IDENTYFIKACJA I OCENA FUNKCJONALNA KOMÓREK NKT.

Praca poglądowa/Review article 2013
IDENTYFIKACJA I OCENA FUNKCJONALNA
KOMÓREK NKT.
Justyna Woś1, Agnieszka Bojarska-Junak1
1
Uniwersytet Medyczny, Lublin
STRESZCZENIE
Komórki NKT (natural killer T cells) stanowią specyficzną subpopulację limfocytów
T wykazującą zarówno ekspresję markerów charakterystycznych dla limfocytów T, jak też
typowych dla komórek NK. Liczne funkcje regulacyjne, a także efektorowe oraz unikalna
zdolność do rozpoznania antygenów lipidowych zarówno komórek prawidłowych, jak też
nowotworowych czy patogenów sprawia, iż komórki NKT odgrywają istotną rolę
w odpowiedzi immunologicznej w przebiegu różnego rodzaju infekcji, nowotworów oraz
wielu innych chorób. W związku z tym istotne znaczenie ma dokładna ocena ilościowa jak też
jakościowa tej niewielkiej populacji komórkowej. Głównym narzędziem wykorzystywanym
do identyfikacji komórek NKT jest wieloparametrowa cytometria przepływowa.
SŁOWA KLUCZE: NKT, Cytometria przepływowa
W ostatnich latach poczyniono
komórek stanowiącą we krwi od 0,01% do
1% (średnio około 0,1%) subpopulacji
limfocytów T [4,5,6]. Jak na tak małą
istotny postęp w poznaniu cech
immunofenotypowych i czynnościowych
subpopulacji komórek NKT. Większość
informacji na temat tej populacji komórek
pochodzi z badań na myszach, jednak
populację komórek, komórki NKT mają
niezwykle wszechstronny i decydujący
wpływ na wiele składowych układu
odpornościowego, a także odpowiedź immunologiczną. Wydaje się, że komórki
cechy fenotypowe i czynnościowe, a także
mechanizmy
odpowiedzialne
za
różnicowanie komórek NKT wydają sie
podobne u obu gatunków [1,2,3].
NKT działają w fazie pośredniej pomiędzy
układami odporności wrodzonej i nabytej.
Ponadto, przypisuje się im funkcje
zarówno komórek regulatorowych, jak też
WSTĘP
Limfocyty
NKT
są
niewielką
grupą
efektorowych układu immunologicznego.
1
Praca poglądowa/Review article 2013
Komórki NKT są subpopulacją
komórek Tɑβ, wykazującą koekspresję
receptorów
limfocytów
T
(TCR)
i markerów charakterystycznych dla
klasycznych komórek NK (CD161, CD56).
W odróżnieniu od konwencjonalnych
limfocytów T rozpoznających cząsteczki
Liczne funkcje regulacyjne, a także
efektorowe oraz unikalna zdolność do
rozpoznania
antygenów
lipidowych
zarówno komórek prawidłowych jak też
guzów czy patogenów sprawia, iż komórki
NKT odgrywają istotną rolę w odpowiedzi
immunologicznej w przebiegu różnego
MHC klasy I i MHC klasy II, które
prezentują antygeny peptydowe, komórki
NKT wykazują zdolność rozpoznawania
cząsteczek CD1d [1,7]. Ta monomorficzna
cząsteczka
prezentuje
antygeny
rodzaju infekcji, nowotworów oraz wielu
innych chorób [12].
o charakterze lipidów i glikolipidów [8,9].
Dlatego też komórki NKT wypełniają lukę
w repertuarze antygenów rozpoznawanych
przez konwencjonalne limfocyty T.
Ponadto NKT cechuje zdolność do
(komórki NKT typu I, iNKT) podlegają
restrykcji CD1d oraz wykazują wyjątkową
zdolność odpowiadania na stymulację
ɑ-galaktozyloceramidem
(ɑ-GalCer).
α-GalCer otrzymany z gąbek morskich
szybkiego wydzielania cytokin przez co
przyczyniają się do pobudzenia innych
komórek układu immunologicznego komórek NK, makrofagów, neutrofili,
limfocytów B, a także typowych
limfocytów T [10,11]. Aktywowane
komórki NKT wydzielają cytokiny IL-4,
IL-5 i Il-10 charakterystyczne dla
limfocytów
Th2
biorących
udział
Agelas mauritianus był pierwszym
opisanym
ligandem
„klasycznych”
komórek NKT, zdolnym do indukcji ich
proliferacji oraz wytwarzania cytokin.
Komórki te charakteryzują się ekspresją
łańcucha TCRɑ o stałej budowie:
Vɑ24Jɑ18 u człowieka i Vɑ14Jɑ18
u myszy, a także ograniczonej liczbie
łańcuchów β: Vβ11 u człowieka oraz Vβ8,
Vβ7 i Vβ2 u myszy. Wykazano, że ludzkie
w odpowiedzi humoralnej oraz IFN-
i TNF, cytokiny charakterystyczne dla
limfocytów
Th1,
biorących udział
w odpowiedzi komórkowej. Ponadto,
komórki NKT wykazują aktywność
cytolityczną, ze względu na wysoki
poziom perforyny, granzymu B, TRAIL
oraz ligandu receptora FAS. Przyczyniają
się w ten sposób do eliminacji komórek
docelowych [6,11].
Komórki NKT typu I
"Klasyczne"
komórki
NKT
komórki NKT typu I można podzielić na
CD4+CD8–, CD4– CD8+ lub podwójnie
ujemne CD4–CD8– [1,10,13].
Komórki NKT typu II
Komórki
NKT
typu
II
("nieklasyczne" komórki NKT) stanowią
drugą grupę subpopulacji komórek NKT,
która również podlega restrykcji CD1d,
2
Praca poglądowa/Review article 2013
jednak w odróżnieniu od komórek NKT
typu I,
komórki NKT typu II nie
odpowiadają na stymulację ɑ-GalCer
[14,15,16] Ponadto subpopulacja ta
posiada heterogenny repertuar łańcuchów
TCR oraz nie wykazuje ekspresji
"klasycznych" łańcuchów TCRɑ Vɑ24-
niskim nieswoistym barwieniem tła, jednak
ich zastosowanie nie umożliwia podziału
komórek NKT na poszczególne typy
(komórki NKT typu I i NKT typu II)
[19,20].
Istotny postęp w badaniu komórek
NKT typu I, stanowił rozwój tetramerów
Jɑ18 u człowieka i Vɑ14-Jɑ18 u myszy
[14].
CD1d
naładowanych
ɑ-GalCer.
Umożliwiło to jednoznaczne określenie
„klasycznych”
komórek
NKT
na
podstawie samej reaktywności z CD1d/ɑGalCer, niezależnie od innych markerów
IDENTYFIKACJA
I
OCENA
FUNKCJONALNA KOMÓREK NKT
Podstawowym
krokiem
w dokładnej analizie funkcjonalnej oraz
czynnościowej komórek NKT jest ich
precyzyjna identyfikacja. Jednakże, ocena
tej subpopulacji komórek jest znacznie
utrudniona głównie ze względu na niski
odsetek komórek NKT. Z uwagi na brak
wiedzy o specyficznych markerach, jak też
fizjologicznych funkcjach komórek NKT
typu II są one znacznie słabiej poznane.
W większości dostępnych prac oceniana
jest subpopulacja komórek iNKT (NKT
typu I), będąca obecnie jedynym rodzajem
fenotypowych [10,15,16] (Rycina 1).
Liczne prace wskazują jednak, że
tetramery
α-GalCer/CD1d
mogą
niespecyficznie wiązać się z limfocytami
B. W związku z tym zaleca się
zastosowanie
przeciwciał
anty-CD19
w
celu
wyeliminowania
komórek
niespecyficznie
wyznakowanych
α-GalCer/CD1d [4,5].
komórek NKT, który może zostać
zidentyfikowany na podstawie budowy
i swoistości receptorów TCR [15,16].
Jedną z powszechnych metod
identyfikacji
komórek
NKT
jest
wykorzystanie
przeciwciał
monoklonalnych anty-Vα24 (klon C15)
i anty-Vβ11 (klon C21) [17,18].
Przeciwciała te charakteryzują się bardzo
Rycina 1. Identyfikacja komórek iNKT za pomocą
tetramerów α-GalCer/CD1d (PROIMMUNE).
3
Praca poglądowa/Review article 2013
Przeciwciało monoklonalne iNKT
(klon 6B11)
reaguje z unikalną
determinantą
w
regionie
CDR3
niezmiennego łańcucha TCR (Vα24Jα18)
komórek
iNKT
[19,21].
Zatem
zastosowanie
przeciwciała
6B11
samodzielnie, czy też w połączeniu z antyVβ11 i/lub anty-CD3 wydaje się
doskonałym narzędziem do analizy
„klasycznych” komórek NKT (Rycina 2).
o pełnej dojrzałości komórek NKT.
Obwodowe i grasicze komórki NKT
NK1.1- (CD161-) są zwykle traktowane
jako „niedojrzałe” [8,22,23,24]. Należy
podkreślić, iż markery komórek NK mogą
również występować na niektórych
konwencjonalnych limfocytach T ocena
tych receptorów na komórkach CD3 nie
może być podstawą identyfikacji komórek
NKT.
Tak jak już wspomniano wcześniej
cechą charakterystyczną komórek NKT
jest zdolność do gwałtownej i szybkiej
Rycina 2. Przykładowy obraz z cytometru
przepływowego przedstawiajacy identyfikację
komórek iNKT za pomocą przeciwciała
monoklonalnego anty-iNKT (anty-Vα24-Jα18, klon
6B11) (BD Pharmingen).
sekrecji cytokin IFN- i IL-4 oraz IL-2, -5,
-6, -10, -13, -17, TNF, TGF-β i GM-CFS
[8,25]. Cytokiny odgrywają kluczową rolę
w reakcjach odpornościowych, reakcjach
zapalnych,
w
procesach
rozwoju,
regeneracji i utrzymania homeostazy
tkanek, a także aktywacji
różnych
komórek układu immmunologicznego.
Dlatego istotne znaczenie może mieć
Ze względu na fakt, że niezmienny łańcuch
ocena wewnątrzkomórkowej ekspresji
cytokin w komórki NKT oraz ocena
zdolności wydzielania cytokin przez te
komórki. Dostępnych jest wiele metod
mierzących ilość wydzielonej cytokiny np.
Vα24 jest połączony tylko z łańcuchem
Vβ11,
mało
prawdopodobne
jest
rozpoznanie innych komórek niż iNKT
przez
przeciwciało
6B11
wśród
limfocytów.
test
immunoenzymatyczny
ELISA,
ELISPOT. Znaczenie mogą mieć także
metody oceniające ekspresję cytokin na
poziomie mRNA. Analiza cytometryczna
daje możliwość oceny populacji komórek
W celu oceny funkcjonalnej oraz
stopnia dojrzałości komórek NKT stosuje
sie przeciwciało anty-CD161. Ekspresja
antygenu NK1.1 (CD161) świadczy
odpowiedzialnych za wydzielanie badanej
cytokiny. Dzięki zastosowaniu mieszaniny
znaczników
immunofluorescencyjnych
rozpoznających powierzchniowe oraz
4
Praca poglądowa/Review article 2013
wewnątrzkomorkowe antygeny możliwa
jest analiza określonej populacji komórek,
w tym komórek NKT. Metoda ta
pozwalam na ocenę zdolności tych
komórek do wytwarzania cytokin bez
konieczności pracochłonnej separacji.
Równie istotna jest ocena zdolności
Adv Cancer Res. 2008; 101: 277348.
2. Godfrey DI, Stankovic S, Baxter
AG. Raising the NKT cell family.
Nat Immunol. 2010; 11: 197–206.
3. van den Heuvel MJ, Garg N, Van
Kaer L, Haeryfar SM. NKT cell
komórek NKT do wykazywania efektu
cytotoksycznego. Aktywność cytolityczna
komórek NKT zbliżona jest do aktywności
komórek NK i polega ona na uczynnieniu
układów
generujących
perforynę,
costimulation:
experimental
progress and therapeutic promise.
Trends Mol. Med. 2011; 17: 65–77.
4. Kita H, Naidenko OV, Kronenberg
M, Ansari AA, Rogers P, He XS,
granzymy i ligand receptora FAS [26].
Oceny takiej można dokonać metodą
cytometrii przepływowej za pomocą
przeciwciał monoklonalnych anty-granzym
A (klon CB9) oraz anty-perforyna (klon
Koning F, Mikayama T, Van De
WJ, Coppel RL, Kaplan M,
Gershwin ME. Quantitation and
phenotypic analysis of natural killer
T cells in primary biliary cirrhosis
dG9).
Komórki NKT stanowią małą
populację komórek, jednak przypisuje się
jej duży wpływ na cały układ
immunologiczny, głównie ze względu na
zdolność wpływania na inne ważne
elementy
układu
odpornościowego.
Pomimo licznych badań komórki NKT
wciąż nie są w pełni poznane. W świetle
powyższych informacji istotne znaczenie
ma dokładna ocena zarówno funkcjonalna,
jak też czynnościowa komórek NKT.
PIŚMIENNICTWO
1. Terabe M, Berzofsky JA. The role
of NKT cells in tumor immunity.
using a human CD1d tetramer.
Gastroenterology. 2002; 123: 10311043.
5. Lee PT, Benlagha K, Teyton L,
Bendelac A. Distinct functional
lineages of human V(alpha)24
natural killer T cells. J Exp Med.
2002; 195: 637- 641.
6. Gumperz JE, Miyake S, Yamamura
T, Brenner MB. Functionally
distinct subsets of CD1d-restricted
natural killer T cells revealed by
CD1d tetramer staining. J Exp
Med. 2002; 195: 625- 636.
7. Godfrey DI, Kronenberg M. Going
both ways: immune regulation via
CD1d-dependent NKT cells. J Clin
Invest. 2004; 114: 1379-1388.
5
Praca poglądowa/Review article 2013
8. Bendelac A, Savage PB, Teyton L.
The biology of NKT cells. Annu
Rev Immunol. 2007; 25: 297- 336.
9. Brutkiewicz RR. CD1d ligands: the
good, the bad, and the ugly. J
Immunol. 2006; 177: 769- 775.
10. Matsuda JL, Mallevaey T, Scott-
Wang CR, Koezuka Y, Kronenberg
M. Tracking the response of natural
killer T cells to a glycolipid antigen
using CD1d tetramers. J Exp Med.
2000; 192: 741-754.
16. Benlagha K, Weiss A, Beavis A,
Teyton L, Bendelac A. In vivo
Browne J, Gapin L. CD1drestricted iNKT cells, the 'SwissArmy knife' of the immune system.
Curr Opin Immunol. 2008; 20: 358368.
identification of glycolipid antigenspecific T cells using fluorescent
CD1d tetramers. J Exp Med. 2000;
191: 1895-1903.
17. Harner S, Noessner E, Nadas K,
11. Wu L, Gabriel CL, Parekh VV, Van
Kaer L. Invariant natural killer T
cells: innate-like T cells with potent
immunomodulatory
activities.
Tissue Antigens. 2009; 73: 535-
Leumann- -Runge A, Schiemann
M, Faber FL, Heinrich J, KraussEtschmann S. Cord blood Vα24Vβ11 natural killer T cells display a
Th2-chemokine receptor profile
545.
12. Masaki T and Berzofsky JA. The
Role of NKT Cells in Tumor
Immunity. Adv Cancer Res. 2008;
101: 277–348.
13. Ishihara S, Nieda M, Kitayama J,
Osada T, Yabe T, Ishikawa Y,
Nagawa H, Muto T, Juji T.
CD8(+)NKR-P1A
(+)T
cells
preferentially accumulate in human
and cytokine responses. PLoS One.
2011; 6:e15714.
18. Spada FM, Koezuka Y, Porcelli
SA. CD1d- -restricted recognition
of synthetic glycolipid antigens by
human natural killer T cells. J Exp
Med. 1998; 188:1529-1534.
19. Thomas SY, Hou R, Boyson JE,
Means TK, Hess C, Olson DP,
Strominger JL, Brenner MB,
liver. Eur. J. Immunol. 1999; 29:
2406–2413.
14. Godfrey DI, MacDonald HR,
Kronenberg M, Smyth MJ, Van
Kaer L. NKT cells: what's in a
Gumperz JE, Wilson SB, Luster
AD. CD1d-restricted NKT cells
express a chemokine receptor
profile indicative of Th1-Type
inflammatory homing cells. J
name? Nat Rev Immunol. 2004; 4:
231-237.
15. Matsuda JL, Naidenko OV, Gapin
L, Nakayama T, Taniguchi M,
Immunol. 2003; 171: 2571-2580.
20. Kent SC, Hafler DA, Strominger
JL, Wilson SB. Noncanonical
Valpha24JalphaQ T cells with
6
Praca poglądowa/Review article 2013
conservative alpha chain CDR3
region amino acid substitutions are
restricted by CD1d. Hum Immunol.
1999; 60: 1080-1089.
21. Boyson JE, Rybalov B, Koopman
LA , Exley M, Balk SP , Racke FK,
Schatz F, Masch R, Wilson SB,
activation. Int. Immunol. 2004; 16:
241–247.
24. McNab FW, Pellicci DG, Field K,
Besra G, Smyth MJ, Godfrey DI,
Berzins SP. Peripheral NK1.1 NKT
cells are mature and functionally
distinct
from
their
thymic
Strominger JL. CD1d and invariant
NKT cells at the human maternalfetal interface. Proc Natl Acad Sci
U S A. 2002; 99: 13741-13746.
22. Crowe
NY,
Uldrich
AP,
counterparts. J. Immunol. 2007;
179: 6630–6637.
25. Sakuishi K, Oki S, Araki M,
Porcelli SA, Miyake S, Yamamura
T. Invariant NKT cells biased for
Kyparissoudis K, Hammond KJ,
Hayakawa Y, Sidobre S, Keating R,
Kronenberg M, Smyth MJ, Godfrey
DI. Glycolipid antigen drives rapid
expansion and sustained cytokine
IL-5 production act as crucial regulators of inflammation. J.
Immunol. 2007; 179: 3452–3462.
26. Leite-de-Moraes MC, Herbelin A,
Gouarin C, et al. Fas/Fas ligand
production by NK T cells. J.
Immunol, 2003; 171: 4020–4027.
23. Harada M, Seino K, Wakao H,
Sakata S, Ishizuka Y, Ito T, Kojo S,
Nakayama T, Taniguchi M. Downregulation of the invariant Va14
antigen receptor in NKT cells upon
interactions promote activationinduced cell death of NK T
lymphocytes. J Immunol. 2000;
165:4367-71.
7