Badanie porównawcze “In-vitro” stabilności i dezintegracji

Badanie porównawcze “In-vitro” stabilności
i dezintegracji kapsułek wykonanych
w technologii MURE (Multi Resistant Encapsulation)
z innymi kapsułkami zawierającymi probiotyki,
w warunkach symulujących środowisko żołądka.
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
FAO/WHO, 2002 Guidelines for the evaluation of probiotics in food. World Health Organization, Geneva, Switzerland.
A. Lillie and A.K. Johansen, 1990, Disintegration and in- vitro acid stability tests on nine lactic acid bacteria preparations. XXIII, Nordic Gastroenterology Meeting
in Reykjavik, Iceland
L. Corneliussen, R. Skov and F. Espersen, 1999, Effect of low pH on survival of lactic producing bacteria in oral formulation. The 9th European Congress
of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Berlin, Germany
Sorensen et al, 2010. Report: Enumeration of probiotics microorganisms exposed to acidic condition.
European Pharmacopoeia 6.0 Vol. 1.:718;2.9,1:263
Finegold,S. M. Sutter, V. L, Mathisen, G. E. 1983 Normal indigenous intestinal flora. In: Human Intestinal Microflora in Health and Disease pp. 3-31 Academic press,
London, UK
Badanie porównawcze “In-vitro” stabilności i dezintegracji kapsułek wykonanych
w technologii MURE (Multi Resistant Encapsulation) z innymi kapsułkami
zawierającymi probiotyki, w warunkach symulujących środowisko żołądka.
Dr hab. med. Jacek Piątek
Katedra Fizjologii Człowieka Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu.
Wykaz stosowanych skrótów
Cel badań
CFU:
LAB:
MURE:
Celem badań było sprawdzenie przeżywalności bakterii,
kilku powszechnie dostępnych na rynku preparatów probiotyków, w warunkach symulujących środowisko soku żołądkowego,
w zależności od technologii ich produkcji.
Colony Forming Units
Lactic Acid Bacteria
Multi Resistant Encapsulation
Streszczenie
Zbadano kilka dostępnych na rynku probiotyków, łącznie
z preparatem MULTILAC® posiadającym kapsułkę wykonaną
w technologii MURE. Badanie miało na celu zbadanie przeżywalności mikroorganizmów w warunkach symulujących środowisko
soku żołądkowego w zależności od technologii wykorzystywanych
przy ich produkcji.
W tym celu inkubowano dostępne na rynku preparaty probiotyków w roztworze o pH 1.2 przez godzinę. Następnie metodami mikrobiologicznymi oceniano ilość żywych bakterii po
zakończeniu eksperymentu. Badania przeprowadzono zgodnie
z zaleceniami i standardami Farmakopei Europejskiej.
Otrzymane wyniki badan in-vitro wykazały, że największą efektywność w ochronie bakterii przed destrukcyjnym wpływem niskiego pH mają kapsułki wykonane w technologii MURE zastosowane
w preparacie MULTILAC®.
Materiał i metodyka
W przeprowadzonych badaniach stworzono model eksperymentu naśladujący „in-vitro” warunki kwasowe panujące
w świetle żołądka. W warunkach tych (roztwór o pH-1.2 odpowiadający kwasowości soku żołądkowego) zbadano przeżywalność szczepów bakteryjnych znajdujących się w różnych produktach rynkowych po godzinnej inkubacji.
Tabela 1.
Próbki probiotyków użyte do badań
Probiotyk
Liczba szczepów
probiotycznych
MULTILAC ® - 9 szczepów
w kapsułce (technologia MURE)
Lactobacillus - 4 szczepy
Bifidobacterium - 3 szczepy
Lactococcus - 1 szczep
Streptococcus - 1 szczep
Wstęp
Produkt B - 3 szczepy bez kapsułki
Lactobacillus - 3 szczepy
Według ogólnie przyjętej definicji probiotyki są żywymi mikroorganizmami, których podanie w odpowiedniej dawce wpływa pozytywnie na zdrowie gospodarza (1).
Preparaty te mają postać leków doustnych. Po ich zażyciu probiotyki, podobnie jak wszystkie inne pokarmy, poddawane są
działaniu kwasu solnego znajdującego się w żołądku. Przeciętny
czas ekspozycji pokarmu (w tym leków) na działanie soku żołądkowego wynosi około 60 min. W czasie tym rozpoczynają się
procesy trawienia jak i dezynfekcji pokarmu.
Dotychczasowe badania wykazały, że tylko nieliczne preparaty
dostępne na rynku były stabilne i odporne na działanie kwasu
solnego w czasie 60 min ekspozycji (2, 3).
W przypadku probiotyków działanie kwasu solnego na mikroorganizmy znajdujące się w nich jest zjawiskiem niekorzystnym, zmniejszającym ich przeżywalność. W celu ochrony szczepów bakteryjnych znajdujących się w preparatach probiotyków,
przed destrukcyjnym działaniem kwasu solnego i innych czynników trawiennych, wprowadzono różnego rodzaju technologie.
Leki probiotyczne, zawierające przede wszystkim bakterie
produkujące kwas mlekowy, podawane są w formie doustnej,
jako czynniki poprawiające zdrowie poprzez kolonizację jelita.
Zasadnicze znaczenie dla prawidłowej kolonizacji jelita przez
probiotyki ma ich pasaż przez ekstremalnie niekorzystne dla żywych bakterii kwaśne środowisko żołądka.
Produkt C - 3 szczepy w kapsułce
Lactobacillus - 2 szczepy
Bifidobacterium - 1 szczep
Produkt D - 2 szczepy w kapsułce
Lactobacillus - 2 szczepy
Produkt E - 4 szczepy w kapsułce
Lactobacillus - 3 szczepy
Bifidobacterium - 1 szczep
Badania przeprowadzono zgodnie z metodyką opisaną w „Enumeration of probiotic microorganisms exposed to acid conditions” (4).
Badanie ilości bakterii LAB przed ekspozycją na działanie kwasu
solnego.
W pierwszej fazie badań obliczono średnią ilość LAB znajdującą się w kapsułkach. W tym celu dokonano homogenizacji jednej
do dziesięciu kapsułek z probiotykiem i metodami mikrobiologicznymi obliczono średnią zawartość mikroorganizmów żywych znajdujących się w jednej kapsułce.
Następnie kapsułki zawierające probiotyki inkubowano
w 0.1 M HCl przy pH 1.2 przez 60 min. Po zakończeniu inkubacji kapsułki przenoszono do buforu fosforanowego o pH 6.8 do
całkowitego rozpadu kapsułek, ale nie dłużej niż 60 minut. Całe
badanie przeprowadzane było w temperaturze 37˚C (5). Wyniki
przedstawiono jako średnią arytmetyczną z trzech oznaczeń.
2
Wyniki
Liczba bakterii LAB przed i po godzinnej ekspozycji
na działanie 0.1 M kwasu solnego o pH 1.2
Tabela 2. Redukcja CFU/ kapsułkę:
Produkt
Początkowe
CFU/kapsułkę
CFU po ekspozycji na
HCL/kapsułkę
MULTILAC®
4,9 x 109
3,9 x 109
Produkt B
7,3 x 108
2,9 x 102
Produkt C
4,8 x 10
8
7,6 x 106
Produkt D
3,8 x 109
1,5 x 107
Produkt E
7,6 x 108
1,2 x 106
(technologia MURE)
Table 3. Redukcja CFU/ kapsułkę w skali logarytmicznej
Produkt
Początkowe
Log CFU/
kapsułkę
Log CFU po
ekspozycji na
HCL/kapsułkę
Redukcja
Log
MULTILAC®
9,69
9,59
0,1
Produkt B
8,86
2,46
6,4
Produkt C
8,68
6,88
1,8
Produkt D
9,58
7,18
2,4
Produkt E
8,88
6,08
2,8
(technologia MURE)
Rysunek 1.
Porównanie w skali logarytmicznej spadku ilości żywych bakterii
LAB w kapsułkach wykonanych w technologii MURE z czterema
innymi probiotykami dostępnymi na rynku po 1 godzinnej ekspozycji na działanie 0.1 M roztworu HCl o pH – 1.2
Początkowe Log CFU/kapsułkę
Log CFU po ekspozycji HCL/kapsułkę
10
9
8
7
6
5
4
Jelito grube jest najbardziej skolonizowaną przez bakterie częścią przewodu pokarmowego. Zawiera ono do
1012 żywych mikroorganizmów na 1 gram treści jelitowej. Bakterie przewodu pokarmowego stanowią złożony ekosystem
mający ogromny wpływ na gospodarza. W procesach metabolicznych bakterii przewodu pokarmowego mogą powstawać
substancje wpływające zarówno pozytywnie, jak i negatywnie
na człowieka (6). Warunkiem, który powinny spełniać probiotyki
podawane doustnie jest to, aby dostały się do jelita w postaci
żywych kolonii bakteryjnych. Środowisko żołądka jest ekstremalnie zakwaszone i stanowi istotną barierę, którą muszą pokonać
substancje podawane z zewnątrz. W celu ochrony probiotyków,
przed destrukcyjnym wpływem kwasu solnego treści żołądkowej,
stosowane są rożnego rodzaju kapsułki ochronne.
Opierając się na otrzymanych wynikach badań należy jednoznacznie stwierdzić, że ekspozycja szczepów bakteryjnych na
działanie niskiego pH ma istotny wpływ na ich przeżywalność.
Dotyczy to zwłaszcza mikroorganizmów przebywających w środowisku zbliżonym do środowiska kwasu solnego w żołądku
człowieka, a nie posiadających dodatkowej ochrony. Otrzymane
powyżej wyniki wykazały jednoznacznie, że przeżywalność bakterii w kwaśnym środowisku była najniższa w przypadku braku
dodatkowej ochrony.
Należy zwrócić uwagę, że przeżywalność mikroorganizmów
w trakcie eksperymentu uzależniona była również od rodzaju
kapsułek użytych do ich ochrony w różnych preparatach handlowych. Najbardziej efektywna w ochronie bakterii przed destrukcyjnym działaniem kwasu solnego w czasie 1-no godzinnej
inkubacji jest technologia MURE zastosowana przy produkcji preparatu pod nazwą handlową MULTILAC®. Wyniki badań przedstawione w tabeli 2 jednoznacznie wskazują, że przeżywalność
szczepów bakteryjnych w kapsułkach wykonanych w technologii
MURE jest znacznie wyższa w porównaniu do przeżywalności
bakterii tego samego preparatu bez kapsułek. Otrzymane wyniki wykazały również lepszą przeżywalność mikroorganizmów
zawartych w preparacie MULTILAC®, w stosunku do innych preparatów handlowych.
Wnioski
3
2
1
0
Chodzi tu o sytuację, gdzie celowo chcemy wprowadzić do organizmu człowieka substancje mające korzystny wpływ na nasze
zdrowie, a które mogą ulec dezintegracji w tych warunkach.
Typowym tego przykładem jest doustne podawanie probiotyków.
W optymalnych warunkach żywe mikroorganizmy znajdujące się
w probiotykach powinny „przejść” nienaruszone przez żołądek,
aby móc zasiedlić się w obrębie jelita cienkiego.
MULTILAC®
(technologia MURE )
Produkt B
Produkt C
Produkt D
Produkt E
Dyskusja
Jak doskonale wiemy pokarmy, w tym również leki przyjmowane doustnie, dostają się drogą przewodu pokarmowego do
żołądka, gdzie podlegają działaniu soku żołądkowego. Głównym
składnikiem soku żołądkowego jest kwas solny o pH około 1.2.
Przeciętnie, przy prawidłowej motoryce, ekspozycja zawartości
żołądka na znajdujący się w nim kwas solny wynosi około 60 min.
Jest rzeczą oczywistą, że te ekstremalne warunki mają ogromny
wpływ na wszystkie składniki pokarmu dostającego się do przewodu
pokarmowego. Z jednej strony jest to wpływ korzystny – rozpoczyna się tu proces trawienia i dezynfekcji pokarmu. W pewnych sytuacjach procesy te są jednak niekorzystne dla naszego organizmu.
Otrzymane wyniki badań wykazały bezspornie, że po inkubacji w środowisku o niskim pH, analogicznym do środowiska
soku żołądkowego, dochodzi do znacznego zmniejszenia przeżywalności mikroorganizmów znajdujących się w handlowych
preparatach probiotyków.
Badanie „In-vitro” jednoznacznie wykazało, że technologia
MURE zastosowana w produkcji preparatu MULTILAC® jest najbardziej efektywna w ochronie probiotyków przed destrukcyjnym
działaniem kwasu solnego, znajdującego się w żołądku, w porównaniu z innymi preparatami obecnymi na rynku. Przyczynia
się to do lepszej kolonizacji mikroorganizmów w jelicie i zwiększa efektywność działania doustnego preparatu MULTILAC® zawierającego żywe szczepy bakterii.
Niska przeżywalność bakterii w preparatach handlowych nie
zawierających ochronnych kapsułek lub słaba ochrona kapsułek
wykonanych w tradycyjnych technologiach mogą być przyczyną
słabszej kolonizacji jelita i tłumaczyć obserwowaną czasem małą
efektywność działania tradycyjnych preparatów probiotyków.
3