Przegląd korzyści płynących ze zmiany analizatora

rev.1 2013-08-19
Przegląd korzyści płynących ze zmiany analizatora hematologicznego
3-Diff na analizator hematologiczny 5-Diff
komórek, automatyczne analizatory zliczają
średnio około 15 000 komórek w jednej próbce.
Dlaczego potrzebne jest różnicowanie krwinek
białych?
Zautomatyzowane
krwinek białych
Populacja białych krwinek składa się z kilku grup,
posiadających zróżnicowane funkcje biologiczne.
Sama liczba krwinek białych (WBC), bez
dodatkowych informacji, nie pozwala na ocenę
stanu zdrowia pacjenta, a prawidłowa liczba WBC
nie oznacza dobrego stanu zdrowia. Dlatego,
powszechnie wykonywane jest różnicowanie
krwinek białych, które standardowo dzielą się na
5 głównych grup:
Limfocyty
Monocyty
Neutrofile
Eozynofile
Bazofile
i
zliczanie
Automatyczne analizatory hematologiczne są
klasyfikowane
jako
analizatory
różnicujące
populację krwinek białych na 3 grupy (analizatory
3-Diff) lub na 5 grup (analizatory 5-Diff):
a) Analizatory 3-Diff
Działanie analizatorów 3-Diff opiera się na
impedancyjnej metodzie pomiaru, w której zliczanie
i rozdział krwinek białych zależny jest od ich
wielkości. Za pomocą odczynników chemicznych
krwinki czerwone ulegają lizie, natomiast krwinki
białe pozostają nienaruszone. W technologii
impedancyjnej strumień zawiesiny komórek
przechodzi przez mały otwór, w którym przepływa
prąd elektryczny. Każda przepływająca komórka
zmienia opór elektryczny, proporcjonalnie do
swojej objętości i w ten sposób jest zliczana.
Dodatkowo, metoda ogniskowania hydrodynamicznego zwiększa dokładność, zapewniając
przechodzenie tylko jednej komórki w danym
momencie i eliminuje nieprawidłowe oszacowanie
rozmiaru (np. jednoczesne przejście dwóch
komórek przez układ pomiarowy daje jeden silny
impuls zamiast dwóch pojedynczych).
Tradycyjną metodą różnicowania krwinek białych
jest oglądanie pod mikroskopem rozmazu
zabarwionego za pomocą jednej z różnych form
barwienia Romanowskiego. Pierwsza metoda
referencyjna
różnicowania
WBC,
została
opublikowana przez Clinical Laboratory Standards
Institute (CLSI) w 1984 roku. Polegała na liczeniu
przez cztery osoby 200 komórek w dwóch
rozmazach wykonanych z tej samej probówki.
Wynik stanowiła średnia otrzymana z tych czterech
zliczeń. Kiedy okazało się to całkowicie
niepraktyczne, w zaleceniach CLSI liczba osób
oglądających rozmaz została zmniejszona do
dwóch. Jednakże, dla większości laboratoriów ta
procedura jest nadal zbyt czasochłonna, zatem
w praktyce zliczane jest przez jedną osobę, 100
komórek w pojedynczym rozmazie. Początkowo
różnicowanie poszczególnych typów leukocytów
określane było tylko w odniesieniu względnym,
głównie jako wartości procentowe. Obecnie uważa
się, że więcej informacji dostarczają wartości
bezwzględne. Rutynowo różnicowanie krwinek
białych
podawane jest zarówno w liczbach
9
bezwzględnych (x10 /l), jak również jako wartości
procentowe (%) całkowitej liczby białych krwinek.
Ryc. 1 Zasada metody impedancyjnej z ogniskowaniem
hydrodynamiczym
W zależności od rozmiaru komórki, identyfikowane
są:
Duże komórki lub granulocyty
Małe komórki lub limfocyty
Średnie komórki lub monocyty lub komórki
„pośrednie”.
Wraz z rozwojem technologii, pojawiła się
możliwość różnicowania krwinek białych na
automatycznych analizatorach, których główną
zaletą jest szybkość i większa dokładność.
W przeciwieństwie do ręcznego zliczania 100
Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o.
różnicowanie
Analizatory Sysmex 3-Diff pocH-100i i XP-300,
posiadają bardziej zaawansowane systemy niż
1
rev.1 2013-08-19
b) Analizatory 5-Diff
Zautomatyzowane analizatory 5-Diff w różnicowaniu WBC wykorzystują różne kombinacje
technik:
impedancji
objętościowej,
energii
elektromagnetycznej
wysokiej
częstotliwości,
technik optycznych i barwień cytochemicznych.
Zasadnicza różnica w odniesieniu do aparatów
3-diff polega na tym, że komórki są identyfikowane
w oparciu o analizę dwuwymiarową, a nie tylko
o wielkość komórek.
inne aparaty, ponieważ specjalny skład chemiczny
odczynników, pozwana zidentyfikować neutrofile
jako osobną grupę.
Hematologia konwencjonalna
3-Diff
5-Diff
Neutrofile
Neutrofile
Mieszana
Bazofile
Eozynofile
Monocyty
Limfocyty
Limfocyty
Analizatory Sysmex klasy X do wykonania analizy
5-Diff wykorzystują fluorescencyjną cytometrię
przepływową. WBC rozdzielane są na poszczególne grupy na podstawie złożoności komórek
(światła rozproszonego bocznie i sygnału
fluorescencyjnego). Próbka poddana jest działaniu
barwnika fluorescencyjnego, który wiąże się do
wewnątrzkomórkowego DNA i RNA. Siła sygnału
fluorescencji jest proporcjonalna do zawartości
RNA/DNA w poszczególnych komórkach. Ponadto,
różnicowanie posiada wysoki poziom dokładności,
dzięki oprogramowaniu ACAS (ang. Adaptive
Cluster Analysis System), który zapewnia, że
każda populacja komórek tworzy wyraźny klaster
jeszcze zanim zostaną zliczone wszystkie komórki.
W
przeciwieństwie
do
systemu
ACAS,
wykorzystywana w innych systemach stała
bramkowania powoduje czasami, że komórki,
zwłaszcza w próbkach patologicznych, są zliczane
jako część niewłaściwej grupy. Znacznie lepsza
jest zdolność analizatorów 5-Diff do zliczenia mniej
licznych
rodzajów
komórek,
mianowicie
monocytów, eozynofilii i bazofilii jako oddzielnych
grup, a nie jako mieszanej populacji komórek.
Poszczególne typy białych krwinek posiadają różne
funkcje, dlatego zmiany w bezwzględnej liczbie
poszczególnych populacji dostarczają bardzo
cennych
informacji.
Umożliwiają
lekarzowi
ukierunkowanie się na najbardziej prawdopodobną
diagnozę, jak również monitorowanie odpowiedzi
na leczenie.
Ryc. 2 Różnicowanie 3-Diff. Neutrofile i limfocyty są
identyfikowane jako odrębne populacje od populacji
monocytów, eozynofili i bazofili, które są zliczane
wspólnie jako komórki mieszane
Badania porównujące dokładność automatycznego
zliczania na analizatorach 3-Diff, z pierwszą
metodą referencyjną – manualnym zliczaniem 800
komórek wykazały, że precyzja jest doskonała, ale
dokładność jest dość słaba. Dotyczyło to zwłaszcza
nieprawidłowych próbek, w których względna liczba
i morfologia komórek mogą być zmienione. Dlatego
uważa się, że rozdział 3-Diff dla patologicznych
próbek jest niewystarczający.
W stanie zdrowia, 5 głównych grup krwinek białych
znajduje
się
w
prawidłowych
zakresach
i proporcjach (%). Jednakże, w stanie choroby:
Proporcje są zniekształcone, a zatem wzór
odsetkowy w przypadku braku wartości
bezwzględnych staje się bez znaczenia
Liczebność grup może się zwiększać, np.
w odpowiedzi na reakcję alergiczną może
wzrosnąć liczba eozynofilii
Liczebność grup może się zmniejszać, np.
liczba limfocytów zmniejsza się stopniowo
w przypadku nieleczonego zakażenia HIV
Niedojrzałe komórki, które zwykle znajdują się
jedynie w szpiku kostnym, mogą pojawić się
w krwi obwodowej, np. niedojrzałe granulocyty
u pacjentów z ciężkim zakażeniem
Mogą pojawić się nieprawidłowe, niedojrzałe
komórki, np. blasty u pacjentów z ostrą
białaczką.
Dlaczego różnicowanie białych krwinek za
pomocą
fluorescencyjnej
cytometrii
przepływowej jest lepsze niż inne technologie
rozdziału 5-Diff i różnicowanie 3-Diff?
a) Ocena jest niezależna od wielkości komórki
Różnicowanie krwinek białych przy pomocy
fluorescencyjnej cytometrii odbywa się na
podstawie
zawartości
kwasu
nukleinowego
oraz wewnętrznej struktury i złożoności komórek.
Rozdział 5-Diff daje o wiele więcej informacji niż
rodził 3-Diff w określeniu ewentualnej przyczyny
choroby.
Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o.
2
rev.1 2013-08-19
b) Identyfikacja niedojrzałych komórek
Ważną
zaletą
fluorescencyjnej
cytometrii
przepływowej
jest
możliwość
identyfikacji
niedojrzałych komórek krwi na podstawie większej
zawartości kwasów nukleinowych w porównaniu do
ich dojrzałych odpowiedników. Umożliwiło to
powstanie generacji rozdziału 6-Diff przez dodanie
niedojrzałych granulocytów (IG, ang. immature
granulocytes). Liczba IG uwzględnia promielocyty,
mielocyty i metamielocyty. Obecność niedojrzałych
granulocytów, z wyjątkiem okresu po porodzie
i noworodków poniżej 3 dni, zawsze wskazuje na
wystąpienie patologii. Precyzja automatycznego
liczenia IG jest znacznie lepsza niż metoda
mikroskopowa. Jest idealna do monitorowania
dużej liczby pacjentów i eliminuje pracochłonne
zliczanie ręczne.
Główną zaletą tej metody, której nie posiadają
analizatory 3-Diff i analizatory 5-Diff innych
producentów jest fakt, że różnicowanie WBC nie
zależy od wielkości komórek. Jest to znacznie
bardziej korzystne, ponieważ:
Po poraniu krwi na EDTA zmiany wielkości
komórek następują dość szybko, ponieważ nie
jest to fizjologiczne środowisko dla krwinek,
które znajdują się w warunkach stresu
metabolicznego, co prowadzi do niedoboru
glukozy i w konsekwencji do niemożności
utrzymania równowagi przepływu przez błonę
komórkową, wywołując obrzęk i ostatecznie
rozpad komórek.
Różnicowanie WCB opierające się na wielkości
komórek może stać się niewiarygodne w ciągu
24 godzin. Dla porównania – analizatory
Sysmex klasy X zapewniają wiarygodne
zliczenie rozdziału WBC do 48 godzin po
pobraniu.
c) Rozbudowany system flagowania służący
identyfikacji nieprawidłowych komórek
Inną zaletą analizatorów Sysmex klasy X jest
rozbudowany system flagowania, który umożliwia
jakościową
identyfikację
niedojrzałych
lub
nieprawidłowych komórek. Analizatory 3-Diff także
posiadają system flagowania, ale dostarcza on
mniej informacji, ponieważ całkowicie oparty jest
na zmianach wielkości komórek.
Czy wymagane jest liczenie rozmazu ręcznego?
Metoda mikroskopowa nadal jest niezbędna do
potwierdzenia obecności populacji komórek
nieprawidłowych, które przez analizator zostały
zidentyfikowane jako podejrzane i oflagowane
w celu zwrócenia uwagi operatora.
Oglądanie rozmazu pod mikroskopem nie ma
jednak
na
celu
sprawdzenia
liczebności
poszczególnych grup WBC, tylko potwierdzenia
obecności populacji komórek nieprawidłowych
i wyszczególnienia wszelkich znaczących zmian
morfologicznych. Zliczanie manualne nigdy nie
będzie tak precyzyjne jak automatyczne, ponieważ
liczba zliczanych komórek jest znacznie niższa.
Jednak, analiza automatyczna nie zapewni tak
dokładnej identyfikacji możliwej odmiany zaburzeń
komórkowych. Natomiast jest mało prawdopodobnym, żeby podczas rozmazu ręcznego zostały
odnalezione jakieś nieprawidłowości, jeśli aparat
nie
oflagował
próbki.
Dobrze
wykonana
mikroskopowa ocena rozmazu, zależy od
wyszkolonych i doświadczonych osób, które są
zasobem deficytowym. Pod tym względem aparat
5-Diff przyczynia się do zaoszczędzenia czasu
i zwiększenia efektywności kosztowej, ponieważ
Ryc. 2 Skatergramy z analizatorów Sysmex klasy X.
a) Skatergram różnicujący: fluorescencja, która jest
wskaźnikiem zawartości DNA/RNA w komórce jest
wyrażona na osi Y, natomiast złożoność komórek
i światło rozproszone bocznie jest wyrażona na osi X.
b) kanał WBC/BASO – obecny w analizatorach XT i XE,
wykorzystuje reakcję chemiczną, która pozostawia
bazofile niezmienione, w celu oddzielenia ich od
pozostałych krwinek białych w oparciu o światło
rozproszone czołowo (oś Y) i światło rozproszone
bocznie (oś X).
Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o.
3
rev.1 2013-08-19
znacząco zmniejszają liczbę rozmazów
wykonania
i
ukierunkowuje
laboranta
poszukiwanie określonej patologii.
do
na
analizatorach hematologicznych, a jednocześnie
rośnie ich przepustowość. To oczywiście zmniejsza
dostępność lepszych technologii, uwzględniając
w tym analizę 5-Diff, dla mniejszych laboratoriów.
Sysmex rozpoznał to ograniczenie i zniwelował je
poprzez wprowadzenie analizatorów serii XS. Są
one zaprojektowane dla laboratoriów ze względnie
małą liczbą wykonywanych analiz, ale zapewniają
lepszą analizę, szczególnie próbek patologicznych.
Dlaczego warto wybrać aparaty Sysmex 5-Diff?
Jeśli laboratoria mają zamiar oceniać tylko
podstawowe parametry, takie jak hemoglobina,
liczba płytek i liczba białych krwinek, wystarczający
i generujący niższe koszty jest aparat 3-Diff.
Jednakże w przypadku wykonywania analiz u ludzi
chorych bez wątpienia lepszy jest aparat 5-Diff,
ponieważ:
Rozróżnia populacje krwinek białych
Posiada
lepszą
zdolność
wykrywania
nieprawidłowych komórek
Posiada znacznie lepszy system flagowania
Dostępne są dodatkowe, użyteczne klinicznie
parametry, które mogą dostarczyć więcej
informacji niż sam rozdział
Analizatory klasy X są czymś więcej niż tylko
licznikami komórek – nacisk został skierowany na
identyfikację subtelnych cech jakościowych w celu
odróżnienia stanów normalnych i patologicznych.
Ryc. 3 Skatergram różnicujący Sysmex przedstawia
obszary
występowania
populacji
komórek
nieprawidłowych.
Podsumowanie
Wszystkie informacje uzyskane z aparatu 5-Diff są
przekazywane lekarzowi, który informuje pacjentów
o dalszych decyzjach w sprawie leczenia. W ten
sposób stanowią korzyść dla pacjenta. Z tego
powodu aparaty 5-Diff są zdecydowanie tak samo
lub nawet bardziej korzystne kosztowo niż
analizatory 3-Diff. Redukcja czasu wymaganego
przy wykonaniu analizy mikroskopowej próbek po
oznaczeniu na analizatorze 5-Diff w porównaniu do
analizatora 3-Diff, przyczynia się do ogólnych
korzyści dla laboratoriów. Ogólnie rzecz ujmując,
dostępne właściwości i mierzone parametry są
coraz bardziej zaawansowane w różnych
Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o.
4