Ćwiczenie 7

Ćwiczenie 7
Sekwencjonowanie zmienionego genu blg b przy użyciu sekwenatora ABI PRISM 310 (Applied
Biosystems)
A. PCR sekwencyjny
a. przygotować mieszaninę reakcyjną do PCR sekwencyjnego:
o matrycowe DNA (100 ng/μl) - 4 μl
o starter I56F For lub Rev (tylko jeden starter) (25 ng/μl) - 1 μl
o mix reagentów do PCR sekwenc. (Terminator Ready Reaction Mix) – 5 μl
o woda – 10 μl (końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej - 20 μl).
b. warunki PCR sekwencyjnego w termocyklerze TPersonal (Biometra):
o denaturacja wstępna: 96°C – 1 min. – 1 cykl
o denaturacja: 96°C – 10 s
o hybrydyzacja starterów: 45°C – 10 s
25 cykli
o elongacja: 60°C – 3 min.
o pauza: 4°C
B. Oczyszczanie DNA po PCR sekwencyjnym przy użyciu zestawu ExTerminator (A&A Biotechnology)
a. mieszaninę po PCR sekwencyjnym przenieść do 1.5 ml probówki;
b. dodać 5 μl Mix Blue do PCR sekwencyjnego;
c. dodać 100 μl roztworu wiążąco-płuczącego i wymieszać przez pipetowanie;
d. całość mieszaniny przenieść na minikolumnę i zwirować 3000-4000 xg przez 30 s (lekko
niebieskie
zabarwienie
minikolumny
świadczy
o
wydajnej
precypitacji
produktów
sekwencjonowania);
e. nałożyć na minikolumnę 400 μl roztworu wiążąco-płuczącego i zwirować 12000-14000 xg przez
2 min.;
f. przenieść minikolumnę do nowej 1.5 ml probówki i nałożyć dokładnie na środek kolumny 25 μl
TSR (Template Suspension Reagent);
g. inkubować w temp. pokojowej przez 2 min.;
h. zwirować 12000-14000 xg przez 1 min.;
i. lekko niebieskie zabarwienie otrzymanej próbki świadczy o jej właściwym oczyszczeniu;
j. próbkę zawieszoną w TSR denaturować przez 2 min. w temperaturze 95°C, po denaturacji
natychmiast przenieść na lód i trzymać na lodzie do momentu umieszczenia w sekwenatorze.
C. Sekwencjonowanie genu blg b pod kątem obecności mutacji A1S2 V92F przy użyciu sekwenatora
ABI PRISM 310.
1
W sprawozdaniu (sprawozdanie będzie obejmować materiał z ćwiczeń 6 i 7):
o proszę zamieścić wynik sekwencjonowania genu blg b z zaznaczonym miejscem, w którym
powinna znajdować się wprowadzana mutacja oraz stwierdzeniem jej obecności lub braku (wynik
sekwencjonowania będzie dostępny na stronie www kursu);
o W latach 70 ubiegłego wieku opracowano sekwencjonowania DNA dwiema metodami: terminacji
łańcucha i degradacji chemicznej. Dlaczego współcześnie praktycznie nie wykorzystuje się
metody degradacji chemicznej?
o proszę nazwać metodę sekwencjonowania przedstawioną na schemacie poniżej i krótko opisać jej
etapy:
o poniżej
zamieszczono
autoradiogram
żelu
sekwencyjnego
otrzymanego
w
wyniku
sekwencjonowania DNA metodą Sangera. Proszę podać fragment sekwencji DNA, który poddano
sekwencjonowaniu (strzałka wskazuje kierunek przebiegu elektroforezy).
ELEKTROFOREZA
2
Tabela pomocnicza do analizy wyników sekwencjonowania:
Sprawozdanie powinno zawierać:
 krótko sformułowany cel ćwiczenia;

właściwie opisane wyniki eksperymentów;

odpowiedzi na zagadnienia odnoszące się do danego ćwiczenia.
Proszę nie umieszczać w sprawozdaniu:

wstępu teoretycznego;

opisu wykonania ćwiczenia.
Sprawozdanie można oddać w wersji papierowej (pokój C020) lub przesłać w formie elektronicznej na
adres: [email protected]. Ostateczny termin oddawania sprawozdania to 7 dni od daty wykonania
ćwiczenia nr 7.
3