WYTWARZANIE I ANALIZA PRODUKTÓW MLECZNYCH

Laboratorium - biotechnologia ogólna - dla studentów kierunku biotechnologia od 2014_2015
PRODUKCJA BIOMASY CZ 3.
Beztlenowy metabolizm sacharydów - fermentacja
Fermentacja etanolowa (alkoholowa) stanowi szereg reakcji enzymatycznych polegających na przekształceniu sacharydów do
etanolu, dwutlenku węgla oraz wytwarzaniu energii niezbędnej do procesów życiowych komórki drożdży. Przemiany składające się
na fermentację tworzą szlak amfiboliczny (powstające metabolity pośrednie są wykorzystywane jako substraty do produkcji
biomasy oraz donory i akceptory atomów wodoru i elektronów). Większość drożdży fermentujących może wykorzystywać glukozę,
fruktozę, mannozę i galaktozę. Głównym szlakiem fermentacji jest ciąg przemian cukrów zwany szlakiem Embdena-MeyerhofaParnasa (EMP) (rys. poniżej)
Fermentowany cukier po wniknięciu do komórki
drożdży jest przekształcany do D-glukozy, która
ulega fosforylacji do glukozo-6-fosforanu, a
następnie w wyniku kolejnych przemian
enzymatycznych szlaku EMP do 2 cząsteczek
pirogronianu. Po ich dekarboksylacji (do
aldehydu octowego i CO2) aldehyd octowy jest
redukowany, przy udziale dehydrogenazy
alkoholowej, do etanolu. Wytworzona energia
zostaje zmagazynowana w postaci 2 cząsteczek
ATP.
C6H12O6 -» 2CO2 + 2CH3CH2OH + 118,43 kJ/mol
Zaledwie 26% energii wytworzonej z 1 mola
glukozy jest magazynowane w postaci ATP. 74%
energii zostaje uwolnione w postaci ciepła.
Ponieważ podczas fermentacji temperatura
powinna być stale kontrolowana i utrzymywana
na poziomie 24-28oC, konieczne jest chłodzenie
kadzi z brzeczką fermentacyjną.
W rzeczywistości około 95% glukozy jest
fermentowane na drodze EMP, a oprócz
głównych produktów fermentacji powstają
niewielkie ilości glicerolu, kwasów organicznych,
alkoholi fuzlowych i mieszaniny wyższych alkoholi,
głównie pentanolu, butanolu i propanolu. W
warunkach limitowanego dostępu azotu, do
etanolu i CO2 przekształcane jest jedynie 70%
glukozy, natomiast jej pozostała część jest
magazynowana w postaci glikogenu.
Glikoliza jest procesem amfibolicznym, gdyż wiele metabolitów pośrednich tego szlaku jest wykorzystywane do biosyntezy
składników komórkowych: glukozo-6-fosforan w syntezie glukanu (sacharyd ściany komórkowej), triozofosforany w syntezie
lipidów, pirogronian jako prekursor aminokwasów.
Jednak rosnące komórki drożdży wymagają do procesów biosyntezy znacznie więcej związków niż szlak EMP jest w stanie
dostarczyć. Są one tworzone w obecności tlenu, w cyklu Krebsa oraz na drodze tlenowych przemian glukozo-6-fosforanu w
obecności NADP+ w szlaku heksozomonofosforanowym (HMP, szlak pentozofosforanowy), nazywanym też szlakiem pentozowym.
Głównym celem jest dostarczenie komórce NADPH niezbędnego do przeprowadzenia reakcji redukcji w cytoplazmie oraz synteza
pentoz. Reakcje zachodzą w cytozolu. W przebiegu szlaku pentozofosforanowego można wyróżnić dwie fazy. Pierwsza - faza
oksydacyjna, podczas której powstaje NADPH oraz druga - faza nieoksydacyjna podczas której powstają pentozy oraz cukry o 3, 4
i 7 atomach węgla. W fazie oksydacyjnej następuje przekształcenie glukozo-6-fosforanu w rybulozo-5-fosforan z wytworzeniem
dwóch cząsteczek NADPH. W fazie nieoksydacyjnej natomiast rybulozo-5-fosforanu zostaje przekształcony w rybozo-5-fosforan
lub ulega wieloetapowym przekształceniom w metabolity glikolizy.
Tlenowy metabolizm węglowodanów
Drożdże fermentujące w obecności tlenu przekształcają sacharydy, wykorzystując tlen cząsteczkowy jako akceptor protonów.
Drożdże niefermentujące metabolizują węglowodany tylko na drodze tlenowej.
Podstawowymi szlakami metabolizmu tlenowego są cykl Krebsa (zwany też cyklem kwasów trójkarboksylowych lub cyklem TCA)
oraz cykl glioksalowy, natomiast zmagazynowanie energii w postaci ATP zachodzi w cytochromach zlokalizowanych w
mitochondriach. Powstały w procesie glikolizy pirogronian, na drodze dekarboksylacji oksydatywnej, przy udziale koenzymu A i w
obecności dehydrogenazy pirogronianowej zostaje przekształcony do acetylokoenzymu A. Zaktywowany acetyl zostaje całkowicie
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium - biotechnologia ogólna - dla studentów kierunku biotechnologia od 2014_2015
PRODUKCJA BIOMASY CZ 3.
utleniony do dwutlenku węgla w szeregu cyklu kwasów trójkarboksylowych. Cykl Krebsa jest szlakiem amfibolicznym,
dostarczającym wielu substratów wykorzystywanych w procesach biosyntezy w komórce, np. w syntezie aminokwasów. W
przypadku wyczerpania zasobów cukru w pożywce hodowlanej, cykl Krebsa zostaje zahamowany na poziomie izocytrynianu, a
metabolizm sacharydów jest prowadzony na drodze cyklu glioksalowego. Wówczas, jako źródło węgla komórki wykorzystują inne
metabolity np. aldehyd octowy, etanol, glicerol, które są przekształcane w acetylo-CoA. Dalej w szlaku TCA do izotiocytrynianu,
kwasu glioksalowego i jabłczanu. Końcowymi etapami metabolizmu tlenowego drożdży są reakcje zachodzące w łańcuchu
oddechowym, polegające na przenoszeniu elektronów i protonów. Końcowym akceptorem elektronów jest tlen cząsteczkowy.
Na regulację cyklu ma wpływ kilka parametrów:
dostępność
substratów,
hamujące
działanie
nagromadzonych produktów i oparte na mechanizmach
sprzężenia zwrotnego allosteryczne hamowanie przez
następne
intermediaty
cyklu.
Najbardziej
prawdopodobnymi miejscami regulacji są reakcje
nieodwracalne katalizowane przez następujące enzymy:
- syntazę cytrynianową (hamowana przez cytrynian, a także
przez ATP)
- dehydrogenazę izocytrynianową (hamowana przez NADH
i ATP, a aktywowana przez ADP)
- dehydrogenazę α-ketoglutaranową (hamowana przez
NADH i bursztynylo-CoA)
- dehydrogenazę pirogronianową (hamowana przez NADH
i acetylo-CoA).
Cykl Krebsa przebiega szybciej, gdy poziom energii w
komórce jest niski (duże stężenie ADP, a małe stężenie ATP
i NADH), a zwalnia swój przebieg, gdy dochodzi do
akumulacji ATP (jak i również NADH, byrsztynylo-CoA oraz
cytrynianu).
Sumaryczny zysk cyklu to 12 cząsteczek ATP z jednej
cząsteczki acetylo-CoA.
C6H12O6 + 6O2 -» 6CO2 + 2H2O + 2824 kJ/mol
Cykl Krebsa poza utlenianiem spełnia także inne role
metaboliczne. Uczestniczy w glukoneogenezie, transaminacjach, deaminacjach i syntezie kwasów tłuszczowych. Intermediaty
cyklu dostarczają prekursorów do wielu szlaków biosyntez:
 synteza aminokwasów następuje po transaminacji α-ketoglutaranu
 synteza nukleotydów purynowych i pirymidynowych z α-ketoglutaranu i szczawiooctanu
 szczawiooctan może być przekształcany w glukozę w procesie glukoneogenezy
 bursztynylo-CoA jest najważniejszym intermediatem w syntezie pierścienia porfirynowego grup hemowych
 cytrynian przenosi grupy acylowe, potrzebne do syntezy kwasów tłuszczowych, z mitochondriów do cytosolu.
Łańcuch oddechowy. Utworzone m.in. podczas glikolizy czy cyklu kwasu cytrynowego NADH i FADH 2 są bogate energetycznie,
ponieważ zawierają pary elektronów o wysokim potencjale przenoszenia. Energia swobodna uwalniana w znacznej ilości podczas
przenoszenia tych elektronów na tlen cząsteczkowy jest wykorzystywana do syntezy ATP. Elektrony są przenoszone z NADH do
O2 z udziałem trzech wielkich kompleksów białkowych:
 reduktazy NADH-Q (ubichinon)
 reduktazy cytochromowej
 oksydazy cytochromowej.
Grupami przenoszącymi elektrony są: flawiny, centra żelazo-siarkowe, hemy i jony miedzi. Elektrony czy wodory przepływają przez
łańcuch oddechowy od składników bardziej elektroujemnych do bardziej elektrododatniego tlenu. Podczas wędrówki protonów i
elektronów z jednej cząsteczki NADPH na tlen, powstają 3 ATP, natomiast w przypadku FADH2 – 2 ATP.
Oddychanie i fermentacja - efekty regulacyjne
Procesy oddychania tlenowego i beztlenowego są w komórkach drożdży nierozerwalne. Rodzaj prowadzonego metabolizmu zależy
nie tylko od dostępu tlenu, ale również wielu czynników. U niektórych gatunków drożdży oddychanie i fermentacja przebiegają
prawie w tych samych proporcjach, u innych obserwuje się przewagę jednego z tych procesów. Browarnicze drożdże dolnej
fermentacji Saccharomyces uvarum charakteryzują się najmniejszym udziałem oddychania w procesach metabolicznych,
natomiast drożdże browarnicze górnej fermentacji Saccharomyces cerevisiae wykazują metabolizm tlenowy na poziomie zbliżonym
do ras drożdży piekarskich S. cerevisiae.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium - biotechnologia ogólna - dla studentów kierunku biotechnologia od 2014_2015
PRODUKCJA BIOMASY CZ 3.
Na podstawie aktywności oddechowej drożdże mogą być podzielone na 3 grupy:
- wykazujące metabolizm tlenowy - drożdże niefermentujące, u których zachodzi jedynie oddychanie
- prowadzące procesy tlenowe i beztlenowe w proporcjach równowagowych - oddychanie stanowi 40-50% przemian
metabolicznych, np. drożdże browarnicze górnej fermentacji, piekarskie, większość drożdży patogennych
- wykazujące głównie metabolizm beztlenowy - (udział oddychania nie przekracza 10-15%), np. drożdże gorzelnicze, winiarskie
oraz drożdże browarnicze dolnej fermentacji
U niektórych gatunków drożdży można prawie całkowicie stłumić fermentację przez silne napowietrzanie, jak to ma miejsce w
drożdżownictwie, gdzie chodzi o możliwie największe nagromadzenie ich masy komórkowej. Są też przypadki, gdy drożdże w
warunkach beztlenowych prawie wcale się nie rozwijają gdyż nie mają zdolności fermentacyjnych, co wykorzystuje się w produkcji
drożdży paszowych. Drożdże dzikie (w przemyśle piekarskim Candida, Torulopsis, Mycoderma) to typowe tlenowce. Szlachetne
szczepy, jak S. cerevisiae, mają zdolność fermentacji lub oddychania tlenowego w zależności od warunków, co wykorzystuje się do
oceny ich jakości - określania biologicznej aktywności, czyli zdolności wytwarzania CO2 spulchniającego ciasto w czasie fermentacji.
Zmiana warunków hodowli z beztlenowych na tlenowe u S. cerevisiae prowadzi do 5-do 10-krotnego zwiększenia wydajności
biomasy, przy czym tlen musi być rozpuszczony w pożywce.
Wzrost stężenia tlenu w pożywce:
- nieznacznie hamuje aktywność glikolizy poprzez inhibicję aktywności fosfofruktokinazy
- zwiększa aktywność liazy cytrynianowej i dehydrogenazy jabłczanowej - wzrost intensywności cyklu Krebsa
- uruchamia proces fosforylacji oksydatywnej w mitochondriach
- hamuje transport aktywny glukozy przez błony plazmatyczne
- intensyfikuje cykl glioksalowy - wykorzystanie etanolu, wyprodukowanego w czasie fermentacji
Hamowanie fermentacji w komórkach drożdży w obecności tlenu nosi nazwę efektu Pasteura. Obserwowany jest u wszystkich
drożdży z wyjątkiem browarniczych, u których wystąpiło zjawisko adaptacji do anaerobiozy i różnica pomiędzy fermentacją w
warunkach beztlenowych a metabolizmem tlenowym jest nieznaczna. Również u wielu ras drożdży winiarskich tlen tylko
nieznacznie hamuje fermentację.
Wysokie stężenie glukozy lub innych fermentowanych cukrów powoduje zahamowanie syntezy mitochondriów i reprodukcji
komórek drożdży w populacji, w której następuje zmiana metabolizmu tlenowego na fermentacyjny. Hamowanie oddychania na
zasadzie katabolicznej represji glukozowej nosi nazwę negatywnego efektu Pasteura i efektu Crabtree. Oba te efekty regulacyjne
są ze sobą powiązane, wywołując fermentację w obecności tlenu cząsteczkowego. Istota negatywnego efektu Pasteura polega
na hamowaniu biosyntezy enzymów oddechowych, podczas gdy mianem efektu Crabtree określa się hamowanie ich
aktywności. W obecności wysokich stężeń glukozy następuje obniżenie stężenia cytochromów, spadek ilości syntetyzowanych
enzymów cyklu Krebsa, zahamowanie aktywności dehydrogenaz i ATP-azy. Katabolicznej represji glukozowej podlega także
synteza podstawowych składników, takich jak: ubichinon, fosfolipidy i kwas palmitynowy.
Najniższe stężenie glukozy, które hamuje syntezę enzymów oddechowych u drożdży S. cerevisiae wynosi 6mM. Stężenie 12mM
hamuje syntezę oksydazy cytochromu c i dehydrogenazy jabłczanowej, a stężenie 30mM glukozy hamuje syntezę oksydoreduktazy
NADPH-cytochromu c.
Oznaczanie ilościowe białek – porównanie metod.
Metoda Bradforda
Metoda Melanii M. Bradford jest obecnie stosowana coraz częściej, głównie ze względu na prostotę oraz wysoką czułość. Barwnik
Coomasie Brillant Blue (CBB) rozpuszczony w roztworze o pH poniżej 1 ma kolor czerwono-brązowy. Kiedy jednak wiąże się z
białkiem uzyskuje kolor niebieski. Ilość białka może być dzięki temu mierzona przy długości fali 595 nm. CBB w znacznej mierze
przyłącza się do zasadowych, aromatycznych aminokwasów. Białka zawierają różną ich ilość, stąd wskazane jest utworzenie
krzywej standardowej dla każdego badanego białka. Wadą tej metody jest to, że reagenty pozostają na szkle oraz plastikach
laboratoryjnych. Można je stamtąd usunąć za pomocą SDS. Metodę stosuje się do detekcji białka w zakresie 20-1200μg białka/ml.
Czułość metody wynosi 20 μg białka/ml
Metoda biuretowa
Metoda ta wykorzystuje obecność wiązań peptydowych w rozmaitych związkach organicznych,
głównie w białkach i peptydach. Warunkiem koniecznym jest występowanie co najmniej dwóch
wiązań peptydowych bezpośrednio obok siebie lub przedzielonych nie więcej niż jednym atomem
węgla. Test biuretowy polega na dodaniu do analizowanej mieszaniny roztworu
silnej zasady oraz siarczanu miedzi(II). Jeżeli w roztworze obecne są związki zawierające bliskie
wiązania peptydowe, to roztwór zmienia barwę z niebieskiej na fioletową (λ=540nm). Jest to
spowodowane powstawaniem anionowych związków kompleksowych, w których jon Cu2+ jest
kompleksowany przez minimum dwie grupy peptydowe (Rysunek 1). W przypadku występowania
dimerów aminokwasów, w których występuje tylko jedno wiązanie peptydowe układ zabarwia się
na różowo. Wolne aminokwasy nie zmieniają barwy roztworu. Test może być stosowany zarówno w
analizie jakościowej, jak i ilościowej. W tym drugim przypadku wykorzystuje się liniową zależność zmiany barwy od stężenia
protein, a w rzeczywistości od liczby podwójnych wiązań peptydowych. Czułość metody 0,1 mg/cm3 , zakres 0,1 – 15 mg/cm3
Oznaczeniu przeszkadzają: sole amonowe (dają barwne kompleksy z jonami miedzi) oraz siarczan (VI) magnezu (przechodzi w
nierozpuszczalny wodorotlenek magnezu, który maskuje właściwą barwę).
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium - biotechnologia ogólna - dla studentów kierunku biotechnologia od 2014_2015
PRODUKCJA BIOMASY CZ 3.
Metoda Lowry’ego
W metodzie tej wykorzystuje się dwie odrębne reakcje: reakcje aminokwasów aromatycznych z odczynnikiem Folina oraz reakcję
jonów miedzi(II) z wiązaniami peptydowymi (reakcja biuretowa). W pierwszym etapie metody Lowry`ego zachodzi reakcja
pomiędzy białkiem (dokładnie atomami azotu wiązania peptydowego) a siarczanem miedzi i cytrynianem sodu w środowisku
zasadowym, co prowadzi do powstania kompleksu miedzi (Cu2+) i białka. Skutkiem tego jest redukcja jonów miedzi do jonów Cu+.
W kolejnym etapie, po dodaniu do mieszaniny reakcyjnej odczynnika Folina-Ciocalteu (kompleksu kwasów fosfomolibdenowego
(Mo6+) i fosfowolframowego (W6+). Aminokwasy aromatyczne redukują te jony do tzw. Błękitu molibdenowo-wolframowego, co
przejawia się zmianą barwy roztworu na niebieską. Zmiana barwy jest proporcjonalna do ilości kompleksów miedziowobiałkowych. Zalety metody: niskie koszty, łatwość wykonania pomiaru. Metoda ta od wielu lat jest najczęściej spotykaną procedurą
określania zawartości protein w nieznanej próbce. Pomiar wykonuje się przy λ=750nm, aby otrzymać wiarygodny wynik należy
stworzyć krzywa kalibracyjną.
Metoda z kwasem bicinchoninowym
Metoda ta jest kolejną modyfikacją reakcji biuretowej. Kwas bicinchoninowy tworzy z jonami miedziowymi stabilny kompleks,
który maksimum absorbancji posiada przy 562 nm. Metoda ta jest czulsza od metody biuretowej i metody Lowr’ego oraz mniej
wrażliwa na warunki zewnętrzne. Podobnie jak pozostałe metody oparte na reakcji biuretowej metoda ta wrażliwa jest na
obecność związków redukujących np. kwasu askorbinowego. Zasadniczo polega na reakcji redukcji jonów Cu2+ do Cu+ w
alkalicznym środowisku poprzez składniki białek (cysteina, tryptofan i inne).
Absorbancja w UV
Absorbancja jest chyba najprostszą metodą do mierzenia koncentracji białka w roztworze. Białka absorbują najlepiej przy długości
fali - 280 nm. Dzieje się tak z powodu zawartości aromatycznych aminokwasów, takich jak tryptofan czy tyrozyna. Natomiast przy
185 nm znajduje się szczyt absorbancji białek, który wynika z obecności wiązań peptydowych. Ekstynkcja białek przy 280 nm jest
różna z powodu różnej zawartości aminokwasów aromatycznych, natomiast poniżej 220 nm w przypadku obecności różnych białek
nie pozwala na ich rozróżnienie. Poza tym trudno jest zmierzyć absorbancję białka w obszarze około 185 nm ponieważ różne formy
tlenu również absorbują na tym obszarze. Współczynniki ekstynkcji białek są różne, zatem absorbancję w UV należy raczej
traktować jako metodę jakościową, oczywiście z wyjątkiem oczyszczonych już białek, dla których współczynniki ekstynkcji są już
znane. Jedną z wad tej metody jest to, że wiele innych związków chemicznych obecnych w próbce powoduje zafałszowanie
wyników. Dzieje się tak np. w przypadku kwasów nukleinowych. Wprawdzie maksimum absorpcji tych związków znajduje się przy
260 nm, ale po części również zafałszowują wynik przy 280 nm.
Wykonanie ćwiczenia
1. Analiza tlenowej hodowli drożdży
1.1. Oznaczyć masę kolby i poziom cieczy (porównać z masą wyjściową).
1.2. Oznaczyć zawartość sacharozy w płynie pohodowlanym.
Pobrać 50 ml hodowli do kolbki miarowej o pojemności 100cm 3, dodać kolejno po 10ml płynów Herlesa I i II, mieszając próbę
po każdej dawce, zawartość kolby dopełnić do kreski wodą destylowaną. Wymieszać starannie otrzymany roztwór i przesączyć
przez suchy sączek z bibuły filtracyjnej.
W przesączu oznaczyć stężenie sacharozy refraktometrem lunetowym MASTER-TA z automatyczną kompensacją temperatury.
W tym celu należy podnieść osłonę pryzmatu, pipetą nanieść ok. 1 ml roztworu sacharozy tak, aby zamykając osłonę ciecz
równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pokryła cały pryzmat. Następnie patrząc przez lunetkę odczytać wynik (skala po
lewej stronie w 0Brix, 1 oBrix = 1% sacharozy.) Po wykonaniu pomiaru refraktometr dokładnie opłukać pod bieżącą wodą i
wytrzeć delikatnie do sucha papierowym ręcznikiem.
2. Oznaczanie zawartości białka – białko oznaczyć metodą wskazaną przez prowadzącego
2.1. Hodowle tlenową drożdży dokładnie wymieszać i ok. 25 cm3 przefiltrować w zestawie do filtracji próżniowej.
W tym celu należy zmontować zestaw. Filtrować używając sączka z bibuły filtracyjnej (w razie potrzeby sączek przyciąć do
odpowiedniego rozmiaru). Zamontować lejek i podłączyć wężem kolbę filtracyjną z pompą próżniową. Przy otwartym
przepływie wlać 25cm3 hodowli i włączyć pompę. Po zakończeniu filtracji cały zestaw należy dokładnie umyć !!!
2.2. Pobrać ok. 0,2g biomasy drożdży z sączka, rozetrzeć z niewielką ilością odtłuszczonego piasku w moździerzu (w celu
rozerwania ścian komórkowych i uwolnienia cytoplazmy). Następnie moździerz dokładnie przepłukać 5ml wody destylowanej.
Całość przenieść ilościowo do probówki wirówkowej i odwirować (6000 obr/min, 5 min.).
W celu odwirowania próby należy:
- otworzyć pokrywę wirówki
- umieścić w niej probówkę z zawiesiną roztartych drożdży, jako przeciwwagi użyć drugiej probówki wypełnionej 5 ml wody
destylowanej
- zamknąć pokrywę wirówki
- ustawić czas wirowania – 5 minut
- ustawić obroty 6000 obr/min
- po upływie wyznaczonego czasu wirówka sama się wyłączy
2.3. Po zakończeniu wirowania ostrożnie pobrać do probówki 1ml płynu znad odwirowanego osadu drożdży (supernatant). Do
drugiej probówki wprowadzić 1ml wody destylowanej – próba kontrolna.
2.4. Oznaczenie białka metodą Lowry’ego.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Laboratorium - biotechnologia ogólna - dla studentów kierunku biotechnologia od 2014_2015
PRODUKCJA BIOMASY CZ 3.
Do 1ml supernatantu, oraz 1 ml próby kontrolnej dodać po:
- 0,3ml 1M NaOH,
- 3ml odczynnika miedziowego,
Odczynnik miedziowy przygotować bezpośrednio przed oznaczeniem mieszając ze sobą w probówce: 10ml odczynnika A,
0,1ml odczynnika B1 i 0,1ml odczynnika B2 - po wymieszaniu odstawić na 10 min.
- 0,3ml odczynnika Folina
Energicznie wymieszać probówki (vortex) i po 20 minut dokonać pomiaru absorbancji w spektrofotometrze, przy długości fali
660 nm, wobec próby kontrolnej, a następnie odczytać stężenie białka z krzywej wzorcowej albuminy.
2.5. Oznaczanie białka metodą Bradforda
Do 1ml supernatantu, oraz 1 ml próby kontrolnej dodać po 2ml odczynnika Bradforda. Po wymieszaniu i upływie 10 minut
dokonać pomiaru absorbancji w spektrofotometrze, przy długości fali 595 nm, wobec próby kontrolnej, a następnie odczytać
stężenie białka z krzywej wzorcowej albuminy w mg/dm3.
Krzywa wzorcowa albuminy: y= 335,21x – 10,014 R2 = 0,99
3. Opracowanie wyników
Opis wykonanych doświadczeń oraz uzyskane wyniki należy zamieścić w sprawozdaniu. Wyciągnąć wnioski.
Można skorzystać z tabeli:
Przed hodowlą
Waga kolbek [g]
Zawartość sacharozy [%]
Stężenie białka [µg/ml]
Po hodowli
-
4. Literatura:
- Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998.
- Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
- Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba