FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Beta-Catenin Klon β

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
Beta-Catenin
Klon β-Catenin-1
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Nr kat. IS702
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Beta-Catenin, klon β-catenin-1, Ready-to-Use (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako
Autostainer/Autostainer Plus. Przeciwciała te są przydatne identyfikacji desmoidów (1) i raków jelita grubego (2).
Przeciwciała przeciwko β-kateninie mogą być równieŜ uŜyteczne w identyfikacji gruczolaka okręŜnicy (3).
Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne,
z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych, i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa,
z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Kateniny są to podobne do siebie pod względem struktury białka cytoplazmatyczne, zaliczane do kategorii alfa (α),
beta (β) i gamma (γ), w zaleŜności od ich ruchliwości w elektroforezie (4, 5). Gen β-kateniny zlokalizowany jest na
chromosomie 3p21 i koduje białko o masie 88 kD (4, 5). To białko cytoplazmatyczne ma charakter wielofunkcyjny
odgrywa zasadniczą rolę w zachodzącym pod wpływem kadheryny mocowaniu i organizacji cytoszkieletu (4). Betakatenina bierze równieŜ udział w regulacji ekspresji genów, jako mediator szlaku sygnalizacji Wnt. StęŜenie β-kateniny
w komórkach jest ściśle regulowane przez wielobiałkowy kompleks, zawierający kinazę serynową/treoninową GSK3β,
produkt genu wywierającego działanie supresyjne na nowotwory APC i aksynę, która wspomaga fosforylację oraz
będący jej skutkiem rozkład β-kateniny. Rozregulowanie rozkładu β-kateniny prowadzi do akumulacji białka w
cytoplazmie, a następnie jego translokacji do jądra. Jądrowa β-katenina tworzy kompleksy białkami wiąŜącymi DNA,
takimi jak TCF i LEF, powodując aktywację transkrypcji genów (6).
Patrz dokument “Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych” firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciało monoklonalne jest dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym
białko stabilizujące i azydek sodu w stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: β-catenin-1. Izotyp: Ig G1, kappa.
Immunogen
Rekombinowane C-końcowe białko fuzyjne β-katenina-GST (7).
Swoistość
W testach Western blot ludzkich komórek nabłonka A431, przeciwciało barwi prąŜek odpowiadający ludzkiemu
białku - β-kateninie. Nie obserwowano reaktywności krzyŜowej z α i γ-kateniną (7).
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli odczynniki
są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma
oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek
pochodzących od pacjenta, naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku
odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z
przeciwciałem, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x) (nr kat. K8010/K8004).
(119498-001)
Dako Denmark A/S
IS702/PL/SSM/2009.02.02 str. 1/2
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(nr kat. K8010/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone
zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania.
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisanej dla skrawków
parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat.
K8010). Kolejne kroki barwienia oraz czasy inkubacji zaprogramowano wstępnie w oprogramowaniu aparatów Dako
Autostainer/Autostainer Plus, przy uŜyciu następujących protokołów:
Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µL dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µL dozowanych odczynników)
Autoprogram: BETACAT (bez barwienia kontrastowego) lub BETACATH (z barwieniem kontrastowym)
Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer ” w programach barwienia ≤10 szkiełek. W przypadku
programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy płukania.
Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje
zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie Dako
Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania, i powinny
być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym
nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako, w celu
uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego
protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka
wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować okręŜnicę i wątrobę,
natomiast komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki, jak opisany dla tej tkanki w części
„Charakterystyka wydajnościowa” we wszystkich dodatnich preparatach. Zalecana kontrola ujemna to FLEX
Negative Control, Mouse, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS750).
Interpretacja
wybarwienia
Komórki znakowane przez przeciwciała wykazują odczyn błonowy. Komórki nowotworowe mogą wykazywać
zarówno wzór odczynu cytoplazmatycznego, jak i jądrowego.
Charakterystyka
działania
Tkanki normalne: W okręŜnicy komórki nabłonka wykazują odczyn z zakresu od umiarkowanego do silnego.
W wątrobie, hepatocyty wykazują odczyn z zakresu od słabego do umiarkowanego.
Tkanki patologiczne: Przeciwciało dało odczyn w przypadku 24/30 sporadycznych desmoidów i 8/12 desmoidów u
pacjentów z rodzinną polipowatością gruczołową (1). W badaniach z uŜyciem mikromacierzy tkanki raka jelita
grubego, 657/1310 przypadków wykazało odczyn jądrowy, 1068/1310 wykazało odczyn cytoplazmatyczny i
1107/1310 wykazało odczyn błonowy (2). Przeciwciało znakowało 1/1 przypadków gruczolaka okręŜnicy.
Piśmiennictwo
1.
Carlson JW, Fletcher CDM. Immunohistochemistry for β-catenin in the differential diagnosis of spindle cell
lesions: analysis of a series and review of the literature. Histopathol 2007;51:509-14.
2.
Lugli A, Zlobec I, Minoo P, Baker K, Tornillo L, Terracciano L, et al. Prognostic significance of the wnt signalling
pathway molecules APC, β-catenin and E-cadherin in colorectal cancer-a tissue microarray-based analysis.
Histopathol. 2007;50:453-64.
3.
Iwamoto M, Ahnen DJ, Franklin WA, Maltzman TH. Expression of β-catenin and full-length APC protein in
normal and neoplastic colonic tissue. Carcinogenesis 2000;21:1935-40.
4.
Bracke ME, Van Roy FM, Mareel MM. The E-cadherin/catenin complex in invasion and metastasis. Cur Top
Microbiol Immunol 1996; 213 (Pt 1):123-61.
5.
Ozawa M, Baribault H, Kemler R. The cytoplasmic domain of the cell adhesion molecule uvomorulin associates
with three independent proteins structurally related in different species. EMBO J 1989;8:1711-7.
6.
Willert K, Nusse R. Curr Opin Genet Dev 1998;8:95-102.
7.
Antibody Certification. On file at DakoCytomation Corporation.
Objaśnienie symboli
N ume r ka ta log owy
Tempe ratura
prze chow ywan ia
Zu Ŝyć p rzed
Wyró b medyczny do
d ia gno styki in vi tro
Zawa rto ść w ysta rcza na
<n> testów
Produ cent
S prawd zić w instrukcj i
sto sowa nia
Nu mer serii
(119498-001)
Dako Denmark A/S
IS702/PL/SSM/2009.02.02 str. 2/2
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17