cwiczenia nr 6

Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Ćwiczenie 6
Część teoretyczna:
KOLOKWIUM 1
I. SYSTEMATYKA DROŻDŻY
Królestwo: Fungi
Podkrólestwo: Dikarya – grzyby wyższe
Typ: Basidiomycota (podstawczaki)
Typ: Ascomycota – workowce
Podtyp: Saccharomycotina
Klasa: Saccharomycetes
Rząd: Saccharomycetales
Rodzina: Saccharomycetaceae – drożdże szlachetne, rozmnażają się płciowo, wytwarzają w workach od 2-4
kulistych zarodników,
oraz sztuczna jednostka często w randze typu „Deuteromycota” („anamorfic fungi”) – grzyby niedoskonałe,
anamorficzne.
II. WORKOWCE (Ascomycota)
Wytwarzaj zarodniki workowe w workach (ascum). Rozmnażają się generatywnie przez wytwarzanie
okrągłych lub owalnych zarodników wewnątrz worka (askospory) oraz wegetatywnie przez pączkowanie
wieloboczne. Mogą formować grzybnię. Z wyjątkiem Schizosaccharomyces nie wytwarzają enzymu ureazy.
Ściana komórkowa jest 3-warstwowa, zbudowana z glukanu i mannanu. Nie wytwarzają pigmentu. Należą tu
drożdże fermentujące i nie fermentujące sacharydów.
Rodzaj Saccharomyces - drożdże te dają na pożywkach płynnych osad opadający na dno, a na stałych
tworzą białe lub kremowe kolonie. Do tego rodzaju należą gatunki drożdży szlachetnych, które
charakteryzują się silnymi właściwościami fermentacyjnymi – w warunkach beztlenowych rozkładają
duże ilości cukru na alkohol, który nie jest przez nie zużywany.
Saccharomyces cerevisiae – mają komórki owalne lub kuliste, na podłożach płynnych pojedyncze lub
podwójne. Fermentują i asymilują większość cukrów, mogą wykorzystywać etanol przy braku innego źródła
węgla w środowisku. Używane są w przemyśle fermentacyjnym (drożdże gorzelnicze) oraz do produkcji
drożdży paszowych i spożywczych (drożdże piekarskie).
1
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Saccharomyces carlsbergensis o owalnych komórkach, od S. cerevisiae odróżnia je zdolność do fermentacji
rafinozy. Stosowane są do produkcji piwa (drożdże piwowarskie).
Saccharomyces ellipsoideus – drożdże winiarskie, od S. cerevisiae różnią się nieco kształtem (bardziej
wydłużone komórki), często tworzą pseudogrzybnię.
Saccharomyces lactis – występują w mleku i produktach mlecznych.
Saccharomyces fragilis – odgrywają dużą rolę podczas fermentacji kefiru i kumysu. Od S. cerevisiae Różnią
się zdolnością do fermentacji laktozy.
Rodzaj Schizosaccharomyces – należy do drożdży rozszczepkowych, czyli takich, które dzielą się przez
podział. Wytwarzanie zarodników poprzedza kopulacja. Schizosaccharomyces pombe jest najczęściej
spotykanym gatunkiem, występuje w melasie i sokach z owoców południowych.
2
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
III. GRZYBY NIEDOSKONAŁE (Deuteromycota, Fungi imperfecti)
Obejmuje gatunki drożdży, u których nie zaobserwowano cyklu rozmnażania płciowego, nie będące
haploidalnymi przedstawicielami gatunków zarodnikujących. Należą tu m.in. takie rodzaje jak:
Cryptococcus, Torulopsis, Candida, Kloeckera, Rhodotorula.
Rodzaj Torulopsis – podobne do S. cerevisiae tylko mniejsze, rozwój przez paczkowanie, odporne na
wysokie stężenia soli i cukru. Występują w solankach, zagęszczonym słodzonym mleku (powodują
nieprzyjemny smak i zapach) oraz w śluzowatym winie. Gatunek Torulopsis utilis ze względu na szybkie
rozmnażanie i gromadzenie białka w komórkach używany jest do produkcji drożdży paszowych.
Rodzaj Candida – stanowi formę przejściową między drożdżakami a pleśniami. Wytwarzają
pseudogrzybnię, komórki są cylindryczne lub owalne, należą do drożdży dzikich, kożuchujących. Gatunek
Candida mycoderma – rozkłada alkohol, stanowi szkodliwą mikroflorę piwa, wina, kiszonek, tworzy
charakterystyczny wpełzający na ścianki naczyń kożuszek. Może występować także w drożdżach
prasowanych.
Rodzaj Rhodotorula – drożdże wytwarzające barwniki karotenoidowe, ich kolonie mają czerwonoróżowe
zabarwienie. Mogą syntetyzować tłuszcze oraz – karoten. Występują w powietrzu, są przyczyną zakażeń
serów, masła, śmietany, mięsa i drożdży piekarskich, na których tworzą barwne kolonie.
3
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Rodzaj Kloeckera – komórki mają kształt cytryny, są drobne, rozmnażają się przez paczkowanie
biegunowe. Fermentują cukry proste. Gatunek Kloeckera apiculata jest często spotykany na owocach, w
fermentujących winach i sokach owocowych. Mogą powodować fermentację moszczów i płynnego owocu z
wytworzeniem kwasów lotnych.
IV. TEST NA ŻYWOTNOŚĆ
Na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę błękitu metylenowego,
do niego dodajemy zawiesinę drożdży przykrywamy szkiełkiem
nakrywkowym i oglądamy pod średnim powiększeniem.
Komórki żywe nie wpuszczają barwnika do wnętrza (trucizna).
Komórki martwe łatwo wpuszczają barwnik do wnętrza i barwią
się na niebiesko.
V. TEST NA ODŻYWIENIE
Na szkiełko podstawowe nanosimy kroplę płynu Lugola, przenosimy drożdże, nakrywamy szkiełkiem
nakrywkowym i oglądamy pod średnim powiększeniem. Glikogen będący materiałem zapasowym tworzy z
płynem Lugola kompleks, co przejawia się brunatnym zabarwieniem komórek dobrze odżywionych.
Komórki słabo odżywione są prawie przezroczyste.
VI.
METODY
BEZPOŚREDNIE
LICZENIA
DROBNOUSTROJÓW
(METODY
MIKROSKOPOWE)
- liczenie drobnoustrojów przy użyciu komór,
Komory do liczenia pod mikroskopem mają postać szklanych płytek z wyciętym wgłębieniem
podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej powierzchni. Komora Thoma ma głębokość 0,1 mm, na
jej dnie znajduje się siatka składająca się z 16 dużych kwadratów, które z kolei podzielone są na 16 małych
kwadracików. Wymiary małej komory wynoszą: głębokość – 0,1 mm, szerokość i długość – 0,05 mm, zatem
powierzchnia małej komory wynosi 0,0025 mm2, a jej objętość – 0,00025 mm3. Podczas liczenia
drobnoustrojów wyznacza się średnią liczbę komórek w ok. 40 małych kwadracikach.
Liczbę drobnoustrojów (L) w 1 cm3 wylicza się ze wzoru:
L = 4·106·n·a
gdzie: n – rozcieńczenie zawiesiny drobnoustrojów,
a – średnia zawartość komórek w jednym kwadraciku.
4
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
- liczenie drobnoustrojów w preparacie przyżyciowym (bezpośrednim),
Polega na wykonaniu preparatu bezpośredniego, tj. naniesieniu kropli zawiesiny drobnoustrojów na
powierzchnię szkiełka przedmiotowego i przykrycia szkiełkiem nakrywkowym. Pod mikroskopem liczy się
średnią liczbę komórek z 20-50 pól widzenia.
- liczenie drobnoustrojów metodą Breeda w preparacie barwionym,
Polega na wykonaniu równomiernego rozmazu określonej,
niewielkiej ilości hodowli, pobranej tzw. pipetą Breeda (0,01 cm3),
na znanej powierzchni (A) szkiełka podstawowego, wcześniej
dokładnie odtłuszczonego. Po wykonaniu rozmazu, wysuszeniu
i utrwaleniu, preparat wybarwia się odpowiednim barwnikiem,
a następnie liczy pod mikroskopem średnią liczbę komórek z trzech
preparatów.
- metoda DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)
Polega na liczeniu pod mikroskopem drobnoustrojów
osadzonych na filtrze membranowym, o porach 0,45 m, po
uprzednim ich wybarwieniu fluorochromami. adane próbki
mogą być wstępnie poddane obróbce enzymatycznej,
następnie wybarwiane najczęściej oranżem akrydyny i liczone
w mikroskopiefluorescencyjnym. Komórki żywe fluoryzują na
pomarańczowo lub żółto, natomiast martwe na zielono.
5
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
VII. KLASYFIKACJA DROŻDŻY
- testy fermentacyjne – badają zdolność drożdży w warunkach beztlenowych do wykorzystywania cukrów
poprzez fermentacje. Wynikiem pozytywnym jest powstanie CO2, który zbiera się w rurce Durhama,
- testy asymilacyjne – badają zdolność drożdży w warunkach tlenowych do wykorzystywania różnych źródeł
węgla i azotu. Wynikiem pozytywnym jest zmętnienie roztworu lub pojawienie się kożuszka na jego
powierzchni, co świadczy o rozwoju mikroorganizmów,
- zarodnikowanie – drożdże dzielimy na zarodnikujące (Ascomycota) i niezarodnikujące (Deuteromycota),
do pobudzenia wytwarzania zarodników przez komórki drożdżowe używa się podłoży sporulacyjnych o
specyficznym składzie (agar octanowy, agar Gorodkowej), uzyskane w ten sposób worki z zarodnikami
barwi się metodą Schaeffera-Fultona, kształty zarodników: kuliste, elipsoidalne, nerkowate, półkuliste,
kapeluszowate, soczewkowate, w kształcie Saturna, maczugowate, igiełkowate,
- inne badania – zdolność wzrostu w podwyższonej temperaturze, przy braku witamin, przy wysokiej
zawartości cukrów, zdolność do syntezy związków skrobiopodobnych, zdolność do syntezy kwasu
octowego.
VIII. DROŻDŻE KILLEROWE
Drożdże killerowe (ang. Killer yeasts) to szczepy drożdży zainfekowane jednym z wirusów,
wytwarzających toksyczne białka, które zabijają blisko spokrewnione, ale niezainfekowane drożdże.
6
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Toksyny te są zabójcze dla szczepów z tego samego rodzaju lub – rzadziej – wobec szczepów z innych
rodzajów. Drożdże killerowe wykazują tolerancję wobec toksyn, które same wytwarzają, natomiast mogą
być wrażliwe na toksyny innych drożdży killerowych. Drożdże killerowe są powszechnie znajdywane w
owocach i kwiatach, w tym winogronach. Odgrywają istotną rolę podczas fermentacji winogron, gdyż mogą
spowalniać proces i pozostawiać niepożądane aromaty w winie. Można powiedzieć, że przejmują
fermentację „w swoje ręce”, zabijając zaszczepione drożdże, nawet jeśli znajdują się na początku procesu w
znacznie mniejszych ilościach.
Rozważa się wykorzystanie do fermentacji odpowiednich gatunków drożdży o właściwościach killerowych,
dzięki czemu będzie można ograniczyć rozwój szczepów niepożądanych, bez sterylizacji moszczu na
początku procesu. Jak dotąd wśród drożdży opisano zarówno gatunki killerowe, jak i wrażliwe oraz
neutralne. Opisano też 11 wzorów aktywności killerowej (K1-K11) w oparciu i interakcje między drożdżami
killerowymi.
Część praktyczna:
Wszystkie doświadczenia wykonujemy w warunkach sterylnych!
1. Morfologia komórek drożdżowych
a) z przygotowanych skosów drożdży (5 sztuk) przygotować preparaty przyżyciowe
b) na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść kroplę płynu Lugola, do niej dodać niewielką ilość
materiału mikrobiologicznego (5 preparatów), delikatnie zamieszać, przykryć szkiełkiem nakrywkowym
oglądać pod obiektywem o powiększeniu 40x
c) wykonać rysunki dla każdego skosu drożdży i opisać je (sprawozdanie 2)
2. Test na żywotność
a) przygotować 1 preparat ze wskazanych drożdży
b) barwić wg przepisu wyżej
c) policzyć komórki martwe i żywe w 3 polach widzenia oraz podać ich procentowy udział w badanym
preparacie (obliczenia w sprawozdaniu 2).
3. Test na odżywianie
a) przygotować 1 preparat ze wskazanych drożdży
b) barwić wg przepisu wyżej
c) policzyć komórki odżywione i nieodżywione w 3 polach widzenia oraz podać ich procentowy udział w
badanym preparacie (obliczenia w sprawozdaniu 2).
4. Testy fermentacyjne
a) każda grupa otrzymuje 2 podłoża płynne z rurką Durhama, każde podłoże zawiera inny cukier (podaje
prowadzący na ćwiczeniach)
b) zaszczepić oba podłoża wskazanymi drożdżami (każda grupa innymi)
7
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
c) odstawić do inkubacji we wskazane miejsce.
5. Testy asymilacyjne
a) każda grupa otrzymuje 2 podłoża płynne w małych probówkach, każde podłoże zawiera inny cukier
(źródło węgla) i inne źródło azotu (podaje prowadzący na ćwiczeniach)
b) zaszczepić oba podłoża wskazanymi drożdżami (każda grupa innymi)
c) odstawić do inkubacji we wskazane miejsce.
6. Liczenie drobnoustrojów w komorze Thoma (OSTROŻNIE!)
a) komorę Thoma (na sucho) umieścić na stoliku, szukać linii siatki pod obiektywem o powiększeniu 10x, a
następnie 40x, kondensor opuszczony do połowy wysokości
b) podnieść tubus do góry, nałożyć szkiełko nakrywkowe na komorę w taki sposób, aby powstały barwne
pierścienie Newtona
c) ponownie odszukać linie siatki komory
d) nałożyć badane drożdże (hodowla płynna) za pomocą zakraplacza (patrząc z boku) w taki sposób, aby nie
poruszyć mikroskopem i ustawionym obrazem
e) patrząc przez okular wyostrzyć obraz i policzyć ilość drobnoustrojów w 40 małych kwadracikach
f) po obserwacji komorę ostrożnie umyć detergentem i wodą, oraz wodą destylowaną i osuszyć
g) obliczenia umieścić w sprawozdaniu 2
8