Spektrometria Mas

Ćwiczenie nr 12
Spektrometria Mas
Analiza jakościowa i ilościowa benzokainy za pomocą
wysokorozdzielczego chromatografu gazowego sprzęgniętego
ze spektrometrem mas z jonizacją elektronami (EI)
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z techniką spektrometrii mas typu EI (Elektron Impact,)
interpretacją, obróbką komputerową widm masowych, doborem mas do analizy ilościowej
oraz sposobem identyfikacji substancji na podstawie ich widm.
I.Analiza jakościowa
Analizie podany zostanie metanolowy roztwór benzokainy (ester kwasu paminobenzoesowego, PABA) o wzorze sumarycznym C9H11NO2 i masie molowej 165,19
g/mol.
Z otrzymanego roztworu dodaj dokładnie 1,5 ml do fiolki a następnie szczelnie zakapsluj przy
pomocy ręcznej kapslownicy. Fiolkę umieść w odpowiednim gnieździe autosamplera
znajdującego się na obudowie chromatografu gazowego.
Ustaw program analizy chromatograficznej:
temperatura pieca: 50°C (2 min.), potem 15°/min.do 300°C,
wstrzymać 11 min.
temperatura komory nastrzykowej: 250°C, tryb: Splitless,
Ilość nastrzyku: 1µl, płukanie: dwa razy z fiolki A, dwa razy fiolki B, powtórzyć po nastrzyku
Możesz skorzystać z gotowego programu sprawdzając powyższe parametry.
Wejdź na stronę „Tune” programu „TurboMass” i sprawdź czy ciśnienie jest odpowiednie
(zbyt mała próżnia spowoduje zniszczenie emitera elektronów-żarnika). Następnie ustaw
parametry anlizy spektrometru masowego trybie „Full Scann” w zakresie mas od 30 do 180
m/z:
Mass start: 40 m/z
Mass end:190 m/z
1
Time (okno czasowe w którym wykonywane będzie skanowanie wybranych mas): Start-0;
End-23 min.
Method: centroid
Scan Time (określa czas trwania każdego skanu w sekundach): 0,5
Inter-Scan Deley (określa czas w sekundach pomiędzy zakończeniem skanowania i
rozpoczęciem następnego (ogólny czas skanowania=Scan Time+ Inter-Scan Deley)): 0.1.
Zapisz swoją analizę w arkuszu analiz wyszczególniając metodę chromatograficzną oraz
metodę spektrometrii masowej, którą utworzyłeś (pamiętaj o wpisaniu numeru gniazda
autosamplera z którego ma być pobrana analiza).
Sprawdź szczelność systemu na stronie „Tune” wpisując masy helu(gazu nośnego) oraz
gazów stanowiących główne składniki atmosfery ziemskiej i porównaj proporcje tych pików.
Jeżeli ciśnienie (próżnia) jest wystarczające oraz nie stwierdzasz przecieków-uruchom
analizę.
Na podstawie wzoru strukturalnego oraz twojej wiedzy z zakresu fragmentacji
kationorodników oraz reguły parzystości zaproponuj w poniższej tabeli teoretyczne metody
fragmentacji, zaznaczając masę danego fragmentu. Postaraj się nazwać każdy opisany przez
ciebie rodzaj fragmentacji np. przegrupowanie McLafferty’ego, fragmentacja α inicjowana
przez rodnik, fragmentacja α inicjowana przez ładunek itd. Pamiętaj, że produkty nie
naładowane dodatnio np. rodniki (w wyniku fragmentacji powstaje kation i rodnik) nie
ujawniają się w widmie MS. Podczas opisywania reakcji fragmentacji ładunek umieszcza się
w miejscu o najniższym potencjale jonizacji pamiętając, że w rzeczywistości jest on
rozproszony w obrębie całej cząsteczki. Pamiętaj, też o efekcie indukcyjnym, który powoduje,
iż czasami atom o niskim potencjale jonizacji przyłącza elektron i tworzy obojętny rodnik.
Posługuj się kalkulatorami mas znajdującymi się w programie „TurboMass” lub dostępnymi
za darmo w Internecie.
2
Proponowane typy fragmentacji
3
Po zakończeniu analizy obejrzyj chromatogram (w spektrometrii masowej nazywany TIC
(Total Ion Current), gdyż powstaje z „ogólnego prądu” spektrometrii mas). Przeskanuj cały
TIC znajdujący się w okolicach 10 min i porównaj czy znalazły się tam masy fragmentów
zaproponowane przez ciebie w tabelce powyżej.
Skorzystaj z dostępnej w programie biblioteki widm masowych, aby potwierdzić czy wybrany
pik chromatograficzny należy do benzokainy, pamiętając o użyciu funkcji „Combine” i
odjęciu widma mas tła.
Obejrzyj widma masowe innych pików znajdujących się na chromatogramie zidentyfikuj je
przy pomocy biblioteki widm i zaproponuj od czego mogą pochodzić np.: adsorbent kolumny,
zanieczyszczenie benokainy, produkt rozkładu benzokainy etc?
Przy pomocy funkcji „Display Mass” sprawdź czy pojawiają się w chromatografie piki o
masach występujących w benzokainie.
Oblicz (przy pomocy zainstalowanej aplikacji) wartość stosunku sygnału do szumu. Określ
możliwości analizy jakościowej i ilościowej takiego stężenia benzokainy (pamiętając o
efekcie matrycy). Za granicę wykrywalności przyjmuje się wartość S/N=3 za granicę
oznaczalności S/N=8-10.
Wybierz i uzasadnij masy które będziesz skanował w trybie SIM (Selected Ion Monitoring)
podczas oznaczania benzokainy.
Wnioski dotyczące analizy jakościowej:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
4
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
……………………………………………...................................................................................
..............................
5
II. Analiza ilościowa
Po wybraniu mass do wykonania analizy w trybie SIM (pamiętając, że wybieramy masy
charakterystyczne dla związku i najbardziej intensywne) przejdź do okna analizy MS w trybie
SIM/SIR i ustaw następujące parametry:
Mass: wpisz wybrane przez ciebie masy i dodaj do tabelki
Dwell czyli czas w sekundach, w których wybrana masa ma myć monitorowana: najczęściej
wybieramy dziesiąte części sekundy
Inter Chennel Delay czyli odpowiednik Inter-Scan Deley z analizy w trybie Full Scan:
standardowo ustawiamy 0.02
Span czyli okno mas, margines jaki ma być skanowany w obrębie zadanej masy. Czym
większa wartość tym mniejsze prawdopodobieństwo „przeoczenia” zadanej masy ale
jednocześnie mniejsza czułość analizy: standardowo ustawiamy tę wartość na 0.2 ( czyli
np.skanowana jest wartość powiedzmy 100 to w rzeczywistości skanowane są masy od 80120 m/z)
Sporządź 5 roztworów wzorcowych stężeniach 20,40;80;120,160 mg/100ml i umieść po 1,5
ml w oznaczonych fiolach poczym zakapsluj je.
Umieść w odpowiednich gniazdach autosamplera i wyznacz warunki analizy w arkuszu
analiz, zostawiając metodę chromatograficzną taką jak w analizie jakościowej oraz
zaznaczając zaprogramowaną przez ciebie analizę w trybie SIM (pamiętaj o zaznaczeniu
odpowiednich gniazd autosamplera oraz wykonaniu ponownej analizy badanej próbki w
trybie SIM.
Po wykonaniu analiz, odnajdź pik (TIC) znajdujący się przy czasie retencji zidentyfikowanym
(podczas analizy jakościowej) dla benzokainy i wyznacz wartości S/N. Porównaj jak
zwiększyła się ta wartość i tym samym SIM wpływa na poprawę czułości analizy.
Pamiętając, że jest to tylko ogólne oszacowanie, oszacuj jakie stężenia można by
zidentyfikować a jakie oznaczyć w trybieSIM (S/N=8-10-granica oznaczalności, S/N=3granica wykrywalności).
Zintegruj pik chromatograficzny (TIC) zidentyfikowany jako benzokaina i sporządź krzywą
regresji wyznaczając parametry regresji. Następnie oblicz zawartość benzokainy w badanej
próbce. W zależności jak postanowi prowadzący ćwiczenia analizę ilościową wykonaj
sporządzając ręcznie krzywą wzorcową i obliczając zawartość lub skorzystaj z gotowej
aplikacji (wymagającej napisania jednak programu ilościowego) programu „TurboChrom.
Mimo, iż oznaczenie benzokainy wykonane było bez użycia wzorca wewnętrznego opisz
jakie korzyści daje użycie metody wzorca wewnętrznego i jaki wzorzec mógłby być tu użyty.
Pod wnioskami dotyczącymi oznaczenia benzokainy umieść wydruki widm masowych oraz
chromatogramy użyte podczas ćwiczeń.
6
Wnioski dotyczące ilościowego oznaczenia benzokainy:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
………......................
Zakres wiedzy potrzebnej do przystąpienia do ćwiczenia:
-budowa spektrometru masowego z elektronowym źródłem jonizacji i pojedynczym
kwadrupolem
- rodzaje fragmentacji kationów nieparzystoelektronowych
-interpretacja widm masowych (typ jonizacji EI)
Źródła:
Wykłady dla studentów farmacji i oddziału analityki medycznej II roku prof. Z.J Kokot
Spektroskopia Mas E. de Hoffman, J Charette, V. Stroobant
7