Ocena stężenia markera stresu oksydacyjnego u pacjentek z

Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 1, zeszyt 3, 209-212, 2008
Ocena stężenia markera stresu oksydacyjnego
u pacjentek z przedwczesnym odpłynięciem płynu owodniowego
SEBASTIAN KWIATKOWSKI, RYSZARD CZAJKA
Streszczenie
Mechanizm powodujący przedwczesne pęknięcie błon płodowych (PROM) jest prawdopodobnie wieloczynnikowy. W dotychczasowych doniesieniach naukowych nie znajdujemy precyzyjnego wyjaśnienia roli stresu oksydacyjnego w patogenezie PROM. Analizowano stężenia markera stresu oksydacyjnego – izoprostanu PGF2alfa – w trzech kompartymentach – w osoczu krwi matczynej,
osoczu krwi pępowinowej oraz w płynie owodniowym w dwu grupach w zależności od czasu trwania ciąży. Grupa 1 – 24- 34 tygodnie
ciąży (n = 10), grupa 2 – 38-42 tygodnie ciąży (n = 13). Porównano stężenia PGF2 alfa w grupach oraz w zależności od stężenia elastazy
neutrofilowej. Stwierdzono wyższe stężenia PGF2alfa i elastazy neutrofilowej w płynie owodniowym w porównaniu ze stężeniami
osoczowymi, jednak nie obserwowano różnic istotnych statystycznie miedzy grupami. Obserwowano zależności między stężeniem
elastazy i PGF2alfa, co może dowodzić iż aktywacja neutrofilów jest głównym źródłem stresu oksydacyjnego. Stwierdzono zależność
między stężeniem elastazy a czasem trwania PROM, natomiast nie obserwowano takiej korelacji w odniesieniu do PGF2alfa co może
świadczyć o ograniczeniu stresu oksydacyjnego po PROM.
Słowa kluczowe: izoprostan, PGF2alfa, elastaza neurofilowa, stres oksydacyjny, PROM
Przedwczesne odpłynięcie płynu owodniowego
(PROM) jest jednym z najczęstszych powikłań ciąży. Według ostatnich danych dotyczy 3% ciąż i jest przyczyną jednej trzeciej prodów przedwczesnych [4]. Jego patomechanizm ciągle pozostaje niewyjaśniony, a dotychczasowe dane wskazują, że może on być wieloczynnikowy [6]. Z jednej strony o zachowaniu integralności błon płodowych
decydują procesy zachodzące w obrębie jaja płodowego
[3], ale o podatności do pęknięcia błon płodowych mogą
decydować również polimorfizmy genowe [8]. Należy również uwzględnić rolę czynników zewnętrznych, przede
wszystkim infekcji wstępującej [7]. Stale są czynione próby oceny różnych markerów[10].
Rola stresu oksydacyjnego w PROM nie została jak
dotąd w pełni wyjaśniona choć pojawiły się nawet doniesienia o korzyściach z zastosowania antyoksydantów [12].
Izoprostan PGF2alfa jest obecnie jednym z najbardziej miarodajnych markerów stresu oksydacyjnego [5]. Jednym ze
znanych źródeł wolnych rodników są neutrofile. Dlatego
oprócz stężenia izoprostanu PGF2alfa oceniano również
stężenie elastazy jako wskaźnika aktywacji neutrofili.
Praca jest doniesieniem wstępnym pierwszych wyników
szerszego programu finansowanego z grantu KBN.
Ocena stężenie izoprostanu PGF2alfa i elastazy neutrofilowej w osoczu krwi matczynej, płynie owodniowym
i osoczu krwi pępowinowej w ciążach donoszonych
(PROM) i niedonoszonych powikłanych przedwczesnym
odpłynięciem płynu owodniowego (pPROM).
Materiał i metody
Materiał stanowiły 23 pacjentki w ciążach pojedynczych powikłanych przedwczesnym odpłynięciem płynu
owodniowego bez chorób towarzyszących. Pacjentki zostały zakwalifikowane do jednej z dwóch grup w zależności o czasu trwania ciąży. Grupa badana 1 – 24-34. ty-
dzień ciąży, grupa badana 2 – 38-42. tydzień ciąży. Kryteriami wyłączenia były: obecność czynności skurczowej
macicy i czas odpływania płynu powyżej 6 godzin.
Charakterystyka badanej populacji
Materiałem do badań było osocze uzyskane z 5 ml
krwi żylnej od ciężarnych, 10 ml płynu owodniowego uzyskanego od pacjentek oraz osocze z 5 ml krwi żyły pępowinowej noworodków po porodzie (tabela1). Do oceny
nasilenia stresu oksydacyjnego posłużyło oznaczenie stężenia izoprostanu PGF2alfa. Ponadto w obu grupach zostało oznaczone stężenie elastazy neutrofilowej. Do powyższych oznaczeń posłużą zestawy immunoenzymatyczne
firmy Biocom i Oxis.
Wyniki
Stężenie izoprostanu PGF2alfa (ng/g białka) i elastazy
neutrofilowej w grupie badanej 1 (μg/g białka) podano
w tabeli 2. Stężenie izoprostanu PGF2alfa (ng/g białka)
i elastazy neutrofilowej w grupie badanej 2 (μg/g białka)
podano w tabeli 3.
Porównanie stężenia izoprostanu PGF2alfa i elastazy
neutrofilowej w poszczególnych kompartmentach obu
grup – test U Manna-Whitneya (tabela 4).
Z użyciem testu U Manna-Whitneya stwierdzono brak
różnic istotnych statystycznych pomiędzy grupami badanymi. Wobec powyższego analizy statystycznej dokonano
wspólnie dla obu grup.
Stężenie izoprostanu PGF2alfa (ng/g białka) i elastazy
neutrofilowej w obu grupach zbiorczo (μg/g białka) podano w tabeli 5.
Najwyższe stężenie izoprostanu PGF2alfa i elastazy
neutrofilowej u pacjentek z przedwczesnym odpłynięciem
płynu owodniowego odnotowano w płynie owodniowym.
Katedra i Klinika Położnictwa i Perinatologii, Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie
210
S. Kwiatkowski, R. Czajka
Tabela 1. Charakterystyka badanej populacji
Grupa badana 1
n = 10
Grupa badana 2
n = 13
28,3 ± 5,7
28 ± 6,31
39603
39664
Wiek pacjentki
Pierwiastka/wieloródka
3(1-5)
2 (1-6)
Wiek ciążowy
Liczba godzin od odpłynięcia płynu w momencie pobrania
31,4 ± 3,34
39,23 ± 1,01
Liczba białych krwinek (g/l)
12,96 ± 4,2
12,98 ± 5,07
CRP w krwi ciężarnych
18 ± 16,6
8,01 ± 4,67
CRP w płynie owodniowym
10 ± 12,58
5,7 ± 2,56
CRP w krwi pępowinowej
13,5 ± 23,9
5,95 ± 2,48
36,725 ±0,21
36,7 ± 0,48
82 ± 14,05
80 ± 7,5
39602
39458
Temperatura ciała pacjentki
Częstość uderzeń serca matki
Droga porodu (cięcie cesarskie/drogami natury)
Tabela 2. Stężenie izoprostanu PGF2alfa (ng/g białka)
i elastazy neutrofilowej w grupie badanej 1 (μg/g białka)
Stężenie izoprostanu
Mediana
Minimum
Maksimum
25 percentyl
75 percentyl
Osocze krwi matczynej
2,995
0,090
20,630
0,150
8,930
Płyn owodniowy
6,084
0,340
22,615
3,892
8,586
Osocze krwi pępowinowej
0,466
0,070
102,000
0,108
0,853
Osocze krwi matczynej
122,794
94,876
316,210
111,821
210,549
Płyn owodniowy
1085,133
56,263
2473,760
239,610
1655,662
66,578
32,118
264,378
41,834
81,148
Stężenie elastazy
Osocze krwi pępowinowej
Tabela 3. Stężenie izoprostanu PGF2alfa (ng/g białka)
i elastazy neutrofilowej w grupie badanej 2 (μg/g białka)
Mediana
Minimum
Maksimum
25 percentyl
75 percentyl
Osocze krwi matczynej
Stężenie izoprostanu
2,335
0,135
2,380
0,130
5,400
Płyn owodniowy
23,660
0,340
12,323
0,460
103,000
Osocze krwi pępowinowej
1,417
0,09
0,755
0,096
5,880
171,902
87,98
127,985
87,984
362,671
Stężenie elastazy
Osocze krwi matczynej
Płyn owodniowy
637,043
80,72
496,4
34,616
1709,410
Osocze krwi pępowinowej
115,636
41,23
56,122
5,346
546,286
Tabela 4. Porównanie stężenia izoprostanu PGF2alfa i elastazy neutrofilowej
w poszczególnych kompartmentach obu grup – test U Manna-Whitneya
Grupa 1
Grupa 2
U
p
151,00
60,00
0,75650
13
171,00
50,00
0,43357
80,00
13
151,00
35,00
0,17693
10
95,00
13
181,00
40,00
0,12104
Płyn owodniowy
10
109,00
13
167,00
54,00
0,21434
Osocze krwi pępowinowej
10
78,00
13
153,00
33,00
0,13559
Stężenie izoprostanu
n = 10
suma rang
n = 13
suma rang
Osocze krwi matczynej
10
125,00
13
Płyn owodniowy
10
105,00
Osocze krwi pępowinowej
10
Osocze krwi matczynej
Stężenie elastazy
Ocena stężenia markera stresu oksydacyjnego u pacjentek z przedwczesnym odpłynięciem płynu owodniowego
211
Tabela 5. Stężenie izoprostanu PGF2alfa (ng/g białka)
i elastazy neutrofilowej w obu grupach zbiorczo (μg/g białka)
Mediana
Minimum
Maksimum
25 percentyl
75 percentyl
Osocze krwi matczynej
Stężenie izoprostanu
2,6825
0,09493
20,634
0,162
4,076
Płyn owodniowy
7,2494
0,34008
102,000
5,0631
14,811
Osocze krwi pępowinowej
0,5858
0,07028
102,000
0,2202
1,092
125,876
87,98376
362,671
108,7426
226,901
Płyn owodniowy
759,671
34,61639
2473,760
309,9913
1262,66
Osocze krwi pępowinowej
65,7626
546,286
45,0938
102,000
100,9123
Stężenie elastazy
Osocze krwi matczynej
Test kolejności par Wilcoxona posłużył do oznaczenia
istotności różnic stężeń w poszczególnych kompartmentach.
1) Stężenie izoprostanu w osoczu krwi matczynej/płynie owodniowym – różnice istotne statystycznie p < 0,0001;
2) Stężenie izoprostanu w osoczu krwi matczynej/osoczu
krwi pępowinowej – różnice istotne statystycznie p < 0,05;
3) Stężenie izoprostanu w osoczu krwi pępowinowej/płynie owodniowym – różnice istotne statystycznie p < 0,0001.
1) Stężenie elastazy w osoczu krwi matczynej/płynie
owodniowym – różnice istotne statystycznie p < 0,0001;
2) Stężenie elastazy w osoczu krwi matczynej/osocze krwi
pępowinowej – różnice istotne statystycznie p < 0,001;
3) Stężenie elastazy w osoczu krwi pępowinowej/płynie
owodniowym – różnice istotne statystycznie p < 0,0001.
Do oznaczenia korelacji posłużył test korelacji rang
Spearmana. Stwierdzono korelacje w następujących parametrach: stężenie izoprostanu / stężenie elastazy we
wszystkich kompartmentach p = 0,00004; R = 0,49; stężenie
elastazy w osoczu krwi matczynej/stężenie elastazy w osoczu krwi pępowinowej p = 0,002; R = 0,60; godziny od pęknięcia i elastaza-płyn – p = 0,0230, R = 0,62.
Dyskusja
Zajęliśmy się problemem przedwczesnego odpłynięcia płynu owodniowego, gdyż jest on jednym z najczęstszych powikłań położniczych. Dotychczas nie udało
się wyjaśnić, jakie czynniki są odpowiedzialne za przedwczesne pęknięcie błon płodowych. Rola neutrofili może
mieć decydujące znaczenie. Degranulacja ziarnistości,
uwalnianie proteaz oraz produkacja wolnych rodników
mają miejsce po aktywacji neutrofili [5]. Elastaza neutrofilowa jest jednym z enzymów, którego znaczenie w
przypadku pPROM, PROM, infekcji jaja płodowego było
kilkakrotnie podnoszone [11]. Stwierdzono jej podwyższone stężenia we wszystkich tych stanach [1, 11].
W naszych badaniach stężenia elastazy były podwyższone
zarówno w pPROM, jak i PROM, jednakże różnice w tych
grupach nie były istotne statystycznie. Nasze badania
rozszerzyliśmy do trzech oddzielnych przedziałów, krwi
matczynej, płynu owodniowego i krwi pępowinowej.
Stwierdziliśmy, że kompartment, jakim jest płyn owodniowy, charakteryzuje się największym stężeniem elastazy
w porównaniu ze stężeniem w osoczu krwi matczynej czy
krwi pępowinowej. Świadczy to niewątpliwie o największym nasileniu aktywacji neutrofili w kompartmencie
mającym bezpośredni kontakt z błonami płodowymi. Nasilenie stresu oksydacyjnego w przedwczesnym odpłynięciu płynu owodniowego nie było dotychczas przedmiotem randomizowanych badań [2, 13]. Podjęliśmy próbę
oceny nasilenia stresu oksydacyjnego w poszczególnych
kompartmentach (osocze krwi matczynej, płyn owodniowy, osocze krwi pępowinowej). Do oceny posłużył nowy
marker nasilenia stresu oksydacyjnego – izomer prostaglandyny F2, produkt działania wolnych rodników – izoprostan PGF2alfa. Wyniki jednoznacznie wykazały największe jego stężenia w płynie owodniowym. Analiza statystyczna wykazała jednocześnie korelację między stężeniem
elastazy i stężeniem izoprostanu. Może to świadczyć, iż
głównym źródłem stresu oksydacyjnego w przedwczesnym odplynięciu płynu owodniowego są zaktywowane
neutrofile. Jednocześnie stwierdzono, iż stężenie elastazy
jest wyższe w zależności od czasu odpłynięcia płynu
owodniowego. Mimo iż nie włączano do badań pacjentek,
u których płyn odpływał dłużej niż 6 godzin, stwierdzono
silną korelację między stężeniem elastazy neutrofilowej
a czasem, jaki upłynął od momentu pęknięcia błon. Sugeruje to, że proces degranulacji ziarnistości neutrofilowych
po pęknięciu błon jeszcze się nasila. Nie wykazano takiej
korelacji w przypadku izoprostanu, co może świadczyć
o ograniczeniu stresu oksydacyjnego po PROM. Brak korelacji między stężeniem izoprostanu w płynie owodniowym
i krwi pępowinowej podobnej do tej stwierdzonej w przypadku elastazy może sugerować natężone działanie antyoksydantów chroniących płód. Wyjaśnienie zarówno tych
kwestii, jak i szeregu innych i porównanie naszych wyników z grupami kontrolnymi są przedmiotem prowadzonych przez nas badań.
Wnioski
1) Najwyższe stężenie elastazy neutrofilowej i stężenia
izoprostanu zaobserwowano w płynie owodniowym,
czy fakt ten ma związek z mechanizmem odpowiedzialnym za przedwczesne odpłynięcie płynu owodniowego wymaga dalszych badań.
212
S. Kwiatkowski, R. Czajka
2) Korelacja między stężeniem elastazy neutrofilowej
i stężeniem izoprostanu może świadczyć, iż głównym
źródłem stresu oksydacyjnego w przedwczesnym odpłynięciu płynu owodniowego są zaktywowane neutrofile.
3) Ocena stężenia elastazy w krwi matki pozwala wnioskować o nasileniu stężeniu elastazy neutrofilowej
w krwi pępowinowej.
4) Wraz z czasem od odpłynięcia płynu owodniowego
rośnie stężenie elastazy, co może sugerować, iż dochodzi do natychmiastowego nasilenia degranulacji
ziarnistości uwalniających elastazę po PROM.
5) Stężenia izoprostanu i elastazy neutrofilowej w ciążach donoszonych i niedonoszonych powikłanych
przedwczesnym odpłynięciem płynu owodniowego
nie wykazują różnic istotnych statystycznie.
Piśmiennictwo
[1] Helmig B.R., Romero R., Espinoza J. et al. (2002) Neutrophil
elastase and secretory leukocyte proteaseinhibitor in prelabor rupture of membranes, parturition and intra-amniotic
infection. J. Maternal Fetal Neonatal Med. 12: 237-246.
[2] Bankowska E.M., Leibschang J., Pawlowska A. (2003) Usefulness of determination of granulocyte elastase plasma
level, c-reactive protein and white blood cell count in prediction in intrauterine infection in pregnant women after
PROM. Gin. Pol. 74(10): 1037-1043.
[3] Lamont R.F. (2003) Recent evidence associated with the
condition of preterm prelabour rupture of the membranes.
Curr. Opin Obstet. Gynecol. 15(2): 91-99.
[4] Mercer B.M. (1998) Management of preterm premature rupture of the membranes. Clin. Obstet. Gynecol. 41: 870-882.
[5] Morrow J.D., Roberts L.J. (1997) The isoprostanes:unique
bioactive products of lipid peroxidation. Prog. Lipid Res.
36: 1.
[6] Polzin W.J., Brady K. (1998) The etiology of premature rupture of the membranes. Clin. Obstet. Gynecol. 41(4): 810-816.
[7] Romero R., Mazor M. (1988) Infection and preterm labor.
Clin. Obstet. Gynecol. 31: 553-584.
[8] Srinivas S.K., Macones G.A. (2005) Preterm premature rupture of the fetal membranes: current concepts. Minerva Ginecol. 57(4): 389-396.
[9] Temma K., Shimoya K., Zhang Q. et al. (2004) Effects of 4-hy-
droxy-2-nonenal, a marker of oxidative stress, on the cyclooxygenase-2 of human placenta in chorioamnionitis. Mol.
Hum. Reprod. 10(3): 167-171. (E-pub 2004 Jan 29)
[10] Torbe A., Czajka R. (2005) Are vaginal fluid procalcitonin
levels useful for the prediction of subclinial infection in patients with preterm premature rupture of membranes? J.
Obstet. Gynaecol. Res. 31(5): 464-470.
[11] Travis J., Dubin A., Potempa J. et al. (1991) Neutrophil pro-
teinases.Caution signs in designing inhibitors against enzymes with possible multiple functions. Ann. NY Acad. Sci.
624: 81-86.
[12] Wall P.D., Pressman E.K., Woods J.R. Jr (2002) Preterm pre-
mature rupture of the memebranes and antioxidants: the
free radical connection. J. Perinat. Med. 30(6): 447-457.
[13] Woods J.R. Jr. (2001) Reactive oxygen species and preterm
premature rupture of membranes – a review. Placenta Apr;
22 Suppl A: S38-44.
J
Sebastian Kwiatkowski
Katedra i Klinika Położnictwa i Perinatologii
Pomorska Akademia Medyczna
Al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin
[email protected]
The oxidative stress marker assesement in premature rupture of mebrane’s patients
The mechanism of premature rupture of mebrane (PROM) seems to be multifactorial. The role of oxidative stress wasn’t precise investigated so far. We evaluated the oxidative stress marker- isoprostane PGF2alfa in three compartments – maternal plasma, amniotic
fluid and cord plasma in two groups with PROM depend on time of gestation, group 1 – 24-34 weeks (n = 10), group 2 – 38-42 weeks
(n = 13). We compared these values each other and according to neutrophil elastase. The highest concentration isoprostane and elastase were in amniotic fluid in comparison to maternal and cord plasma although were no statistical differences between groups.
There is a correlation between elastase and isoprostane concentrations, what may indicate neutrophils activation as a main source
of oxidative species. There is a correlation between elastase concentration and time duration from PROM and concentration elastase
in amniotic fluid and cord plasma. These correlation were not observed with isoprostane what can suggest limitation oxidative stress
after PROM in amniotic sac and protection fetus against reactive species. We run further investigations in this area.
Key words: isoprostane PGF2alfa, neutrophil elastase, oxidative stress, PROM