ćwiczenie 4 - ATRINBIOTECH

„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
ELEKTROFOREZA BIAŁEK W ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM
W WARUNKACH DENATURUJĄCYCH
WPROWADZENIE
Elektroforeza od ponad 60 lat pozostaje najczęściej stosowaną metodą izolacji
makrocząstek w układach biologicznych oraz stanowi cenne narzędzie dostarczające
informacji na temat masy cząsteczkowej, modyfikacji struktury, ładunku, czystości preparatu.
Metoda ta wykorzystuje zjawisko wymuszonego ruchu cząstek obdarzonych ładunkiem,
nałożonych na żel, w polu elektrycznym. Odległość jaką są one w stanie pokonać zależy od
wielkości porów układu rozdzielającego, masy cząsteczkowej rozdzielanych substancji i
wypadkowego ładunku. Elektroforeza w warunkach denaturujących SDS-PAGE (ang. sodium
dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) jest najbardziej rozpowszechnioną
techniką rozdziału białek i kwasów nukleinowych. Dodecylosiarczan sodu jest detergentem
anionowym, który wiąże się z białkami i niszczy ich naturalną strukturę trójwymiarową,
zmieniając je w sztywne cząsteczki o kształcie pałeczek. Ponadto nadaje białkom silny
ładunek ujemny niezależnie od ich składu aminokwasowego. Białka poddane elektroforezie w
obecności SDS poruszają się z szybkością zależną jedynie od ich rozmiarów. W 1959 jako
nośnik do elektroforezy został wprowadzony poliakrylamid. Zel poliakrylamidowy ma szereg
zalet: jest łatwy i szybki w przygotowaniu, obojętny chemiczny, bezbarwny, wytrzymały
mechanicznie i termicznie oraz pozbawiony ładunków elektrycznych. Powstaje wskutek
polimeryzacji akrylamidu i N,N’-bisakrylamidu, a wielkość sieci oczek zależy od proporcji
między tymi substratami. Polimeryzacja rozpoczyna się po dodaniu nadsiarczanu amonu w
obecności katalizatora, którym jest N,N,N’,N’-tetrametylo-etylenodiamina (TEMED) lub βdimetyloaminopropionitryl (DMAP). W wyniku rozpadu nadsiarczanu amonu w obecności
katalizatora powstają wolne rodniki tlenowe inicjujące powstawanie rodników akryl
amidowych. Początkowo w elektroforezie SDS-PAGE zakładano jednorodne warunki
rozdziału. Metodę tę wkrótce zastąpiono przez układ złożony z dwóch faz: zagęszczającej i
rozdzielającej. Fazy te różnią się między sobą stężeniem akrylamidu oraz pH. W
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
zagęszczającym następuje koncentracja białka w wąskim pasie startowym, co sprawia, że
wszystkie białka rozpoczynają rozdział od tego samego punktu.
Zastosowanie białek wzorcowych pozwala na sporządzenie krzywej zależności
ruchliwości elektroforetycznej od logarytmu masy cząsteczkowej, na podstawie której można
wyznaczyć eksperymentalnie masy cząsteczkowe badanych białek.
Ze względu na brak barwy większości białek w świetle widzialnym niezbędne jest ich
wybarwianie pozwalające na dalszą analizę jakościową i ilościową. Stosuje się wiele technik
barwienia, z których najczęściej stosowane są błękit CBB (Coomassie Brillant Blue) lub sole
srebra. W środowisku kwaśnym cząsteczki barwnika CBB wiążą się do grup aminowych
łańcucha polipeptydowego poprzez oddziaływania hydrofobowe. Detekcja z wykorzystaniem
soli srebra opiera się na precypitacji srebra na powierzchni żelu w postaci ciemnobrunatnych
plamek na jasnym tle. Metodę tę stosuje się często w proteomice ze względu na wysoką
czułość.
WYKONANIE
Przygotowanie żelu poliakrylamidowego i rozdział białek
A.
•
Przygotować aparat do elektroforezy starannie odtłuszczając alkoholem etylowym
wszystkie uszczelki i szyby. Zmontować zestaw według instrukcji.
•
Przygotować 12% żel rozdzielający. W tym celu do zlewki wprowadzić kolejno: 20,4
ml wody destylowanej, 15 ml buforu 1,5 M Tris-HCl z 0,4% SDS o pH 8,8, 24 ml
30% akrylamid/bisakrylamidu, 0,6 ml 10% SDS, 60 µl TEMED, 0,3 ml 10% APS.
Uwaga! Wprowadzenie APS uruchamia proces polimeryzacji. Tak przygotowana
mieszaninę ostrożnie, aby uniknąć pojawienia się bąbelków powietrza, wlać pomiędzy
szyby. Na powierzchnię żelu nawarstwić alkohol izopropylowy i pozostawić do
całkowitej polimeryzacji (około 45 minut).
•
Pod koniec polimeryzacji przygotować 7% żel zagęszczający o składzie: 12,44 ml
wody destylowanej, 2,51 ml buforu 0,5 M Tris-HCl z 0,4% SDS o pH 6,8, 4,81 ml
30% akrylamid/bisakrylamidu, 200 µl 10% SDS, 25 µl TEMED, 100 µl 10% APS. Na
osuszoną po zlaniu alkoholu izopropylowego powierzchnię żelu rozdzielającego wlać
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
przygotowany roztwór żelu zagęszczającego. Po wylaniu żelu zagęszczającego
umieścić w nim grzebień i pozostawić na około 30 minut do pełnej polimeryzacji.
•
W trakcie polimeryzacji przygotować próby białkowe. W tym celu pobrać 100 µl
buforu S (o składzie: 62,5 mM buforu Tris-HCl o pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 5%
2-merkaptoetanol, 0,05% błękitu bromofenylowego) i odpowiednią ilość badanej
próbki (o stężeniu białka 1-2 mg/ml) lub prób zawierających markery masy
molekularnej o znanej wielkości. Mieszaninę inkubować w temperaturze 96°C przez
10 minut, w celu usunięcia wiązań siarczkowych ze struktury białka. Po inkubacji
próbki dobrze wymieszać.
•
Umocować spolimeryzowane żele w aparacie do elektroforezy, delikatnie wyciągnąć
grzebienie spomiędzy płytek, a następnie zalać kieszonki buforem elektrodowym o pH
8,3 (o składzie: 0,025 M Tris-HCl, 0,192 M glicyny, 0,1% SDS) oraz napełnić tym
buforem komory aparatu.
•
Nałożyć próbki i standardy do wcześniej zalanych buforem elektrodowym kieszonek.
Komorę podłączyć do zasilacza i prowadzić rozdział elektroforetyczny w
temperaturze 4°C przy napięciu 60 V dopóki próba znajduje się w żelu
zagęszczającym, a następnie przy napięciu 120 do momentu, gdy marker migracji
białek osiągnie odległość 1 cm od końca żelu rozdzielającego. Po zakończeniu
elektroforezy rozmontować zestaw i pozostawić żel do wybarwienia.
Wywoływanie białek w żelu poliakrylamidowym metodą z Coomassie Brillant
B.
Blue
•
Żel zanurzyć w roztworze A (130 ml wody destylowanej, 30 ml etanolu i 20 ml kwasu
octowego) i wytrząsać w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Następnie żel przenieść
do roztworu B (130 ml wody destylowanej, 50 ml etanolu, 20 ml kwasu octowego,
0,04 gCoomassie Brillant Blue R-250) i wytrząsać w temperaturze 37°C przez 20-30
minut. Po inkubacji w roztworze barwnika żel przenieść do roztworu C (160 ml wody
destylowanej, 20 ml etanolu i 20 ml kwasu octowego) i wytrząsać w temperaturze
37°C aż do odbarwienia.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
C.
Wywoływanie białek w żelu poliakrylamidowym metodą srebrową
•
Uwaga! Wszystkie etapy barwienia przeprowadzać z energicznym wytrząsaniem.
•
Żel utrwalić przez 1 godzinę w 200 ml roztworu 1 (o składzie: 50% metanol, 12%
kwas octowy, 0,5 ml/l formaldehyd, woda), a następnie przemyć 50% alkoholem
etylowym 3-krotnie po 20 minut.
•
Przenieść żel do 200 ml roztworu 2 (roztwór 0,2g/l Na2S2O3 x 5H2O) na 1 minutę, a
następnie przemyć 3-krotnie wodą po 20 sekund.
•
Przenieść żel do 200 ml roztworu 3 (o składzie: 2 g/l AgNO3, 0,75 ml/l formaldehyd,
woda) i pozostawić na 20 minut. Następnie żel przemyć 3-krotnie wodą po 20 sekund.
•
Przenieść żel do 200 ml roztworu 4 (o składzie: 60 g/l Na2CO3, 0,5 ml/l formaldehyd,
4 mg/l Na2S2O3 x 5H2O, woda) i pozostawić maksymalnie do 10 minut (powinny
pojawić się brązowe prążki). Następnie żel przemyć wodą.
•
Przenieść żel w celu zatrzymania reakcji do 200 ml roztworu 5 (o składzie: 50%
metanol, 12% kwas octowy, woda) na 10 minut. Następnie przenieść żel do 50%
roztworu metanolu, w którym żel może być przechowywany.
LITERATURA
Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-258 (1976).
Doonan S. Białka i peptydy. Wydawnictwa naukowe PWN, Warszawa 2008.
Gniot-Szulżycka J., Leźnicki A., Komoszyński M., Wojczuk B. Materiały do ćwiczeń z
biochemii. Białka. Metody ilościowego oznaczania, rozdziału i oczyszczania. Uniwersytet
Mikołaja Kopernika w Toruniu, Toruń 2005.
Kraj A., Drabik A., Silberring J. Proteomika i metabolomika. Wydawnictwa Uniwersytety
Warszawskiego, Warszawa 2010.
Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970)
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
„Atrakcyjna i Innowacyjna Biotechnologia - ATRINBIOTECH”
Priorytet IV POKL „Szkolnictwo wyższe i nauka”
Uniwersytet Śląski w Katowicach, ul. Bankowa 12, 40-007 Katowice, http://www.us.edu.pl
OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW
• Na podstawie ruchliwości elektroforetycznej białek wzorcowych sporządzić krzywą
kalibracyjną zależności ruchliwości względnej białek (iloraz drogi przebytej przez
białko do drogi pokonanej przez czoło barwnika) od logarytmu ich masy cząsteczkowej.
• Na podstawie krzywej kalibracyjnej określić masę molekularną 1,2-dioksgenazy
katecholowej rozdzielonej na żelu.
• Wykonać zdjęcie otrzymanego żelu z dołączonym opisem.
• Zaproponować modyfikacje protokołu oczyszczania 1,2-dioksygenazy katecholowej
szczepu KB2, jeśli na obrazie SDS-PAGE występuje kilka prążków, zamiast
oczekiwanego jednego.
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego