Perspektywy wykorzystania komórek macierzystych sznura

&ARM0RZEGL.AUK†
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
0ERSPEKTYWYWYKORZYSTANIAKOMÌREKMACIERZYSTYCH
SZNURAPÃPOWINOWEGOWMEDYCYNIEREGENERACYJNEJ
4HEUMBILICALCORDSTEMCELLSASAPROMISINGCELLSOURCE
INREGENERATIVEMEDICINE
!NNA+ULCZYCKA!RKADIUSZ/RCHEL%WA#HODUREK.ATALIA'AWLIK:OFIA$ZIER˜EWICZ
+ATEDRAI:AKŒAD"IOFARMACJI
7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNYZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJ
gL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Niedostateczna dostępność organów do przeszczepu oraz ryzyko nadmiernej reakcji ze strony układu immunologicznego biorcy wskazuje na konieczność wykorzystania nowych
rozwiązań z zakresu nauk biomedycznych mających na celu
opracowanie sztucznych narządów. Możliwości takie daje
inżynieria tkankowa, u której podstaw zakłada się wykorzystanie komórek umieszczanych w trójwymiarowym rusztowaniu. Najbardziej pożądanym typem komórek są komórki
macierzyste ze względu na ich zdolność do samoodnowy,
duży potencjał różnicujący i możliwość odtwarzania nie tylko tkanek, ale też całych narządów.
Wcześniej wykorzystywane szpikowe mezenchymalne komórki macierzyste (BMSC) mają pewne ograniczenia związane z niewielką liczebnością ich populacji zasiedlającej szpik
kostny, inwazyjnością procedury pozyskiwania oraz niedostatecznym potencjałem proliferacyjnym. Problemy te nie występują w przypadku innego źródła pozyskiwania MSC jakim
jest galareta Whartona czyli tkanka łączna otaczająca naczynia
krwionośne sznura pępowinowego. Komórki wyizolowane
z galarety Whartona (UCSC) mają charakter miofibroblastów.
Mają one zdolność różnicowania zarówno w komórki łącznotkankowe jak również w m. in. kardiomiocyty czy neurony
produkujące dopaminę. UCSC nie posiadają na swojej powierzchni markerów charakterystycznych dla linii hematopoetycznej (CD45 i CD34) oraz antygenów zgodności tkankowej
układu MHC klasy II przez co nie są immunogenne. Cechują
się wyższym potencjałem proliferacyjnym oraz możliwością
większej liczby podziałów przed wystąpieniem oznak starzenia się w stosunku do BMSC. Dodatkowym atutem jest brak
inwazyjności procedury izolacji komórek, gdyż sznur pępowinowy jest postnatalnym materiałem odpadowym.
An insufficient number of organs available for transplantation and the risk of an overreactive immune response generate the great need for developing new solutions in biomedical
sciences to create some artificial organs. Tissue engineering
provides necessary solutions based on the utilization of cells
seeded on three-dimensional scaffolds. The most desired type
of cells are stem cells because of their ability to self-renewal,
great differentiating potential and ability to formation not
only single tissues but also whole organs.
Commonly used bone marrow mesenchymal stem cells
(BMSC) have some disadvantages. Their number in bone
marrow is very low. The isolation procedure is invasive and
cells often have inadequate proliferative potential. These
problems probably can be resolved by using alternative
sources of stem cells. Among them, Wharton’s jelly, a connective tissue surrounding blood vessels in the umbilical cord
appears to be most interesting. Wharton’s jelly is composed
of myofibroblast-like stromal cells that are generally considered to be mesenchymal stem cells (UCSC). They are able to
differentiate into cells of chondrogenic, adipogenic and osteogenic lineages as well as cardiomyocytes or dopaminergic
neurons. UCSC do not express hematopoietic lineage markers (CD45, CD34) and MHC class II antigens so they are
not immunogenic. UCSC are characterized by a higher proliferative potential and a greater number of population doublings
without any signs of aging compared to BMSC. An additional
advantage is the lack of invasiveness of the cell isolation procedure as the umbilical cord is a postnatal waste material.
Key words: tissue engineering, mesenchymal stem cells,
UCSC cells
Słowa kluczowe: inżynieria tkankowa, mezenchymalne komórki macierzyste, komórki UCSC
Inżynieria tkankowa jako dziedzina medycyny
Zarówno nagły wypadek jak i przewlekły proces chorobowy mogą prowadzić do uszkodzenia lub nawet całkowitego
zniszczenia organów czy tkanek. Możliwości leczenia, jakie
daje współczesna medycyna, często są w takich przypadkach
niezadawalające. Ograniczają się one do metod takich jak
transplantacja, rekonstrukcja chirurgiczna czy zastosowanie
sztucznych protez. W przypadku transplantacji często pojawiają się problemy z dostępnością organów do przeszczepu.
Istnieje ponadto duże ryzyko odrzucenia przeszczepu w wyniku nadmiernej reakcji układu immunologicznego [1, 2].
&ARM0RZEGL.AUK
Obecnie duże nadzieje na przełom w terapii wiąże się
z rozwojem inżynierii tkankowej, stosunkowo młodej dziedziny nauki, stanowiącej nowe narzędzie medycyny regeneracyjnej [3, 4].
Inżynieria tkankowa jest dziedziną łączącą wiedzę z zakresu hodowli tkankowych, biomateriałów oraz transplantologii i wykorzystującą ją do odtwarzania tkanek, a także
projektowania sztucznych narządów. Jej głównym celem
jest wytwarzanie tkanek, w kulturach in vitro, a następnie
implantowanie ich w miejsca, które uległy uszkodzeniu
[5-7]. Przykładem zastosowania tej strategii w praktyce
są takie produkty jak Hyalograft-C czy Apligraft. W przypadku Hyalograftu–C autologiczne chondrocyty osadzane
są na trójwymiarowym rusztowaniu (ang. scaffold) wykonanym z kwasu hialuronowego, poddanego chemicznym
modyfikacjom (HYAFF 11) i wszczepiane pacjentom z konfliktem rzepkowo-udowym [8, 9]. Z kolei trudno gojące się
owrzodzenia i rany można pokrywać „żywym opatrunkiem”
- Apligraftem, który jest ekwiwalentem skóry, posiadającym
zarówno warstwę naskórkową, jak i warstwę skóry właściwej. Obecne w nim komórki, substancje odżywcze, białka
oraz czynniki wzrostu dostają się bezpośrednio w rejon
uszkodzenia i przyspieszają proces regeneracji [10, 11]. Aktualnie możliwe jest także zastąpienie, w plastyce pęcherza
moczowego, wcześniej wykorzystywanych segmentów żołądkowo-jelitowych przez wszczep skonstruowany z autologicznych komórek, umieszczonych na rusztowaniu z kwasu
poliglikolowego i kolagenu, okryty otrzewną [12].
Znaczenie mezenchymalnych
komórek macierzystych w inżynierii tkankowej
Rozwój inżynierii tkankowej w ostatnich latach jest
mocno związany z postępami badań nad komórkami macierzystymi. Komórki te charakteryzują się zdolnością do samoodnowy, dużym potencjałem do różnicowania, a także
możliwością odtwarzania tkanek czy całych narządów
[13, 14].
Pionierem badań nad mezenchymalnymi komórkami
macierzystymi był Alexander Friedenstein [15]. Badacz ten,
w latach 70-tych ubiegłego wieku, wykrył w czerwonym
szpiku kostnym stosunkowo nieliczną populację komórek,
które w warunkach in vitro ulegały adhezji do powierzchni
naczynia i intensywnie proliferowały tworząc charakterystyczne kolonie. Ponieważ komórki te wyglądem przypominały fibroblasty badacz określił je terminem „colony forming unit – fibroblastic” (CFU-F) czyli jednostki tworzące
kolonie fibroblastów [15]. Wykazał on także, że komórki
tworzące te kolonie odznaczały się zdolnością do przekształcania się w komórki kości – osteoblasty. Dalsze badania nad
tymi komórkami ujawniły, że w odpowiednich warunkach
hodowli mają zdolność do różnicowania się w chondrocyty, osteocyty, adipocyty oraz miocyty [16, 17]. Caplan [18]
po raz pierwszy użył w odniesieniu do tych komórek terminu „mezenchymalne komórki macierzyste” (mesenchymal
stem cells – MSC) i ta nazwa jest obecnie powszechnie stosowana. Nie jest ona jednak akceptowana przez wszystkich,
stąd można w literaturze spotkać odmienne określenia m.
in. komórki zrębu szpiku, multipotencjalne komórki zrębu
i mezenchymalne komórki zrębu. MSC określane są jako
komórki multipotencjalne, czyli zdolne do różnicowania się
w kierunku różnych typów komórek w obrębie tej samej
tkanki lub listka zarodkowego. Panuje powszechna zgoda
co do tego, że możliwe jest indukowanie ich różnicowania
w kierunku różnych rodzajów komórek mezodermalnych
(z wyjątkiem komórek hematopoetycznych) [19]. Warto
nadmienić, że istnieją doniesienia o różnicowaniu MSC do
komórek o charakterze endodermalnym (np. hepatocyty, komórki wysp trzustkowych) oraz ektodermalnym (neurony,
komórki glejowe) [17, 19, 20]. Jednakże możliwość różnicowania się MSC w inne, niż mezodermalne, typy komórek
jest nadal kontrowersyjna. Powyższe obserwacje mogłyby
być rezultatem obecności w szpiku kostnym niezwykle
rzadkich komórek o cechach zbliżonych do embrionalnych
komórek macierzystych, które izolowałyby się wspólnie
z MSC. W wielu ośrodkach badawczych izolowano ze szpiku kostnego komórki pluripotencjalne nadając im przy tym
różne nazwy, np. MAPC (multipotent adult progenitor cells)
[21, 22] MIAMI (marrow-isolated adult multilineage inducible cells) [23] oraz VSEL (very small embryonic-like stem
cells) [24]. Wymienione typy komórek izolowane były różnymi metodami i charakteryzowały się nieco odmiennymi
właściwościami.
Niewątpliwie populacja tworzących kolonie, adherentnych komórek (CFU-F) izolowana z czerwonego szpiku
kostnego jest bardzo niejednorodna: tylko część jej komórek stanowią multipotencjalne, zdolne do samoodnowy, komórki macierzyste (MSC). W jej składzie można wyróżnić
także komórki trójpotencjalne, bipotencjalne oraz unipotencjalne, gdzie te ostatnie charakteryzują się tylko zdolnością
np. do kościotworzenia [17, 25]. Podczas prowadzenia hodowli MSC pochodzących ze szpiku kostnego stwierdzono,
że po osiągnięciu stanu konfluencji ulegają kontaktowemu
hamowaniu wzrostu [26]. Intrygujący jest fakt, że w chwili
izolacji ze szpiku kostnego komórki te nie wykazywały aktywności podziałowej. Obserwacje te stały się podstawą do
przypuszczeń, że in vivo komórki te większość czasu pozostają w spoczynku a ich proliferacja może być aktywowana
podczas procesu regeneracji tkanki [27]. Po przeniesieniu
do hodowli aktywność podziałowa MSC zwiększa się pod
wpływem czynników obecnych w surowicy bydlęcej dodawanej standardowo do pożywki.
Mezenchymalne komórki macierzyste zaczęły już być
stosowane do celów terapeutycznych [28], a w przyszłości
należy spodziewać się dynamicznego rozwoju metod leczenia z ich wykorzystaniem. Obecność MSC w przeszczepianym materiale przyspiesza odnowę układu hematopoetycznego zarówno po autologicznych jak i allogenicznych
przeszczepach hematopoetycznych komórek macierzystych
(HSC) [28]. Sądzi się, że immunosupresyjne właściwości
tych komórek mogą chronić przed chorobą „przeszczep
przeciw gospodarzowi”, a także zapobiegać zjawisku odrzucenia po przeszczepach narządowych [28]. MSC podawano pacjentom cierpiącym na chorobę Crohna, a także
leczonym z powodu udaru niedokrwiennego mózgu czy
zawału mięśnia sercowego uzyskując poprawę stanu klinicznego [29-31]. Podejmowano także próby wykorzystania
własnych MSC pacjenta do odtwarzania uszkodzonych odcinków dróg oddechowych. Jako matrycę wykorzystywano
fragmenty tchawic osób zmarłych. Były one oczyszczane
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
z komórek i mogły być wszczepiane biorcom bez ryzyka odrzucenia gdyż, po usunięciu komórek, nie posiadały antygenów zgodności tkankowej. Obecność w matrycy czynników
proangiogennych gwarantowała zajście procesu neowaskularyzacji i odpowiednie ukrwienie po implantacji. Przed
wytworzeniem biowitalnego implantu, komórki nabłonka
oddechowego pacjenta pozyskiwano w wyniku bronchoskopii, a MSC z aspiratu szpikowego. Wyizolowane MSC
poddawano działaniu czynników chondrogennych a następnie nanoszono na matrycę, od strony zewnętrznej. Dzięki
tak temu możliwa była transplantacja odcinków dłuższych
niż 6cm, które uzyskiwano we wcześniejszych doświadczeniach. Wyniki transplantacji stanowią nadzieję dla osób
z ciężkimi uszkodzeniami dróg oddechowych zwłaszcza
w ich późnych stadiach [32].
Terapia komórkowa z wykorzystaniem MSC należy do
bezpiecznych ponieważ komórki te, w stanie niezróżnicowanym, nie przyczyniają się do powstania guzów - potworniaków, co odróżnia je od embrionalnych komórek macierzystych [14, 17]. Problematyczny jest natomiast brak jednego
wspólnego markera dla linii mezenchymalnej. Powoduje to
utrudnienia podczas izolacji tych komórek [17].
W celu izolowania ludzkich MSC szpik kostny standardowo pobiera się z talerza kości biodrowej. Metoda ta odznacza się dużą inwazyjnością i znacznym dyskomfortem
dla pacjenta. Szpik kostny jest stosunkowo ubogim źródłem
MSC. Wraz z wiekiem dawcy, liczba MSC w szpiku znacznie spada. U noworodków jedna na 10 000 komórek szpiku
to mezenchymalna komórka macierzysta. U nastolatków już
jedna na 100 000, natomiast w przypadku 50 – latka tylko
jedna na 400 000 komórek szpiku to komórka macierzysta
[18].
Obecnie wiadomo jednak, że komórki o właściwościach zbliżonych do MSC ze szpiku kostnego występują
powszechnie w wielu tkankach i narządach organizmu. Ich
obecność wykazano m. in. w tkance kostnej, tkance tłuszczowej, skórze, mięśniach szkieletowych, miazdze zębów,
płucach i płodowej wątrobie [17, 33]. Udało się je nawet
wyizolować z krwi obwodowej poprzez mobilizację m. in.
chemokiną SDF-1 [34]. Bogatym źródłem MSC okazały się
tkanki towarzyszące płodowi, które po porodzie nie spełniają już żadnej roli fizjologicznej i zostają odrzucone. Komórki te izolowano z łożyska, sznura pępowinowego, krwi
pępowinowej, płynu owodniowego i owodni [35]. Sznur
pępowinowy wydaje się być jednym z najlepszych źródeł
mezenchymalnych komórek macierzystych zarówno do badań jak i do ewentualnych zastosowań klinicznych. Biorąc
pod uwagę potencjalne możliwości wykorzystania tych komórek w terapii, jest wysoce prawdopodobne, że ich bankowanie i przechowywanie stanie się przynajmniej tak samo
korzystne jak przechowywanie krwi pępowinowej [36].
Sznur pępowinowy
jako źródło komórek macierzystych
Sznur pępowinowy składa się z trzech spiralnie skręconych naczyń krwionośnych (dwu tętnic i jednej żyły) otoczonych galaretowatą tkanką łączną (tzw. galaretą Whartona) i jest pokryty nabłonkiem. Galareta Whartona rozwija
się z mezodermy, jest bogata w białka kolagenowe (głównie
kolagen I oraz III) oraz w glikozoaminoglikany (wśród których najobficiej występuje kwas hialuronowy, stanowiący
aż 70% wszystkich glikozoaminoglikanów). Białka kolagenowe stanowią ok. 50% odtłuszczonej suchej masy sznura
pępowinowego. Galareta Whartona zapewnia utrzymanie
drożności naczyń krwionośnych sznura pępowinowego
zapobiegając tworzeniu się zagięć lub zaciśnięciu światła
naczyń [37]. Różnice w zagęszczeniu komórek i ich właściwościach stały się podstawą do wyróżnienia w zrębie sznura
pępowinowego stref: okołonaczyniowej, międzynaczyniowej i podowodniowej [38]. Komórki wchodzące w skład
galaretowatej tkanki łącznej sznura pępowinowego posiadają cechy zarówno fibroblastów jak i włókien mięśniowych
gładkich, dlatego w piśmiennictwie komórki te określa się
terminem „miofibroblasty” [39]. Stwierdzano w nich obecność desminy oraz α-aktyny mięśni gładkich, a ponadto
wykazują one właściwości kurczliwe. Brak ekspresji mięśniowej miozyny, obecność wimentyny to wspólne cechy
tych komórek z fibroblastami. Komórki te są odpowiedzialne za syntezę składników macierzy pozakomórkowej galarety Whartona [38]. Sądzi się, że miofibroblasty najmniej
zróżnicowane, zdolne do szybkich podziałów znajdują się
w podowodniowej strefie sznura pępowinowego, natomiast
komórki najsilniej zróżnicowane znajdują się najbliżej naczyń krwionośnych.
W ostatnich latach ukazały się publikacje, w których
wykazano niezwykłą plastyczność miofibroblastów pochodzących z galarety Whartona [38, 40]. Komórki te hodowane w odpowiednich warunkach różnicowały się nie tylko
w kierunku komórek łącznotkankowych (chondrocyty,
osteoblasty, adipocyty) lub kardiomiocytów, ale także przekształcały się w komórki o właściwościach neuronów, produkujące dopaminę [38, 41]. Miofibroblasty te można stosunkowo łatwo wyizolować z tkanki poprzez enzymatyczne
trawienie składników macierzy pozakomórkowej (standardowo używa się kolagenazy i hialuronidazy). Dobre wyniki
daje też technika eksplantacji polegająca na przeniesieniu
do hodowli niewielkich fragmentów tkanki łącznej sznura
pępowinowego. Fragmenty te po pewnym czasie przyklejają się do powierzchni naczynia hodowlanego a miofibroblasty migrują z ich wnętrza na tę powierzchnię [42, 43].
Wyizolowane w ten sposób komórki charakteryzują się
morfologią zbliżoną do fibroblastów oraz ekspresją szeregu
antygenów powierzchniowych typowych dla mezenchymalnych komórek macierzystych. Należą do nich m. in. CD105,
CD73, CD90, CD44, CD51, SH2 i SH3 [40]. W komórkach
tych nie stwierdzono ekspresji markerów linii hematopoetycznej takich jak CD45 czy CD34. Jest to zgodne z ustaleniami Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej (ISCT), które uznaje komórkę za mezenchymalną jeśli
spełnia ona następujące kryteria: tworzy populację komórek
zdolnych do adherencji w plastiku, nie posiada markerów
charakterystycznych dla linii hematopoetycznych (CD14,
CD34, CD45, HLA klasy II), posiada na swojej powierzchni
określone makrocząsteczki m. in. CD73, CD29 czy CD105
oraz ma zdolność do samoodnowy i potencjał różnicowania
w różne linie komórkowe w warunkach in vitro [44, 45].
Zaobserwowana, w komórkach izolowanych ze zrębu sznura pępowinowego, ekspresja czynników transkrypcyjnych
charakterystycznych dla embrionalnych komórek macie-
&ARM0RZEGL.AUK
rzystych, takich jak: Oct-4 czy Nanog, może świadczyć, że
komórki te zachowały pewne właściwości typowe dla ESC
(embryonic stem cells) i posiadają duże możliwości różnicowania [45].
Mezenchymalne komórki macierzyste z galarety Whartona (UCSC, umbilical cord mesenchymal stem cells) odznaczają się wyższą aktywnością podziałową od mezenchymalnych komórek szpikowych (BMSC, bone marrow
mesenchymal stromal cells) oraz stosunkowo dużą aktywnością telomerazy [46]. Istnieją doniesienia, że UCSC
zdolne są do ok. 60 podziałów przed pojawieniem się oznak
starzenia. Obliczono, że z fragmentu sznura pępowinowego
o długości 15 cm można wyizolować ok. 4r105 komórek
macierzystych, co oznacza że narząd ten jest bardzo bogatym źródłem tych komórek [46]. Dla porównania w szpiku
kostnym odnajduje się tylko 1-10 mezenchymalnych komórek macierzystych w przeliczeniu na 106 jednojądrzastych
komórek tam występujących [38].
W początkowym stadium prowadzenia hodowli czas podwojenia populacji wynosi od 60 do 85 godzin i zmniejsza
się wraz z liczbą pasaży. Różnice w szacowanym czasie podwojenia populacji oraz liczbie podziałów bez oznak starzenia uzyskiwane przez różnych badaczy wskazują na obecność subpopulacji wśród komórek izolowanych z galarety
Whartona [38]. Przy pomocy techniki CCE (counterflow
centrifugal elutriation) wyróżniono subpopulacje różniące
się rozmiarami i morfologią. Zauważono, że mniejsze komórki miały większy potencjał proliferacyjny i większą ekspresję markerów typowych dla MSC na swojej powierzchni.
Prawdopodobnie są one prekursorami populacji większych
i bardziej zróżnicowanych komórek, których ilość zwiększa
się w czasie prowadzenia hodowli długoterminowej [47].
Stwierdzono, że na powierzchni komórek izolowanych
z galarety Whartona znajduje się zwiększona, w stosunku do
BMSC, ilość markera CD146. W dorosłym organizmie marker ten występuje na komórkach śródbłonka, które są zaangażowane w procesy neowaskularyzacji w czasie trwania procesów chorobowych. Doświadczalnie stwierdzono, iż komórki
UCSC CD146+ posiadają potencjał chondrogenny, osteogenny i adipogenny, w odróżnieniu do komórek CD146- [26].
Wcześniej wspomniana cecha hamowania kontaktowego w czasie trwania hodowli nie dotyczy UCSC. Brak takiej
inhibicji jest charakterystyczny dla linii nowotworowych.
W hodowlach UCSC obserwowano tworzenie agregatów komórek ponad monowarstwą jednakże bez cech transformacji
komórek. Wykonując przyżyciowe barwienie błękitem trypanu stwierdzono, że komórki budujące takie agregaty były
żywe. Po przeniesieniu do nowego naczynia agregaty mogły tworzyć prawidłowe linie hodowlane [26]. Biorąc pod
uwagę duży potencjał proliferacyjny omawianych komórek,
brak spontanicznej transformacji nowotworowej jest niesłychanie pożądaną cechą z punktu widzenia ich zastosowania klinicznego. Co więcej cykle rozmrażania i zamrażania
materiału nie wywoływały widocznego zmniejszenia liczby
żywych komórek, a stabilność linii zwiększała użyteczność
komórek i możliwość przechowywania w warunkach laboratoryjnych [46].
Brak ekspresji HLA klasy II na komórkach UCSC i zdolność modyfikacji cząsteczek HLA klasy I umożliwia wszczepianie tych komórek zarówno na drodze allo- jak i kse-
notransplantów, dzięki czemu możliwe jest odniesienie eksperymentalnego modelu zwierzęcego dla przyszłych aplikacji u ludzi. Właściwości immunosupresyjne UCSC potwierdzone zostały w kokulturach, gdzie ich obecność hamowała
proliferację aktywowanych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i szczurzych splenocytów. Immunogenność UCSC mogła być indukowana przez interferon-γ
(IFN-γ), który stymulował ekspresję cząstek MHC na powierzchni tych komórek. Mezenchymalne komórki macierzyste sznura pępowinowego powodowały immunosupresję
poprzez hamowanie proliferacji i odpowiedzi limfocytów T,
modulację funkcji komórek dendrytycznych oraz indukcję
limfocytów T regulacyjnych. Dodatkowo zachodziła w nich
ekspresja podtypu G6 antygenu HLA, który nie był wykrywany w BMSC. Wpływ tego podtypu na immunogenność
i immunosupresję jest wciąż badany, ze względu na wcześniejsze doniesienia o jego udziale w ochronie płodu przez
działaniem układu immunologicznego matki [45].
Cechą charakterystyczną mezenchymalnych komórek macierzystych jest ich wysoki potencjał różnicowania.
W badaniach porównawczych dotyczących osteogenezy
wykazano, że aktywność enzymatyczna alkalicznej fosfatazy i tempo mineralizacji były większe w przypadku
UCSC niż BMSC. Aktywacja szlaku sygnalizacyjnego Wnt
wpływała na kościotworzenie zarówno w populacji UCSC
jak i BMSC, a profil ekspresji genów z nim związany był
zbliżony w obu populacjach – wyjątkami była nadekspresja
genów Fz2, DKK1 i PITX2 oraz obniżona ekspresja genów
Wnt1, Wnt5a, Wnt5B, Fz1, Fz5 i Fz7 w przypadku komórek
UCSC w stosunku do BMSC [26, 47]. Podejmowane są próby wykorzystania UCSC w tworzeniu biowitalnych implantów kostnych. Postęp inżynierii tkankowej umożliwił opracowanie biodegradowalnych trójwymiarowych nośników
z kolagenu typu I i III. Wyższa ekspresja wskaźnika kościotworzenia – osteopontyny w BMSC najprawdopodobniej
wynikała z jego stałej wysokiej obecności w szpiku, gdzie
wspomaga on samoodnowę komórek hematopoetycznych.
Niezależnie od poziomu ekspresji osteopontyny zaobserwowano zwiększoną ekspresję składowych macierzy zarówno
w hodowlach UCSC jak i BMSC, po dodaniu czynników
osteogennych, przy czym najlepsze zdolności kościotworzenia miały komórki UCSC będące w kontakcie z kolagenowym rusztowaniem. Dodatkowo ekspresja metaloproteinazy
1 i 2 umożliwiała migrację tych komórek do wnętrza trójwymiarowego rusztowania [48]. Także zastosowanie podłoży
z fosforanu wapnia usieciowanych i wzmocnionych chitozanem umożliwiło wykorzystanie komórek wyizolowanych
z galarety Whartona do odbudowy ubytków kostnych, gdyż
takie konstrukty w warunkach in vitro nie były cytotoksyczne, a proliferacja i adherencja komórek przebiegała na bardzo dobrym poziomie [49].
Kolejnym wyzwaniem dla inżynierii tkankowej jest
możliwość efektywnej chondrogenezy UCSC z wykorzystaniem trójwymiarowych podłoży. Wang i wsp. [44] wskazali, że względnie duże zagęszczenie komórek nanoszonych
na rusztowanie sprzyja wydajnej kolonizacji nośnika oraz
zapewnia komórkom optymalne warunki do wzrostu w trakcie trwania hodowli. Autorzy ci [44] stwierdzili również, że
ekspresja kolagenu typu I i glikozoaminoglikanów w UCSC
była większa niż w komórkach chrząstki z wyrostków kłyk-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
ciowych, pod warunkiem odpowiednio dużego zagęszczenia komórek podczas zakładania hodowli na nośniku [42].
Kolejne doświadczenia wykazały, iż dodanie do środowiska
hodowli TGF-β3 (transforming growth factor-β3) i IGF-1
(insulin-like growth factor 1) zwiększało syntezę kolagenu
typu II i glikozoaminoglikanów, co umożliwiło tworzenie
się prawidłowej chrząstki szklistej. Ze względu na kurczenie rusztowania wykonanego z poliglikolidu (polimeru odznaczającego się stosunkowo szybkim tempem degradacji
hydrolitycznej) i uwalnianie komórek do medium konieczne
jest zbadanie możliwości wykorzystania wolniej degradujących się rusztowań, np. z polilaktydu [44].
Komórki UCSC pod wpływem 5-azacytydyny lub medium kondycjonowanego formowały się w kardiomiocyty.
Uwidocznione to było przez obserwowaną ekspresję troponiny I, F-aktyny czy N-kadheryny [40].
W badaniach Mitchella i wsp. [50] wykryto ekspresję
markera dla neuronalnych komórek macierzystych (NSE)
czy komórek glejowych (GFAP i CNPaza) na powierzchni
komórek z galarety Whartona. Fu i wsp. [41] zbadali możliwość wykorzystania UCSC w leczeniu choroby Parkinsona,
częstego schorzenia neurodegeneracyjnego. Było to możliwe dzięki konwersji tych komórek w neurony dopaminergiczne po dodaniu NCM (neuronal-conditioned medium),
SHH (sonic hedgehog) i FGF8 (fibroblast growth factor 8)
do pożywki hodowlanej. Komórki z hodowli wszczepiane
były do prążkowia szczurów, u których wcześniej wywołano chorobę Parkinsona przez podanie 6-hydroksydopaminy.
Konieczne jest oszacowanie wystarczającej liczby komórek
potrzebnych do wszczepienia. Jak dotąd nie przeprowadzono dłuższej obserwacji, która umożliwiłaby pełne zbadanie
efektów ubocznych, sekrecji neurotransmitterów, aktywacji
mikrogleju oraz toksyczności medium i użytych czynników
- SHH, FGF8 [41].
Jomura i wsp. [51] badali możliwość wykorzystania komórek Oct-4+ pozyskiwanych ze zrębu szczurzego sznura
pępowinowego w leczeniu niedokrwienia mózgu, jako efektu zatrzymania akcji serca u szczurów. Zastosowanie szczurzych komórek umożliwiło zmniejszenie o 25-32% uszkodzeń neuronów. Prawdopodobnie odbudowa tkanki była
możliwa m. in. przez aktywację i proliferację neuronalnych
komórek macierzystych czy też aktywację szlaków sygnałowych Notch i Wnt, które umożliwiają cofnięcie się do wcześniejszego stadium tkanki mózgu, aczkolwiek stwierdzenie
poprawności takich sformułowań wymaga dalszych badań.
Bezpieczeństwo stosowania UCSC sprawdzano podając
podskórnie i dożylnie duże ilości tych komórek myszom
z wrodzonym brakiem odporności (SCID). Nie formowały
one potworniaków po transplantacji. Ich interakcje z komórkami transformowanymi i możliwość zastosowania w terapii genowej zbadano przez wszczepienie myszom komórek
raka płuc - MDA 231. Wstrzyknięte w następnej kolejności
UCSC zlokalizowały się w obrębie guza lub w jego pobliżu. Prawdopodobnie w niedalekiej przyszłości będzie można wykorzystać te komórki, jako nośniki leków np. IFN-β
w bezpośredniej terapii antynowotworowej [52].
Lund i wsp. [53] zbadali możliwość zastosowania UCSC
do leczenia chorób zwyrodnieniowych m. in. retinitis pigmentosa. Komórki te miał większy zakres działania niż
komórki z łożyska czy BMSC i umożliwiały poprawienie
funkcjonowania narządu wzroku u szczurów. Były one podawane zarówno pod siatkówkę jak i do ciałka szklistego,
a ich efektywność wynikała głównie z syntezy czynników
neurotroficznych.
Podejmowane zostały także próby leczenia zwłóknienia
wątroby czy cukrzycy typu I przy pomocy mezenchymalnych komórek macierzystych z galarety Whartona.
Tsai i wsp. [54] podawali szczurom tetrachlorek metylu
w celu wywołania zwłóknienia wątroby. Następnie do ich
wątroby wszczepiono ludzkie UCSC i znów podano substancję indukującą zwłóknienie. We wszczepionych komórkach zaobserwowano syntezę związków zaangażowanych
w odbudowę wątroby w tym: prolaktyny, HGF (hepatocyte
growth factor), LIF (leukemia inhibitory factor) czy CTACK
(cutaneous T cell-attracting chemokine). Ksenotransplantacja spowodowała zmniejszenie ekspresji TGF-β pobudzającego komórki gwiaździste wątroby, których aktywacja
prowadzi do odkładania składników macierzy pozakomórkowej, rozwoju zwłóknienia i w końcowym efekcie marskości wątroby. Jak dotąd uznano na przykładzie modelu
zwierzęcego, iż odpowiednio dobrana pula wszczepianych
komórek UCSC zmniejszała ilość komórek gwiaździstych,
co umożliwiło odbudowę wątroby.
Leczenie cukrzycy typu I wymaga długotrwałej terapii
immunosupresyjnej, co może indukować rozwój nowotworów. Z drugiej strony poszukuje się nowych źródeł pozyskiwania wysepek β trzustki do przeszczepu. Komórki
UCSC poddano działaniu NCM, a następnie glukozy, insuliny, nikotynamidu, związku stymulującego wzrost neuronów - B27 i SCM (stem cell-conditioned medium). Wraz
z postępującym różnicowaniem komórek zauważono zmiany w ekspresji genów kodujących insulinę i genów związanych z komórkami β trzustki, w tym zwiększenie poziomu
ekspresji genów Hlxb9, Nkx2.2 i Nkx6.1 oraz zmniejszenie
ekspresji genów - Pdx1 i Glut-2. Efektem zastosowania takiej
procedury było uzyskanie wysepko-podobnych klastrów komórkowych, które następnie wszczepiono do wątroby szczurów z indukowaną streptozotocyną cukrzycą typu I. Umożliwiło to utrzymywanie stałego optymalnego poziomu glukozy
we krwi, bez oznak hipoglikemii, oraz odzyskanie zdolności
do produkcji insuliny przez chore szczury [20].
Do lat 90-tych XX wieku sznur pępowinowy nie budził
większego zainteresowania klinicznego i był uznawany za
materiał odpadowy [38]. Ze względu na małą częstość występowania szpikowych komórek mezenchymalnych, ich
ograniczony potencjał proliferacyjny i bolesną procedurę
ich pozyskiwania, która wymaga inwazyjnej metody pobierania materiału, co może w niektórych przypadkach doprowadzić do stanu zapalnego, krwawienia czy chronicznego
bólu w okolicy pobrania, poszukiwano nowych źródeł pozyskiwania MSC. Komórki z galarety Whartona wydają się
najbardziej perspektywicznym źródłem mezenchymalnych
komórek macierzystych, gdyż nie tylko procedura pozyskania komórek nie jest inwazyjna, nie rodzi dylematów natury
etycznej, ale komórki mają bardzo duży potencjał proliferacyjny i możliwości różnicowania nie tylko w linie łącznotkankowe, ale także m. in. kardiomiocyty, czy komórki
zbliżone do neuronów [26, 55]. Konieczne są jednak dalsze
badania w celu przejścia z modelu zwierzęcego na zastosowanie kliniczne u człowieka [38].
&ARM0RZEGL.AUK
Piśmiennictwo
1. Calne R. The history and the development of organ
transplantation: biology and rejection. Baillieres Clin
Gastroenterol 1994; 8(3): 389-397.
2. Linden PK. History of solid organ transplantation and
organ donation. Crit Care Clin 2009; 25(1): 165-184.
3. Vacanti J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. J Pediatr Surg
2010; 45(2): 291-294.
4. Tsonis PA. Regenerative biology: the emerging field
of tissue repair and restoration. Differentiation 2002;
70(8): 397-409.
5. Stocum DL. Regenerative biology and engineering:
strategies for tissue restoration. Wound Repair Regen
1998; 6(4): 276-290.
6. Arosarena O. Tissue engineering. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 2005; 13(4): 233-241.
7. Ikada Y. Challenges in tissue engineering. J R Soc Interface 2006; 3(10): 589-601.
8. Gobbi A i wsp. Patellofemoral full-thickness chondral
defects treated with Hyalograft-C: a clinical, arthroscopic, and histologic review. Am J Sports Med 2006; 24:
1763-1773.
9. Tognana E i wsp. Hyalograft C: hyaluronan-based scaffolds in tissue-engineered cartilage. Cells Tissues Organs 2007; 186(2): 97-103.
10. Lee KH. Tissue-engineered human living skin substitutes: development and clinical application. Yonsei Med J
2000; 41(6): 774-779.
11. Edmonds M i wsp. Apligraft in the treatment of neuropathic diabetic foot ulcers. Int J Low Extrem Wounds
2009; 8(1): 11-18.
12. Atala A. Tissue-engineered autologous bladders for
patients needing cystoplasty. Lancet 2006; 367(9518):
1241-1246.
13. Jukes J i wsp. Stem Cells. W: Tissue Engineering. Red.
Blitterswijk C. Academic Press. London 2008, 1-27.
14. Koh CJ, Atala A. Tissue engineering, stem cells, and
cloning: opportunities for regenerative medicine. J Am
Soc Nephrol 2004; 15(5): 1113-1125.
15. Friedenstein AJ, Chailakhjan RK, Lalykina KS. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures
of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue
Kinet 1970; 3(4): 393-403.
16. Friedenstein AJ i wsp. Stromal cells responsible for
transferring the microenvironment of the hemopoietic
tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo.
Transplantation 1974; 17(4): 331-340.
17. Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells:
characterization, differentiation, and application in cell and
gene therapy. J Cell Mol Med 2004; 8(3): 301-316.
18. Caplan AI. The mesengenic process. Clin Plast Surg
1994; 21(3): 429-435.
19. Sensebé L i wsp. Mesenchymal stem cells for clinical
application. Vox Sang 2010; 98(2): 93-102.
20. Chao KC i wsp. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton’s Jelly of the human
umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One 2008; 3(1): e145.
21. Jiang Y i wsp. Pluripotency of mesenchymal stem cells
derived from adult marrow. Nature 2002; 418(6893):
41-49.
22. Jahagirdar BN, Verfaillie CM. Multipotent adult progenitor cell and stem cell plasticity. Stem Cell Rev 2005;
1(1): 53–69.
23. D’Ippolito G i wsp. Marrow-isolated adult multilineage
inducible (MIAMI) cells, a unique population of postnatal young and old human cells with extensive expansion
and differentiation potential. J Cell Sci 2004; 117(Pt
14): 2971-2981.
24. Ratajczak MZ i wsp. Very small embryonic-like (VSEL)
stem cells in adult organs and their potential role in rejuvenation of tissues and longevity. Exp Gerontol 2008;
43(11): 1009–1017.
25. Pittenger MF. Multilineage potential of adult human
mesenchymal stem cells. Science 1999; 284(5411):
143-147.
26. Baksh D, Yao R, Tuan RS. Comparison of proliferative
and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and
bone marrow. Stem Cells 2007; 25(6): 1384-1392.
27. Castro-Malaspina H i wsp. Characterization of human
bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F)
and their progeny. Blood 1980; 56(2): 289-301.
28. Bernardo ME, Locatelli F, Fibbe WE. Mesenchymal
stromal cells. Ann NY Acad Sci 2009; 1176(1): 101–
117.
29. Psaltis PJ i wsp. Concise review: mesenchymal stromal
cells: potential for cardiovascular repair. Stem Cells
2008; 26(9): 2201-2210.
30. Dharmasaroja P. Bone marrow-derived mesenchymal
stem cells for the treatment of ischemic stroke. J Clin
Neurosci 2009; 16(1): 12–20.
31. Dryden GW. Overview of stem cell therapy for Crohn's
disease. Expert Opin Biol Ther 2009; 9(7): 841-847.
32. Macchiarini P i wsp. Clinical transplantation of a tissueengineered airway. Lancet 2008; 372(9655): 2023-2030.
33. Chen Y i wsp. Mesenchymal stem cells: a promising
candidate in regenerative medicine. Int J Biochem Cell
Biol 2008; 40(5): 815–820.
34. Kucia M i wsp. Tissue-specific muscle, neural and liver
stem/progenitor cells reside in the bone marrow, respond
to an SDF-1 gradient and are mobilized into peripheral
blood during stress and tissue injury. Blood Cells Mol
Dis 2004; 32(1): 52-57.
35. Tsai MS i wsp. Functional network analysis of the transcriptomes of mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid, amniotic membrane, cord blood, and bone
marrow. Stem Cells 2007; 25(10): 2511-2523.
36. Secco M i wsp. Mesenchymal stem cells from umbilical cord: do not discard the cord! Neuromuscul Disord
2008; 18(1): 17-18.
37. Franc S i wsp. Microfibrillar composition of umbilical
cord matrix: characterization of fibrillin, collagen VI
and intact collagen V. Placenta 1998; 19(1): 95-104.
38. Can A, Karahuseyinoglu S. Concise review: human
umbilical cord stroma with regard to the source of
fetus-derived stem cells. Stem Cells 2007; 25(11):
2886-2895.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
39. Kobayashi K, Kubota T, Aso T. Study on myofibroblast
differentiation in the stromal cells of Wharton’s jelly.
Expression and localization of alpha-smooth muscle actin. Early Hum Dev 1998; 51(3): 223–233.
40. Wang HS i wsp. Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord. Stem Cells 2004;
22(7): 1330-1337.
41. Fu YS i wsp. Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton's jelly to dopaminergic neurons in vitro: potential therapeutic application
for Parkinsonism. Stem Cells 2006; 24(1): 115-124.
42. Wang L i wsp. Effect of initial seeding density on human umbilical cord mesenchymal stromal cells for fibrocartilage tissue engineering. Tissue Eng Part A 2009;
15(5): 1009-1017.
43. Kim YJ. Culture of umbilical cord- and cord blood-derived stem cells. W: Culture of human stem cells. Red.
Freshney RI, Stacey GN, Auerbach JM. John Wiley &
Sons, Inc. New Jersey 2007, 167-169.
44. Wang L, Detamore MS. Insulin-like growth factor-I improves chondrogenesis of predifferentiated human
umbilical cord mesenchymal stromal cells. J Orthop
Res 2009; 27(8): 1009-1015.
45. Weiss ML i wsp. Immune properties of human umbilical cord Wharton’s jelly-derived cells. Stem Cells 2008;
26(11): 2865-2874.
46. Karahuseyinoglu S, Cinar O, Kilic E. Biology of the
stem cells in human umbilical cord stroma: in situ and
in vitro surveys. Stem Cells 2007; 25(2): 319-331.
47. Majore I i wsp. Identification of subpopulations in mesenchymal stem cell-like cultures from human umbilical cord. Cell Commun Signal 2009; 7: 6.
48. Schneider RK i wsp. The osteogenic differentiation
of adult bone marrow and perinatal umbilical mesenchymal stem cells and matrix remodelling in three-dimensional collagen scaffolds. Biomaterials 2010;
31(3): 467-480.
49. Zhao L i wsp. Fatigue and human umbilical cord stem
cells seeding characteristics of calcium phosphate-chitosan-biodegradable fiber scaffolds. Biomaterials 2010;
31(5): 840-847.
50. Mitchell KE i wsp. Matrix cells from Wharton's jelly
form neurons and glia. Stem Cells 2003; 21(1): 50-60.
51. Jomura S i wsp. Potential treatment of cerebral global
ischemia with Oct-4+ umbilical cord matrix cells. Stem
Cells 2007; 25(1): 98-106.
52. Rachakatla RS i wsp. Development of human umbilical
cord matrix stem cell-based gene therapy for experimental
lung tumors. Cancer Gene Ther 2007; 14(10): 828-835.
53. Lund RD i wsp. Cells isolated from umbilical cord tissue
rescue photoreceptors and visual functions in a rodent model of retinal disease. Stem Cells 2007; 25(3): 602-611.
54. Tsai PC i wsp. The therapeutic potential of human
umbilical mesenchymal stem cells from Wharton’s jelly
in the treatment of rat liver fibrosis. Liver Transpl 2009;
15(5): 484-495.
55. Secco M i wsp. Multipotent stem cells from umbilical cord:
cord is richer than blood!. Stem Cells 2008; 26: 146-150.
data otrzymania pracy: 02.08.2010 r.
data akceptacji do druku: 31.08.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr Ewa Chodurek
Katedra i Zakład Biofarmacji
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Śląski Uniwersytet Medyczny
41-200 Sosnowiec
ul. Narcyzów 1
e-mail: [email protected]