algorytm fenotypowania blastów w ostrych

Nowiny Lekarskie 2008, 77, 3, 190–194
MARIA WĄSIK, URSZULA DEMKOW, BARBARA JAKUBCZAK, MARZENA MODZELEWSKA,
ANNA STELMASZCZYK-EMMEL, ELŻBIETA GÓRSKA, MONIKA BŁOCKA
ALGORYTM FENOTYPOWANIA BLASTÓW W OSTRYCH BIAŁACZKACH DZIECIĘCYCH
ALGORHYTHM OF BLASTS PHENOTYPING IN ACUTE CHILDREN’S LEUKEMIAS
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego
Warszawski Uniwersytet Medyczny
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Maria Wąsik
Streszczenie
Wstęp. Opracowanie przedstawia retrospektywną analizę oceny przydatności diagnostycznej jednoczasowego stosowania zestawu 23 przeciwciał monoklonalnych u 231 dzieci z rozpoznaną ostrą białaczką.
Cel. Celem opracowania było sprawdzenie, które z nich pozwalają z dużym prawdopodobieństwem na szybkie ustalenie pochodzenia komórek
blastycznych w ostrych białaczkach wieku dziecięcego.
Metodyka. Oceniono przydatność przeciwciał anty CD34, CD45, HLA-DR oraz wykrywających antygeny komórek charakterystycznych dla
linii limfocytów T i B oraz komórek linii mieloidalnej.
Wyniki. Stwierdzono, że dla ALL z linii B istotnie statystycznie częściej występuje antygen CD19 w porównaniu do CD22 (p < 0,0001). Dla
AML stwierdzono istotnie częściej występowanie antygenu CD33 w porównaniu do CD13 i CD15. Dla ALL z linii T najbardziej charakterystyczny był antygen CD7 występujący u pond 90% przypadków.
Wnioski. Autorzy analizy sugerują dwuetapowe fenotypowanie pozwalające na szybkie rozpoznanie choroby i następujące po nim już ukierunkowane szukanie ekspresji antygenów, które pozwolą na dokładną charakterystykę blastów przydatną do oceny choroby resztkowej. Taka
procedura będzie miała wymierne korzyści finansowe nie ograniczając informacji o cechach komórek nowotworowych.
SŁOWA KLUCZOWE: ostre białaczki wieku dziecięcego, ostra białaczka limfoblastyczna T, ostra białaczka limfoblastyczna B,
białaczki mieloidalne (nielimfoblastyczne – AML), cytometryczna ocena fenotypu, częstość ekspresji antygenów.
Summary
Introduction. This paper presents retospective analysis of simultaneous application of the set of 23 monoclonal antibodies in a group of 232
children with recognized acute leukemias.
Aim. The aim of the analysis was assessment which of them with high probability and faster allow to determine recognition of the tumor cell line
origin in children’s acute leukemias.
Methods. Assessment was performed with antibodies against CD34, CD45 and HLA-DR as well as detecting antigens characteristic for T and
B lymphocytes and myeloid cells.
Results. The results showed that for B lymphocytes the most characteristic antigens was CD19 and in comparison to CD22 this antigen is expressed more frequently p < 0.0001. In cases with AML CD33 had the significantly higher expression CD33 in comparison to CD13 and CD15.
Lymphoblasts T were characterized by expression of CD7 in almost 90% of investigated ALLT cases.
Conclusions. The authors suggest a two-stages phenotyping in which the first stage would allow recognition of the disease and the second would
involve search for antigens coexpression allowing determination of minimal residual disease. The two stages procedure would be profitable
without restriction of information about tumor cells.
KEY WORDS: acute children’s leukemias, acute lymphoblastic T leukemia, acute lymphoblastic B leukemia, myeloid leukemia
(acute non–lymphoblastic leukemia, AML), cytometric phenotyping, frequency of antigen expression.
Wstęp
Potwierdzenie podejrzenia choroby nowotworowej
w układzie krwiotwórczym powinno wynikać z badań
wykonanych w szpiku, ponieważ w tej tkance choroba
się rozwija. Tylko w sytuacjach wyjątkowych problemów z pobraniem aspiratu szpiku dopuszcza się wykonanie badań we krwi obwodowej. Z pobranego szpiku do
suchej strzykawki (bez antykoagulantu) wykonuje się
rozmazy, które następnie wybarwione będą swoistymi
metodami pozwalającymi na uwidocznienie barwnej
reakcji w komórkach posiadających wewnątrzkomórkowe enzymy (MPO), fosfataza kwaśna i zasadowa, i esterazy oraz związki chemiczne, takie jak glikogen. W celu
wykonania fenotypowania, czy też badań genetycznych,
szpik należy pobrać na heparynę, a w przypadku krwi na
EDTA. Zawsze należy ocenić liczbę leukocytów w szpiku i krwi i wykonać rozmaz, który barwi się metodą May
Grunwald-Giemza. Oglądając preparat należy zwrócić
uwagę na liczbę blastów i ocenić na ile komórki nowotworowe wyparły z badanej tkanki prawidłowe leukocyty. Odpowiednią objętość pobranej tkanki należy przesłać do pracowni specjalistycznych celem wykonania
badań cytogenetycznch i immunofenotypowania [1].
Ocenę immunofenotypu wykonuje się wtedy, gdy
ocena liczby i morfologii leukocytów potwierdziła podejrzenie białaczki. Wykonanie immunofenotypowania
pozwala na rozpoznanie typu ostrej białaczki lub jej
Algorytm fenotypowania blastów w ostrych białaczkach dziecięcych
wykluczenie. Rozpoznając chorobę należy uwzględnić
linię, z której pochodzą komórki blastyczne i etap zróżnicowania, na którym zostało zakłócone dojrzewanie
komórek tej linii [2, 3]. Immunofenotypowanie pozwala
również na ocenę cech komórek nowotworowych mających wpływ na rokowanie [4, 5, 6]. Wśród tych cech
ważne znaczenie mają:
– lekooporność [4, 7]
– pH [8]
– wrażliwość na apoptozę [8, 9, 10].
Ważne praktycznie znaczenie ma również znalezienie takich cech antygenowych, które różnią komórki
nowotworowe od prawidłowych, ponieważ umożliwią
one monitorowanie procesu leczenia zmianą liczby komórek nowotworowych we krwi i szpiku pacjenta, czyli
śledzenie choroby resztkowej (MDR – minimal residual
disease) [4, 5].
Na zapotrzebowanie Katedry i Kliniki Pediatrii, Hematologii i Onkologii Akademii Medycznej w Warszawie cytometryczne rozpoznawanie ostrych białaczek
u dzieci rozpoczęto w roku 1996 i jest ono do dziś kontynuowane. W okresie 10 lat wykonano badania u ponad
300 dzieci podejrzanych o chorobę nowotworową z zajęciem szpiku kostnego.
wykazały, że istotnie częściej w tej grupie są pacjenci,
u których w szpiku stwierdzano wyższy odsetek blastów
CD19+ (76,8 ± 19,72 %) w porównaniu do odsetka blastów CD22+ (70,9 ± 23,39). Różnica pomiędzy tymi wynikami jest istotna statystycznie (test t-studenta p < 0,0001,
n = 135). Analiza testem χ2 wykazała również, że istotnie częściej w tej grupie badanych blasty wykazują ekspresje CD19 niż CD22 (p < 0,0001).
Analizę częstości ekspresji antygenów w ALL B wykonano również dla wyników badań po podzieleniu tej
grupy zgodnie z rozpoznanym podtypem ostrej białaczki
limfoblastycznej B tzn: pro B (ryc. 1.), common B (ryc. 2.),
pre B (ryc. 3.) i dojrzałe B (ryc. 4.).
100
90
80
70
60
%
50
40
30
20
10
0
CD45
CD34
Cel pracy
Postanowiono wykonać retrospektywną analizę przydatności diagnostycznej jednoczasowego stosowania pełnego zestawu 23 przeciwciał, by sprawdzić, które z nich pozwolą z dużym prawdopodobieństwem na szybkie ustalenie
pochodzenia komórek blastycznych.
Materiał i metody
Do określenia fenotypu blastów w szpiku dzieci podejrzanych o ostrą białaczkę stosowano następujące 23 przeciwciała monoklonalne rozpoznające następujące antygeny:
CD34, CD45, HLA-DR i CD10 oraz antygeny charakterystyczne odpowiednio dla limfocytów B: CD19, CD20,
CD22, cytoplazmatyczne łańcuchy μ, sIgG, sIgM i sIgA;
dla limfocytów T: CD2, CD3, CD5, CD7, CD4, CD8; dla
linii mieloidalnej CD13, CD14, CD15, CD 33, CD65w,
CD117 i przeciwciało przeciwko mieloperoksydazie.
U 231 pacjentów z grupy 300 badanych rozpoznano
ostrą białaczką. W 134 (58%) przypadkach była to ALL B,
w 53 (23%) przypadkach była to ALL T, a w 43 (19%)
przypadkach była to AML.
U dzieci z rozpoznaną ALL B porównano częstość występowania CD19 i CD22. W ALL T porównano częstość
występowania CD2, CD3, CD5 i CD7. W AML porównano częstość występowania CD13 i CD33. Analizowano
odsetki pacjentów, u których w szpiku znajdowano wysokie
odsetki blastów z badanymi antygenami (ponad 25% blastów pozytywnych dla analizowanego antygenu). Do analizy
statystycznej stosowano test t-studenta i test χ2.
Wyniki
Wyniki oceny częstości występowania antygenów
CD19 i CD22 w grupie dzieci z rozpoznaną ALL B
191
HLA DR
CD19
CD22 CD10/CD19 CD20
cIgµ
antygen
Ryc. 1. Odsetek pacjentów z rozpoznaną ALL pro B, u których
analizowane antygeny występowały na powyżej 25% blastów
w szpiku (n = 13).
Fig. 1. Percentage of patients with diagnosed ALL pro B in
which analyzed antigens were expressed on more than 25%
bone marrow blasts (n = 13).
100
90
80
70
%
60
50
40
30
20
10
0
CD45
CD34
HLA DR
CD19
CD19/CD10
CD22
CD20
antygen
Ryc. 2. Odsetek pacjentów z rozpoznaną cALL, u których analizowane antygeny wystąpiły na powyżej 25% blastów w szpiku (n
= 110).
Fig. 2. Percentage of patients with diagnosed cALL pro B in
which analyzed antigens were expressed on more than 25%
bone marrow blasts (n = 110).
Jak pokazano na rycinach, ekspresję antygenu CD45
na blastach ALLB stwierdzono u ponad 85% badanych
pacjentów. U około 50% badanych blasty wykazywały
ekspresję antygenu CD34. U blisko 100% badanych na
limfoblastach B występowały antygeny MHC II klasy
(HLA DR). Z dwóch antygenów: CD19 i CD22, charakterystycznych dla limfocytów B, częściej na limfoblastach białaczki ALLproB występował antygen CD19 niż
192
Maria Wąsik i inni
CD22. Test χ2 wykazał istotnie statystycznie wyższą
częstość występowania wyższej liczby blastów z ekspresją antygenu CD19+ niż CD22+ (p < 0,0002).
100
90
80
70
60
%
50
40
30
20
10
0
CD45
CD34
HLA-DR
CD19
CD22
CD19CD10
CD20
cIgµ
antygen
Ryc. 3. Odsetek pacjentów z rozpoznaną ALL preB, u których
analizowane antygeny wystąpiły na powyżej 25% blastów w
szpiku (n = 9).
Fig. 3. Percentage of patients with diagnosed ALL pre B in
which analyzed antigens were expressed on more than 25%
bone marrow blasts (n = 9).
W szpiku chorych z rozpoznaną ostrą białaczką limfoblastyczną T analizowano częstość występowania na
blastach antygenów CD2, CD3, CD5, CD7 (ryc. 5.).
Ponad 97% blastów wykazywalo ekspresję antygenu
CD45 i około 50% ekspresję antygenu CD34. Z antygenów charakterystycznych dla limfocytów T, będących
podstawą rozpoznania ALL T, najczęściej występował
antygen CD7. Był on podstawą rozpoznania u 87% chorych w tej grupie. Antygeny CD2, CD5 i CD3 były
obecne odpowiednio u 69,6%, 69,2 i 51, 2% pacjentów
z rozpoznaną ALL T.
Analiza testem χ2 wykazała statystycznie istotne
różnice w częstości występowania tych antygenów na
blastach T (p < 0,01). Częściej na wyższym odsetku
limfoblastów T występował antygen CD7 (p < 0,01) w
porównaniu do CD2 i CD5. Częściej wyższy odsetek
blastów miał ekspresje CD7 niż CD5 (p < 0,01). Częstość występowania antygenu CD3 była najniża w porównaniu do CD7, CD5 i CD2 (p < 0,01).
W grupie pacjentów z rozpoznaną ostrą białaczką
mieloidalną (AML) (nielimfoblastyczną) antygen CD45
kappa
antygen
sIgG+IgA
CD19/CD10
HLA DR
CD22
CD19
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
procent pacjentów
Ryc. 4. Odsetek pacjentów z blastami ALL B wykazującymi charakterystyczne antygeny (n = 3).
Fig. 4. Percentage of patients with ALL B blasts expressing characteristic antigens (n = 3).
W tym typie białaczki antygen CD10 towarzyszył
CD19 tylko u około 10% badanych i to na niskim odsetku blastów.
W cALLB stwierdzono również, że istotnie częściej
w szpiku występuje wyższy odsetek blastów z ekspresją
CD19 w porównaniu do CD22. Analiza częstości występowania antygenu CD19 i CD22 na blastach testem χ2
wykazała istotność statystyczną z p > 0,0001.
We wszystkich badanych przypadkach stwierdzano
obecność antygenów CD19 i CD10.
U chorych z rozpoznaną ALL preB i dojrzałokomórkową B nie znaleziono różnic w częstości występowania
antygenów CD19 i CD22. W tych przypadkach pojawiał
się na większości blastach antygen CD20.
wykryto na blastach 97% pacjentów a antygen CD43
u 54%. Występowanie antygenów CD13 i CD33 na
blastach upoważniające do rozpoznania AML stwierdzono odpowiednio u 73% i 81% pacjentów. Ekspresja
antygenu CD15 wystąpiła na blastach 74% chorych
a wewnątrzkomórkową mieloperoksydazę (MPO) znaleziono w blastach 55% chorych. Analiza testem χ2 nie
wykazała istotnej statystycznie zmienności występowania antygenów CD13 i CD33 na badanych blastach. Jak
pokazuje rycina 6. antygen CD33 występował nieco częściej na blastach w większym odsetku badanych w porównaniu do CD13 i CD15.
Algorytm fenotypowania blastów w ostrych białaczkach dziecięcych
100
90
80
70
60
%
50
40
30
20
10
0
CD45
CD34
HLA DR
CD7
CD2
CD5
CD3
CD4
CD8
antygen
Ryc. 5. Odsetek pacjentów z T ALL, u których analizowane antygeny wystąpiły na powyżej 25 blastów (n = 53).
Fig. 5. Percentage of patients with diagnosed ALL T in which
analyzed antigens were expressed on more than 25% bone
marrow blasts (n = 53).
100
90
80
Wstępny panel przeciwciał wykaże również obecność najbardziej typowych koekspresji T na B, B na T
i mielo na B i T [12].
W celu rozpoznania etapu zróżnicowania blastów
można zastosować:
a/ w przypadku ALLT MoAbs anty: CD2, CD3,
CD4, CD8,
b/ w przypadku ALLB MoAbs anty: C20, CD10, cyt.
m, kappa, lambda, sIgG, sIgM, CD79,
c/ w przypadku AML MoAbs anty: CD117, CD13,
CD14, CD15, CD7, MPO i CD41, CD42, CD61, CD65.
Rozpoznanie linii i etapu zróżnicowania komórki
blastycznej wystarcza lekarzowi do postawienia rozpoznania i rozpoczęcia leczenia. Oszczędność przeciwciał
monoklonalnych poprzez obniżenie wstępnego kosztu
badania umożliwi dalsze poszukiwanie na lub w komórce nowotworowej [12, 13, 14] markerów odróżniających
ją od komórki prawidłowej. Pozwoli to na śledzenie
choroby resztkowej bez znacznego podwyższania kosztów takiego badania.
Wniosek
70
60
%
193
50
40
30
20
10
0
CD45
CD34
HLA DR
CD13
CD33
CD15
MPO
antygen
Ryc. 6. Odsetek pacjentów z AML, u których analizowane
antygeny występowały na powyżej 25% blastów (n = 43).
Fig. 6. Percentage of patients with diagnosed AML in which
analyzed antigens were expressed on more than 25% bone
marrow blasts (n = 43).
Dyskusja
Przeprowadzona analiza oceniająca przydatność diagnostyczną poszukiwania określonych antygenów na blastach szpiku chorych podejrzanych o chorobę nowotworową
w układzie krwiotwórczym wykazała, że w największym
odsetku chorych antygenami różnicującymi ostrą białaczkę limfoblastyczną B od T są antygeny CD19 dla ALLB
i CD7 dla ALLT. W białaczkach AML zaobserwowano
tendencję do częstszego występowania na mieloblastach
antygenu CD33 w porównaniu do CD13. Uzyskane wyniki
sugerują możliwość znacznego ograniczenia liczby przeciwciał monoklonalnych w stosowanym do immunofenotypowania panelu. Wstępne zastosowanie zestawu zawierającego przeciwciała anty CD45, CD34 i HLA DR oraz
CD19, CD7 i CD33 i odpowiednich kontroli izotypowych
da w ponad 90% przypadków rozpoznanie linii, z której
pochodzą blasty.
Wynik taki uzyska się z cytometru bardzo szybko.
Po rozpoznaniu linii należałoby szukać przy pomocy dodatkowych przeciwciał monoklonalnych ekspresji tych
antygenów, które dla tej linii pozwolą określić etap zróżnicowania komórki nowotworowej [11, 12].
Przedstawiona analiza upoważnia do wnioskowania,
że dwuetapowe immunofenotypowanie blastów przyniesie wymierne korzyści w sensie oszczędności zużycia
przeciwciał monoklonalnych umożliwiając bardziej celowane badania nad poszukiwaniem cech choroby resztkowej bez znacznego podwyższenia kosztów. Jednocześnie proponowana procedura nie będzie się wiązała
z ograniczeniem informacji dla lekarza o cechach komórki nowotworowej niezbędnych dla prawidłowego
rozpoznania choroby.
Piśmiennictwo
1. Kaleem Z., Crawford E., Pathan M.H. et al.: Flow cytometric
analysis of acute leukemias. Diagnosis utility and critical
analysis of data. Arch. Pathol. Lab. Med., 2003, 127, 42-48.
2. Orfao A., López A., Flores J. et al.: Diagnosis of hematological malignancies: new applications for flow cytometry.
Hematology (EHA Educ. Program), 2006, 2, 6-13.
3. Bene M.C., Castoldi G., Knapp W., Ludwig W.D. et al.:
Proposals for the immunological classification of acute
leukemias. European group for the immunological characterization of leukemias (EGIL). Leukemia, 1995, 9, 1783-1786.
4. Compana D.: Application of cytometry to study acute leukemia: in vitro determination of drug sensitivity and detection of minimal residual disease. Cytometry, 1994, 18, 68-74.
5. Compana D., Coustan-Smith E.: Advances in the immunological monitoring of childhood acute lymphoblastic
leukemia. Best Pract. Res. Clin. Hematol., 2002, 15, 1-19.
6. Sikorska-Fic B., Wąsik M., Rybczyńska J., Stelmaszczyk A.,
Rokicka-Milewska R.: DNA index in children with acute
lymphoblastic leukaemia – additional diagnostic factor. Cent.
Eur. J. Immunol., 1999, 24, 181-190.
7. Pui Ch-H., Evans W.E.: Treatment of acute lymphoblastic
leukemia. N. Eng. J. Med., 2006, 354, 166-181
8. Malinowska I., Stelmaszczyk-Emmel A., Wąsik M., Rokicka-Milewska R.: Apoptosis and pH of blasts in acute
childhood leukaemia. Med. Sci. Monit, 2002, 8, 441-447.
194
Maria Wąsik i inni
9. Malinowska I., Wąsik M., Stelmaszczyk A., Górska E.,
Steczowicz M., Rokicka-Milewska R.: Evaluation of spontaneous and therapeutically induced apoptosis in childhood
Leukemias. Acute Leukemias VIII: prognostic factors and
treatment strategies. In: Haematology and Blood Transfusion.
Red. Buchner T. Springer-Verlag, Berlin, 2001, 124-127.
10. Modzelewska M., Wąsik M.: Ekspresja białek egulujących
apoptozę i lekowrażliwość w/na komórkach prawidłowego
szpiku i krwi obwodowej. Haematol. Pol., 2004, 35, 242250.
11. Wąsik M.: Przydatność i zasady oceny fenotypu komórek
w diagnozowaniu ostrych bialaczek. Diag. Lab., 2001, 37,
227-233.
12. Drach J., Drach D., Classl H.: Flow cytometric determination
of atypical expression in acute leukemia for the study of
minimal residual disease. Cytometry, 2005, 13, 893-901.
13. Stelmaszczyk-Emmel A., Wasilewski R., Górska E., Popko
K., Modzelewska M., Wąsik M: Sefulness of cytoplasmatic
antigens appointing in hyperplastic cells in case of acute
childhood leukaemia. Proceedings of the 15th IFCC-IFSCC
European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory
Medicine. Barcelona, Euromedlab, 2003, 891-895.
14. Stelmaszczyk-Emmel A., Górska E., Malinowska I., Matysiak M., Wąsik M.: The influence of dexamethazone on
P-glycoprotein (P-gp)on expression and activity. Pol. J.
Environ. Stud., 2005, 14, Suppl. II, Part I, 344-347.
15. Wąsik M., Modzelewska M., Górska E. i wsp.: Mechanizmy
regulujące lekooporność komórek nowotworowych. Aktualne Problemy Immunodiagnostyki i Immunotoksykologii.
Red. Skopińska-Różewska E., Siwicki.A.K., Wyd. SPW
Edycja, Olsztyn 2007, 245-258.
Adres do korespondencji:
Prof. dr hab. Maria Wąsik
Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej
ul. Marszałkowska 24
00-576 Warszawa