Klonowanie

Klonowanie i transgeneza
dr n.med. Katarzyna Wicher
Klonowanie
– proces tworzenia idealnej kopii z oryginału
– oznacza powstawanie lub otrzymywanie
genetycznie identycznych:
 cząsteczek DNA
 komórek
 organizmów
Klonowanie DNA
Wektory do klonowania
Krótkie cząsteczki DNA, które mają zdolność do
autonomicznej replikacji w danym typie komórek,
zapewniają powielenie wprowadzonego fragmentu DNA,
a w wielu przypadkach także wydajną ekspresję
zawartych w nim genów.
Podstawowe właściwości wektorów:
 niewielka cząsteczka DNA
 wydajna replikacja w genomie gospodarza
(np. miejsce Ori)
 możliwe do izolacji niezależnie od genomu gospodarza
 zawierają miejsca rozpoznawane przez enzymy
restrykcyjne: polilinker (MCS - multiple cloning site
– miejsce wielokrotnego klonowania)
 zawierają markery pozwalające
na identyfikację zrekombinowanych
cząsteczek
Markery wektorowe:
 geny oporności na antybiotyki
 histochemiczne – nadające komórce
rozróżnialną barwę
 pokarmowe – umożliwiające transformowanej
komórce wzrost bez niezbędnego składnika
odżywczego
Rodzaje wektorów







plazmidy bakteryjne
pochodne faga 
Pochodne faga M13
Kosmidy
PAC
BAC
YAC
15kpz
25kpz
25kpz
45kpz
150kpz
500kpz
1000kpz
Etapy klonowania molekularnego
1.
Przygotowanie sekwencji do klonowania
(wstawki):
-
trawienie enzymem restrykcyjnym
lub losowe rozerwanie DNA poprzez sonikację
oczyszczenie i przygotowanie produktów PCR
-
Enzymy restrykcyjne (endonukleazy)
 przecinają
cząsteczkę w obrębie specyficznych
sekwencji, zwykle 4-8 pz,
 najczęściej rozpoznają sekwencje palindromowe
(symetryczne) – identyczne na obu niciach
w kierunku 5’- 3’,
SmaI
5'---CCC GGG---3'
3'---GGG CCC---5'
 trzy typy: I, II, II;
tylko typ II przecina cząsteczkę zawsze w tym
samym miejscu.
Enzymy restrykcyjne (endonukleazy)
Sposoby cięcia:
-tępe końce
-lepkie końce
Nazwy enzymów:
1 litera-rodzaj bakterii
2,3 litera- gatunek bakterii
Dodatkowe litery, cyfryserotyp, lub szczep bakteryjny
Etapy klonowania DNA – c.d.
2. Przygotowanie wektora do klonowania
– przeprowadzenie wektora z formy kolistej
(plazmid) w formę liniową – trawienie enzymem
restrykcyjnym
3. Ligacja - łączenie fragmentów DNA (wstawki)
z wektorem poprzez zastosowanie ligazy
DNA,
katalizującej
formowanie
wiązań
fosfodiestrowych między końcem hydroksylowym
3’, a końcem fosforanowym 5’ DNA. Najczęściej
stosowana ligazą jest ligaza T4.
4. Wprowadzenie zrekombinowanej cząsteczki
do gospodarza:
- bakterie – transformacja
- rośliny – transfekcja (chemiczna,
bakteryjna)
- zwierzęta i człowiek – transdukcja wirusowa
5. Namnożenie zrekombinowanych cząsteczek
w komórce biorcy
6. Identyfikacja zrekombinowanych genów:
- wykorzystanie markerów selekcyjnych (np.Bgalaktozydaza – X-Gal)
- hybrydyzacja z sondą w przypadku braku
ekspresji genu
7. Analiza sklonowanych sekwencji lub dalsza
manipulacja
Zastosowanie klonowania DNA:
 tworzenie bibliotek genomowych i genowych (ginące gatunki!)
 izolowanie genów i innych sekwencji DNA w celu dalszej analizy
uzyskanych fragmentów
sekwencjonowanie)
(hybrydyzacji
z
sondą
molekularną,
 tworzenie
zmodyfikowanych wersji genów do ponownego
wprowadzania do organizmu w celu badania ekspresji genu i jej
regulacji,
 przenoszenie genów do innego organizmu, w celu otrzymania dużej
ilości białka kodowanego przez ten gen.
TRANSGENEZA
transgen - egzogenny gen wprowadzony
do komórki
Terapia genowa (genoterapia)
Sposób leczenia wrodzonych błędów
genetycznych
przez
wprowadzenie
z
zewnątrz prawidłowego genu do komórek
chorego w taki sposób, aby gen ten przejął
funkcje nieprawidłowego (zmutowanego lub
brakującego) genu.
Warunki, które muszą być spełnione aby
rozważać terapię genową:
 gen musi być sklonowany, zsekwencjonowany,
a jego prawidłowa forma powinna być łatwo dostępna
 musi istnieć możliwość wprowadzenia genu bezpiecznie
i efektywnie do odpowiednich komórek docelowych
 musi dojść do ekspresji genu w miejscu przeznaczenia
Typy terapii genowej:
 terapia genowa komórek linii zarodkowej
(linii płciowej albo generatywnej)
– terapia germinalna




modyfikacje dotyczą gamet, zygoty i wczesnych embrionów
trwały, dziedziczony efekt
trudno przewidzieć wszystkie konsekwencje
zabroniona w większości krajów
 terapia genowa komórek somatycznych
– terapia somatyczna
Strategie terapii genowej
 metoda ex vivo – terapeutyczny gen wprowadzany jest
do komórek pobranych wcześniej od chorego
i hodowanych poza organizmem (in vitro). Po udanej
transfekcji komórki zostają z powrotem wszczepione do
organizmu chorego.
 metoda in vivo – terapeutyczny gen wprowadza się
bezpośrednio do organizmu chorego za pośrednictwem
odpowiedniego wektora. Do transfekcji dochodzi
w komórkach wewnątrz organizmu.
Metody wprowadzania genów do komórek
 bezpośredni transfer DNA do komórki przy użyciu metod
fizykochemicznych
-fuzja DNA z liposomami
-transfekcja precypitatu DNA z fosforanem wapnia
-elektroporacja
-mikroiniekcja dojądrowa
 wprowadzanie DNA lub RNA do komórek przy użyciu metod
biologicznych - za pomocą specjalnie skonstruowanych
nośników tzw. wektorów (wirusy DNA, wirusy RNA, plazmidy)
Wirusy RNA
Retrowirusy
Najczęściej stosowane w terapii genowej!
•dzięki odwrotnej transkryptazie mogą
przepisywać swój genom z RNA na
cDNA i trwale integrować się z
genomem
Lentiwirusy
• wyspecjalizowane retrowirusy
• mogą infekować tylko dzielące
się komórki (ograniczenie
ukierunkowania)
• infekują niedzielące się
komórki (aktywny transport
przez pory otoczki jądrowej)
• ryzyko mutacji insercyjnej
• integracja z genomem
przypadkowa
• bardzo wydajne jako wektory
(~100%)
• długotrwała ekspresja
Wirusy DNA
Adenowirusy
• infekują zarówno komórki dzielące się,
jak i niedzielące się
• dwuniciowe DNA wirusa nie integruje
z genomem gospodarza (powstaje
nietrwały episom)
• bezpieczny
• krótkotrwała ekspresja
Czynniki ryzyka związane
ze stowaniem wektorów wirusowych:
 mutageneza insercyjna – możliwość wywołania
mutacji w DNA gospodarza
 powikłania infekcyjne – rekombinacja DNA
unieczynnionego wektora wirusowego z DNA wirusa
dzikiego
 pobudzona odpowiedź immunologiczna i zapalna
Ashanti De Silva, 4letnia dziewczynka
z ciężkim złożonym
niedoborem odporności SCID
(ang. severe combined
immunodeficiency) była
pierwszą pacjentką poddaną
terapii genowej (1990).
Wprowadzenie genu
deaminazy adenozyny do
limfocytów T pacjentki.
Negatywne skutki terapii genowej
1999 Jesse Gelsinger –pierwsza udokumentowana
ofiara
- zmarł po zastosowaniu terapii genowej, która miała
wyleczyć go z dziedzicznej choroby wątroby
- przyczyną śmierci była agresywna odpowiedź układu
immunologicznego
2002
-
11 pacjentów z X-SCID poddano terapii genowej,
aby umożliwić im powrót do normalnego życia
-
2 pacjentów zmarło z powodu białaczki – nastąpiła
insercja wirusa w locus onkogenu LMO2
Rodzaje terapii genowej:
 wprowadzenie prawidłowej kopii genu – komplementacja
defektu genetycznego
 wymiana
nieprawidłowego
rekombinacja homologiczna
genu
-
somatyczna
 wprowadzanie genów „samobójczych” - molekularna
chemoterapia nowotworów, apoptoza komórek
 wybiórcze hamowanie ekspresji
- eliminowanie funkcji nieprawidłowych genów poprzez
wyciszanie lub usuwanie nadmiernie aktywnych,
nieprawidłowo
działających
genów
(hamowanie
transkrypcji lub unieczynnianie RNA)
Rodzaje terapii genowej
 aktywacja odpowiedzi immunologicznej
przez transfekcję komórek odpornościowych
organizmu, takich jak limfocyty lub makrofagi
 wybiórcze niszczenie komórek
- dostarczanie zakażonej komórce białek wiążących
i unieczynniających białka wirusa konieczne do jego
namnażania (np. AIDS)
System CRISPR-CAS9 – nożyce molekularne
przełomowa metoda manipulacji DNA
Klonowanie terapeutyczne
Klonowanie terapeutyczne
przewiduje hodowanie komórek,
tkanek, a nawet całych organów w
celu ich zastosowania u ludzi
Komórki macierzyste
Komórki mające zdolność regeneracji, a w określonych
warunkach różnicujące się w inne populacje komórek
 totipotencjalne – zygota
 pluripotencjalne - różnicują się w komórki listków
zarodkowych
 multipotencjalne - różnicują się w komórki jednego
listka zarodkowego
 unipotencjalne - mogą wytworzyć tylko jeden
typ komórek
Komórki macierzyste
Ze względu na pochodzenie wyróżnia się komórki
macierzyste: embrionalne, płodowe i dorosłe.
ES – embryonic stem cells

embrionalne komórki macierzyste można
wyizolować z blastocysty (wczesne stadium
rozwojowe, około etapu zagnieżdżania się
zapłodnionego jaja) i hodować in vitro
TRANSPLANTACJA
JĄDER KOMÓRKOWYCH
-wiele utrudnień
-nie udało się pozyskać
komórek macierzystych
-potrzeba wielu komórek
jajowych
-ASPEKTY ETYCZNE:
wykorzystanie ludzkich
‘zarodków’?
TRANSPLANTACJA JĄDER KOMÓRKOWYCH
1. Komórki jajowe skłania się, żeby dojrzewały w warunkach
laboratoryjnych.
Każda ma ciałko kierunkowe, a do ich powierzchni przylegają komórki
pęcherzykowe.
2. Komórkę jajowa przytrzymuje się pipetą, a igłą
przekłuwa osłonkę przejrzystą, usuwając czopek.
3. Po wyrzuceniu czopka igłę ponownie wprowadza się
do komórki jajowej przez zrobiony wcześniej otwór, by
usunąć z niej ciałko kierunkowe i materiał genetyczny.
4. Do igły pobiera się materiał genetyczny pochodzący
z komórki somatycznej.
Jądro komórki
somatycznej
5. Jądro komórki somatycznej wstrzykuje się głęboko do
komórki jajowej pozbawionej własnego materiału
genetycznego. Istnieją także metody nieinwazyjne –
owca Dolly.
6. Po wstrzyknięciu, działa się na komórkę różnymi
związkami chemicznymi, m.in. czynnikami wzrostowymi,
które pobudzają ja do podziałów.
7. Po około 24 godzinach komórka zaczyna się dzielić.
Komórki potomne zawierają materiał genetyczny
pochodzący tylko ze wstrzykniętej uprzednio komórki
somatycznej.
8. Czwartego lub piątego dnia powstaje blastocysta
- pusta kula złożona z około 100 komórek. Zawiera ich
skupienie zwane wewnętrzną masą komórkową,
w której znajdują się komórki macierzyste.
9. Rozrywa się blastocystę, a wewnętrzna masę komórek
hoduje w warunkach laboratoryjnych, aby uzyskać
komórki macierzyste (ang. stem cells)
10. Komórki macierzyste skłania się do różnicowania
w rozmaite komórki, które kiedyś można będzie wstrzyknąć
pacjentom.
TRANSPLANTACJA
JĄDER KOMÓRKOWYCH
-wiele utrudnień
-nie udało się pozyskać
komórek macierzystych
-potrzeba wielu komórek
jajowych
-ASPEKTY ETYCZNE:
wykorzystanie ludzkich
‘zarodków’?
Indukowane pluripotencjalne
komórki macierzyste (IPS)
Dziękuję za uwagę!