DNA
Naprawa DNA
przed rozpoczęciem replikacji DNA
• naprawa bezpośrednia (np. fotoreaktywacja)
• wycięcie nukleotydu
• wycięcie odcinka DNA
pojedyncza nić łączy się
z siostrzaną chromatydą
po rozpoczęciu replikacji DNA
• rekombinacja homologiczna
• niehomologiczne łączenie końców
• mismatch
wymiana nici
uszkodzenia DNA często powodują zaburzenie struktury helisy
kompleks polimerazy nie jest w stanie ominąć takiego miejsca i oddysocjowuje
od tak odkształconej matrycy
rozszerzanie się
połączenia
replikacja zostaje wznowiona kilkanascie nukleotydów dalej
– w nowej nici powstają przerwy
Naprawa DNA na drodze
homologicznej rekombinacji
Rola mediatorów
• resekcja końców
usuwanie
białek wiąŜących
jednoniciowy DNA
• tworzenie nukleofilamentu
przez Rad51 (RecA)
• Rhp52
• Rhp55 i Rhp57
• poszukiwanie homologii
• tworzenie pętli D
mediator
rekombinaza
(Rhp51,
RecA)
• synteza DNA
• rozdział produktów
rekombinacji
PNAS (1999) 96: 10684
PNAS (2001) 98: 8419
PNAS (2001) 98: 8411
Gen. Dev. (2004) 18: 602
Naprawa DNA poprzez uszkodzenie - mutagenna
Regulon SOS
represowany
LexA
polV
kompleks UmuD’2C
aktywny
RecA
• naprawa DNA
wycięcie nukleotydów, homologiczna - wierna
poprzez uszkodzenie – mutagenna
• zahamowanie podziałów komórkowych
• apoptoza (kolicyny A, E1)
10
Antybiotyki – mechanizm działania
Antybiotyki – spektrum działania
prątki
Gram -
Gram +
chlamydie
riketsje
hamowanie syntezy
ściany komórkowej
penicylina, wankomycyna
zakłócenie funkcji
błony komórkowej
polimyksyny
ściana komórkowa
błona komórkowa
penicyliny
tobramycyna
sulfonamidy
cefalosporyny
streptomycyna
hamowanie
syntezy
kwasów
nukleinowych
chinolowe
(replikacja)
rifamycyna
(transkrypcja)
hamowanie
syntezy białka
streptomycyna,
erytromycyna,
tetracyklina,
chloramfenikol
tetracykliny
izonazid
polimyksynyny
antymetabolity
sulfonamidy,
trimetoprim
Degradacja polimerów zewnątrzkomórkowa
proteazy – Bacillus, Clostridium, Proteus, Pseudomonas spp.
alkaliczne, neutralne, kwaśne
specyficzne (np. typu reniny) i niespecyficzne
nukleazy
deoksyrybonukleazy – Clostridium sp., Staphylococcus aureus,
hemolityczne paciorkowce
rybonukleazy – Bacillus subtilis, Penicillium citrinum (RNazaP)
lipazy
enzymy degradujące polisacharydy
fermentacje
Rola:
• patogenność
• biotechnologia
enzymy lub produkty ich działania
oddychanie
Fosforylacja oksydacyjna –
róŜnice w potencjale oksydoredukcyjnym
Fosforylacja oksydacyjna – łańcuch oddechowy
• w wyniku transportu elektronow
na łańcuchu oddechowym
i wyrzucaniu H+ na zewnatrz komórki
powstaje potencjał
w poprzek błony
para red-ox
fumaran
bursztynian
• zredukowany NADH zostaje
zregenerowany do NAD+
• ATP powstaje pośrednio,
w wyniku działania ATP-az
błonowych,
wnikanie H+ do
wnętrza komórki
dostarcza energii
11
rozmieszczenie elementów łańcucha
w błonie cytoplazmatycznej
mitochondria
E.coli
Paracoccus
denitryficans
Micrococcus
luteus
ODDYCHANIE AZOTANOWE
(dysymilacyjna redukcja azotanów)
1. denitryfikacja - Bacillus, Pseudomonas spp., Paracoccus denitrificans
glu + 4.8 NO3- + 4.8 H+ → 6 CO2 + 2.4 N2 + 8.4 H2O
Go’ = -2669 kJ (-638 kcal)
dla porównania:
glu + 6O2 → 6 CO2 + 6H2O
Fosforylacja substratowa
• ATP powstaje bezpośrednio,
sprzęŜone jest z utlenianiem substratu
• powstaje zredukowany NADH
Go’ = -2870 kJ (-686 kcal)
część wykorzystywana do biosyntezy
2. Escherichia coli, Klebsiella sp., Staphylococcus sp.
glu + 12 NO3- → 6 CO2 + 12 NO2 - + 6 H2O
Go’ = -1766 kJ (-422 kcal)
część musi być zregenerowana
by odnowić pulę NAD+ do utleniania
następnych cząsteczek substratu
u niektórych mikroorganizmów z tej grupy zachodzi proces:
glu + 3 NO3- + 3 H+ → 6 CO2 + 3 NH3 + 3 H2O
Go’ = -1796 kJ (-429 kcal)
Rozkład glukozy do pirogronianu
HMP
EMP
ED
• brak energizacji błony komórkowej
DEKARBOKSYLACJA PIROGRONIANU
1. Eukaryota, bakterie tlenowe
pirogronian + CoA + NAD+ → acetylo-CoA + NADH + H+ + CO2
(kompleks dehydrogenazy pirogronianu)
2. Archebakterie, bakterie beztlenowe
pirogronian + CoA + 2Fd → acetylo-CoA + 2FdH + CO2
(oksydoreduktaza
pirogronianu)
U Archaebacteriae zamiast ferredoksyny (Fd) występuje koenzym F420.
3. Fermentacja mieszana pałeczek jelitowych
pirogronian + CoA → acetylo-CoA + mrówczan
(liaza pirogronianowa)
4. Fermentacja alkoholowa droŜdŜy i Zygomonas sp.
pirogronian → acetaldehyd + CO2
(dekarboksylaza pirogronianu)
5. Bacillus sp., Enterobacteriaceae
2 cz. pirogronianu → acetomleczam + CO2
(syntaza acetomleczanu)
12
Homofermentacja mlekowa
Znaczenia słowa FERMENTACJA
1. KaŜdy proces, tlenowy lub beztlenowy, w którym na duŜą skalę
wykorzystuje się hodowlę mikroorganizmów.
2. KaŜdy proces biologiczny zachodzący pod nieobecność tlenu.
3. Psucie się poŜywienia.
4. Produkcja napojów alkoholowych.
5. UŜywanie organicznego substratu jako dawcy i akceptora elektronów.
6. UŜywanie organicznego substratu jako czynnika redukującego i tego
samego, częściowo rozłoŜonego organicznego substratu jako czynnika
utleniającego (akceptora elektronów).
7. Wzrost zaleŜny od fosforylacji na poziomie substratu.
FERMENTACJA MLEKOWA
Udział mikroorganizmów w przetwarzaniu mleka
homofermentacja
kefir
Lactococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Saccharomyces spp.
jogurt
Streptococcus thermophilus, L.bulgaricus
masło
Lactococcus diacetylactis, Leuconostoc cremoris
glukoza → 2 cz. mleczanu
(Lactobacillus lactis, L.delbrueckii, L. bulgaricus, L.casei,
Streptococcus faecalis, S.cremoris, S.lactis, Pediococcus damnosus)
sery
heterofermentacja
glukoza → mleczan + etanol + CO2
(Lactobacillus brevis, L.fermentum, Leuconostoc mesenteroides,
L.dextranicum)
szlak bifidum
Roquefort
L.lactis, L.cremoris, Penicillium roqueforti
Camembert
L.lactis, L.cremoris, Penicillium camamberti,
Gouda
L.lactis, L.diacetylactis, L.cremoris
Ementaler
S. thermophilus, L.lactis, Propionibacterium shermani
Brevibacterium linens
2 glukoza → 3 cz. octanu + 2 cz. mleczanu
(Bifidobacterium bifidum)
L.helveticus, P.freudenreichii
Fermentacja alkoholowa
ENTEROBACTERIACEAE
dekarboksylaza
pirogronian/aldehyd octowy
rzadka u bakterii
Escherichia coli
Salmonella sp.
Shigella sp.
komensal przewodu pokarmowego ssaków
Enterobacter sp.
Serratia sp.
Proteus sp.
Erwinia sp.
występują w glebie i wodzie
Yersinia sp.
patogeny człowieka
Vibrio sp.
Aeromonas sp.
Photobacterium sp.
występują w wodzie, niektóre patogenne
patogeny człowieka
patogeny roślin
13
Fermentacja mieszana produkty kwaśne
Fermentacja mieszana produkty obojętne
Fermentacja masłowa
IMViC
+
+
-
-
-
-
+
+
Fermentacja masłowa
Toksyczność tlenu
wynika z obecności w komórce :
CO2
enzymów flawinowych
oksydaz (np. oksydaza NADPH)
barwników uczulających na światło (np. chlorofil, cytochromy)
H2
ATP
etanol
octan
CO2
ATP
funkcję ochronna pełnią:
dysmutazy ponadtlenkowe
katalazy
karotenoidy
O2- + 2H+ → H2O2
2H2O2 → 2H2O + O2
aceton
maślan
butanol
14
Enegrizacja błony.
Metabolity prekursorowe
• hydroliza ATP
• dekarboksylacje sprzęŜone
z transkolacją Na+
12
• symport z produktem fermentacji
REAKCJE ANAPLEUROTYCZNE
glukoza
Cykl glioksalowy
1. karboksylaza PEP
PEP + HCO3- → szczawiooctan + Pi
(pałeczki jelitowe, Bacillus anthracis, Acetobacter xylinum, Azotobacter vinelandii)
2. karboksylaza pirogronianu
pirogronian + HCO3- + ATP → szczawiooctan + ADP + Pi
(enzym obecny u ssaków i bakterii, zawiera biotynę)
pirogronian, jabłczan
1. karboksykinaza PEP
szczawiooctan + ATP → PEP + ADP + CO2
2. syntetaza PEP
pirogronian + ATP → PEP + AMP + Pi
3. enzym jabłczanowy
jabłczan + NAD+ (NADP+) → pirogronian + NADH (NADPH) + H+ + CO2
octan
1. karboksykinaza PEP
szczawiooctan + ATP → PEP + ADP + CO2
2. cykl glioksalowy
Rozkład związków aromatycznych
wszystkie związki przekształcane do dwóch kluczowych struktur
• aktywacja pierścienia przez wprowadzenie grup hydroksylowych –
powstaje katechol lub protokatechol
• rozerwanie pierścienia w pozycji ORTO lub META –
udział dioksygenazy
• przekształcenie alifatycznych produktów pośrednich
i włączenie ich do metabolizmu centralnego
Bezwzględne tlenowce
(Pseudomonas sp., Rhizobium sp., Azotobacter sp., Agrobacterium sp.,
Caulobacter sp., Spiryllum sp.,
bakterie octowe – Acetobacter sp., Gluconobacter sp.)
OH
OH
OH
OH
protokatecholan
katechol
15
dioksygenaza
ORTO
Rozkład węglowodorów
O2
O2
• metan – metanotrofy
O2
• do C8 – niewiele bakterii (Nocardia sp., Mycobacterium sp.)
specjalna struktura ściany komórkowej
O2
• C10-C18 – wiele mikroorganizmów
(Pseudomonas sp., Nocardia sp., Mycobacterium sp.,
Corynebacrium sp., droŜdŜe np. Candida sp., Torulopsis sp. )
META
metylotrofy
monooksygenaza
CH4 + NADH + H+ + O2 → CH3OH + NAD+ + H2O
monooksygenaza
oksydacja terminalna
CH3OH + PQQ → CH2O + PQQH2
dehydrogenaza
CH2O + NAD+ + H2O → HCOOH + NADH + H+
HCOOH + NAD+ → CO2 + NADH + H+
O2
O2
PQQ
u droŜdŜy brak PQQ
CH3OH + O2 → CH2O + H2O2
oksydaza
O2
2 H2 O2 → 2 H2 O + O2
katalaza
CH2O punktem wyjścia do biosyntezy
oksydacja subterminalna
3 drogi asymilacji aldehydu mrówkowego (CH2O)
• cykl serynowy
CH2O + CO2
→ acetyloCoA
3 drogi asymilacji aldehydu mrówkowego (CH2O)
• cykl rybulozomonofosforanu
→ fruktozo-6-fosforan
• cykl ksylulozomonofosforanu
→ dihydroksyaceton
tylko u droŜdŜy
16
Niepełne utlenianieprodukcja acetoiny i butandiolu
Niepełne utlenianie substratu – bakterie octowe
Acetobacter sp.
Gluconobacter sp.
Bacillus spp.
Oddychanie beztlenowe
Oddychanie beztlenowe – dysymilacyjna redukcja siarczanów
brak akceptora elektronów – uwalnianie H2
oddychanie azotanowe lub fumaranowe
5H2 + 2NO3- + 2H+ → N2 + 6H2O
mrówczan + fumaran → bursztynian + CO2
H2 + fumaran → bursztynian
H2
dawcą energii
3 grupy mikroorganizmów
oddychanie
Rozmieszczenie elementów łańcucha oddechowego w błonie
• niepełne utlenianie substratu
Desulfovibrio sp. (gram-), Desulfotomaculum sp. (gram+)
niepełne
utlenienie substratu
Desulfovibrio sp.
• pełne utlenianie substratu
zmodyfikowany CKTK
Desulfobacter sp. (gram-)
oksydatywnej dehydrogenazy CO
Desulfobacterium sp. (gram-), Desulfotomaculum sp. (gram+)
Arechaeglobus sp. (Archae)
jako źródło węgla mogą słuŜyć:
cukry
aminokwasy
alkohole
kw. organiczne
zw. aromatyczne
węglowodory (C12-C20)
tlen włączany do cząsteczki substratu pochodzi z H2O hydroksylazy nie będące oksydazami
biosynteza
(asymilacjyjna redukcja siarczanów)
mleczan pirogronian
octan
mleczan + SO42- + 8H+ → octan + CO2 + H2S
17
Pełne utlenianie substratu – oksydatywna dehydrogenaza CO
Pełne utlenianie substratu – zmodyfikowany CKTK
• dehydrogenaza
kw. α-ketoglutarowego
zaleŜna od Fd a nie NAD+
• dehydrogenaza jabłczanu
niezaleŜna od NAD+,
związana z błoną
• liaza a nie syntaza cytrynianu,
CoA przenoszone na octan
z bursztynylo-CoA,
powstaje ATP
Desulfobacterium sp.
Desulfotomaculun sp.
Desulfobacter sp.
Arechaeglobus sp. (Archae)
(inne koenzymy)
Bakterie homoacetogenne – oddychanie węglanowe
CO2 jako końcowy akceptor elektronów:
oddychanie węglanowe
fruktoza → 3 cz. octanu
4H2 +2CO2 → octan- +2H2O + H+
redukcyjna dehydrogenaza CO
CO2
dwie grupy organizmów:
CO2
acetogeny - redukcja CO2 do octanu
H2
dawcą energii
CO2
akceptorem
elektronów
dawcy elektronów:
• głównie H2
• cukry, kwasy organiczne, aa, alkohole
metanogeny -redukcja CO2 do metanu
Clostridium aceticum, Acetobacterium woodi
Szlak redukcyjnej dehydrogenazy CO
4H2 +2CO2 →
CO2
formylo-
Bakterie metanogennne (Archae)
octan-
+ 2H2O +
H+
4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O
Methanobacterium thermoautotrophicum
CO2 akceptorem elektronów – oddychanie węglanowe
H2 dawcą energii
metylo-
metylo-
CH3COOH → CH4 + CO2
Methanosarcina sp. Methanothrix sp.
3CH3OH → 3CH4 + CO2 + 2H2O
4(CH3)3N + 6H2O → 9CH4 + 3CO2 + 4NH3
Methanolobus sp., Methanococcoides sp.
Methanosarcina barkeri - modelowy organizm
ograniczona ilość substratów dla metanogenezy
OCTAN
acetylo-
18
Metanogeneza z octanu
Metanogeneza z CO2
OCTAN
CO2
formylo-
biosynteza
metyleno-
metylo-
METAN
METAN
CHEMOLITOTROFY
Typy troficzne – źródła energii
• bakterie wodorowe
H2 + 0.5O2 → H2O
Nocardia, Alcaligenes, Pseudomonas spp.
5H2 + 2NO3- + 2H+ → N2 + 6H2O
Paracoccus denitryficans
4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O
Methanobacterium sp.
4H2 +2CO2 → octan- + 2H2O + H+
Clostridium aceticum, Acetobacterium woodi
• bakterie siarkowe
S2- + 2O2 → SO42-
Beggiatoa, Thiothrix spp.
S0 + 1.5O2 + H2O → SO42- + 2H+
Thiobacillus, Sulfolobus spp.
S2O32- + 2O2 + H2O → 2SO42- + 2H+
Thiobacillus thiooxidans
5S2O32- + 8NO3- + H2O → 10SO42- + 2H+ +4N2 Thiobacillus denitryficans
• bakterie Ŝelazowe
2Fe2+ + 2H+ + 0.5O2 → 2Fe3+ + H2O Gallionella sp., Thiobacillus ferroxidans
• bakterie nitryfikacyjne
utleniające amoniak
NH4+ + 1.5O2 → NO2- + H2O + 2H+
Typy troficzne – źródła węgla
CO2 – autotrofy
Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus spp.
utleniające azotyny
zwiazki organiczne - heterotrofy
Odwrotny transport elektronów
potencjał dawcy elektronów nie jest dostatecznie
ujemny by zapewnić redukcję NAD+ (wyjątek H2)
NO2- + 0.5O2 → NO3-
Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus spp.
Odwrotny transport elektronów –
bakterie siarkowe
bakterie nitryfikacyjne
siła redukcyjna
odwrotny transport
ATP
Figure 20.27b
wiele z nich to autotrofy – bardzo wolny wzrost
19
Obligatoryjna autotrofia
Fosforylacja cykliczna – bakterie purpurowe
CO2
CO2
odwrotny transport
elektronów
zewnętrzne źródło
elektronów, np. H2S
brak dehydrogenazy kw. α-ketoglutarowego
Fosforylacja cykliczna – bakterie zielone
bakterie purpurowe
bakterie zielone
Fotoasymilacja związków organicznych przez bakterie purpurowe
octan
2nCH3COOH + 2nH+ → (C4H6O2)n + 2nH2O
CH3COOH + H2O → 2CO2 + 8H+
(CKTK - źródło siły redukcyjnej)
razem:
9nCH3COOH → 4 (C4H6O2)n + 2CO2 + 6nH2O
maślan
2nC4H8O2 + nCO2 → 2 (C4H6O2)n + (CH2O)n + nH2O
związki aromatyczne
Wiązanie CO2 – cykl Calvina
Wiązanie CO2 – redukcyjny CKTK
materiał komórkowy
• wiązanie CO2
5 ATP na fosfotriozę
• redukcja CO2
• regeneracja akceptora CO2
cykl Calvina- 9ATP na jedną fosfotriozę
bakterie zielone (Chlorobiaceae),
niektóre redukujące siarczany
20
Wiązanie CO2 – szlak redukcyjnej dehydrogenazy CO
Dodatkowe karboksylacje
1. karboksylaza PEP
CO2
PEP + CO2 → szczawiooctan + Pi
formylo-
(pałeczki jelitowe, Bacillus sp.)
metylo-
metylo-
2. karboksylaza pirogronianu
pirogronian + CO2 + ATP → szczawiooctan + ADP + Pi
(Pseudomonas sp., Bacillus sp.)
3. cykl glioksalowy
fosfotrioza
4. acetylo-CoA + CO2 + FdH2 → pirogronian + Fd + CoA
3ATP
acetylo-CoA
metanogeny, acetogeny, niektóre redukujące siarczany
3 ATP na fosfotriozę
polimery
(polisacharydy,białka)
Fermentacje II rzędu
1. 3 mleczan → 2 kw. propionowy + octan + CO2
(Propionibacterium sp., Clostridium sp.)
hydroliza
monomery
(cukry, aminokwasy)
2. etanol + H2O → octan + 2H2
Go’ = +9.6 kJ
fermentacja I
propionian, maślan,
bursztynian, alkohole
octan
H2+CO2
UmoŜliwiają wzrost na octanie, u niektórych (np. Clostridium sp.)
aŜ 30% węgla komórkowego pochodzi z CO2
acetogeneza
fermentacja II
octan
H2+CO2
octan
metanogeneza
3. kw. masłowy + 2H2O → 2octan + 2H2
Go’ = +48.1 kJ
(Syntrophomonas wolfei)
4. kw. propionowy + 3H2O → octan + + CO2 + 3H2
Go’ = +76.1 kJ
(Syntrophobacter wolfinii)
syntropia
międzygatunkowe przekazywanie wodoru
CH4+CO2
przełyk
Główne grupy
mikroorganizmów
1010 –
1011
Układ pokarmowy
układ moczowy
Escherichia coli, Proteus mirabilis – patogeny oportunistyczne
(zmiana pH, spadek oporności)
kom./g
układ płciowy
Enterococcus faecalis,
pałeczki jelitowe
Bacteroides sp.
Bifidobacterium sp.
Peptococcus sp.
Peptostreptococcus sp.
Ruminococcus sp.
Closrtidium sp.
Streptococcus sp.
Staphylococcus sp.
Lactobacillus sp.
Lactobacillus sp.
Enterococcus sp.
niskie pH utrzymywane przez Lactobacillus acidophilus
inne organizmy to:
Escherichia coli,
Streptococcus sp.
droŜdŜaki:
Candida i Torulopsis spp.
odbyt
21
OBECNOŚĆ
patogenów
Czynniki adhezyjne:
glycocalyx
enterotoksyczna Escherichia coli (ETEC)
Streptococcus mutans
białka adhezyjne
Streptococcus pyogenes
Neiseria gonorrhoeae
ADHEZJA
WZROST i KOLONIZACJA
lokalna
TOKSYCZNOŚĆ
efekt lokalny
lub systemowy
INWAZYJNOŚĆ
wzrost lokalny lub
w miejscach oddalonych
białkoM
białko Opa
kwas lipotejchojowy Streptococcus pyogenes
fimbrie (pili)
Neiseria gonorrhoeae
enterotoksyczna Escherichia coli (ETEC)
USZKODZENIE TKANEK
CHOROBA
Neutrofil – fagocytoza komórek bakteryjnych
Wnikanie do wnętrza komórki
• namnaŜanie się, wzrost, wywoływanie choroby ściśle związane
z inwazją cytoplazmy komórek gospodarza
riketsie, chlamydie – pasoŜyty wewnątrzkomórkowe
lizosomy
cytoplazma
pseudopodium
trawienie
• ucieczka przed układem immunologicznym,
moŜliwość rozprzestrzeniania się po całym organizmie
Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae,
Shigella sp., Salmonella sp., patogenne szczepy Escherichia coli
fagolizosom
wchłanianie
fagosom
bakterie
wydzielanie
adhezja
błona
cytoplazmatyczna
Unikanie fagocytozy
1. repelenty, toksyny –
brak chemotaksji
Inwazja przez wymuszoną fagocytozę – Shigella sp.
2. otoczki, śluzy, biofilm –
brak adhezji i pochłaniania
komórka M
3. blokowanie fuzji lizosomów
z fagosomem
komórka
nabłonka
jelita
4. wydzielanie katalazy
5. nieprzepuszczalne osłony
komórkowe
aktynaruch
6. blokowanie odpowiedzi makrofagów
na czynniki stymulujące
7. utrata zdolności do prezentacji
antygenów
makrofag
8. ucieczka patogenu z fagosomu
22
IgA
Dopełniacz
toksyny
neutralizacja
fagocytoza
opsonizacja
fagocytoza
komplement
bakterie
liza
fagocyt
fagocyt
bakterie
chemotaksja
opsonizacja
opsonizacja
wiązanie
IgG
bakterie między
komórkami
IgM
bakterie w
plazmie
autotransportery
I
II
przeciwciała
III
dopełniacz
i przeciwciała
liza i
fagocytoza
Systemy sekrecyjne dla toksyn bakteryjnych
typ systemu
sekrecyjnego
dopełniacz
kompleksy
immunologiczne
IV
przykładowe toksyny
IgA proteaza
hemaglutynina
N.gonorrhoeae
Bor. pertusis
α-hemolizyna
cyklaza adenylowa
proteaza
pullulanaza
elastaza, fosfolipaza
E.coli
Bor. pertusis
Ps. aeruginosa
Klebsiella oxytoca
Ps. aeruginosa
Yersinia sp.
białka Yop
białka Ipa
Shigella sp.
toksyna Bor. pertusis (PT),
Legionella sp., Helicobacter sp.
Autotransportery
Typ I
peryplazma
peryplazma
cytoplazma
23
komórka
eukariotyczna
Typ II
Typ III
pili typu IV
rzęska
Podział toksyn bakteryjnych
do komórki
eukariotycznej
Typ IV
endotoksyny
• składniki LPS, głównie lipid A
• bardzo podobne, działają w taki sam sposób,
objawy ogólne (gorączka, wymioty, biegunka)
• ciepłostałe
• mało toksyczne LD50 300 mikrogramów
egzotoksyny
• białka, wydzielane do środowiska przez bakterie G+ i G• bardzo róŜnorodna grupa, specyficzne działanie (niepyrogenne)
• ciepłochwiejne (są wyjątki np. toksyna S.aureus)
• bardzo toksyczne LD50 25 pikogramów (botulina)
Curr Op Cell Biol (2000) 12:420
Podział toksyn bakteryjnych
neurotoksyny
zakłócają normalne przekazywanie impulsów nerwowych
Clostridium tetani, Clostridium botulinum
cytotoksyny
zabijają komórki gospodarza
Corynebacterium diphteriae – hamuje elongację białka
Streptococcus pyogenes – uszkadza błonę lizosomów
enterotoksyny
stymulują komórki układu pokarmowego do wydzielania wody
i elektrolitów do światła jelita
Vibrio cholerae, Escherichia coli,
Shigella dysenteriae (hamuje syntezę białka w kom. nabłonka jelita)
Bakterie chorobotwórcze
Staphylococcus aureus
• obecny na skórze i w nosogardzieli
• powoduje zatrucia pokarmowe (50% szczepów produkuje
enterotoksynę)
• choroby związane z produkcją ropy (zapalenia skóry, wrzody)
• produkuje kolagenazę oraz cytotoksyny (hemolizyna, leukocydyna)
Diplococcus pneumoniae
• typowa flora górnych dróg oddechowych
• powoduje zapalenie płuc, opon mózgowych, ucha środkowego
• 30% śmiertelność, duŜy naciek limfocytów, cytokin,
zapalenie systemowe, uszkodzenie tkanek gospodarza
• oporność warunkowana przez przeciwciała przeciwko
cukrowej otoczce – duŜa zmienność patogenu
24
Streptococcus pyogenes
• rzadko występuje u zdrowych ludzi
• powoduje ropne zapalenie gardła oraz zapalenie skóry
• produkuje cytotoksyny (β
β-hemoliza) oraz enzymy (nukleazy,
lipazy, proteazy)
• białka powierzchniowe A i M to tzw. superantygeny
• liczne powikłania (zapalenie kłębuszków nerkowych,
reumatyczne zapalenie mięśnia sercowego) spowodowane
osadzaniem się w tkankach kompleksów immunologicznych
Corynebacterium difteriae – transformacja lizogenna
Corynebacterium difteriae
• powoduje infekcje gardła, nekrozę komórek epitelialnych,
toksyna ma efekt systemowy (serce, układ nerwoway, nerki)
• produkuje toksynę dyfterytu (hamuje syntezę białka)
Helicobacter pylori
• bardzo często występuje u zdrowych ludzi
• powoduje powstawanie wrzodów oraz nowotworów Ŝołądka
• czynniki wirulencji: system sekrecyjny IV oraz cytotoksynę
indukującą procesy zapalne i apoptotyczne w komórkach
Bacillus anthracis
• powoduje wąglik, tzw. zoonozę, chorobę odzwierzęcą
• powoduje skórne i płucne infekcje, obrzęki, nekroza tkanek,
wysoka śmiertelność
• czynniki wirulecji: otoczka uniemoŜliwiająca fagocytozę,
wytwarzanie egzotoksyn (zaburzenie równowagi jonowej,
zakłócenie przekazywania sygnałów w obrębie układu
immunologicznego)
W.J.H. Kunicki – Goldfinger śycie Bakterii PWN 1998
Porównanie cech Bacteria, Archaea i Eukarya
cecha
Bacteria
Archaea
Eukarya
komórka prokariotyczna
tak
tak
nie
DNA w postaci CCC
tak
tak
nie
białka histonowe
nie
tak
tak
ściana komórkowa
mureina
róŜny skład
róŜny skład
lipidy błonowe
estry
etery
estry
rybosomy
70S
70S
80S
inicjacyjny tRNA
f-Met
Met
Met
introny
nie
tak
tak
operony
tak
tak
nie
polimeraza RNA
jedna (4podj)
kilka (8-12
podj. kaŜda)
trzy (12-14
podj. kaŜda)
czynniki transkrypcyjne
nie
tak
tak
promotory
-10 i -35
TATA
TATA
Porównanie cech Bacteria, Archaea i Eukarya
cecha
Bacteria
Archaea
Eukarya
metanogeneza
nie
tak
nie
redukcja So do H2S
tak
tak
nie
nitryfikacja
tak
nie
nie
denitryfikacja
tak
tak
nie
dysymilacyjna redukcja
siarczanów
tak
tak
nie
fotosynteza (chlorofil)
tak
nie
tak
(chloroplasty)
wiązanie azotu
tak
tak
nie
chemolitotrofia
tak
tak
nie
wzrost powyŜej 80oC
tak
tak
nie
Nature (1998) 392: 38
The hydrogen hypothesis for the first eukaryote
William Martin, Miklos Muller
25