ADA

Wykład XI
Terapia genowa chorób monogenowych
Ponad 600 prób klinicznych terapii genowej na świecie,
w tym 555 zarejestrowanych przez NIH (stan z XI.2003)
392 - terapia genowa nowotworów
57 – choroby monogenowe, w tym 23 mukowiscydoza
46 - choroby układu krążenia
40 – choroby zakaźne (w tym 37 AIDS)
http://www4.od.nih.gov.oba/rac/clinicaltrial.htm
Ciężkie złożone niedobory odporności
- niedobór X-SCID (SCID-X1) – 1: 150 000
- niedobór deaminazy adenozynowej – 1: 375 000
Deaminaza adenozyny
ADA - deaminaza adenozyny oraz 2-deoksyadenozyny
- ecto-ADA - interkacja z CD26 obecnym na powierzchni limf. T
- interakcja ta jest niezbędna do aktywacji limfocytów T
- ecto ADA -związana z receptorem adenozyny na powierzchni
komórek mięśni gładkich ściany naczynia - niezbędna do wiązania
adenozyny do receptora
Niedobór deaminazy adenozyny (ADA)
Deoxy-adenozyna
Adenozyna
Deoxy-inozyna
Inozyna
Niedobór ADA
Upośledzenie układu odpornościowego
Konsekwencje niedoboru ADA
rGTP, rCTP, rTTP
Niedobór ADA
dAMP
dATP
dGTP, dCTP, dTTP
Terapia genowa niedoboru ADA
ADA
ADA-
ADA+
ADA+
Sukces terapii genowej
Science 2000 Apr 28;288(5466):669-72
Comment in:
•Science. 2000 Apr 28;288(5466):627-9
Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease.
Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G, Gross F, Yvon E, Nusbaum P, Selz
F, Hue C, Certain S, Casanova JL, Bousso P, Deist FL, Fischer A.
INSERM Unit 429, Gene Therapy Laboratory, Cell Therapy Laboratory, Unite d'Immunologie
et d'Hematologie Pediatriques, Hopital Necker, 75743 Paris Cedex 15, France.
Severe combined immunodeficiency-X1 (SCID-X1) is an X-linked inherited disorder
characterized by an early block in T and natural killer (NK) lymphocyte differentiation. This
block is caused by mutations of the gene encoding the gamma-c cytokine receptor subunit of
interleukin-2, -4, -7, -9, and -15 receptors, which participates in the delivery of growth, survival,
and differentiation signals to early lymphoid progenitors. After preclinical studies, a gene
therapy trial for SCID-X1 was initiated, based on the use of complementary DNA containing a
defective gammac Moloney retrovirus-derived vector and ex vivo infection of CD34+ cells.
After a 10-month follow-up period, gammac transgene-expressing T and NK cells were detected
in two patients. T, B, and NK cell counts and function, including antigen-specific responses,
were comparable to those of age-matched controls. Thus, gene therapy was able to provide full
correction of disease phenotype and, hence, clinical benefit
Receptory cytokin
D. Kohn et al., Nature Rev Cancer July 2003
Efekty uboczne terapii genowej X-SCID
U dwóch spośród 10 chłopców poddanych terapii genowej
doszło do rozwoju białaczki
Disease targets for gene therapy
Disease
Cystic fibrosis
SCID
Gaucher disease
Hemophilia A
Hemofilia B
Familial hypercholesterolemia
Muscular dystrophy
Ornithine transcarbamylase deficiency
Gene(s)
CFTR, α-1-anti-trypsin
ADA
glucocerebrosidase
Factor VIII
Factor IX
LDL-R
sarcoglycan, dystrophin,
utrophin
OTC
Niedobór karbamoilotransferazy ornitynowej
Jesse Gelsinger
1999
Zmarł po podaniu
dużej dawki wektora
adenowirusowego
z prawidłowym
genem OTC
Terapia genowa hemofilii
Proces krzepnięcia krwi
Uszkodzenie naczynia
Czynnik XIIa
Czynnik XII
Czynnik XIa
Czynnik XI
Czynnik IX
Czynnik IXa
Czynnik X
Czynnik Xa
Czynnik VIIIa
protrombina
Czynnik VIII
fibrynogen
trombina
fibryna
Hemofilia A and gene therapy
1. Factor VIII production is not regulated in response to bleeding
2. The broad therapeutic index of factor VIII minimises the risk of
overdoses
3. Delivery of factor VIII into the bloodstream does not require
expression of the gene by specific organ
4. Even low levels of the protein can be beneficial
Size of the coding sequences of factor VIII and factor IX
mRNA - factor VIII - 8,8 kb
factor IX - 1,8 kb
Próba kliniczna terapii genowej
hemofilii A
Steps in human factor VIII gene
transfer procedure
Roth DA et al., NEJM 2001; 344: 1735
Próba kliniczna terapii genowej hemofilii A
Roth DA et al., NEJM 2001; 344: 1735
Bleeding Events and Use of Exogenous Factor VIII in Three of the Six Patients.
Roth DA et al., NEJM 2001; 344: 1735
Opublikowane wyniki badań prób klinicznych
terapii genowej hemofilii
Hemofilia A
-wektora plazmidowy –transfer ex vivo,
-Wektor retrowirusowy – transfer in vivo (dożylny) –
sekwencja kodująca czynnik VIII pozbawiony domeny B
(domena B nie jest konieczna do prawidłowego funkcjonowania
czynnika VIII i jest wycinana potranslacyjnie)
Hemofilia B
-wektor AAV 2 – a) domięśniowo
b) do aorty wątrobowej
Mukowiscydoza, zwłóknienie torbielowate
Cystic fibrosis
- most common autosomal recessive disorder in Caucasians
(1:2000-2500 live births; carrier rate in northern Europeans
- 1:20-1:25)
in Hawaiians - 1:90000
- after asthma, CF is the commonest cause of chronic respiratory
distress in childhood; responsible for the majority of deaths
-
Mukowiscydoza, zwłóknienie torbielowate
Cystic fibrosis
Płuca zdrowe
Płuca osoby chorej na
mukowiscydozę
GeneMedicine Research Group
Mukowiscydoza
Cystic fibrosis
Complications
- respiratory - chronic bacterial infections; respiratory and cardiac failure
-gastrointestinal tract - more than 85% of children –
malabsorption due to exocrine pancreatic insufficiency
- infertility - affects 85% males and to a lesser extent females
Median survival remains about 30 years
CFTR gene
Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
168 kDa protein; 1480 aa residues
CFTR codes for a chloride ion channel
over 600 mutations produce CF; deltaF508 (D508) is the most common
(in exon 10, interferes with ATP binding)
Budowa i rozmieszczenie białka CFTR
Terapia genowa mukowiscydozy
-najwięcej prób klinicznych spośród chorób monogenowych
- próby kliniczne rozpoczęte w roku 1993
Strategie terapii genowej w CF:
1. Transfer genu CFTR
- wykorzystuje się różne wektory, ostatnio najczęściej AAV
- sposoby podawania:
a) bronchoskopia
b) zawiesina aerozolowa
- problemy ze skutecznością transfekcji/transdukcji
2. Naprawa mutacji w genie CFTR; zastosowanie G418
Dystrofia mięśniowa
Duchenne muscular dystrophy
Progressive muscle weakness, more proximal
Onset between 2-4 years of age
>95% in wheelchair by 12 years of age
Death between 15-25 years of age
Variable mental retardation
Frequent cardiac involvement
Orthopaedic deformities
Calf hypertrophy
High creatine phosphokinase concentrations
Dystrophin deficiency in muscle
Hereditary,
X-linked disease
Gene Xp21 mutations
In 1861, Duchenne described his first case of the dystrophy that
now bears his name, under the title, Paraplégie hypertrophique
de l'enfance de cause cerébrale. Because of the intellectual
impairment in the affected boys, Duchenne initially thought the
condition was cerebral in origin.
Duchenne & Becker muscular dystrophy
Duchenne dystrophy: 1:3000 newborn males
X - linked;
The largest gene described in humans (~1% of X chromosome),
extending over 2300 kb and comprising 79 exons
- in 65% patients the molecular abnormality involves exon deletions
Becker dystrophy: 7-10 times less frequent that Duchenne
Terapia genowa dystrofii mięśniowej Duchenn’a
Zwiększenie ekspresji:
transfer genu
Dystrofiny
Utrofiny
Naprawa mutacji
Terapia komórkowa
(transplantacja mioblastów)
Naprawa mutacji – chimeraplastyka
James G Tidball & Melissa J Spencer
Nature Medicine 9, 997 - 998 (2003)
Przyczyny niepowodzeń w terapii genowej chorób monogenowych
1. Poziom i czas trwania ekspresji
2. Bariery ograniczające transdukcje/transfekcję
3. Stopień zaawansowania choroby
4. Możliwe rozwiązania:
a) skuteczniejsze wektory – np. helper-dependent
b) nowe strategie – np.. Naprawa genu
c) wykorzystanie komórek macierzystych – np. zarodkowych
komórek macierzystych uzyskanych drogą terapeutycznego
transferu jądrowego (tzw. klonowanie terapeutyczne).