Show publication content!

POSTĘPY
BIOCHEMII
PL ISSN 0032-5422
Indeksowane w Medliné /PubMed
www.postepybiochemii.pl
POLSKIE
TOWARZYSTWO
BIOCHEMICZNE
WARSZAWA 2008
TOM 54
NUMER 2
Numer specjalny poświęcony mitochondriom
przygotowany przez Polską Sieć Mitochondrialną
http://rcin.org.pl
MitoNet.pl
Merck
Chem ic als
zostają
fo r
u wi e ńc zo n e
Biosciences.
sukcesem,
gdy
Badania
stają
się
nau ko we
u tr zy m a ć
przewagę
nad
ko nkurencją.
Chcąc
u ła t w i ć
źródłem
p r ow adz en ie badań, o fe r u j e m y szeroką gamę najwyższej
in n o w a c j i i m o to r e m postępu. Tak j e s t w przypadku badań
jako śc i p r o d u k tó w i usług tec h n ic z n y ch . Jak przystało na
prow a dz o n y c h w Me rc k Chemicals. Co roku o p r a c o w u j e m y
najlepszych n a u k o w c ó w m y ś lim y pr zyszłościowo i to r u je m y
setki n ow yc h p r o d u k tó w sto so wa n yc h w b io te c h n o lo g ii .
inny m drogę do sukcesu.
Jaki
w w w .m e rck-ch em ica ls.com
jest
nasz
cel?
Chcemy
p om óc
naszym
kl ie n to m
W ja k i sposó b M e rc k C h e m ic a ls prz y c z y n ia się do s u k c e s ó w w d z ie d z in ie b io t e c h n o lo g ii ?
To proste.
Przełomowe odkrycia to efekt naszych n o w a to rs kic h
pomysłów, najwyższej jakości p r o d u k t ó w
i doskonałego po ziomu usług te chnicznych.
That's w h a t's in it f o r you. M erck Chemicals
I
http://rcin.org.pl
'.MERCK
II
I
S
P
I
S
T
R
E
Ś
C
I
Postępy Biochemii — vol. 54, nr 2, 2008
P olska S ie ć
NUMER SPECJALNY „MITOCHONDRIA'
POD REDAKCJĄ ADAMA SZEWCZYKA
M ito ch ondrialna
w w w .m itan c t.p l
Polska sieć mitochondrialna
Adam Szewczyk
117
WYDARZENIA/OPINIE/KOMENTARZE
Wiadomości krajowe
pod red. Teresy Wesołowskiej
120
Central European Congress of Life Sciences EUROBIOTECH 2008
Kraków 17-19.10.2008
126
Nowe geny związane z miażdżycą
Agnieszka Dettlaff-Pokora, Julian Świerczyński
127
TEMAT NUMERU - MITOCHONDRIA
W NASTĘPNYM NUMERZE:
T ra n s p o r te r y ABC w n e rc e
A g nieszka P iw k o w sk a
U k ła d r e n in a - a n g io te n s y n a w
k a n c e ro g e n e z ie
K am ila D om ińsk a, A g n ie sz k a
L achow icz-O chędalska
C h o le ste ro l i m ia ż d ż y c a
A ngelika Chachaj, K a ta rz y n a
D ro żd ż, A ndrzej S zu b a
Rysunek na okladce:
Front cover im age „M itochondrial to m o ­
gram show ing the stru c tu ra l featu res of cristae junctions joining lam ellar cristae to the
inner b o u n d ary m em brane" by T.G. Frey,
San Diego State U niversity, San D iego, CA
(tfrey@ sunstroke.sdsu.edu) a n d G.A. P er­
kins, U niversity of California, San D iego,
CA, w ith perm ission.
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
j
Mitochondria w życiu, chorobie i śmierci komórki
Lech Wojtczak, Krzysztof Zabłocki
129
Ewolucja mitochondrialnego DNA i jego systemu
ekspresji — porównanie królestwa zwierząt i roślin
Janusz Piechota, Hanna Jańska
142
Występowanie mutacji w mtDNA i ich potencjalny wpływ
na strukturę białek w wybranych typach nowotworów
Katarzyna Plak, Wojciech Kukwa, Ewa Bartnik, Paweł Golik,
Anna Ścińska, Tomasz Krawczyk, Anna M. Czarnecka
151
Choroby mitochondrialne u dzieci — podłoże molekularne
i biochemiczne, ze szczególnym uwzględnieniem zespołu Leigha
Ewa Pronicka, Dorota Piekutowska-Abramczuk, Maciej Pronicki
161
I Mitochondrialna neuroprotekcja
Marta Piwońska, Adam Szewczyk
169
I Mitochondrialne białka rozprzęgające —
i regulacja i ich rola fizjologiczna
Wiesława Jarmuszkiewicz, Andrzej Woyda-Płoszczyca
179
| Udział białek rozprzęgających w modulacji funkcji
| mitochondriów — perspektywy terapeutyczne
Andrzej Woyda-Płoszczyca, Wiesława Jarmuszkiewicz
188
I Mitochondria śródbłonka — nowy cel dla
| farmakologii dysfunkcji śródbłonka
Antoni Wrzosek, Agnieszka Łojek, Iwona Stanisławska,
Antonina Chmura-Skirlińska, Krzysztof Dołowy, Stefan Chłopicki,
Adam Szewczyk
198
i Kinazy białkowe w mitochondriach
Joanna Ewa Kowalczyk, Barbara Zabłocka
209
I Zastosowanie elektroforezy „Blue Native" w badaniach
| mitochondrialnego łańcucha oddechowego w normie i patologii
Magdalena Lebiedzińska, Jerzy Duszyński, Mariusz R. Więckowski
217
Czy
zapłaciłeś ju ż
składkę
członkow ską
Biochemicznego za rok 2008?
Jeśli nie, wejdź na stronę n w w .p tt och.edu.pl
i dopełń swojego obowiązku.
http://rcin.org.pl
Polskiego
Towarzystwa
I
C
O
N
T
E
N
T
s
ADVANCES IN BIOCHEMISTRY VOL. 54, NO. 2, 2008
117
E vents/O p in io n s/C o m m en ts
REVIEWS
M ito ch o n d ria in cell life, d e ath a n d disease
129
E w olution of th e m ito ch o n d rial D N A a n d its expression system — co m p ariso n b e tw ee n an im al and p la n t k in g d o m
142
T he im pact of m tD N A m u ta tio n s on p ro tein s stru c tu re in selected types of cancer
151
M etabolic diseases in c h ild re n in c lu d in g Leigh syndrom e — biochem ical a n d m olecular b ack g ro u n d
161
M ito ch o n d rial n e u ro p ro te ctio n
169
M ito ch o n d rial u n c o u p lin g p ro tein s — re g u la tio n an d physiological role
179
U n co u p lin g p ro tein s in m o d u la tio n of m ito ch o n d rial fun ctio n s; th era p eu tic prospects
188
E ndothelial m ito ch o n d ria — a novel targ et for pharm acology of e n d o th e lia l d y sfu n ctio n
198
P ro tein k in ases in m ito ch o n d ria
209
A p p licatio n of „Blue N ative" electro p h o resis in th e stu d ies of m ito c h o n d ria l resp irato ry ch ain com plexes in p h y sio lo g y and
pathology
217
Apel Z a rzą d u P olskiego T o w a rz y s tw a B ioch em iczneg o
Szanowna Koleżanko, Szanowny Kolego,
Statut Polskiego Towarzystwa Biochemicznego od wielu lat pozostaje niezmieniony i obecnie w niektórych punktach stał się anachroniczny lub
wymaga zmian, które dostosowałyby go do współczesnych warunków funkcjonowania Towarzystwa. Niestety, paragraf 37 obecnego Statutu
mówi, że wszelkie zmiany mogą być dokonane wyłącznie przez Walne Zebranie, przy obecności co najmniej połowy członków Towarzystwa. W
całej historii naszego Towarzystwa taka frekwencja na Walnym Zebraniu zdarzyła się tylko raz, mianowicie na Pierwszym Walnym Zebraniu w
1958 r., kiedy Towarzystwo liczyło około 200 członków. Frekwencja na Walnych Zebraniach wynosi zawsze kilkadziesiąt osób, mimo że z bi­
egiem lat Towarzystwo liczebnie wzrastało. Obecnie liczy około 1200 członków. Dlatego, po konsultacji z prawnikami, Zarząd Główny P.T.Bioch.
postanowił spróbować zmienić Statut, wprowadzając na najbliższym Walnym Zebraniu, głosowanie przez pełnomocników. Zebranie to odbędzie
się przy okazji 43. Zjazdu Towarzystwa w Olsztynie we wrześniu br. (o czym zawiadomimy szczegółowo we właściwym czasie). Każdy członek To­
warzystwa, który nie będzie mógł uczestniczyć w tym Zebraniu, jest proszony o upoważnienie kogokolwiek z uczestników Zebrania do głosowania
w jego imieniu, ale tylko w jednej, konkretnej, wymienionej w upoważnieniu sprawie, mianowicie zmianie §37 Statutu. Zmiana ta umożliwiłaby
w przyszłości wprowadzanie innych niezbędnych zmian w Statucie przez członków, którzy będą uczestnikami przyszłych Walnych Zebrań, bez
względu na frekwencję.
Zwracamy się zatem do Pani/Pana z gorącym apelem o wypełnienie załączonego pełnomocnictwa, wydrukowanie i niezwłoczne odesłanie
na adres Zarządu Głównego lub na adres swojego Oddziału Towarzystwa. Prosimy przy tym o wpisanie swojego imienia, nazwiska i nu­
meru PESEL oraz zaznaczenie, ja k chce Pani/Pan głosować: za, czy przeciw proponowanej zmianie. Nie je st ważne natomiast, komu
Państwo udzielą tego pełnomocnictwa, byleby była to osoba, która na pewno weźmie udział w Walnym Zebraniu. Dlatego proponujemy,
aby pozostawić niewypełnioną rubrykę z imieniem i nazwiskiem osoby upoważnionej. Zostaną tam wpisane dane personalne jednej z osób
obecnych na Walnym Zebraniu we wrześniu 2008 roku. Zwracamy uprzejmie uwagę, że sposób głosowania (TAK lub NIE) zaznaczy Pani/Pan
w swoim pełnomocnictwie. A zatem osoba upoważniona, ktokolwiek nią będzie, nie będzie mogła głosować w Państwa imieniu inaczej, niż
to będzie zaznaczone w upoważnieniu. Jeśli będzie Pani/Pan obecna(y) na Walnym Zebraniu, wówczas pełnomocnictwo to zostanie wycofane
i głosować będzie Pani/Pan osobiście.
Bardzo liczymy na Pani/Pana zrozumienie wagi sytuacji i niezwłoczne odesłanie wypełnionego pełnomocnictwa, za co z góry dziękujemy.
Przewodniczący Komisji Statutowej
Prof. Andrzej Dżugaj
Pełnomocnictwo dodane do niniejszego numeru czasopisma prosimy odesłać na adres:
Polskie Towarzystwo Biochemiczne, Zarząd Główny, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa
PARTNERZY POSTĘPÓW BIOCHEMII
Redaktor naczelny: S ław om ir Pikuła; e-m ail: s.pikula@ nencki.gov.pl, Redaktor senior: Zofia Zielińska
Redaktor d ziału krajowego: Teresa W esołowska; e-m ail: redbioch@ sci.pam .szczecin.pl, Redaktor działu „Forum M łodych B ioch em ik ów ”: G rzegorz Bartosz; e-m ail: gbartosz@ biol.uni.lodz.pl
Redaktorzy: Joanna B andorow icz-Pikuła, Jolanta B arańska, A ndrzej Dżugaj, K rystyna Grzelak, Lilia H ryniew iecka, D anuta H ulanicka, A ndrzej Jerzm anowski, A ndrzej K asprzak, W anda Kłopocka, Liliana Konarska,
Paweł P om orski, A leksander F. Sikorski, A n n a Szakiel, A dam Szewczyk, T om asz Twardowski, M arek Z em bala, K rzysztof Zabłocki, Alicja Żylicz
Sekretarz redakcji: H anna Laskowska; e-m ail: h.laskowska@ nencki.gov.pl, tel. (022) 5892441
Skład i łamanie: M ałgorzata Basaj; e-m ail: biochem@ nencki.gov.pl
Korekta językowa: M arta M agdalena Izdebska; e-m ail: 3m ip@ neostrada.pl lub m arta.izdebska@ gm ail.com
Adres redakcji: “Postępy Biochem ii”, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa; e-m ail: postepy@ nencki.gov.pl; http://w w w .postepybiochem ii.pl
Wydawca: Polskie Towarzystwo Biochem iczne; ul. P asteura 3, 02-093 W arszawa, tel/fax (022) 6582099, e-m ail: ptbioch@ nencki.gov.pl, http://w w w .ptbioch.edu.pl
K w artalnik “Postępy B iochem ii” jest w ydaw any z p o m o cą finansow ą M inisterstw a N auki i Szkolnictwa Wyższego, “P ostępy B iochem ii” są indeksow ane w M edline, In d e x C ope rnicus i A grolibrex. N akład 1000 egz.
II
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
Real-time PCR
axima™ SYBR Green qPCR Master Mix (2X)
%
High specificity
T em p e ra tu re, °C
M elting curve analysis c onfrm s high qPCR specifcity.
Am plification of 10-fold dilutions of supercoiled plasm id DNA, starting from
10 ng dow n to 0.1 fg, using the Maxima™ SYBR Green qPCR M aster Mix
(2X) in duplicate reactions. Reactions were p erform ed on the Eppendorf
M a ste rc ycle r® ep realplex instrum ent. NTC is the non-tem plate control.
K0222
10x1.25 ml (for 1000 reactions of 25 ¡j\ )
Maxima™ Probe qPCR Master Mix (2X)
High sensitivity
¡y O
All the advantages at a glance
• Sensitivity - detects low copy number targets.
• Specificity - Maxima™ Hot Start Taq DNA Polymerase and the
optimized buffer eliminate non-specific amplification and formation
• of primer dimers.
• W ide linear range - accurate quantification across 9 orders
of magnitude.
Universal - can be used with sequence-specific probes on m ost
real-time thermal cyclers.
Reproducibility and convenience - ready-to-use 2X master mix
minimizes pipetting error and reduces set-up time.
Applications
• Real-time PCR using sequence-specific probes.
• Real-time RT-PCR using sequence-specific probes
M axim a' Probe qPCR Master Mix (2X)
Cat. No.
Appl.
K0231
2x1.25 ml (for 200 reactions of 25 /l/I)
K0232
10x1.25 ml (for 1000 reactions of 25 ¿ul)
I
^^^1
A m plification of human PPP1CA gene w as p erform ed on serial 10-fold
dilutions of Jurkat cell total RNA (from 1 ng to 1 pg). First strand cDNA was
generated w ith the RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit ( # K 1 621).
cDNA w as am plified with the Maxima™ Probe qPCR M aster Mix (2X) using
the Ta q M an ® assay specific for PPP1CA. R eactions were perform ed on an
ABI P R IS M ® 7 0 0 0 instrum ent. 1 pg of total RNA w as successfu lly detected.
NTC is the non-tem plate control.
DYSTRYBUTOR: abo Grażyna Boreysza
ul. Podleśna óa, 80 -25 5 Gdańsk
Biuro: ul. Małachowskiego 1, 80-262 Gdańsk
łel.: (58) 341 21 43; fax: (58) 520 33 80
[email protected]; www.abo.com.pl
http://rcin.org.pl
£- ——
|
1111
UFE
O
111
w
SCIENCES
Ch
21-st Wilhelm Bernhard
^
^
*
w
^
__________________ _
Nuclear Workshops
3 1 .0 8 - 0 4 . 0 9 . 2 0 0 9 Ustroń, Poland
Dear Friends a n d Colleagues,
The Wilhelm Bernhard Workshop is a biennial event focusing on functional a n d
structural aspects o f the nucleus a n d its c o m p o n e n t structures. The Workshop
fosters interaction a n d c oo pe ratio n be tw e e n scientists from all parts of the world
a n d especially encourages a ctive participation o f young scientists. The m ajor
aim o f the Workshop is to cre a te a multidisciplinary m eeting representing most
research approaches used in studies on the cell nucleus structure, functions, an d
their relationships, as well as to give young scientists the opportunity to present
their research within a fairly small circle of c o m p e te n t colleagues a n d to m ee t
exp erience d colleagues in their field o f research.
We have the pleasure to announce that the 21st Wilhelm Bernhard International
Workshop on the Cell Nucleus will b e held in Ustroń, Poland, from the 31 August
to the 4 September 2009.
The Sessions will co ver the following topics:
►n u c le a r structure and dynamics
►nucleolus and ribosome biogenesis
►c h ro m a tin structure and regulation of its functions
►n u c le a r/n u c le o la r proteins and RNA
►re g u la tio n of gene expression
►th e nucleus in stress, death and pathology
►D N A d a m a g e and repair
► n e w technologies and bioinformatics
The Workshop registration fee is 1400 Polish zlotys (which a t the current excha nge rate is 400€).
The fee includes meals, a c c o m m o d a tio n , c o n fe re n ce materials and social program.
A limited num ber of grants will be available for PhD students and young investigators to cover
the workshop fee.
The registration starts January 1st, 2009. Because of a limited space at the workshop venue the
"first come-first served" m ethod will be used.
We hope to see you in Ustroń!
On behalf o f the Organizing Committee
prof. Piotr Widłak
Maria Skłodowska-Curie
S
5L
M em orial
Cancer Center and
prof. Mieczysław Chorąży
Please, visit the Workshop w eb page for more information
http://www.cd.lo.gliwice.pl/wbw21
http://rcin.org.pl
POLSKA
SIEĆ
M I T O C H O N D R I ALN A
P o ls k a S ie ć
M ito c hond ri a ln a
w w w . m ita n c t .p l
A dam S z e w c z y k
'Polska Sieć M itochondrialna M itoN et.pl,
Insty tu t Biologii D ośw iadczalnej PA N im.
M arcelego N enckiego, ul. L udw ika Pasteura
3, 02-093 W arszaw a, tel: (022) 659 85 71, faks:
(022) 822 53 42, e-mail: m itonet@ nencki.gov.
pl, w w w .m itonet.pl
M itochondria stanow ią po d staw o ­
w e źródło energii wszystkich kom ó­
rek.1 Organelle te są zaangażow ane
w tak złożone zjawiska biologiczne,
jak apoptoza i w ew nątrzkom órkow a
hom eostaza w apnia. M itochondria są
także jednym z ważniejszych miejsc
pow staw ania w olnych
rodników
w komórce. Doniesienia ostatnich
lat wskazują, że niepraw idłow ości
w funkcjonow aniu m itochondriów
m ogą stanowić podłoże chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba
Parkinso­
na, choroba
Hunting­
tona i cho­
roba
Al­
zheimera.
Z
drugiej
strony, m i­
to c h o n d ria
m ogą pełnić
d o b ro c z y n ­
ne funkcje
w organi­
zmie,
w
ochronie
komórek
m ię śn io wych i nerw ow ych przed skutkam i
stresu oksydacyjnego (kardio- i neuroprotekcja). Na podkreślenie zasłu­
guje fakt, że ostatnie lata to pra w d z i­
w y renesans badań nad genetyką m i­
tochondriów , szczególnie m itochon­
driów roślin i drożdży.
Polska Sieć M itochondrialna MitoNet.pl, której działania są koordyno­
w ane przez Instytut Biologii D ośw iad­
czalnej im. M. Nenckiego PAN w
W arszawie, została zaw iązana w 2006
roku. Stanowi ona unikalną platfor­
mę integrującą dotychczas rozproszo­
ne w polskim środow isku n aukow ym
badania poświęcone mitochondriom .
Realizowane w spólnie przez człon­
ków sieci badania pozwalają stworzyć
nie tylko w arunki dla rozwoju badań
podstaw ow ych w obszarze tzw. frontier science, ale także m ogą wyjść na
przeciw zapotrzebow aniu społeczne­
m u w zakresie diagnostyki m edycz­
nej. Przykładem w spólnego działania
członków sieci jest publikacja z 2007
roku w renom ow anym czasopiśmie
am erykańskim Journal of Biological
Chemistry.2 Badacze trzech pracow ni
działających w ram ach Polskiej Sie­
ci Mitochondrialnej: z Uniwersytetu
im. A dam a Mickiewicza w Poznaniu,
ze
Szkoły
Głównej G o­
s p o d a r s tw a
Wi e j s k i e g o
w W arsza­
wie oraz z
Instytutu
Biologii Do­
świadczal­
nej PAN w
W a rsz a w ie ,
zid entyfiko­
wali w w e­
wnętrznej
błonie m ito­
chondrialnej
A cantham oeba castellanii kanał potasow y regulo­
w any przez ATP. Przeprow adzenie
tych badań było możliwe dzięki in­
tegracji dośw iadczenia różnych grup
badaw czych działających w ram ach
jednej sieci naukowej.
G łów nym celem działania Polskiej
Sieci M itochondrialnej MitoNet.pl jest
konsolidacja, w spom aganie rozwoju
potencjału intelektualnego i m aterial­
nego jednostek naukow ych tw o rzą­
cych sieć oraz integracja bad ań p o d ­
staw ow ych w zakresie bioenergetyki
mitochondrialnej (w obrębie biologii
molekularnej, biochemii i farm akolo­
gii), z potencjalnymi możliwościami
ich w ykorzystania w diagnostyce i w
terapii medycznej. Próbujemy to osią­
gnąć przez koordynację w spółpracy
jednostek naukow ych tworzących
sieć MitoNet.pl, prow adzących bada­
nia dotyczące mitochondriów.
Realizowane cele pow inny d o­
prow adzić do podniesienia poziom u
krajowych badań w zakresie szeroko
rozumianej bioenergetyki i ich zna­
czenia w Europejskiej Przestrzeni
Badawczej. Pow inno nastąpić tak­
że wzmocnienie m iędzynarodow ej
współpracy, konkurencyjności i inte­
gracji badań w zakresie bioenergetyki
mitochondrialnej. W roku 2010 człon­
kowie Sieci (przy w spółpracy Sekcji
Bioenergetycznej Polskiego T ow arzy­
stwa Biochemicznego) zorganizują 16tą Europejską Konferencję Bioenerge­
tyczną (EBEC — European Bioenergetic
Conference). Będzie to bardzo dobra
okazja do zaprezentow ania osiągnięć
Polskiej Sieci Mitochondrialnej.
Cele szczegółowe Polskiej Sieci Mi­
tochondrialnej obejmują:
■
w spieranie w spółpracy jed­
nostek naukow ych zajmujących się
badaniam i m itochondriów przez ini­
cjowanie, realizację w spólnych p rz e d ­
sięwzięć badaw czych oraz edukację
m łodych pracow ników naukow ych w
zakresie zgodnym z obszaram i m ery­
torycznym i Sieci;
■
stw orzenie forum dla w y ­
miany informacji, promocji osiągnięć
iupow szechniania w yników
prac
naukow o-badaw czych dotyczących
biochemii, farmakologii oraz biologii
molekularnej m itochondriów; grupą
'R ycinę p o d ty tu łe m "M ito ch o n d rio n R evealed" u d o stęp n ił jej au to r, Erie R obert Russell, Bellingham , W A, USA (w w w .eB ioM ED IA .com )
'K icińska A, S w id a A, B ednarczyk P, K oszela-Piotrow ska I, C hom a K, D ołow y K, Szew czyk A, Jarm uszkiew icz W (2007) A TP-sensitive potassium channel in m ito ch ond ria
of the eukaryotic m icroorganism Acanthamoeba castellanii. J Biol C hem 282:17433-17441
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
117
prof. Ewę Pronicką, Uni­
w ersytet Jagielloński Colle­
gium M edium w Krakowie
reprezento w any przez prof.
■
w spieranie
uczest­
Stefana Chłopickiego, Cen­
nictwa jednostek naukowych,
tru m M edyczne Kształcenia
będących członkami sieci MiP odyplom ow ego w W arsza­
toNet.pl w projektach realizo­
w ie reprezentow ane przez
w anych w ram ach funduszy
prof. A ndrzeja Beręsewicza,
krajowych i europejskich;
U niw ersytet im. A dam a
M ickiewicza w Poznaniu
■
podniesienie pozio­
reprezentow any p rzez prof.
m u i znaczenia w Europejskiej
W iesław ę Jarm uszkiew icz,
Przestrzeni Badawczej, pol­
U niw ersytet
W rocławski
skich badań m itochondriów
Fotografia 1. U roczystość w ręczenia N ag ro d y Polskiej Sieci M itochondrialnej na XLII reprezentow any p rzez prof.
ze szczególnym uw zględnie­ Zjeździe Polskiego T ow arzystw a Biochem icznego w Szczecinie w 2007 roku. O d le­
niem badań podstaw ow ych wej stoją: A d a m Szew czyk, Lech W ojtczak, D anu ta H aertle (O lym pus), A ndrzej M. H an nę Jańską, U niw ersytet
W arszaw ski reprezentow aoraz ich potencjalnych zasto­ W oyda-Płoszczyca (laureat nag rod y) o raz Z y g m u n t M achoy.
-----------ny przez prof. Piotra Stęp­
sowań;
nia oraz Szkoła G łów na Go­
Komisji N agrody był prof. Lech Wojt­
sp o d arstw a Wiejskiego w W arszaw ie
czak z Instytutu Biologii Doświadczal­
■
identyfikacja obszarów tem a­
rep rezen to w an a przez prof. Krzysz­
nej
PAN
im.
M.
Nenckiego.3
tycznych Sieci przydatnych dla spo­
tofa Dołowego. C złonkiem stow a­
łeczeństwa i gospodarki w zakresie
rzy szonym Sieci jest U niw ersytet
Prace sieci MitoG dański reprezentow any przez prof.
N et.pl są k o o rd y n o ­
Jarosław a M arszałka. W ram ach Sieci
w an e przez Instytut
działa także laboratorium kierow ane
Biologii D ośw iadczal­
przez prof. Ewę Bartnik z U niw ersy­
nej P,AN. W ram ach
tetu W arszawskiego.
Sieci działają dw ie
W niniejszym n u m erze k w artal­
pracow nie Instytutu
(Zakład Biochemii):
nika Polskiego T ow arzystw a Bio­
chem icznego „Postępy Biochemii"
Pracow nia Bioenerge­
przed staw io n o różnorodne, a zara­
tyki i Błon Biologicz­
zem kom pleksow e zainteresow ania
nych kierow ana przez
nau k o w e członków Polskiej Sieci
prof. Jerzego D u­
M itochondrialnej. Z apraszam y do
szyńskiego
(Fot. 2)
w spółpracy g rup y badaw cze zainte­
oraz Pracow nia W e­
w n ątrzk o m ó rk o w y c h
resow ane bad aniam i m itochondriów .
Więcej informacji o działaniach Sieci
K anałów
Jonow ych
M itochondrialnej na stronie w w w .
kierow
ana
przez
prof.
Fotografia 2. Pracow nia Bioenergetyki i Błon B iologicznych (Zakład Bioche­
Szewczyka.
m itonet.pl.
mii In stytutu Biologii D ośw iadczalnej PAN) k ierow ana przez prof. Jerzego A dam a
D uszyńskiego.
____________
P o n ad to ___________
człon­
kami Sieci są Instytut
diagnostyki medycznej (identyfikacja
tzw. chorób mitochondrialnych);
M edycyny
D ośw iad­
czalnej i Klinicznej im.
■
propagowanie badań mito­
M.
M ossakow skiego
chondrialnych w Polsce. Przykładem
PA N w W arszaw ie re­
prezentow an y
przez
takiej działalności jest ustanowienie
doc. Barbarę Zabłocką
nowej nagrody naukowej dla młodego
badacza za szczególnie dobre i intere­
(kierującą
Pracow nią
Biologii M olekularnej),
sujące przedstawienie wartościowej
Instytut Biochemii i
pracy bioenergetycznej na Sesji Bio­
energetycznej na corocznym Zjeździe
Biofizyki PA N w W ar­
szaw ie reprezento w an y
Polskiego Towarzystwa Biochemicz­
przez prof. M agdę Bonego. Po raz pierwszy Nagrodę Pol­
skiej Sieci Mitochondrialnej przyznano
gutę, Instytut „Pom nikna XLII Zjeździe Polskiego Towarzy­
C entrum
Z drow ia
Fotografia 3. C złonkow ie sieci organizow ali w rok u 2006 k u rs ek sp ery m en ­
stwa Biochemicznego w 2007 roku w
Dziecka" w W arszaw ie talny
dotyczący biochem ii m itochondriów .
reprezentow any przez
Szczecinie (Fot. 1). Przewodniczącym
docelową dla informacji będą
też osoby zagrożone choroba­
mi mitochondrialnymi;
3W 2007 roku nag ro d ę u fu n d o w a n ą p rzez firm ę O ly m pus otrzy m ał m gr A ndrzej M. W oyda-Płoszczyca z pracow n i prof. W iesław y Jarm uszkiew icz (U niw ersytet im. A d a ­
m a M ickiew icza w Poznaniu) za prezentację p o d ty tu łem " Regulation o f the energy-dissipating systems in Acanthamoeba castellanii mitochondria by purine nucleotides"
118
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii .pi
EBEC2010
16thEuropean Bioenergetic Conference
Warsaw, 17-22July 2010
WWW.EBEC2010.PL
Organized by:
Biochemical Soajety^Bioenergetic Section
"" —
Polish Mitochondrial Network
Nenckl Institute of Experimental Biology
nencki institute
o f experim ental biology
Postçpy 3iochemii 53 (2) 2007
http://rcin.org.pl
119
WYDARZENIA
-
OPINIE
-
KOMENTARZE
Biofizyki PAN. Prof. Chojnacki był i
W roku 2007 Profesor Tadeusz
jest członkiem szereg u Rad N a u k o ­
Chojnacki w y ró ż n io n y został n a ­
w ych, członkiem redakcji czasopism
gro d ą Prezesa Rady M inistrów za
n
a uko w y ch. Prof. Chojnacki był
w y b itn y d o robek n au kow y. Prot.
tw
órcą i w ieloletnim k ierow nikiem
T adeusz Chojnacki (Fot. 1) uzyskał
Z a k ła d u Fosfolipidów , a n astępn ie
d y p lo m lekarza w 1955 r. na W y­
Z a k ła d u Biochemii L ipidów (do
dziale L ekarskim A kadem ii M e­
2003 r.). Prof. Chojnacki jest inicja­
dycznej w W arszaw ie; w latach
torem oryginalnej tem aty ki b a d a w ­
1953-1957 był asy sten tem w Z ak ła­
czej,
dotyczącej b a d a ń n a d s tru k tu ­
dzie Chem ii Fizjologicznej AM w
rą, w y stęp o w a n iem w
W arszaw ie, a od 1958
p rzy ro d z ie i funkcją
r. jest pracow nikiem
biologiczną z w iązków
In sty tu tu Biochemii i
poliprenoidowych.
Biofizyki PA N (IBB).
P ierw sze
prace
na­
Prof. Chojnacki jest
u k o w e Jego a u to rstw a
pro m o to re m 9 u k o ń ­
dotyczące tej tem atyki
czonych prac d o k to r­
ukazały
się w 1972 r.
skich.
Trzy
osoby
M a n u sk ry p t
n a jn o w ­
sp o śró d w sp ó łp ra c o w ­
szej pracy jest przyjęty
n ików uzysk ały tytuł
do d ru k u . W iele z tych
profesora. L au reat m a
pionierskich prac zy­
w do ro b k u około 170
skało szeroki rozgłos w
prac dośw iadczaln ych ,
literatu rze św iatowej.
kilkanaście arty k u łó w
Do najczęściej cy to w a­
przegląd ow ych, kilka Fotografía 1. Prof. Tadeusz Chojnacki.
nych należy klasyczna
rozdziałów w o p ra ­
już praca d o św ia d cz a l­
cow aniach m o n o g ra ­
na opisująca chem iczną m eto d ę fos­
ficznych oraz jest a u to re m dw óch
forylacji dolicholi (FEBS Lett, 131,
zgłoszeń p atentow ych . Prof. Choj­
310-312, 1981), praca p rz eg lą d o w a
nacki był je d n y m z założycieli IBB,
(Biochem J, 251, 1-9, 1988) cyto­
pełnił także funkcję Z astępcy D y­
w a n a w p o dręczn ikach biochem ii
rektora ds. N au k o w y c h Instytutu.
L ehningera, a także d w a rozdziały
Prof. Chojnacki o dzn aczony został
w pow szechnie z n a n y m w y d a w n ic ­
o d znaczeniam i p a ń stw o w y m i, m.in.
tw ie m ono graficznym M ethods in
K rzyżem Oficerskim O rd e ru O d ro ­
Enzym ology (1969, 2004). O d krycia
dzenia Polski (1999). Za osiągnięcia
n
a u k o w e prof. C hojnackiego były
n a u k o w e był w ielok rotnie w y ró ż ­
p u n k te m wyjścia do b a d a ń k o n ty ­
nian y n ag rodam i, m.in. Sekretarza
nu o w an y c h p rzez Jego w sp ó łp ra ­
N a uko w ego PA N, W ydziału N a u k
cow ników w IBB PA N , a także w
Biologicznych, a także na g ro d am i
kilku labo ratoriach zagranicznych,
Rady N aukow ej IBB za publikacje.
z którym i Profesor od w ielu lat
W 2002 r. otrzym ał m edal im. L.
w spółpracuje. Wiele znakom itych
M archlew skiego K om itetu Bioche­
prac pow stało i n ad al pow staje w
mii i Biofizyki PAN. Prof. Chojnacki
w y n ik u w sp ó łp racy z lab o rato riu m
jest członkiem rzeczyw istym PAN.
prof. G ustava D allnera (D epartm en t
U zyskał tytuł do k to ra honoris causa
of Biochem istry & Biophysics, U ni­
(1987) oraz tytu ł „Foreign A djunct
versity of Stockholm). Prof. Choj­
Professor" (1992) K rólew skiego In­
nacki w sp ó łp raco w ał także z labo­
sty tu tu M edyczno-C h irurgicznego
ra to riu m Prof. S hibayew a (Zielinski
w Sztokholm ie. W 1998 r. o trzym ał
Institute of O rganic C hem istry R us­
m edal im. M. Ł om onosow a Rosyj­
sian A cadem y of Sciences, M oskwa).
skiej A kadem ii N auk. Do 1995 r.,
W IBB prof. Chojnacki u tw o rz y ł i
przez kilka kadencji, pełnił funkcje
n ad al kieruje działalnością „Kolek­
Z astępcy S ekretarza W ydziału N a u k
cji Poliprenoli" w ytw arzającej u n i­
Biologicznych PA N , a w latach 1996katow e b io p re p a ra ty u d o stęp n ian e
98 kierow ał tym W ydziałem , n a to ­
za in te reso w a n y m b ad aczom w ra ­
m iast w latach 1992-95 był P rze­
m ach bezpośredniej w sp ó łp racy n a ­
w odniczącym K om itetu Biochemii i
120
http://rcin.org.pl
ukow ej, jak i za p o śred n ic tw e m firm
kom ercyjnych.
Z w iązki p oliizop ren oidow e, k tó ­
rym i od końca lat 60. XX w iek u zaj­
m uje się prof. Chojnacki są su b sta n ­
cjami n a tu ra ln y m i, w ystęp ujący m i
pow szechnie w przyrodzie. A lk o h o ­
le p o liizo p ren o id o w e są polim eram i
w ielu (od 5 do p o n a d 130) pięciow ęglow ych reszt izopreno w ych. U d e ­
rzające p o d o b ie ń stw o s tru k tu ra ln e
p o liizo p re n o id ó w z jednej strony
do k au cz u k u n a tu ra ln eg o (stopień
polim eryzacji w ynosi najczęściej
kilka tysięcy), z drugiej do lotnych
m ono, seskw i i d ite rp e n ó w (skład­
nik ów olejków eterycznych), nie jest
p rzy p a d k o w e. W szystkie te zw iązki
pow stają w kom órkach w w y n ik u
akty w ności cis- i / l u b trans-preny lotransferaz. Badania prof. C hoj­
nackiego p ro w a d z o n e od p o n a d 40
lat koncentro w ały się na p o z n a n iu
stru k tu ry p oliio zp ren o id ó w , a ta k ­
że ich roli biologicznej i m e c h a n i­
zm ó w biosy ntezy (natura d o sta rc z a
p o liiz o p re n o id ó w o sp o ry m sto p n iu
ró ż n o ro d n o śc i stru ktu ralnej). C z y n ­
nikiem różnicującym są długość
łańcucha w ęglow ego, izo m eria g eo­
m etry czna pod w ó jnego w ią z an ia
(w ystępuje jedno takie w iąz a n ie w
każdej niem al reszcie izoprenow ej),
u w o d o ro w a n ie w iązań p o d w ó jn y c h
i, rzadko, obecność d o d a tk o w y c h
p o d staw n ik ó w . O bserw acją p o c h o ­
dzącą z lat 60. było odkrycie, że ro ­
śliny i bakterie sy ntety zują poliizopren o id y , których w szystkie reszty
izo p ren o w e posiadają z ac h o w a n e
jedno p od w ó jn e w iązanie — m ó ­
w im y o nich „alkohole nie w pełni
nasycone", p odczas gd y z w ierz ęta i
grzyby, także d ro żd że, sy n tety zu ją
alkohole (n azyw ane są dolicholam i)
zaw ierające jedn o p o d w ó jn e w ią z a ­
nie u w o d o ro w an e. Dość tajem nicza,
jeszcze nie do końca w yjaśniona,
sp ra w a długości łańcucha poliizop re n o id o w e g o była od lat te m atem
p o sz u k iw a ń prof. C hojnackiego.
O kazuje się, że o ile dolichole w y ­
stępu ją w form ie m ieszaniny h om ologów o n iezby t szerokim s p e k tru m
długości łańcucha (u lud zi cząstecz­
ka dom in ującego w m ieszan in ie dolicholu sk łada się z 19 reszt izoprew w w .postepybiochem ii.pl
now ych, a w szystkich hom ologó w
w m ieszan inie w y stęp u je ok. 5-6),
0 tyle polip renole roślinne p r z e d ­
staw iają sobą o lbrzy m ią ró ż n o ro d ­
ność, gdyż zaró w n o długość d o m i­
nującego w m ieszaninie zw iązku,
jak i ich liczba zm ienia się zależnie
od g a tu n k u rośliny. Dla p rz y k ła d u
ro d z in a b etu laprenoli z b rzozy z a ­
w ie ra zaledw ie 4 hom ologi (dom i­
nuje ilościowo prenol z b u d o w a n y
z 7 reszt izoprenow ych), a ro d zin a
p reno li w y izo lo w an y ch z liści p ię­
ciornika złotego zaw iera 30 h o m o lo ­
gów (dom inuje prenol-18). O d tego
sch em atu całkowicie odbiegają b a k ­
terie, które sy ntetyzu ją zw ykle poje­
d y n czy prenol z b u d o w a n y z 11 reszt
(baktoprenol). Badania przesiew ow e
mające na celu ocenę różn orod ności
w y stęp ujących w p rzy ro d zie s tru k ­
tu r poliprenoii są od lat p ro w a d z o n e
p rze z zespół prof. Chojnackiego we
w sp ó łp ra cy z w ielom a specjalistam i
w zakresie botaniki i fizjologii roślin
1 obejm ują rośliny pochodzące z ró ż ­
nych g ru p system atycznych, stref
klim atycznych i nisz ekologicznych.
O bok analizy struk turalnej prof.
Chojnacki pracuje od w ielu lat nad
u zy sk iw a n ie m chem icznie z m o d y ­
fikow anych poliizo preno idów . Ten
k ie ru n e k b a d a ń w iąże się z dobrze
o p isan ą funkcją fosforanów alk oho­
li p o liizo p ren o id o w ch jako kofaktorów w procesie glikozylacji i glipiacji (syntezy kotw icy GPI) białek
u eu k ario n tó w ; u bakterii fosforan
b ak to p ren o lu jest kofaktorem bio­
syntezy p e p ty d o g lik a n u i O -antygenu. N iezw ykle in ten sy w n y rozwój
b a d a ń n a d glikozylacją białek w y ­
m agał dostępności fosforanów polii­
zo p re n o id ó w , p o dczas gdy w tk an ­
kach roślin i zw ierz ą t g rom ad zone
są (niekiedy w znacznych zresztą
ilościach) w olne alkohole lub ich
estry z kw asam i tłuszczow ym i. O l­
b rzy m ią zasługą prof. Chojnackiego
było o praco w anie b a rd z o w ydajnej
m eto d y fosforylacji dolicholi, do
dziś p ow szechn ie stosow anej i cyto­
wanej. W ostatnim czasie prof. Choj­
nacki zainteresow ał się m ożliw ością
p rzek ształcenia poliizo p ren o id ó w w
form y kationow e użyteczne w m eto ­
dzie lipofekcji, a b a d an ia te z ao w o ­
cow ały o p u b lik o w an ą w ubiegłym
ro k u
pracą d ośw iadczalną. Prof.
Chojnacki w ra z z zespołem o praco­
w ał także m eto d y chemicznej syn­
Postępy Biochemii 53 (2) 2007
tezy ra d io izo to p o w o zn ak o w an y ch
p o liiz o p re n o id ó w i ich p re k u rso ­
rów ; zw iązki te dały a su m p t w ielu
b a d a n io m d otyczącym m etaboli­
zm u po liizo p ren o id ó w , a ostatnio
— ubich in o n u (zaw ierającego poliiz o p re n o id o w y łańcuch boczny).
S tw orzona p rzez prof. Chojnackiego
u n ik aln a w skali św iatow ej „Kolek­
cja Poliprenoii" dała początek w ie ­
lu b a d a n io m p ro w a d z o n y m dziś w
Z akładzie Biochemii L ipidów IBB
PA N w W arszaw ie, w L aboratorium
A rrh e n iu sa na U niw ersytecie w
Sztokholm ie, a także
w w ielu laboratoriach
europejskich i am e ­
rykań skich
(p rzy g o ­
to w an o na p o d sta w ie
inform acji o p ra c o w a ­
nej p rzez prof. d r hab.
Ewę Sw ieżew ską).
d y rek to rem tej placówki. O becnie
kieruje w Instytucie Pracow nią Bio­
energetyki i Błon Biologicznych. Jest
au to re m lub w sp ó łau to re m w ielu
publikacji n auk ow ych, a rtyk ułów
p raso w y ch p o pu lary zujący ch w sp ó ł­
czesną naukę, a także serii p o d rę c z­
ników z d z ie d zin y biologii. O dbył
liczne staże zagraniczne, m.in. w la­
boratoriach J. R. W illiam sona w P en­
nsylvania U niversity oraz K. F. LaN o ue w PennState U niversity. Prof.
D uszy ński b ędzie o d p o w ia d a ł w
resorcie za sp ra w y nauki (wg PAP,
N a u k a w Polsce).
Rada do Spraw Edu­
kacji i Badań N auko­
w ych została pow ołana
11 lutego br., a 19 lutego
2008 ro k u w Pałacu P re­
zyd enckim odbyło się
u roczyste sp otk anie P re­
Prof.
Jerzy
Du­
z y d e n ta RP z członkam i
n o w o pow ołanej Rady.
szyński,
biochem ik
Rada (Fot. 3) stanow i
z Instytutu Biologii
fo ru m konsultacyjne i
D ośw iadczalnej PAN,
został pow o ła n y na
org an o p in io d a w c z o -d o ­
radczy P rezy d en ta RP.
stanow isko
p o d se ­
W skład Rady w eszli
kretarza stanu w M i­
nisterstw ie N auki i Fotografía 2. Prof. Jerzy Duszyński.
p rzedstaw iciele
PAN,
PAU,
znakom itych
Szkolnictw a
W yż­
polskich uczelni, przew o dniczący
szego. Prof. D uszyńsk i (Fot. 2) jest
konferencji rek to ró w oraz rektorzy
specjalistą w dzied zin ie n a u k biolo­
najbardziej zn any ch (w ocenie P re­
gicznych. U kończył W ydział Biolo­
z y d e n ta RP najlepszych) uczelni
gii i N a u k o Ziem i UW w 1971 r. W
p ry w a tn y c h w Polsce. Reguła p o ­
1975 ro k u uzyskał stop ień doktora,
w o ły w a n ia członków Rady nie m a
a w 1983 — do k to ra habilitow anego.
W 1993 roku
otrzym ał
no­
minację
p ro ­
fesorską z rąk
prezydenta
Lecha
W ałę­
sy. Prof. Jerzy
D uszyński jest
członkiem ko­
re sp o n d e n te m
Polskiej
A ka­
dem ii N a u k , a
od 2005 r. k ra ­
jow ym
dele­
gatem do prac Fotografia 3. R ada P ro gram ow a Prezyd en ta RP, ds. Edukacji i Badań N aukow ych.
zesp ołu b io m e­
dyczneg o E u ro p e a n Strategy Foru m
c h a ra k teru personalnego; łączy się
z ok reślonym i stanow iskam i. P rze­
for Research Infrastructu res. O d 2006
w odniczącym Rady został prof.
r. jest także p rz e w o d n ic zą cy m Z e­
d r hab. R yszard Legutko, w y b it­
społu ds. In fra stru k tu ry Badawczej
ny przedstaw iciel polskiej filozofii
p rzy M NiSW . N o w y w icem inister
przez w iele lat był p rz e w o d n ic z ą ­
społecznej i politycznej, a także w
ostatnich latach czynny polityk. W
cym R ady N aukow ej In sty tu tu im.
skład R ady weszli prof. d r hab. inż.
M arcelego N enckiego PAN, a także
http://rcin.org.pl
121
Jerzy Błażejowski, P rzew o d n iczący
lo ń sk ie g o [1]. W p ra c y tej, p r z y g o ­
Rady G łów nej Szkolnictw a W yższe­
to w a n e j w r a z z prof. A n u p a m e m
go, prof. d r hab. inż. T ad eu sz Luty,
A g a rw a le m i d r Jessy D e s h a n e z
P rzew o d n iczący K onferencji Rekto­
U n iv e rs ity of A la b a m a w B irm in g ­
rów A k adem ickich Szkół Polskich,
h a m , USA, a u to r z y p o d s u m o w u ją
prof. d r hab. inż. T om asz Borecki,
w y n ik i s w o ic h k ilk u le tn ic h b a ­
R ektor SGGW w W arszaw ie, prof.
d a ń d o w o d z ą c y c h k lu c z o w e j roli
dr hab. A ndrzej Białas, Prezes PAU,
o k s y g e n a z y h e m o w e j-1 (H O-1) w
prof. d r hab. A d a m B udnikow ski,
a n g io g e n e z ie , czyli p o w s ta w a n iu
Rektor Szkoły G łów nej H andlow ej,
n o w y c h n a c z y ń k rw io n o ś n y c h .
prof. d r hab. K atarzy n a C hałasińH O -1 to e n z y m , k tó ry , r o z k ła d a ­
ska-M acukow , R ektor U n iw ersy tetu
jąc h e m d o zielon ej b iliw e rd y n y ,
W arszaw skiego, prof. d r hab. A n­
p rz e k s z ta łc a n e j n a s tę p n ie w ż ó ł­
drzej Eliasz, R ektor Szkoły W yższej
tą b iliru b in ę , p r z y c z y n ia się do
Psychologii Społecznej, prof. d r hab.
z a n ik u s in ia k a o ra z o d p o w ia d a
inż. M ichał Kleiber, Prezes PAN,
za z a ż ó łc e n ie sk ó ry p o d c z a s ż ó ł­
prof. d r hab. A ndrzej K. Koźm iński,
taczki. O sią g n ię c ie m k r a ­
Rektor W yższej Szkoły
k o w s k ic h n a u k o w c ó w jest
Przedsiębiorczości i Z a ­
o d k ry c ie n ie z n a n e j d o tą d
rz ą d z a n ia im. Leona K oź­
m ińskiego, prof. d r hab.
q fu n k cji H O -1, n ie z b ę d n e j
inż. W łod zim ierz K urnik,
O w sy n te z ie i a k ty w n o śc i
Rektor Politechniki W a r­
^ c z y n n ik ó w
s ty m u lu ją ­
szaw skiej, prof. d r hab.
cej* c ych a n g io g e n e z ę , k tó re
Stanisław Lorenc, R ektor
o d g ry w a ją w a ż n ą ro lę w
U n iw ersy te tu im. A d a m a
procesach napraw czych,
M ickiew icza w P ozn an iu , Fotografia 4. G odło U n iw er­ ta k ic h ja k g o jen ie ra n , ale
prof. d r hab. Karol M u- sytetu M edyczn ego w Bia­ ta k ż e p rz y c z y n ia ją się do
łym stoku.
sioł, R ektor U n iw e rsy te tu
w z r o s tu n o w o tw o r ó w . W
Jagiellońskiego, prof. dr
jed n e j z n a jn o w s z y c h p rac
hab. M ichał Szulczew ski, P rz e w o d ­
[2] b a d a c z e z B irm in g h a m i K ra ­
niczący Rady N a u k i i S zkolnictw a
k o w a w y k a z a li u d z ia ł H O -1 w a k ­
W yższego, prof. d r hab. inż. A ntoni
ty w n o śc i k o m ó r e k m a c ie rz y s ty c h
Tajduś, R ektor A k ad em ii G órniczoś ró d b ło n k a ; w kolejnej p u b lik ac ji
H utniczej, ks. prof. d r hab. Stanisław
[3] k ra k o w s k i z e s p ó ł u d o w o d n ił,
Wilk, R ektor Katolickiego U n iw e r­
iż H O -1 p r z y c z y n ia się d o w z r o s tu
sytetu Lubelskiego im. Jana Paw ła
c z e rn ia k a , m .in. p o p r z e z s ty m u ­
II oraz prof. d r hab. E d m u n d W nuklację a n g io g e n e z y . L e p sz e p o z n a ­
Lipiński, Rektor C olleg ium Civitas.
nie m e c h a n iz m ó w p o w s ta w a n ia
Akademia M edyczna w Białym­
n a c z y ń k rw io n o ś n y c h jest w a ­
stoku (Fot. 4), Lublinie i Warszawie
ru n k ie m u le p s z e n ia istn iejący ch
może używać nazwy Uniwersytet
Medyczny. Ustawy zmieniające na­
zwę trzech uczelni medycznych pod­
pisane przez Prezydenta RP, w dniu
27 lutego br., opublikowano w dzien­
niku Ustawa dnia 7 marca 2008 r.
N a c z y n ia k r w io n o ś n e — spra­
w a ż y c ia i śm ierci. W n a jn o w s z y m
z e sz y c ie Circulation (15 sty c z n ia ),
u z n a w a n e g o za n a jle p s z e c z a s o ­
p is m o z d z ie d z in y k a rd io lo g ii i
b io lo g ii n a c z y n io w e j, u k a z a ł się
a r ty k u ł, k tó re g o w s p ó ła u to r a m i są
prof. d r h a b . Jó zef D u la k (Fot. 5) i
d r h a b . A licja J ó z k o w ic z z Z a k ła ­
d u B io te c h n o lo g ii M e d y c z n e j W y ­
d z ia łu B iochem ii, B iofizyki i Bio­
te c h n o lo g ii U n iw e r s y te tu Ja g ie l­
122
Fotografia 5. Zespół Z akład u B iotechnologii M edycznej
(po prawej).
http://rcin.org.pl
i o p ra c o w a n ia n o w y c h s tra te g ii
p r z e c iw n o w o tw o r o w y c h , a ta k ­
że te ra p ii o g ra n ic z a ją c y c h n ie d o ­
k rw ie n ie serca lu b p o b u d z a ją c y c h
g ojenie r a n u p a c je n tó w z c u k r z y ­
cą. P u b lik a cje w ty ch u z n a n y c h
c z a s o p is m a c h s ta n o w ią p o tw ie r ­
d z e n ie ra n g i b a d a ń p r o w a d z o ­
n y c h p r z e z n a u k o w c ó w z Z a k ła d u
B io tec h n o lo g ii M ed y czn ej UJ, k tó ­
rz y w e w r z e ś n iu byli ró w n ie ż o r ­
g a n iz a to ra m i V M ię d z y n a r o d o w e ­
go K o n g re su n a te m a t O k s y g e n a z
H e m o w y c h . K on ferencja ta o d b y ła
się n a U n iw e rsy te c ie Ja g ie llo ń sk im
w d n ia c h o d 5 d o 9 w rz e ś n ia 2007
ro k u . U c z e stn ic z y ło w niej p o n d
230 n a u k o w c ó w z 24 k ra jó w ś w ia ­
ta. K o n feren cja o d b y ła się p o d p a ­
tr o n a te m P o lsk ie g o T o w a rz y s tw a
B io ch e m ic z n e g o . P o d c z a s k o n f e ­
rencji p r z e d s ta w io n o k ilk a d z ie s ią t
w y k ła d ó w i k ró tk ic h w y s tą p ie ń
u s tn y c h , o d b y ły się ta k ż e sesje
p o s te ro w e . P ro g r a m ko n fe re n c ji
d o s tę p n y jest n a stro n ie h t t p : / /
b io tk a .m o l.u j.e d u . p l / h o -c o n fe re n c e / h t m l / a b s tr a c ts - p r o g r a m .h tm l.
J e d n y m z o w o c ó w p rz y g o to w a ń d o
k o n fere n cji jest z e s z y t c z a s o p is m a
A n tio xida n ts & Redox Signaling (IF
= 4.49), z a w ie ra ją c y 14 a r ty k u łó w
(w ty m 4 p ra c e o ry g in a ln e , 9 p r z e ­
g lą d o w y c h i k o m e n ta r z r e d a k to ­
ra), p o ś w ię c o n y c h b io ch em ii i z n a ­
c z e n iu fiz jo lo g ic z n e m u o k sy g e n a z
h e m o w y c h . Sw oje p ra c e w ty m
z e sz y c ie z a m ie ścili n a jw y b itn ie jsi
sp ecjaliści z a jm u ją c y się o k sy g e n a z ą h e m o w ą , w ty m m .in. M a h in
M aines, N a d e r
A b ra h a m , Shigeki S h ib a h a ra
i inni. R e d a k ­
to re m całości
był p ro f. Józef
D u la k .
Bada­
n ia n a d ro lą
oksygenazy
h em o w ej-1 s ta ­
n o w ią część te ­
m a ty k i b a d a w ­
czej
Z a k ła d u
B io te c h n o lo g ii
M edycznej,
k o n c e n tr u ją c e j
się n a p o z n a ­
UJ z prof. Józefem D ulakiem
w a n iu m o le k u ­
w w w .postepybiochem ii.pl
la rn y c h m e c h a n iz m ó w tw o r z e n ia
i f u n k c jo n o w a n ia n a c z y ń k r w io ­
n o śn y c h . W s w o ic h b a d a n ia c h
b a d a c z e k ra k o w s c y sto su ją m .in.
te c h n ik i tra n s f e r u g e n ó w p r z y w y ­
k o r z y s ta n iu w e k to r ó w p la z m id o ­
w y c h i w iru s o w y c h . Z a g a d n ie n iu
te m u p o ś w ię c o n y je st z e s z y t „B io­
te c h n o lo g ii" (nr 3 /2 0 0 7 ) z a w ie r a ­
jący p ra c e p r z y g o to w a n e p rz e z
p r a c o w n ik ó w i d o k to r a n tó w Z a ­
k ła d u .
[1] D ulak J, D eshane J, Jozkowicz A, A garw al
A (2008) H em e oxygenase-1 and carbon
m onoxide in vascular pathobiology; focus
on angiogenesis. Circulation 117: 231-241
[2] D eshane J, Chen S, Caballero S, GrochotPrzeczek A, W as H, Li Calzi S, Lach R,
Hock TD, Chen B, Hill-K apturczak N, Się­
gał GP, D ulak J, Jozkowicz A, G rant MB,
A garw al A (2007) Strom al cell-derived fac­
tor-1 prom otes angiogenesis via a hem e oxygenase-1 dependent pathw ay. J Exp M ed
204: 605-618
[3] W as H, CichonT, Sm olarczyk R, Rudnicka
D, Stopa M, Chevalier C, LegerJJ, Lackow ska B, G rochot A, Bojkowska K, Ratajs­
ka A, Kieda C, Szala S, D ulak J, Jozkowicz
A (2006) O verexpression of hem e oxygenase-1 in m urine m elanoma: increased pro­
liferation an d viability of tum or cells, de­
creased survival of mice. Am J Pathol 169:
2181-2198
Z e sp ó ł dr M acieja Lazarczyka
p o d c z a s b adań p r o w a d z o n y c h
d z ię k i w sp a r c iu Fundacji na rzecz
N a u k i P o lsk ie j w In sty tu cie Pa­
steura, o d k r y ł n ie z n a n y natural­
n y m e c h a n iz m o b ro n y przed w i ­
ru sam i p o w o d u ją c y m i m .in. raka
sz y jk i m acicy. C z ło n k o w ie z e s p o ­
łu b a d a li p a c je n tó w z b a rd z o r z a d ­
k ą c h o r o b ą epidermodysplasia verru­
ciformis (EV), k tó ra z w ią z a n a je st z
w y s tę p o w a n ie m m u ta c ji w g e n ie
k o d u ją c y m b ia łk a E v e rl i Ever2,
u c z e s tn ic z ą c y m i w tw o r z e n iu b a ­
rie ry p r z e d a ta k u ją c y m i k o m ó rk ę
w iru s a m i. N o sic ie le ta k ic h m u ta cji
są n ie z w y k le p o d a tn i n a z a k a ż e n ia
o n k o g e n n y m i w ir u s a m i lu d z k ie g o
b r o d a w c z a k a (HPV) (w iru s y EVH PV ). Te p o w s z e c h n e w p r z y r o ­
d z ie w ir u s y n ie p o w o d u ją z a z w y ­
czaj ż a d n y c h p ro b le m ó w u o só b z
p r a w id ło w y m , a n ie z m u to w a n y m
g e n e m E V E R . U p o d a tn y c h n a z a ­
c h o r o w a n ie p a c je n tó w c ie rp ią c y c h
n a EV p o ja w ia ją się z m ia n y s k ó r ­
ne, u tr z y m u ją c e się p r z e z całe ż y ­
cie, w o b rę b ie k tó ry c h ro z w ija się
r a k sk ó ry . Z e sp ó ł d r Ł a z a rc z y k a
Postępy Biochemii 53 (2) 2007
o d k ry ł, że b ia łk a E ver u c z e s tn ic z ą
w k o n tro li w e w n ą tr z k o m ó rk o w e j
h o m e o s ta z y cy n k u ; z a b u rz e n ie tej
ró w n o w a g i jest k lu c z o w e d la r o z ­
w o ju z a k a ż e n ia H PV . M e c h a n iz m
te n n ie d o ty c z y je d n a k ty lk o r z a d ­
kiej c h o ro b y ja k ą jest EV. M a r ó w ­
n ie ż is to tn e z n a c z e n ie w z a k a ż e ­
n ia c h g e n ita ln ą o d m ia n ą H PV . Z a ­
k a ż e n ia o d m ia n ą E V -H PV n a le ż ą
d o n a jc z ę stsz y c h c h o ró b p r z e n o ­
s z o n y c h d r o g ą p łc io w ą , a n ie k tó re
H P V p o w o d u ją ra k a szyjki m acicy
u k ob iet. N a u k o w c y w y k a z a li, że
w ir u s y w y w o łu ją c e ra k a szyjki m a ­
cicy w d r o d z e e w o lu c ji w y k s z ta ł­
ciły m e c h a n iz m b lo k u ją c y d z ia ­
ła n ie b ia łe k E ver, u m o ż liw ia ją c y
w ir u s o m n a ś la d o w a n ie s k u tk ó w ,
ja k ie w y w o łu je m u ta c ja w g en ie
EVE R . W sk a z u je to, że z a b u r z e n ia
w e w n ą tr z k o m ó r k o w e j h o m e o s ta ­
zy c y n k u s ta n o w ią k lu c z o w y e ta p
w z a k a ż e n iu H P V i o d g ry w a ją rolę
w u ja w n ie n iu o n k o g e n n e j n a tu r y
w iru s a . C h o ć o d k ry c ie m a n a ra z ie
z n a c z e n ie p r z e d e w s z y s tk im p o ­
z n a w c z e , id e n ty fik u je o n o n ie z n a ­
n y d o tą d m e c h a n iz m o c h ro n n y ,
k tó re g o b lo k a d a je st b a r d z o w a ż n a
w c y k lu ż y c io w y m ty c h w ir u s ó w
(L az a rc zy k M, P o n s C, M e n d o z a
JA, C a s s o n n e t P, Jacob Y, F a v re M
(2008) R e g u la tio n of c e llu la r zinc
b a la n c e as a p o te n tia l m e c h a n is m
of E V E R -m e d ia te d p ro te c tio n a g a ­
in st p a th o g e n e s is b y c u ta n e o u s
o n c o g e n ic h u m a n p a p illo m a v i­
ru ses. J E xp M e d 205: 35-42) (w g
PA P, N a u k a w Polsce).
N ie o b s e r w o w a n y od 100 lat w
w o d a c h M orza B a łty c k ie g o g a tu ­
n e k z w ie r z ę c ia o d k ryła Marta Ron o w ic z , dokto ra n tk a w Z a k ła d z ie
E k o lo g ii M orza In sty tu tu O c e ­
a n o lo g ii P A N , p o d c z a s n u r k o w a ­
nia s w o b o d n e g o . Tenellia adspersa
jest ś lim a k ie m n a g o s k r z e ln y m o
o g ó ln o ś w ia to w y m z a s ię g u w y s tę ­
p o w a n ia z a m ie s z k u ją c y m w o d y
z a ró w n o o c e a n ic z n e , jak i sło d k ie ,
je d n a k p o ra z p ie rw s z y z a n o to w a ­
no jego o b e c n o ść w po lskiej s tr e ­
fie B ałtyk u. M g r R o n o w ic z w ś ró d
k o lo n ii s tu łb io p ła w ó w z g a tu n k u
Gonothyrea loveni z n a le z io n y c h w
2006 r. w ś r ó d ro ś lin p o ra s ta ją c y c h
k a m ie n ie w p r z y b r z e ż n y c h w o ­
http://rcin.org.pl
d a c h H e lu , z a u w a ż y ła ż e ru ją c e g o
ś lim a k a n a g o s k r z e ln e g o o d łu g o ­
ści 3 m m . R ok p ó ź n ie j ślim a k teg o
s a m e g o g a t u n k u z o sta ł z n a le z io n y
w w o d a c h w re jo n ie S o p o tu . Jest to
z w ie rz ę o b a r d z o d u ż y c h z d o ln o ­
ściach a d a p ta c y jn y c h , k tó re to le r u ­
je sz e ro k i z a k r e s w a r u n k ó w ś r o d o ­
w is k o w y c h . R o z m n a ż a się w te m ­
p e r a tu r z e 1 5-25°C i p rz y z a s o le n iu
8 -3 0 p s u . Ż e ru je n a r ó ż n y c h g a ­
t u n k a c h b e n to s o w y c h s tu łb io p ła ­
w ó w . O d k r y ty z o s ta ł w 1845 r o k u
w M o rz u C z a r n y m i o d te g o c z a su
b y ł s p o ty k a n y w w o d a c h o k a la ją ­
c y c h W y s p y B ry tyjskie, w M o rz u
B ałtyckim , w M o rz u P ó łn o c n y m ,
a ta k ż e w p ó łn o c n o - w s c h o d n im
A tla n ty k u . W B a łty k u o b s e r w o w a ­
n o go o d 1865 d o 1907 ro k u , a n a ­
s tę p n ie p r z e z p r a w ie 100 lat nie p o ­
ja w ia ły się ż a d n e w z m ia n k i o jego
is tn ie n iu w ty m a k w e n ie . D o p ie ro
w 2004 r o k u u k a z a ła się p u b lik a ­
cja fiń sk ic h n a u k o w c ó w in f o r m u ­
ją c y c h o lic z n y m w y s tę p o w a n iu
ślim a k a u w y b r z e ż y A rc h ip e la g u
F iń sk ie g o . M e to d a n u r k o w a n ia
s w o b o d n e g o je st s k u te c z n y m s p o ­
s o b e m p e w n e g o z n a le z ie n ia o r g a ­
n iz m ó w d r o b n y c h . W e d łu g M a rty
R o n o w ic z g a tu n e k ś lim a k a m ó g ł
z o sta ć z a w le c z o n y z M o rz a C z a r­
n e g o n a k a d łu b a c h s ta tk ó w w ra z
z fa u n ą s to w a r z y s z o n ą . N ie w y ­
k lu c z o n e , że o r g a n iz m d o s ta ł się
d o B a łty k u z w o d a m i b a la s to w y ­
m i s ta tk ó w . O d k r y c ie to p o z w a la
p o s z e rz y ć w ie d z ę o z b io ro w is k a c h
f a u n y M o rz a B ałtyckiego . Z c z a ­
s e m o k a ż e się, c z y n o w o o d k r y ty
m a ły ś lim a k b ę d z ie m ia ł w p ły w
n a e k o s y s te m B a łty k u (w g PA P,
N a u k a w Polsce).
N o w a u m o w a o K o m isji Fulbri­
ghta z o sta ła p o d p is a n a p r z e z S ta n y
Z je d n o c z o n e i R P 10 m a rc a 2008 r.
w z w ią z k u z o ficjaln ą w iz y tą P re ­
m ie ra R P w W a s z y n g to n ie . N o w a
u m o w a z n a c z n ie z w ię k s z a fin a n ­
so w y u d z ia ł s tr o n y p o lskiej w P r o ­
g ra m ie F u lb rig h ta , co w p ły n ie na
r o z s z e rz e n ie w y m ia n y s tu d e n tó w ,
n a u k o w c ó w i n a u c z y c ie li p o m ię ­
d z y o b o m a k ra ja m i. W c e re m o n ii
p o d p is a n ia w Sali T ra k ta to w e j D e ­
p a r ta m e n tu S ta n u u d z ia ł w z ięli
123
p.o. z a s tę p c y s e k r e ta rz a B iura ds.
E d u k ac ji i K u ltu r y D e p a r ta m e n tu
S ta n u USA, C. M iller C ro u c h o ra z
c h a rg e d 'a f fa ir e s a.i. A m b a s a d y RP
W o jciech Flera. W 2009 r. p r z y p a ­
d a 50. ro c z n ic a is tn ie n ia p r o g r a m u
s ty p e n d ia ln e g o F u lb rig h ta w P o l­
sce (w w w .f u lb r ig h t.e d u .p l).
M o ż liw o ś c i fin a n so w a n ia d z ia ­
ła ln o śc i n a u k o w o -b a d a w c z e j z
F u n d u sz u N a u k i i T e c h n o lo g ii
P o lsk ie j. S z c z e g ó ło w e z a s a d y g o ­
s p o d a r k i fin a n so w ej F u n d u s z u N a ­
u k i i T e c h n o lo g ii Polskiej o k re śla
R o z p o r z ą d z e n ie M in is tra N a u k i i
S z k o ln ic tw a W y ż sz e g o z d n ia 22
m a rc a 2007 r. (w w w .m n is w .g o v .
pl), a k ty p r a w n e , n a u k a (B iulety n
In fo rm ac ji P ublicznej). F u n d u s z
N a u k i i T e c h n o lo g ii Polskiej g r o ­
m a d z i n a k o n c ie 2% p r z y c h o d ó w
u z y s k a n y c h z p ry w a ty z a c ji w d a ­
n y m r o k u b u d ż e to w y m o ra z o d s e t­
ki o d ty c h ś r o d k ó w , z p r z e z n a c z e ­
n ie m n a cele z w ią z a n e z ro z w o je m
n a u k i i te c h n o lo g ii p olsk iej, o bej­
m u jąc e w s p ie ra n ie u z n a n y c h za
sz c z e g ó ln ie w a ż n y c h k ie r u n k ó w
b a d a ń n a u k o w y c h k ra ju lu b p ra c
r o z w o jo w y c h o k re ś la n y c h w z a ­
ło ż e n ia c h p o lity k i n a u k o w o - te c h ­
n icznej p a ń s tw a , w s p ie r a n ie in w e ­
stycji słu ż ą c y c h p o tr z e b o m b a d a ń
n a u k o w y c h lu b p ra c ro z w o jo w y c h
o ra z p ro m o c ję i u p o w s z e c h n ia n ie
n a u k i. Z g o d n ie z u s ta w ą z F u n ­
d u s z u m o g ą być f in a n s o w a n e m.
in.: p ro je k ty b a d a w c z e , in w esty c je
słu ż ą c e p o trz e b o m b a d a ń n a u k o ­
w y c h (in w esty cje a p a r a tu r o w e lu b
b u d o w la n e ) , d z ia ła ln o ść w s p o ­
m a g a ją c a b a d a n ia (e k sp e rty z y ,
k o n feren cje). W n io sk i s p o r z ą d z a
się w e d łu g o d p o w ie d n ic h w z o ­
ró w s ta n o w ią c y c h z a łą c z n ik i d o
r o z p o r z ą d z e n ia . Z g o d n ie z r o z p o ­
r z ą d z e n ie m ś r o d k a m i F u n d u s z u
d y s p o n u je m in is te r w ła ś c iw y d o
s p r a w n a u k i. W n io sk i m o g ą być
s k ła d a n e w cią g u c ałeg o ro k u . P i­
sm o (w n io se k ), z a w ie ra ją c e u z a ­
s a d n ie n ie ce lo w o ści w y s tą p ie n ia
o f in a n s o w a n ie w y m ie n io n e g o
z a d a n ia o ra z z a łą c z n ik w p o sta c i
w n io s k u , n a le ż y k ie ro w a ć n a a d ­
res: M in iste r pro f. Je rz y D u s z y ń ­
ski, D e p a r ta m e n t Bazy B adaw czej
124
prof, d r hab. med. W iesław W iktor
Jędrzejczak (Fot. 6). Prof. Jędrzej­
czak kieruje Kliniką Flematologii,
O nkologii i Chorób W ew nętrznych
U n iw ersy tetu M edycznego w W a r­
szaw ie, jest także k o n su lta n ­
tem krajow ym w zakresie h e ­
m atologii. Prof. Jędrzejczak
N a ro d o w e Centrum Ba­
w 1993 roku został la u rea te m
dań i R o zw oju (NCiBR)
prestiżow ej n ag ro d y F u n d a ­
p o szu k u je ekspertów , któ­
cji na rzecz N auki Polskiej
rzy będą o p in io w a ć projek­
w dziedzinie n a u k p rz y ro d ­
ty realizow ane w ramach
niczych i m edycznych. W y­
strategicznych program ów
różniono go za cykl prac na
badaw czych. P rzedstaw iciel
tem at m olekularnych i ko­
NCBiR p o in fo rm o w a ł, że re ­
m órk ow ych m echanizm ów
alizacja z a d a ń N a ro d o w e g o Fotografia 6. Prof. W ie­ p o w staw an ia kom órek krw i.
C e n tru m B adań i R ozw oju sław W iktor Jędrzej­ Jest au to re m p o n a d 160 p u ­
czak.
w y m a g a stw o rz e n ia bazy
blikacji naukow y ch, w tym
ek sp e rtó w , z a ró w n o z ob­
w najbardziej prestiżow ych czaso pi­
sm ach na świecie, takich jak Scien­
sz a ru n au k i, jak i gospodarki. N aj­
ce, Journal of E xperim ental M edici­
w a żn ie jsz y m z a d a n ie m e k sp e rtó w
ne, Blood i British M edical Journal.
będ zie o p in io w a n ie projektów w
Pozostałe m iniatury d o k u m e n ta ln e
ra m a c h strateg iczn y ch p ro g ra m ó w
ukazują prof. Lecha Leciejewicza
b ad a w cz y c h . Z ain tere so w an e osoby
z In sty tu tu A rcheologii i Etnologii
p ro sz o n e są o zarejestrow anie się i
PAN, prof. H enryka S karżyńsk ie­
w y p e łn ie n ie fo rm u larz a in te rn eto ­
go z M ię d zynarodow eg o C e n tru m
w ego. Po za a k c e p to w a n iu aplikacji
Słuchu i M ow y w K ajetanach koło
i w p is a n iu d o b azy eksp ertów , d y ­
W arszaw y, prof. Z y g m u n ta Pejsaka
re k to r C e n tru m będzie, w m iarę p o ­
z P ań stw o w eg o In sty tu tu W ete ry n a­
jaw iających się potrzeb, zapraszać
ryjnego w P uław ach, prof. E d w ard a
e k sp e rtó w d o sp o rz ą d z e n ia opinii
W nuka-L ipińskiego, Rektor C olle­
lub e k sp erty z. O kreśli także szcze­
giu m Civitas w W arszaw ie, prof.
gó ło w e w a ru n k i z w ią z an e z pracą
Karola M yśliw ca z Z a k ła d u A rche­
e k sp e rtó w (w w w .n c b ir.g o v .p l).
ologii Śródziem nom orskiej PAN,
prof.
Stefana Z a w adzkiego z UAM
Powstała seria 10 filmów, w w y ­
w
Poznaniu,
prof. Zofię Kielan-Janik u w spólnej inicjatyw y Fundacji
w o ro w sk ą z In sty tu tu Paleobiologii
na rzecz N au k i Polskiej, MNiSW
PAN, prof. Jadw igę Staniszkis z In ­
oraz TVP 2, ukazujących sylw etki
sty tu tu Socjologii UW i prof. K rzysz­
w y b itn y ch osobistości polskiej n a ­
tofa M atyjaszew skiego z W yd ziału
uki, z a ty tu ło w a n a „M łodzi tw órcy
Chem ii C arnegie M ellon U niversity
— m istrzo m ". O realizację filmów
(USA) oraz C e n tru m Badań M oleku­
p o p ro szo n o abso lw entó w łódzkiej
larnych
i M akro m o lekularny ch PA N
„Film ów ki". Sami w ybierali b o h a ­
w Łodzi.
terów , konw encję i tem atykę sw oich
filmów. Jedy nym w y m ogiem było,
P olskie uczelnie techniczne będą
w spółpracować z ukraińskimi; p o ­
aby p rz e d sta w ia n a osoba była la u ­
rozum ienie w tej sp ra w ie zostało
re ate m tzw . polskiego N obla lub
dorocznej n a g ro d y M inistra N auki i
za w a rte w W arszaw ie, o czym p o in ­
fo rm ow ał Rektor Politechniki Ł ó d z ­
S zkolnictw a W yższego za osiągnię­
cia w bad a n iac h na rzecz rozw oju
kiej, prof. Jan Krysiński. P o ro z u m ie ­
n auki, sp ołeczeństw a i gospodarki.
nie m ięd zy Konferencją R ektorów
Serię 10 ob raz ó w rozp oczyna film
Polskich
U czelni
Technicznych,
„M iędzy złem a złem ". Tw órcą (sce­
której prof. Krysiński p rz e w o d n i­
n a riu sz i reżyseria) filmu jest 25-letczy, a S tow arzy szeniem R ektorów
ni Jakub K ossakow ski. B ohaterem
Uczelni Technicznych U krainy jest
p ierw szeg o filmu (emisja 3 stycznia
w stęp e m do w spó łpracy p o szcze­
gólnych uczelni, za ró w n o przy w y ­
2008 r.) jest wielki hum an ista, w y ­
bitny onkolog, au to r pierw szego w
m ianie stu d e n tó w i w y k ła d o w có w ,
jak i przy bad an ia c h n aukow ych.
Polsce u d a n e g o przeszczepu szpiku,
M in is te rs tw a N a u k i i S z k o ln ic tw a
W y ż sz e g o , ul. W s p ó ln a 1 /3 , 00-529
W a rs z a w a . W n io sk i, na k tó re nie
p r z y z n a n o ś r o d k ó w fin a n so w y c h
w d a n y m ro k u , nie są r o z p a tr y w a ­
n e w r o k u n a s tę p n y m .
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
Politechniki zobo w iązały się też do
d w u stro n n e j w y m ian y informacji.
Poszczególne uczelnie krajow e będą
teraz na tej p o d staw ie n aw iązy w ały
k o n tak ty z uczelniam i ukraińskim i.
Centrum
N auki
„Kopernik"
zorganizuje jedno z najw iększych
w ydarzeń w środow isku centrów
nauki i m uzeó w na św iecie, k o n fe ­
rencję ECSITE (European N etwork
of Science Centres & M useums)
w 2011 roku. U czestniczy w niej co
r o k u blisko tysiąc osób, d y re k to ró w
i przedstaw icieli m u z e ó w i centrów
n a u k i z całego św iata oraz firmy
projektujące i w y tw arzające w y sta ­
w y do centrów „K opernika". Pol­
skie c e n tru m n a u k i ryw alizo w ało z
pięciom a centram i z całej Europy.
D y rek to r ECSITE, V incenzo Lipardi,
po in fo rm o w ał o sukcesie Polaków
27 m arca 2008 r. C en tru m N auki
„K opernik" planuje połączenie k o n ­
ferencji z Piknikiem N a uko w y m ,
który w spó łorg anizuje z Polskim
Radiem . To najw iększa w E uropie
im p reza p len ero w a tego ty pu, w
której uczestniczą setki instytucji z
Polski i świata. K onferencja ECSITE
będzie prom ocją dla polskich n a ­
uk o w có w i p o p u la ry z a to ró w nauki.
Będą oni mieli okazję obejrzeć także
to, co p okażą uczestnicy konferencji
z zagranicy. Z konferencji p o w in n y
skorzystać in te rak ty w n e centra n a ­
uki. P rzew o dniczącym Rady P ro g ra­
m owej C e n tru m N auki „K opernik"
o raz p o m ysłodaw cą Pikniku N a u k o ­
w eg o jest prof. Ł ukasz Turski.
C enioną na św ie c ie nagrodę im.
Christopha Schmelzera odebrała
30 listopada 2007 r. w Darmstadt
Katarzyna Psonka, s ty p e n d y stk a
p r o w a d z o n e g o w CITTRU projektu
sty p e n d ia ln e g o „A k ad em ick a In n o ­
w acyjność dla M ałop olski". N a g ro ­
da, n a z w a n a im ieniem p ierw szeg o
d y re k to ra n a u k o w e g o i założyciela
T o w a rz y stw a na Rzecz B adań C ięż­
kich Jonów , jest w ręc z an a corocz­
nie p rz e z Stow arzyszenie na rzecz
promocji C iężkojonow ej Terapii
N o w otw o ro w ej za w y b itn e prace
z z a k re su te ra p ii n o w o tw o ro w e j
w ią z k a m i jono w y m i. Do tej p ory
w śró d osób n a g ro d z o n y c h z n a le ź ­
li się m ło d z i n a u k o w cy z Niem iec,
Francji, Szw ajcarii, Szwecji i Ja­
ponii. W ręczenie n a g ro d y o d b y ­
ło się o śro d k u n a u k o w y m , który
Postępy Biochemii 53 (2) 2007
p ro w a d z i p ilo ta ż o w y projekt te ra ­
pii n o w o tw o ro w e j jonam i w ęgla.
W projekcie CITTRU K atarzy n a
P so n k a za jm o w ała się badaniam i
u s z k o d z e ń D N A , w ykorzystując
m ik rosk o p ię atom ową. K atarzyn a
P so n k a jest z w ią z a n a z W y d ziałem
Fizyki, A stro n o m ii i Inform atyki
Stosow anej UJ, a jej z a in te re so w a ­
nia n a u k o w e k o n ce n tru ją się w okół
radiobiolog ii.
N agrodę N aukow ą Miasta G dań­
ska im. Jana H ew eliu sza otrzym ał
prof. M arcin Pliński w dziedzinie
n a u k ścisłych, za rozw inięcie u n ik a ­
tow ych b a d a ń n a d zm ianam i ekolo­
gicznym i w Bałtyku, a zw łaszcza za
p o szu k iw an ie przy c zy n reg u larn y ch
zak w itó w sinic. Prof. Pliński kieruje
Z ak ła d em Biologii i Ekologii M o­
rza w Instytucie O ceanografii UG,
był założycielem C e n tru m Biologii
M orza PA N w G dyni. N a g ro d a im.
Jana H ew eliu sza jest najstarszym
n a u k o w y m w y ró ż n ien ie m p rz y z n a ­
w a n y m p rzez sam o rz ąd y w Polsce.
U stan o w iła ją w 1987 roku Miejska
R ada N a ro d o w a na w niosek g d a ń ­
skiego o d d z ia łu PA N. W kapitule
n a g ro d y zasiadają Prezes G d a ń ­
skiego T o w arz y stw a N aukow ego,
Prezes g d ańskieg o o d d zia łu PA N ,
R ektorzy gdańskich szkół w yższych
i p rzed staw iciel P rez y d en ta G d a ń ­
ska. W p rz y szły m ro k u w grem ium
z asiąd ą ró w n ie ż d otychczasow i la u ­
reaci n ag ro d y .
W spólną bu d ow ę pom nika w e
Lw ow ie, upam iętniającego zamor­
dow anych profesorów U n iw ersy­
tetu L w ow skiego, za p o w ied zieli
Prezydent W rocławia Rafał D u tk ie­
w icz i Prezydent Lwowa Andriy Sadovyy. List intencyjny w tej spraw ie
p o d p isa n y został w e W rocław iu w
m arcu 2008 r. Intencją uzg o d n ien ia
m a być u p am ię tn ien ie ofiar zbrodni
dokonanej p rz ez niem ieckich n a z i­
stów w 1941 r., p o p rz ez w zniesienie
p o m n ik a w e Lwowie, na miejscu
m o rd u p rofeso rów U niw ersytetu
Lw ow skiego. Projekt p o m nika zo ­
stanie w yło n io n y w d ro d ze k o n ­
k u rsu , a w szelk ie napisy będą w y ­
k o n an e w d w ó c h językach. Pom nik
m a p o w sta ć do końca 2009 r. Strona
polska zo bow iązała się do p oniesie­
nia w szy stk ich kosztów zw iązanych
z realizacją przedsięw zięcia. Część
finansów będ zie p ra w d o p o d o b n ie
http://rcin.org.pl
pochodzić z b u d ż e tu W rocław ia, ale
w ład ze m iasta mają też nadzieję p o ­
zyskać sponsorów . Prezydenci obu
m iast zapo w iedzieli także w sp ó l­
ne ubieganie się o organizację w
2016 r. Europejskiej Stolicy K ultury.
Pierw otn ie idea Europejskiego M ia­
sta K ultury p o w stała w Parlam encie
E uropejskim w 1985 r. z zam ysłem
zbliżania n a ro d ó w E uropy. W 1999
r. przyjęto n ow ą n azw ę projektu
E uropejska Stolica K ultury. A k tu al­
nie E uropejska Stolica K ultury jest
w sk a z y w an a co roku przez Radę
na zalecenie Komisji, u w z g lę d n ia ­
jąc opinię P arlam en tu E uropejskie­
go i jury, w skład którego w chodzi
siedm iu w y b itn y ch przedstaw icieli
św iata k u ltu ry (wg PAP, N auk a w
Polsce).
N akładem W ydaw nictw a U n i­
w ersytetu W arm ińsko-M azurskie­
go w O lszty n ie u k az a ła się książka
„M ało z n a n e ro śliny sad o w n ic ze ".
A u to rzy , pro feso r Z d z isła w K aw ec­
ki, d r hab. R o m u ald Łojko i d r Bole­
sław Pilarek, zam ieścili w niej o p i­
sy i zdjęcia 22 m ało z n an y ch roślin
sa d o w n ic z y c h oraz o m ów ili m o żli­
w ości ich u p ra w y i w y k o rz y sta n ia
w p rz e tw ó rstw ie i ziołolecznictw ie.
W iększość p rz e p isó w została o p ra ­
co w a n a albo u d o sk o n a lo n a p rzez
a u to ró w . N ie k tó re z p o d a n y c h w
książce re c e p tu r z n a n o już w okresie
śre d n io w ie cz a , a później sto so w a ­
no n a w e t na m ag n ack ich dw orach .
P ra w ie w sz y stk ie p rze p isy zostały
s p ra w d z o n e w Z ak ła d zie P rz e tw ó r­
stw a In s ty tu tu S a d o w n ic tw a
w
S am o ch w ało w iczach koło M ińska
na B iałorusi p rz e z nieżyjącego już
w s p ó ła u to ra , Polaka z p o c h o d z e ­
nia, dr. hab. R o m u a ld a Łojkę, p r a ­
c o w n ik a n a u k o w e g o tego in sty tu tu .
Książkę poleca się szczególnie s tu ­
d e n to m O g ro d n ic tw a, Rolnictw a,
A rc h ite k tu ry K rajobrazu, K ształto­
w a n ia i O ch ro n y Ś rodo w iska, A g ro ­
tu ry sty k i o raz T echnologii Ż y w n o ­
ści i Ż y w ien ie C złow ieka. Książka
za w ie ra w iele c enny ch w iad o m o ści
i m ogą z niej k orzystać nie tylko
stu d e n ci, ale w szyscy, k tó rzy chcą
u p ięk sz y ć sw oje o g ro d y lub działki
o raz w zbogacić sw oją d ietę i zadbać
o zd ro w ie .
POD REDAKCJĄ TERESY
WESOŁOWSKIEJ
125
C E N T R A L E U R O P E A N C O N G R E S S OF L I F E
SCIENCES E U R OBI OTECH 2008
KRAKÓW, 1 7-19.1 0.2008
Central European
Congress of Life Sciences
Eurobiotech 2008
Leading Area: Red Biotechnology
Kraków, Poland, 17-19 October 2008
wspólnie
przez: P ol­
ską
F ede­
rację
Bio­
technologii,
U niw er­
sytet
Ja­
gielloński
(Wydział
B io c h e m ii,
Biofizyki i
B io te c h n o ­
logii
oraz
Collegium
M e d ic u m ) ,
Akademię
Rolniczą w
Krakowie
oraz Targi
N a jesieni tego roku o rg a n iz o w a ­
ny jest Central European Congress
of Life Sciences EUROBIOTECH
2008, którego tem atem p rz e w o d n im
będzie tzw. „czerw ona biotechnolo­
gia"; na kongresie zostaną p o ru s z o ­
ne tem aty z w iązane z biotechnologią
m edyczną i farm aceutyczną, biofar-
macją, biom ateriałam i i żyw ieniem .
K ongres zostanie z o rg a n izo w an y
126
w K rakow ie sp. z o.o. Do w sp ó łp ra ­
cy przyłączyło się rów nież Jagielloń­
skie C en tru m Innowacji oraz K ra­
kow ski K laster Life Science.
w ych w y k ład ó w i prezentacji z b iz ­
nesem . W w ystaw ie tow arzyszącej,
oprócz firm z sek tora „Biotech",
w ezm ą rów nież u d z ia ł firm y p a te n ­
towe, firmy d oradcze, fu n d u sz e in­
westycyjne. N a u k o w y m w y k ła d o m
tow arzyszyć będą ró w n ież panele
dyskusyjne, sp otkan ia i w arszta ty
biznesow e.
Tematy dyskutow ane w trakcie
Kongresu i Targów będą zorganizo­
w ane w 7 panelach:
— Biotechnologii Medycznej,
— Biotechnologii Farmaceutycznej,
— N utrigenom iki (Jedzenie dla ży­
cia),
— Biomateriałów,
— Biotechnologii Zw ierząt,
— Praw własności intelektualnej i
czerwonej biotechnologii,
— Finansow ania b adań naukow ych
ze źródeł pryw atnych.
W kw ietniu 2007 roku, odbyła
się w K rakow ie I M ięd z y n a ro d o w a
Konferencja i Targi Biotechnolo­
gia w Rolnictw ie EUROBIOTECH
2007. Konferencja ta okazała się d u ­
ż ym sukcesem ; w zięło w niej udział
p raw ie 400 u czestników z kraju i
z agranicy oraz 30 firm z bran ży bio­
technologicznej. Mając na u w a d z e
p o w o d z e n ie pierw szej edycji oraz
coraz w iększe zain tereso w an ie te­
m atem w kraju i na świecie, o rg an i­
z ato rzy p ostanow ili ten projekt ro z ­
wijać. O rg an izato rzy p ra g n ą w łą ­
czyć do w sp ó łp racy najw ażniejsze
o środ ki biotechnologiczne z E uropy
Środkow ej i stw orzy ć p ra w d z iw ą
platform ę sp o tk ań z p a rtn e ra m i z
inn ych krajów. Swój ak ty w n y udział
w im prezie z a p o w ied ziała Słowacka
A k adem ia N a u k oraz środow iska
biotechnologiczne z Czech, Litw y i
U krainy.
Z a p ra sz a m y d o K rak ow a. Szcze­
gółow e inform acje m o ż n a zn aleźć
n a stronie in tern eto w ej w w w .b io -
W zam yśle O rg a n iza to ró w K on­
gres będzie połączeniem n a u k o ­
tech n o lo g ia.k rak o w .p l lu b
e u ro b iotech.krakow .pl.
http://rcin.org.pl
www.
w w w .po step yb iochem ii.p l
NOWE
GENY
A g n ieszk a D ettlaff-Pokora
Julian Św ierczyński
K atedra i Z akład Biochemii A kadem ii Me­
dycznej w G dańsku, ul. Dębinki 1, 80-811
G dańsk, tel. 058 349 14 60; e-mail: agnieszka_dettlaff-pokora@ am g.gda.pl
A rtykuł n adesłano i przyjęto do d ru k u 21
kw ietnia 2008 r.
S łow a kluczow e: m iażdżyca, polim orfizm
P odziękow ania: Praca pow stała w ram ach
realizacji pracy statutow ej ST-41
Jednym z głównych czynników
rozwoju m iażdżycy jest akumulacja
lipoprotein o niskiej gęstości (LDL)
w ścianach naczyń krw ionośnych
prow adząca do pow staw ania blasz­
ki miażdżycowej, a w konsekwencji
— do zaw ału mięśnia sercowego. Ry­
zyko zawału mięśnia sercowego jest
bezpośrednio zw iązane ze stężeniami
lipoprotein w osoczu. Wysokie stęże­
nie cholesterolu LDL jest czynnikiem
ryzyka rozwoju choroby wieńcowej,
a w ysokie stężenie cholesterolu HDL
zmniejsza to ryzyko. Zm iana stęże­
nia cholesterolu LDL w e krwi o 1%,
zwiększa o 1% ryzyko choroby w ień­
cowej. Z kolei wyższe stężenie chole­
sterolu HDL w e krwi o 1% pow oduje
obniżenie ryzyka choroby wieńcowej
o 2%. Tak silna zależność pom iędzy
stężeniem cholesterolu (HDL i LDL)
a ryzykiem choroby wieńcowej spra­
wia, że wszelkie czynniki w pływające
na stężenie cholesterolu w lipoproteinach osocza mają duże znaczenie w
rozwoju choroby wieńcowej. O prócz
cholesterolu do podstaw ow ych czyn­
ników ryzyka choroby wieńcowej naj­
częściej zalicza się wysokie stężenie
triacylogliceroli w osoczu. Do po d sta­
w ow ych czynników etiologicznych
wpływających na stężenia triacylo­
gliceroli i cholesterolu (LDL i HDL)
w osoczu należą: palenie papierosów,
w ysokokaloryczna dieta i mała aktyw ­
ność fizyczna. Obserwuje się także ro­
dzinne skłonności do w ystępow ania
choroby wieńcowej, determ inow ane
przez czynniki genetyczne. Przykła­
dem tego m oże być genetycznie u w a ­
run kow ana niepraw idłow a funkcja
receptora LDL, lipazy lipoproteinowej oraz w arianty polimorficzne ge­
P ostępy Biochemii 53 (2) 2007
ZWIĄZANE
Z MIAŻDŻYCĄ
nów zaangażow anych w m etabolizm
lipidów [1],
Jak dotąd poszukiw ania now ych
w ariantów polimorficznych koncen­
trowały się na badaniu pojedynczych
genów i były prow adzone na stosun­
kowo niedużych populacjach. W luto­
w ym num erze czasopisma Nature Ge­
netics ukazały się trzy prace, w których
przeanalizow ano około 50 000 osób
pod kątem setek tysięcy pojedynczych
polim orfizm ów genowych (SNP —
Single Nucleotide Polymorphism) [2-4],
Analizie p o d dano wyselekcjonowane
polimorfizmy, położone w obrębie
genów zw iązanych z m etabolizm em
lipidów oraz polimorfizmy związane
z patogenezą chorób metabolicznych.
Wyniki te zestawiono z danym i kli­
nicznymi pacjentów, takimi jak stę­
żenia cholesterolu HDL, cholesterolu
LDL i stężenia triacylogliceroli we
krwi. Analizy statystyczne potw ier­
dziły udział SNP-ów w ponad tuzinie
genów już wcześniej podejrzew anych
o zw iązek ze zm ianam i stężeń chole­
sterolu HDL i cholesterolu LDL oraz
stężeniami triacylogliceroli w osoczu.
Ponadto, odkryto zw iązek pom iędzy
stężeniami cholesterolu LDL i cho­
lesterolu HDL oraz triacylogliceroli
w osoczu a polim orfizm em siedmiu
now ych genów przedstaw ionych w
Tabeli. Odkrycie to otw iera na now o
dyskusję nad w p ływ em dziedzicze­
nia skłonności do zachorow ania na
choroby sercowo-naczyniowe (Tabe­
la 1).
Jednym z tych genów jest MLXIPL
(ang. Max Like Protein Interacting Pro­
tein-Like), kodujący czynnik transkrypcyjny ChREBP (ang. Carbohydrate
Responsive Element Binding Protein),
należący do rodziny bHLH Z (ang.
basic Helix-Loop-Helix Leucine Zipper).
Aktywność tego czynnika jest zależna
od jego możliwości transportu do ją­
dra komórkowego. W formie ufosforylowanej czynnik ten jest nieaktyw ­
ny, poniew aż nie przechodzi do jądra
kom órkowego. Z kolei defosforylacja
tego czynnika pow oduje jego aktyw a­
cję (transport do jądra kom órkow e­
go). Defosforylacja ChREBP jest ka­
talizow ana przez fosfatazę białek 2A
(PP2A) aktyw ow aną w ysokim i stęże­
http://rcin.org.pl
niami glukozy, a precyzyjniej — przez
powstający z glukozy ksylulozo 5-fosforanu. Nieufosforylow any ChREBP
przem ieszcza się do jądra kom órko­
wego, gdzie ulega dimeryzacji, a n a­
stępnie wiąże się z sekwencją ChoRE
(ang. Carbohydrate Response Element),
obecną w prom otorach genów ko d u ­
jących enzym y lipogenezy, glikolizy
1 sekrecji lipoprotein. W ydaje się, że
jeden w w ariantów polimorficznych
(rs799160 Gln241His) w obrębie genu
MLXIPL m oże aktywow ać transkryp ­
cję genów enzym ów lipogennych, a w
konsekwencji — w pływ ać na stęże­
nie triacylogliceroli oraz cholesterolu
HDL w osoczu jak rów nież p ro w a­
dzić do otyłości.
Ze stężeniem cholesterolu LDL
pow iązano także gen SORT1, k o d u ­
jący sortilinę, białko zaangażow ane
w procesy sortow ania białek w ap a­
racie Golgiego. Sortilina bierze udział
w procesach endocytozy i degradacji
lipazy lipoproteinowej, katalizującej
rozkład triacylogliceroli zaw artych
w lipoproteinach (głównie w chylom ikronach i VLDL), co sugerowałoby
raczej zw iązek genu SORT1 ze zm ia­
nam i stężeń triacylogliceroli w oso­
czu, a nie stężeniem cholesterolu LDL
(Tabela 1).
Geny M V K i MM AB, kodujące
odpow iednio kinazę m ew alonianu i
adenozylotransferazę ATP : kobalamina, pozostają pod kontrolą w spól­
nego
prom otora,
aktyw ow anego
przez czynnik transkrypcyjny SREBP2 (ang. Sterol Regulatory Element Binding Protein 2). Czynnik transkryp­
cyjny SREBP-2 kontroluje syntezę ge­
nów zw iązanych przede wszystkim
z syntezą cholesterolu. Gen GALNT2
koduje
galaktozoam inotransferazę
(UDP-N-acetylo-a-D-galaktozoamino:
N-acetylogalaktozoamino transferazę
polipeptydow ą 2), katalizującą pro­
cesy glikozylacji apolipoprotein, re­
ceptorów lipoprotein i lipaz. Lipaza
nabłonkow a (EL), jeden z substratów
galaktozyloam inotransferazy, jest glikozylow ana w kilku miejscach. Glikozylacja EL zmienia jej aktywność i
specyficzność wobec poszczególnych
frakcji HDL (HDL,, HDL,, HDL3). Gen
ANGPTL3 koduje białko podobne do
127
Tabela 1. Nowe geny, w których znaleziono SNP, związne ze stężeniami triacylogliceroli i lipoprotein.
Najbliższy
gen (geny)
Polimorfizm
Lokalizacja SNP
rs!7145738
m iędzygenow y
MLXIPL,
(BCL7B, TBL2)
SORT1, (CELSR2,
PSRC1)
rs799160
eksonow y
rs646776
rs599838
m iędzygenow e
Powiązanie ze
Funkcja białka
stężeniem triacylogliceroli
stężeniem cholestrolu HDL
czynnik transkrypcyjny, aktyw uje
geny zw iązane z lipogenezą,
glikolizą i sekreqą lipoprotein
[2,3]
stężeniem cholesteolu LDL
białko uczestniczące w procesie
sortow ania białek w aparacie Golgiego
[3,4]
[3]
[3,4]
M VK, M M A B
rs2338104
intronow y
stężeniem cholestrolu HDL
MVK — kinaza m ew alonianu, enzym
szlaku syntezy cholesterolu
MMAB — adenozylotransferaza
A TP:kobalam ina
GALNT2
rs4846914
intronow y
stężeniem triacylogliceroli
stężeniem cholesterolu HDL
galaktozoam inotransferaza
glikozylująca apolipoproteiny,
receptory lipoprotein i lipazy
ANGPTL3,
(DOCK7, ATG4C)
rs!2130333
m iędzygenow y
stężeniem triacylogliceroli
horm on p e ptydow y obniżający aktyw ność
lipaz endotelialnej i lipoproteinow ej
NCAN, (CUP2,
PBX4)
r s l 6996148
m iędzygenow y
stężeniem triacylogliceroli
stężeniem cholesterolu LDL
proteoglikan w ystępujący w
centralnym układzie nerw ow ym
[3.4]
TRIB1
rs!7321515
poniżej 3'
stężeniem triacylogliceroli
receptor sprzężony z białkam i G
[3.4]
angiopoetyny-3, zw iązane z m etabo­
lizmem lipidów. Białko to jest synte­
tyzow anym i w ydzielanym przez w ą­
trobę horm onem regulującym oprócz
m etabolizm u lipidów, hom eostazę
glukozy i wrażliwość na insulinę. O b­
niża ono aktyw ność lipazy lipopro­
teinowej i EL. Obniżenie aktywności
obu lipaz prow adzi do w zrostu stęże­
nia triacylogliceroli w osoczu.
Związek dw óch kolejnych białek z
patogenezą chorób sercowo-naczyniow ych jest niejasny. Gen N C A N koduje
neurocan, proteoglikan występujący
w dużych ilościach w ośrodkow ym
układzie nerw ow ym i zaangażow any
w procesy adhezji i migracji komórek.
G en TRIB1 koduje sprzężony z biał­
kami G receptor, zaangażow any w re­
gulację kinaz białkowych uczestniczą­
cych w procesie mitozy. Nie jest zna­
ny m echanizm w pływ u tych białek
na m etabolizm lipidów i w ęglow oda­
nów. Nie ulega jednak wątpliwości,
że polimorfizmy położone w pobliżu
kodujących je genów są zw iązane w
obu przypadkach ze zm ianam i stęże­
nia triacylogliceroli we krwi. Polim or­
fizm położony blisko genu N C A N jest
ponadto zw iązany ze stężeniem cho­
lesterolu LDL.
128
Podsumowując, dane przedstawio­
ne we wspomnianych pracach opubli­
kowanych w Naturę Genetics wskazują,
że ciągły rozwój technik biologii mole­
kularnej w powiązaniu z poznaniem
związków pomiędzy materiałem gene­
tycznym, a skłonnością do zachorowa­
nia na choroby sercowo-naczyniowe,
daje nadzieję na ich wczesne wykrycie.
Z kolei wczesne wykrycie tych zabu­
rzeń może w znacznym stopniu przy­
czynić się do zapobiegania wystąpienia
skutków tych zaburzeń (np. zawału
mięśnia sercowego). Zaprezentowane
w wymienionych pracach wyniki po­
winny być jednak traktowane ostroż­
nie, gdyż konieczne jest zbadanie w y­
stępowania tych samych związków na
różnych populacjach ludzkich. W obec­
nych czasach z uwagi na duże migracje
jest to bardzo trudne do oceny. Otwiera
się również na nowo dyskusja na temat
wpływ u polimorfizmów na funkcję po­
wstających białek (w wypadku siedmiu
opisanych powyżej białek polimorfi­
zmy w większości są położone poza
sekwencjami kodującymi).
PIŚMIENNICTWO
1. O rdovas J (2002) M ini-sym posium : Lipid
and protein disorders: biochem istry and
http://rcin.org.pl
,
'
m olecular genetics. Cardiovascular D rugs
and T herapy 16: 273-281
2. Kooner J, C ham bers J, Aguilar-Salinas C,
H inds D, H yde C, W am es G, Gom ez Perez
F, Frazer K, Elliot P, Scott J, Milos P, Cox D,
Thom son J (2008) Genom e-wide scan iden­
tifies variation in MLXIPL associated w ith
plasm a triglicerydes. N at Gen 40:149-151
3. W ilier C, Sanna S, Jackson A, Scuteri A,
Bonnycastle L, Clarke R, H eath A, Tim pson
N, Najjar S, Stringham H, Strait J, D uren
W, Maschio A, Busonero F, M ulas A, Albai
G, Swift A, M orken M, N arisu N, Bennett
D, Parish S, Shen H, Galan P, M eneton P,
H ercberg S, Zelenika D, Chen WM, Li Y,
Scott L, Scheet P, Sundw all J, W atanebe R,
Nagaraja R, Ebrahim S, Lawlor D, Ben-Shlom o Y, Davey-Smith G, Shuldiner A, Collins
R, Bergman R, U da M, Tuomilehto J, Cao
A, Collins F, Lakatta E, Lathrop G, Boehnke
M, Schlessinger D, M ohlke K, Abecasis G
(2008) N ew ly indentified loci that influence
lipid concentrations and risk of coronary
artery disease. Nat Gen 40:161-169
4. K athiresan S, M elander O, Guiducci C,
Surti A, Burtt N, Rieder M, Cooper G, Roos
C, Voight B, H avulinna A, W ahlstrand
B, H edner T, Corella D, tai E, O rdovas J,
Berglund G, Vartiainen E, Jousilahti p,
H edblad, Taskinen MR, N ew ton-Cheh C,
Salomaa V, Peltonen L, G roop L, A ltshuler
D, O rho-M elander M (2008) Six new loci
associated w ith blood low-density lipopro­
tein cholesterol, high-densiy lipoprotein
cholesterol or triglicerydes in hum ans. Nat
G en 40:189-197
w w w .postepybiochem ii.pl
Mitochondria w życiu, chorobie i śmierci komórki
STRESZCZENIE
om órce zw ierzęcej m ito ch o n d ria są głó w n y m m iejscem p ro d u k c ji ATP n iezb ęd n eg o
la p o trzeb energetycznych, a zatem praw id ło w eg o p rz eb ieg u pod staw o w y ch fu n k c ji
życiow ych. Z d rugiej strony, m ito ch o n d ria o dgryw ają kluczow ą rolę w in ic jo w a n iu p ro g ra­
m ow anej śm ierci k o m ó rk i (apoptozie). P onadto, w ady w g enom ie m ito c h o n d ria ln y m lu b
g e n o m ie jąd ro w y m kod u jący m b iałk a m ito c h o n d ria ln e m ogą być przyczyną pow ażnych za­
b u rz e ń fu n k c ji m ito c h o n d rió w i w efekcie — po d ło żem chorób całego o rganizm u. A rtykuł
zaw iera op is p o d staw o w y ch procesów biochem icznych zw iązanych z o ksydacyjną fosforyzacją oraz tw o rzen iem w olnych ro d n ik ó w tlenow ych. P rzed staw ia ró w n ież m echanizm y
in ic jo w a n ia ap o p to zy na p oziom ie m ito c h o n d ria ln y m i o p isu je najczęściej sp o ty k a n e w ady
gen ety czn e w a ru n k u jąc e w y stę p o w a n ie „chorób m ito ch o n d rialn y ch ".
WPROWADZENIE
M itochondria opisyw ane były już przez cytologów w drugiej połowie XIX
w ieku jako w ew nątrzkom órkow e ziarnistości o zm iennym kształcie i w ielko­
ści. Ich współczesna n azw a w yw odzi się z połączenie dw óch greckich słów rat­
ios, czyli nić, i chondrion, czyli ziarno. Obserwacja Leonora Michaelisa (1898),
że barw ią się one zielenią janusową, barw nikiem zmieniającym zabarwienie po
utlenieniu, zwróciły uw agę na udział tych organelli w kom órkow ych procesach
oksydacyjnych. Potwierdziły to kilkanaście lat później badania Otto W arburga
nad zużyciem tlenu przez frakcję ziarnistości kom órkow ych. Jednakże dopie­
ro opisana po raz pierw szy przez Alberta C laude'a (1940) m etoda izolowania
w zględnie czystych frakcji m itochondriów przez homogenizację tkanek i frak­
cjonowane w irow anie tak otrzym anego materiału otw orzyła szerokie m ożliw o­
ści dla b adań nad biochemicznymi właściwościami tych organelli i ich rolą w
funkcjonow aniu komórki.
Lech Wojtczak
Krzysztof Zabłocki
Z akład Biochemii, Instytut Biologii D ośw iad­
czalnej im. M arcelego Nenckiego, W arszaw a
Z akład
Biochemii,
Instytut
Biologii
D ośw iadczalnej im. M arcelego Nenckiego,
ul. Pasteura 3, 02-093 W arszaw a; tel. (022) 589
23 15; e-mail; l.w ojtczak@ nencki.gov.pl
A rtykuł otrzym ano 2 kw ietnia 2008 r.
A rtykuł zaakceptow ano 21 kw ietnia 2008 r.
Słow a kluczow e: apoptoza, choroby m ito­
chondrialne, łańcuch oddechow y, m itochon­
dria, oksydacyjna fosforylacja, reaktyw ne for­
m y tlenu, syntaza ATP
W ykaz skrótów : P — fosforan nieorganicz­
ny; SOD — dysm utaza ponadtlenkow a; Ap
— różnica elektrochem icznego potencjału
protonow ego (siła protonom otoryczna); ApH
— gradient pH; Aip — różnica potencjału elek­
trycznego
Począw szy od tych wczesnych prac na przełomie XIX i XX stulecia m itochon­
dria identyfikow ane są głównie z ich funkcją w oddychaniu kom órkow ym , a
od czasu wykrycia oksydacyjnej fosforylacji (lata 30. i 40. XX wieku) — także
jako głów ne miejsce syntezy ATP, niezbędnego dla potrzeb energetycznych ko­
mórki. Dość w cześnie w ykryto także, że m itochondria są miejscem niektórych
w ażnych procesów metabolicznych, np. m itochondria w ątroby — niektórych
etapów syntezy glukozy i mocznika. W ten sposób przez cały niemal wiek XX
traktow ano m itochondria jako organella niezwykle istotne dla życia komórki.
Jakież było zatem nasze zdum ienie, gdy w ostatnich dosłownie latach m inione­
go stulecia okazało się, że m itochondria są także niezbędne, by kom órka mogła
w sposób zaprogram ow any... umrzeć! A jeszcze nieco wcześniej zidentyfikow a­
no m itochondria jako źródło, na szczęście rzadkich, lecz niezwykle groźnych i
dotychczas nieuleczalnych chorób o podłożu genetycznym. Celem niniejszego
artykułu jest przedstaw ienie podstaw owej w iedzy na tem at tej trojakiej funkcji
m itochondriów .
MORFOLOGIA
M ikroskopia elektronow a zarów no ultracienkich skraw ków tkanek, jak i
izolowanych m itochondriów, pokazuje je jako okrągłe lub owalne struktury o
rozm iarach od ułam ka m ikrom etra do kilku m ikrom etrów . Z ew nętrzna błona
oddziela m itochondrium od cytosolu, w ew nętrzna zaś tw orzy liczne w puklenia zw ane grzebieniami m itochondrialnym i (łac. cristae). W ten sposób zostają
w yodrębnione dw ie przestrzenie, przestrzeń m iędzybłonow a i przestrzeń w e ­
w nętrzna, zawierająca macierz mitochondrialną. Kształt grzebieni i sposób ich
„upakow ania" byw a różny i często charakterystyczny dla danej tkanki [1], Ta
różnorodność jest odzw ierciedleniem roli, jaką m itochondria odgryw ają w kon­
kretnej tkance. Tam, gdzie są one głównie dostarczycielami energii pod postacią
ATP (np. w mięśniach i nerce), błona w ew nętrzna i grzebienie zajmują pokaźną
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
129
Rycina 1. Poró w nanie u ltrastru k tu ry m ito chon driów w ą troby i m ięśnia. A, W ątroba szczura. G rzebienie m itoch ond rialne nieliczne. P o nadto w idoczne są: frag m en t jądra
i siateczka śródp lazm aty czna. B, M ięsień szkieletow y szczura. Całe w nętrze m itochondriów w ypełniają liczne, gęsto u p a k o w an e grzebienie. Zdjęcia z m ikroskop u elek­
tronow ego w y kon an e przez (A) prof. Elżbietę W yrobę, (B) d r hab. A nnę jakubiec-Pukę (Instytut Biologii D ośw iadczalnej im. M. N enckiego, W arszaw a).
część przestrzeni organelli. N atom iast w tkankach, w któ­
rych m itochondria włączają się w różne procesy metabo­
liczne, jak na przykład w wątrobie, grzebienie są nieliczne,
natom iast praw ie całą objętość organelli w ypełnia macierz
(Ryc. 1).
D w uw ym iarow y obraz, jaki z natury rzeczy uzyskuje­
my przy pom ocy m ikroskopu elektronowego, jest odbiciem
bardziej skomplikowanej sytuacji w żywej komórce. Po
pierwsze, liczne profile, dające w rażenie odrębnych mito­
chondriów, m ogą w istocie być przekrojami rozgałęzień
tego samego organellum. Dopiero tak zw ane „skrawki se­
ryjne" m ogą ujawnić ich w zajem ne powiązanie. U w aża się
nawet, że niektóre drożdże i pierw otniaki m ogą zawierać
jedno gigantyczne, rozgałęzione m itochondrium . Po drugie,
przyżyciow e obserwacje, w szczególności z zastosow aniem
barw ników fluorescencyjnych, wykazały, że m itochondria
są strukturam i niezwykle dynam icznym i, zmieniającymi
swój kształt, a co więcej — w y ­
kazującymi tendencję do łącze­
nia się i rozdzielania. W rezulta­
cie m ożna mówić raczej o dy na­
micznej, będącej w nieustannym
ruchu, bogato rozgałęzionej sieci
mitochondrialnej (Ryc. 2).
OKSYDACYJNA
FOSFORYLACJA
Rycina 2. Sieć m itochondrialna. K om órki ludzkiego now o tw oru, osteosarcoma, barw ione znacznikam i fluoryzującymi:
na m itochondria (czerw onym — M itoTracker CMXRos), n a w łókna aktyny (zielonym — phalloidin-FITC) i n a jądro (nie­
bieskim — DAPI). O dcinek od p o w iad a 12 pm. A, Linia ko m órkow a norm alna (szczep „dziki"). B, Linia kom órkow a o°
(pozbaw iona m itochondrialnego DNA). W idoczne różnice w stru k tu rze sieci m itochondrialnej. Zdjęcie z m ikroskopu flu­
orescencyjnego w ykonane przez d r J. Szczepanow ską (Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, W arszaw a).
130
http://rcin.org.pl
Jako główną funkcję mito­
chondriów uw aża się pow szech­
nie produkcję ATP, a ściślej
— zamianę swobodnej energii
procesów utleniania na energię
wiązania bezw odnikowego po­
między dw iem a resztami kwasu
fosforowego w cząsteczce adenozynotrifosforanu (ATP) [2,3],
w w w .postepybiochem ii.pl
Oksydacyjną fosforylację można rozpatrywać jako dw a od­
rębne procesy biochemiczne: utlenianie substratów odde­
chowych i fosforylację ADP do ATP przy udziale fosforanu
nieorganicznego. Pierwszy z tych procesów dostarcza energii
chemicznej, drugi ją zużywa. M aterialnym podłożem obu jest
w ew nętrzna błona mitochondrialna w raz z jej w pukleniam i
do przestrzeni wewnętrznej, czyli „grzebieniami". Błona ta
wyróżnia się spośród innych błon biologicznych wysoką za­
wartością białka (80%) w stosunku do fosfolipidów. A w śród
tych ostatnich zwraca uw agę znaczna zawartość kardiolipiny, fosfolipidu występującego w zasadzie tylko w błonie
wewnętrznej mitochondriów. Jego cząsteczka zawiera trzy
reszty glicerolu i cztery reszty kw asów tłuszczowych, głów­
nie linolenowego.
W ew nętrzna błona m itochondrialna charakteryzuje się
bardzo ograniczoną przepuszczalnością dla większości w y ­
stępujących w komórce zw iązków chemicznych. Sw obod­
nie przechodzić przez nią m ogą cząsteczki wody, słabe hydrofilne kw asy (np. octowy) i rozpuszczalne w w odzie gazy
(np. tlen i amoniak), a także substancje lipofilne. Większość
m etabolitów kom órkowych, w tym aniony kw asów di- i trikarboksylow ych (a w śród nich rów nież substraty oddecho­
we) oraz jony nieorganiczne, w tym jon fosforanowy oraz
kationy K+ i N a+, są przenoszone przez błonę w ew nętrzną
wyłącznie przez specjalne białka transportow e lub przeni­
kają poprzez specyficzne kanały błonowe. N a podkreślenie
zasługuje także w ysoka nieprzepuszczalność w ew nętrznej
błony wobec jonu w odorow ego H +, cecha szczególnie istot­
na z uw agi na rolę m itochondriów w przem ianach energe­
tycznych.
Oksydacyjną fosforylację możemy rozpatrywać jako
współdziałanie dw óch pom p protonowych, zlokalizowanych
w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Pom py te są zdolne
transportować jony H +z przestrzeni macierzy mitochondrial­
nej do przestrzeni międzybłonowej (skąd dalej mogą one dyfundować do cytosolu). Jedną z tych pom p jest łańcuch od ­
dechowy jako całość, czyli zespół enzym ów oksydoredukcyjnych, które — w raz z odpow iednim i koenzymami — biorą
udział w transporcie elektronów z substratów oddechowych
na tlen cząsteczkowy. Druga pompa, to mitochondrialna
ATP-aza, która energię sw obodną hydrolizy ATP w ykorzy­
stuje do w yprow adzenia jonów H + w tym sam ym kierunku,
to jest z wnętrza mitochondriów na zewnątrz. Doniosłość od­
krycia Petera Mitchella [4], twórcy chemiosmotycznej teorii
oksydacyjnej fosforylacji (Nagroda Nobla w 1978 r.), polegała
na zrozumieniu, że obie pom py są odwracalne. Inaczej m ó­
wiąc, odpow iednio wysoki gradient stężenia jonów H + jest
zdolny odwrócić kierunek działania każdej z tych pomp. W
przypadku pom p protonowych łańcucha oddechow ego jest
to tak zw any odw rotny transport elektronów, np. redukcja
N A D +przez ubichinol (zredukowany koenzym Q), a w przy­
padku ATP-azy — synteza ATP z produktów jego hydrolizy,
czyli ADP i P. Właśnie ta ostatnia pom pa w normalnie funk­
cjonujących komórkach pracuje w trybie odwróconym, czyli
syntetyzuje ATP kosztem elektrochemicznego potencjału
protonowego. Działa więc nie jako hydrolaza ATP, lecz jako
s y n t a z a ATP (Ryc. 3).
W spom niany tu „elektrochemiczny potencjał pro ton o­
w y" [2,3], inaczej zw any siłą protonom otoryczną (Ap), jest
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
Rycina 3. Schem atyczne o dzw ierciedlenie istoty „chem iosm otycznej" koncepcji
oksydacyjnej fosforylacji. Pom py pro to n o w e łańcucha oddechow ego, działające
w obrębie kom pleksów o dd echow ych I, III i IV, b u d u ją elektrochem iczny gra ­
dient p ro tono w y (siłę proto nom o to ryczną, Ap) po obu stronach w ew nętrznej
błony m itochondrialnej. G ra d ie n t ten stanow i siłę spraw czą odw róconego dzia­
łania A TP-azy F1Fo, czego efektem jest synteza ATP. R eprodukcja z [19] za zgod ą
redakcji.
sum ą dw óch składowych, elektrycznej i stężeniowej (ina­
czej zwanej chemiczną). Chodzi o to, że strum ień jonów H +,
w padający do wew nętrznej przestrzeni m itochondriów i
dostarczający energii dla syntezy ATP, napędzany jest dw ie­
m a siłami, gradientem stężenia tych jonów (wyższe stężenia
na zew nątrz w ew nętrznej błony mitochondrialnej), inaczej
mówiąc gradientem pH (ApH), i potencjałem elektrycznym
(Aip, dodatnim na zewnątrz), co zapisujemy w postaci w zo­
ru podanego poniżej.
Ap = Aip — ApH
Z nak m inus przy ApH m a czysto form alne znaczenie,
poniew aż różnica p H m iędzy przestrzenią zew nętrzną
(niższe pH) a przestrzenią w ew n ątrzm ito cho ndrialną
(wyższe pH) jest liczbowo ujemna. W m aksym alnie zenergizow anych m itochondriach zwierzęcych składow a
elektryczna, Aip, w ynosi zazwyczaj 180-200 mV, składow a
chem iczna zaś tylko około 0,5 jednostki pH , co w przeli­
czeniu o d p o w iad a około 30 mV. P róbow ano ocenić wiel­
kość energii zakum ulow anej w m itochondriach w formie
potencjału elektrochem icznego. Bardzo przybliżone obli­
czenia [5] dały dla m itochondriów w ątroby wartość około
130 pj (m ikrodżuli) na m g białka m itochondrialnego, co
od p o w ia d a 3,3 nm oli ATP. Taką ilość ATP zdolne byłyby
w y p ro d u k o w a ć w pełni „zenergizow ane" m itochondria,
gdyby nagle pozbaw ić je dalszego d o p ły w u substratów
oddechow ych lub tlenu.
W istocie oksydacyjna fosforylacja jest procesem ciągłym,
a funkcjonujący łańcuch oddechow y utrzym uje siłę proto­
nom otoryczną na stałym, w przybliżeniu, poziomie. Dzieje
się to za spraw ą po m p protonow ych napędzanych energią
procesów oksydoredukcyjnych, czyli transportem elektro­
nów w zdłuż elem entów łańcucha oddechow ego. Badania
ostatnich kilkudziesięciu lat pozwoliły wyróżnić w łańcu­
chu oddechow ym cztery w ieloenzym atyczne kom plek­
http://rcin.org.pl
131
P roduktem pośrednim jest ubisemichinon, w olnorodnikow y produk t jednoelektronowej redukcji ubichinonu, który
ulega przemieszczeniu m iędzy zew nętrzną a w ew nętrzną
stroną w ew nętrznej błony mitochondrialnej. Reakcji prze­
niesienia pary elektronów przez kompleks III tow arzyszy
w ypom pow anie 4 protonów.
Rycina 4. M itochondrialny łańcuch o d d ech ow y i z w iązan e z n im p o m py proto ­
now e. R ysow ał d r M. R. W ięckow ski (Instytut Biologii D ośw iadczalnej im. M.
N enckiego, W arszaw a). R eprodukcja z [6] za zg odą w ydaw cy.
sy, stanowiące zarazem integralne jednostki funkcjonalne
(Ryc. 4).
Kompleks I, określany również jako oksydoreduktaza
NADH-ubichinon, jest największym i najbardziej złożonym
kompleksem łańcucha oddechowego [7]. Składa się on z 43
łańcuchów peptydowych, a jego centrum katalityczne zawie­
ra m ononukleotyd flawinowy (FMN) i kilka kompleksów żelazowo-siarkowych. Kompleks I zawiaduje utlenianiem całej
puli wewnątrzm itochondrialnego NADH, pochodzącego z
działania rozmaitych dehydrogenaz. Akceptorem elektro­
nów jest zaś ubichinon, utleniona forma koenzym u Q. Prze­
niesieniu pary elektronów przez kompleks I z N A D H na ko­
enzym Q towarzyszy w ypom pow anie 4 protonów z wnętrza
m itochondrium do przestrzeni zewnętrznej.
Kompleks II, zlokalizowany po wewnętrznej stronie we­
wnętrznej błony mitochondrialnej, jest również określany
jako kompleks dehydrogenazy bursztynianowej [8], Jest to
jedyna dehydrogenaza uczestnicząca w cyklu kwasów trikarboksylowych (cyklu Krebsa), będąca białkiem błonowym,
a nie rozpuszczalnym. Jego grupą prostetyczną jest dinukleotyd flawinowo-adeninowy (FAD). Ponadto zawiera centra
żelazowo-siarkowe. Ten złożony układ przenosi atomy wo­
doru z bursztynianu na koenzym Q. Funkcjonowaniu kom­
pleksu II nie towarzyszy pom pow anie protonów.
Zredukow any na kompleksie III, cytochrom c ulega utle­
nieniu na kompleksie IV zw anym rów nież oksydazą cytochrom ow ą [10-12]. W m itochondriach ssaków kom pleks
ten składa się z 13 podjednostek, przy czym tylko dw ie z
nich bezpośrednio uczestniczą w przeniesieniu elektronu.
Zawierają one dw ie grupy hemowe, cytochrom y a i ay i
dw a atom y miedzi. Przeniesieniu dw óch elektronów przez
ten system tow arzyszy w ypom pow anie tylko dw óch p ro ­
tonów. Jednakże owe dw a elektrony neutralizują pozostałe
dw a protony po wewnętrznej stronie błony m itochondrial­
nej i, łącząc się z atom em tlenu, tw orzą cząsteczkę w ody.
W ten sposób kończy się droga pary elektronów pochodzą­
cych z substratu oddechow ego i następuje redukcja tlenu
cząsteczkowego do wody, a jednocześnie po obu stronach
wew nętrznej błony mitochondrialnej tw orzy się gradient
stężenia jonów H + i różnica ładunków elektrycznych, dając
w sumie to, co wcześniej określiliśmy jako elektrochem icz­
ny potencjał protonow y, Ap.
Syntazę ATP, wykorzystującą ten potencjał do tw orzenia
ATP, niektóre opracow ania określają m ianem kom pleksu V,
podkreślając tym sam ym jej funkcjonalny zw iązek z p o m p a ­
mi protonow ym i kom pleksów I, III i IV. Jest to pokaźnych
rozm iarów kompleks białkowy, dający się obserw ow ać w
mikroskopie elektronow ym jako „grzybkow ate" struktury
rozmieszczone gęsto po w ew nętrznej stronie w ew nętrznej
błony mitochondrialnej (Ryc. 5). Klasyczne już dośw iadcze­
nia Efraima Rackera [13] (patrz również [14]) w ykazały, że
cząstki subm itochondrialne pozbaw ione ow ych struk tur
traktow aniem trypsyną zachowują pełną aktyw ność o d d e ­
chową, lecz nie są zdolne do syntetyzow ania ATP. N ato­
miast izolowane struktury wykazują aktyw ność hydrolazy
Koenzym Q, czyli ubichinon, jest niskocząsteczkow ym
przenośnikiem ró w n ow ażnikó w redukcyjnych, który
m oże się sw obodnie przem ieszczać w lipidowej w arstw ie
w ew nętrznej błony m itochondrialnej i w ten sposób po­
średniczy w transporcie elektronów m iędzy kom pleksam i
I i II, jako donoram i, a kom pleksem III, jako akceptorem
elektronów . Ubichinon jest rów nież akceptorem elektro­
nów dla niektórych innych dehydrogenaz, jak na przykład
d eh ydro genazy a-glicerofosforanu i flaw oproteiny prze­
noszącej elektrony, biorącej udział w utlenianiu kw asów
tłuszczowych.
Kompleks III, określana jako oksydoreduktaza ubichinol-cytochrom c, jest dim erem , w którym każdy monomer
składa się z 11 podjednostek [9], Zawiera rów nież trzy
gru py hem ow e (dwie typu cytochrom u b i jedną cytochrom u q) oraz centrum żelazowo-siarkowe (białko Rieske'go).
Redukcja ubichinonu do ubichinolu jest dw ustopniow a.
132
Rycina 5. F ragm ent pękniętego m itocho ndrium . W idoczne są: frag m e n ty błony
zew nętrznej zaznaczone białym i strzałkam i o raz fragm enty grzebieni m itochondrialnych, na pow ierzchni których osadzone są kom pleksy F, m itocho ndrialnej
ATP-azy (syntazy ATP), p rz y k ła d o w o zaznaczone krótkim i czarn ym i strzałkam i.
Średnica kom pleksu Fj w yn osi około 10 nm . Zdjęcie z m ikro sko pu elek tro n o w e­
go p re p a ra tu barw ioneg o n egatyw ow o m olib denian em am onu w y k o n a n e przez
prof. P aulinę W łod aw er (Instytut Biologii D ośw iadczalnej im. M. N enckiego,
W arszaw a).
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
oksydacyjnej fosforylacji, zaproponow anej jeszcze w latach
siedem dziesiątych ubiegłego stulecia przez Paula D. Boyera
[17], lecz uaktualnionej badaniam i J. E. Walkera.
Dzięki tym odkryciom, za które obaj badacze wspólnie
otrzymali w 1997 r. N agrodę Nobla [20], dość dobrze m o­
żem y zrozum ieć przebieg oksydacyjnej fosforylacji. Wyso­
ka siła protonom otoryczna, w ytw orzona działaniem pom p
protonow ych łańcucha oddechow ego, n apędza pow rót jo­
nów H + do przestrzeni w ewnętrznej mitochondriów. Jedy­
nym miejscem, przez które taki pow rót jest możliwy, jest
kanał protonow y ulokow any w błonow ym sektorze kom ­
pleksu syntazy ATP, mianowicie w obrębie kom pleksu F .
Praw dopodobnie sekwencyjna protonacja i deprotonacja
usytuow anych tam podjednostek c pow oduje obrót zako­
twiczonej tam jednym końcem w ydłużonej podjednostki y.
Ta zaś, obracając się w przestrzeni utworzonej przez połą­
czone ze sobą podjednostki a i p, w ym usza zmiany prze­
strzennej struktury podjednostek p i zw iązane z tym zm ia­
ny pow inow actw a tychże do ADP i ATP. To zaś w efekcie
prow adzi do syntezy ATP, jak opisano wyżej.
Rycina 6. S tru k tu ra p o d jed nostk ow a m itochondrialnej A TP-azy (syntazy ATP).
K om pleks Fo, zakotw iczony w w ew nętrznej błonie m itochondrialnej, składa się
z pod jed n o stek a i b oraz tkw iących w lipidow ej w arstw ie błony 10 kopii podjednostki c. K om pleks Fj znajduje się na po w ierzch ni błony od stron y m acierzy
m itochondrialnej. Jego głów ny m i skład nik am i są 3 kopie pod jednostki a , 3 kopie
p odjedno stki (3 oraz jedna kopia po djednostki Strum ień protonów , w padający
do w n ę trz a m ito ch ond riu m przez kanał p ro tono w y u tw o rz o n y p rzez p o djed ­
nostki c, w yw ołuje ruch w iro w y po djednostki
co z kolei pow o duje zm iany
konform acyjne pod jedn ostek (3 i syntezę ATP. R ysow ał d r M. R. W ięckow ski (In­
sty tu t Biologii D ośw iadczalnej im. M. N enckiego, W arszaw a). R eprodukcja z [6]
za zg o d ą w ydaw cy.
ATP. Kluczowym odkryciem było wykazanie, że ponow ne
przyłączenie grzybkow atych struktur do fragm entów bło­
ny przyw racało im zdolność syntetyzow ania ATP kosztem
energii utleniania.
Obecnie wiemy [15-19], że kom pleks syntazy ATP składa
się z części hydrofilowej, właśnie owych „grzybków", o m a­
sie około 370 kDa, określanych jeszcze przez Rackera jako
„czynnik sprzęgający pierwszy" (F^, i części zanurzonej
w lipidowej w arstw ie w ew nętrznej błony, oznaczanej jako
F . W skład F1w chodzi pięć rodzajów łańcuchów peptydowych, oznaczanych kolejnymi greckimi literami a, (3, y, 5
i £. Trzy podjednostki a i trzy (3, usytuow ane przem iennie
wokół centralnie położonej podjednostki y, są głów nym i
strukturalnym i cegiełkami „czynnika sprzęgającego" Fr
Całość zakotwiczona jest w błonie przy udziale wysoce hy­
drofobow ych podjednostek a, b i c, tej ostatniej występującej
w 10 kopiach (Ryc. 6). Badania nad konformacją łańcuchów
peptydow ych wchodzących w skład Fy prow adzone głów ­
nie w laboratorium Johna E. Walkera [16,18], wykazały, że
centrum katalityczne, odpow iedzialne zarów no za syntezę
jak i hydrolizę ATP, zlokalizowane jest na podjednostce (3.
Podjednostka ta może przyjmować trzy różne konfiguracje
przestrzenne charakteryzujące się różnym pow inow actw em
do ADP, P i ATP. Konformacja O (ang. open) wykazuje niskie
pow inow actw o do ATP. Konformacja L (ang. loose) wiąże
słabo ADP i P . Natom iast konformacja T (ang. tight) mocno
wiąże te dw ie cząsteczki, prow adząc je do takiego zbliżenia,
że łączą się one ze sobą, tworząc ATP (Ryc. 7). Ta sekwencja
w ydarzeń stanowi istotę tak zwanej konformacyjnej teorii
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
Jak to już podkreślano, synteza ATP jest procesem od­
wracalnym . Przy braku siły protonomotorycznej lub w
p rzy p ad k u jej niskiej wartości proces zaczyna przebiegać
odw rotnie. ATP łączy się z podjednostką p, przez co w y m u ­
sza jej odpow iednią konformację. Następuje przyłączenie
cząsteczki w ody i rozpad na ADP i P , czemu tow arzyszy
dalsza zm iana konformacji, pow odująca obrót centralnie
położonej podjednostki y. To zaś, niby turbina, przepom ­
pow uje protony z w nętrza m itochondriów do przestrzeni
zewnętrznej. Układ taki m ożem y traktować jako m olekular­
ny silnik obrotowy. Pomysłowości japońskich badaczy [21]
zaw dzięczam y to, że działanie takiego silnika dało się zaob­
serwować. A utorzy ci mianowicie unieruchomili kompleks
F1na szkiełku m ikroskopow ym pow leczonym solami niklu,
wykorzystując wysokie pow inow actw o reszt histydynow ych do Ni. N astępnie do końca podjednostki y doczepili
cząsteczkę aktyny, która ma formę długiego łańcucha i do
której dołączono barw nik fluoryzujący (Ryc. 8). Dodanie
ATP pow odow ało obrotow y ruch tego łańcucha aktynow e­
go, co m ożna było obserw ować w mikroskopie fluorescen­
cyjnym (i na stronie internetowej w w w .k2.phys.w aseda.
a c .jp /F lm o v ie s/F lP ro p .h tm ).
Pomysłowość autorów poszła dalej. Zam iast nici aktyno­
wej doczepiono m ikrogranulkę magnetyczną, a następnie
przyłożono wirujące pole magnetyczne. W ten sposób w y ­
m uszono ruch obrotow y podjednostki y. Zmuszając ją do
w irow ania w kierunku przeciw nym niż ten, jaki obserwo­
w ano przy hydrolizie ATP, w ykryto pow staw anie zniko­
mych, lecz w ykryw alnych ilości ATP [22],
Rycina 7. K onform acyjny m odel oksydacyjnej fosforylacji P. D. Boyera [17]. O bja­
śnienia w teście. R eprodukcja z [19] za zgod ą redakcji.
http://rcin.org.pl
133
A nionorodnik, ze w zględu na swą dużą reaktywność
chemiczną, jest zw iązkiem wysoce cytotoksycznym. Prak­
tycznie wszystkie komórki organizm ów żyjących w w a ru n ­
kach tlenowych w ytw orzyły na drodze ewolucji m echani­
zm y ochronne, neutralizujące szkodliwe działanie wolnych
rodników tlenowych. I tak anionorodnik ponadtlenkow y, a
ściślej — jego uprotonow ana forma o wzorze H O ,', ulega
enzymatycznej dysmutacji (czyli redukcji jednej cząsteczki
przy jednoczesnym utlenieniu drugiej) w myśl reakcji p o ­
danej poniżej.
2 HO,
Rycina 8. M odyfikacja kom pleksu o ,P 3y um ożliw iająca b ezpośrednią obserwację
w m ikro sk opie fluorescencyjnym w irow an ia po djednostki y podczas hydrolizy
ATP. R eprodukcja z [16] za zgod ą redakcji N ature, co p y rig h t (1997) M acm illan
M agazines Ltd.
MITOCHONDRIA A REAKTYWNE FORMY TLENU
O pisan y w p o p rz e d n im ro zdziale łańcuch odd echow y
p ro w a d z i do zachodzącej na k om pleksie IV dw uelektronow ej redukcji ato m u tlenu (ściślej — d o czteroelektronow ej redukcji cząsteczki O,). P ow stały hipotetyczny
jon O 2- n aty ch m iast łączy się z d w o m a jonam i H +, dając
cząsteczkę w ody. Jednakże niew ielka ilość elektronów na
swej długiej d ro d z e od su b stra tu o d decho w eg o, poprzez
kom p leksy od decho w e, aż do o k sydazy cytochrom ow ej
„ w y m y k a się" z tego u ta rteg o szlaku, reagując z tlenem
c ząsteczkow ym w m echanizm ie redukcji jednoelektronowej. Pow staje w ten sposób cząsteczka zaw ierająca niesp a ro w a n y elektron, czyli w o lny ro d n ik O,'*, określany
chem icznym term in em anionorodnika ponadtlenkowego.
Przyjm uje się, że około 1% tlenu zu ży w an eg o przez tk a n ­
ki zw ierzęce ulega p rzem ian ie na tej drodze.
h 2o 2 + o2
Pow yższą reakcję katalizuje dysm utaza ponadtlenkow a
(SOD), występująca zarów no w mitochondriach, jak i w cytosolu, w każdym z tych w ew nątrzkom órkow ych przedzia­
łów w postaci innego izoenzymu. D ysm utaza znajdująca
się w przestrzeni macierzy mitochondrialnej zawiera atom
m anganu (MnSOD), natom iast dysm utaza cytosolowa za­
wiera atom y miedzi i cynku (CuZnSOD). U w aża się, że en­
zym ten w ystępuje rów nież w przestrzeni międzybłonowej
i to w formie identycznej jak w cytosolu, a więc CuZnSOD.
Powstały w w yniku dysmutacji nadtlenek w odo ru H ,0 , nie
jest w praw d zie w olnym rodnikiem , lecz z uw agi na swą
reaktyw ność chemiczną zaliczany jest, łącznie z anionorodnikiem ponadtlenkow ym , do tak zw anych reaktywnych
form tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS) [23]. Do tej g ru ­
py zw iązków należy również w olny rodnik hydroksylow y
HO*. Powstaje on z nadtlenku w odoru w obecności dw uwartościowych jonów żelaza i jest chemicznie niezwykle
agresywny. Do reaktyw nych form tlenu zaliczamy także
ozon 0 3 oraz tlen singletowy 30 2. Ten ostatni powstaje w
niektórych reakcjach fotochemicznych.
Głów nym i miejscami pow staw ania anionorodnika po­
nadtlenkow ego są kom pleksy oddechow e I i III [24-29], W
kompleksie I jest to praw dop odob nie jedno z ug ru p o w ań
żelazowo-siarkowych.
Po­
wstający anionorodnik ulega
w ydzieleniu do wewnętrznej
przestrzeni mitochondrialnej.
W kompleksie III utlenianie i
redukcja koenzym u Q prze­
biega poprzez stadium semichinonu, który sam jest w ol­
nym rodnikiem i, reagując z
cząsteczką O,, może przyczy­
niać się do tworzenia O,'*. Po­
niew aż w obrębie kom pleksu
III ubisem ichinon przem iesz­
cza się m iędzy zew nętrzną
i w ew nętrzną pow ierzchnią
w ew nętrznej błony m itochon­
drialnej, tw orzony przy jego
udziale anionorodnik p o n a d ­
Rycina 9. Miejsca p o w staw an ia a n iono rodn ika p o n a dtlenk ow ego O, w w y n ik u transp ortu elektro nów w łańcuchu odtlenkow y może uw alniać się
dechow ym . O znaczenia: FeS — g ru p y żelazow o-siarkow e; R FeS — białko R ieske'go z gru p ą żelazow o-siarkow ą; FMN
— m o no n u k leo ty d flaw inow y; FAD — dinu k leo ty d flaw inow o-adeninow y; G 3P — glicerolo-3-fosforan (a-glicerofosforan);
rów nież po obu stronach tej
D H A P — fosforan d ih ydroksyacetonu; G 3P-D H — d e h y d ro g e n az a glicerolo-3-fosforanu; burszt. — burszty nian; fum . — fu­
błony, jak to pokazano na
m aran; Q — p u la m itoch ond rialneg o u b ichinon u (k oenzym u Q); Q o ‘ — ubisem ichinon w pozycji o (po zew nętrznej stronie
Ryc. 9. Mniejsze znaczenie
błony); Q i‘ — ub isem ichinon w pozycji i (po w ew nętrznej stro nie błony); strona C — zew nętrzn a stro n a w ew nętrznej błony
m itochondrialnej; stro na M — w e w n ę trzn a strona w ew nętrzn ej błony m itochondrialnej. N iebieskie strzałki w skazują kie­
pod w zględem ilościowym
ru n e k tra n sp o rtu elektronów ; czerw one łuko w ate strzałki pokazują tw orzenie anion orodnika ponad tlen kow eg o. Rysow ał
ma produkcja w olnych ro d ­
prof. Peter Schónfeld (Instytut Biochemii i Biologii Kom órki, U niw ersytet O tto von G uericke, M agdeburg, N iemcy).
134
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
ników tlenowych przez dehydrogenazy a-glicerofosforanu [30] i a-ketoglutaranu [31]. Ta pierw sza występuje w
znaczących ilościach tylko w niektórych tkankach, m iędzy
innymi w mięśniu, i jest zlokalizow ana na zewnętrznej po­
wierzchni w ewnętrznej błony mitochondrialnej. Ta druga
jest rozpuszczalnym enzym em macierzy mitochondrialnej
i uczestniczy w cyklu Krebsa.
P onadto, rea k ty w n e form y tlenu pow stają na z e w n ę trz ­
nej błonie m itochondrialnej w w y n ik u działania o k sy d a ­
zy m onoam inow ej [32], Jest to flaw o p ro tein o w y enzym ,
obficie w y stępujący szczególnie w tkance nerw ow ej. Ka­
talizuje utlenianie biogenny ch am in do o d p o w ie d n ic h
a ld e h y d ó w lub ketonów , a w yn ikiem jednoelektronow ej
redukcji tlenu jest p ra w d o p o d o b n ie n a d tle n e k w o d o ru , a
nie anionorodnik.
G łów nym źródłem reaktyw nych form tlenu w mitochondriach pozostaje jednak łańcuch oddechow y. Badania
ostatnich lat zm ierzają do ustalenia zależności intensy w no­
ści tw orzenia tych zw iązków od stanu funkcjonalnego m i­
tochondriów . N ajw ażniejszym czynnikiem sprzyjającym
jednoelektronow ej redukcji tlenu w ydaje się stan oksydoredukcji nośników elektronów w krytycznych miejscach
łańcucha oddechow ego. M ożna przyjąć jako regułę, iż im
w yższy jest stopień redukcji, tym intensyw niejszy staje się
„wyciek" elektronów z łańcucha oddechow ego i reagow a­
nie ich z tlenem cząsteczkow ym w reakcji jednoelektro­
nowej. Dotyczy to przed e w szystkim kom pleksu I. Tym
tłum aczy się stym ulujące działanie inhibitorów oddecho­
wych, jak na przykład rotenonu (inhibitor kom pleksu I)
i antym ycyny A (inhibitor kom pleksu III), na produkcję
anionorodnika ponad tlenkow ego przez oddychające m i­
tochondria. Stopień redukcji nośników elektronów zale­
ży rów nież od stanu funkcjonalnego m itochondriów . Im
w yższe zap otrzebow anie kom órki na ATP, tym intensyw ­
niej przebiega oksydacyjna fosforylacja i tym szybszy jest
tran sp o rt elektronów . W tych w aru n k ach stopień redukcji
nośników elektronów obniża się. I rzeczywiście, m itochon­
dria oddychające w obecności ADP i P , a więc in ten sy w ­
nie p rodukujące ATP (tak zw any stan 3), w ytw arzają mniej
w olnych rod nik ów tlenow ych niż m itochondria w stanie
spoczynkow ym , nie m ogące syntetyzow ać ATP z p o w o ­
d u braku ADP (stan 4). W iąże się to rów nież z w artością
siły protonom otorycznej (Ap) i jej głów ną składow ą, p o ­
tencjałem błonow ym m itochondriów , w ysokim i w stanie
spoczynkow ym (4) i obniżającymi się w stanie aktyw n ym
(3). Skrajnym przy p ad k iem jest zniesienie Ap działaniem
substancji rozprzęgających oksydacyjną fosforylację (protonoforów), które jednocześnie radykalnie obniżają w y ­
tw arzanie w olnych rodn ikó w tlenow ych przez łańcuch
o ddech ow y [33-35].
R ozw ażania po w y ższe zbliżają nas do zro zu m ien ia
m echan izm u stresu oksydacyjnego to w arzyszącego c za­
so w e m u niedotlenieniu tkanki (ischemii i reperfuzji).
S p o w o d o w an e czasow ym zablok ow aniem k rążenia krw i
niedotlen ienie w p ro w a d z a nośniki elektronó w łańcucha
o d d e c h o w eg o w stan m aksym alnej redukcji, a n a s tę p u ­
jące po nim o d blok ow anie krążenia (reperfuzja) d o sta r­
cza tlenu. Pow stają w ów czas w aru n k i dla intensyw nej
pro dukcji w olnych ro d n ik ó w tlenow ych [36], Tej w y so ­
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
ce niebezpiecznej dla kom órki i całego organu, sytuacji
zapobiec m oże przy sp ieszen ie tra n sp o rtu elektronów w
łańcuchu o d d e ch o w y m p rzez częściow e rozprzężenie
oksydacyjnej fosforylacji, na p rz y k ła d działaniem protonoforów lub otw arciem m ito ch o n d rialn y ch kanałów p o ­
taso w y ch [37],
Poza dysm utazą ponadtlenkow ą, komórki aerobowe w y­
posażone są w cały zestaw enzym ów i związków drobno­
cząsteczkowych chroniących je przed szkodliw ym działa­
niem reaktyw nych form tlenu [26,27,38]. Należy tu przede
wszystkim katalaza, katalizująca rozpad nadtlenku w odoru
do w ody i tlenu cząsteczkowego.
2 H 20 2 -> 2 H 20 + 0 2
Katalaza charakteryzuje się niezwykle w ysoką liczbą
obrotów, jedną z najwyższych w śród enzym ów . Jedna czą­
steczka enzym u może przereagow ać z kilkoma milionami
cząsteczek substratu, nadtlenku w odoru, w ciągu sekundy.
Enzym ten w komórce zlokalizowany jest głównie w peroksysomach.
Z H 20 2 reagują ró w n ież liczne p ero k sy d a z y , r e d u ­
kujące n a d tle n e k w o d o ru do w o d y k o sztem ró żnych
z w iąz k ó w organicznych. W m acierzy m itochondrialnej
z najduje się w ysoce a k ty w n a p e ro k sy d a z a g lutationow a.
Z aw iera ona w sw y m c e n tru m a k ty w n y m selenocysteinę
i katalizuje redukcję H 90., p rzez z re d u k o w a n y glutation.
W ażną rolę w ochronie p rz e d oksydacy jnym u sz k o d z e ­
niem błon biologicznych o d g ry w a inna p ero k sy d a za
g lu tatio n o w a , specyficznie red u k u jąc a p ro d u k ty peroksydacji fosfolipidów .
Reaktyw ne formy tlenu u suw ane są rów nież nieenzym atycznie w reakcji z drobnocząsteczkowym i reduktoram i:
kw asem askorbinow ym (witaminą C), a-tokoferolem (wita­
miną E), p-karotenem (prow itam iną A) oraz ze zredu kow a­
nym glutationem.
M am y więc do czynienia w kom órce, a także w sam ych
m itochon driach, z procesam i tw orzącym i reak ty w n e for­
m y tlenu i usuw ającym i je. R ów now aga m iędzy tym i
procesam i pozw ala u trzy m ać o p ty m a ln y dla kom órki p o ­
ziom tych re a k ty w n y c h form. Pełnią one bow iem n iektó ­
re istotne funkcje sygnałow e [38-40], a także uczestniczą
w tw o rz en iu w ażn y ch zw iązków : p ro stag la n d y n i leukotrienów . Jednakże z ab u rzen ie tej rów n ow agi, w sensie
p o d w y ższ en ia produkcji w oln ych ro d n ik ó w tlenow ych
lub obniżenia ich u su w a n ia , p ro w a d z i do groźnego dla
życia kom órki stanu określanego jako stres oksydacyjny.
U w aża się obecnie, że stres oksydacyjny leży u podło ża
niek tó rych chorób n eurodegen eracyjnych, jak choroba
P arkin sona i choroba A lzheim era [41]. Być m oże, o d g ry ­
w a także rolę w patog enezie niek tórych typ ów cukrzycy
[42], U w aża się także, że jest on jed n y m z m echanizm ów
starzenia [43,44].
Na poziomie
liczany jest do
skom plikow any
mórki, apoptozy
http://rcin.org.pl
m itochondrialnym stres oksydacyjny za­
głów nych bodźców zapoczątkowujących
m echanizm program owanej śmierci ko­
[45-47].
135
ROLA MITOCHONDRIÓW W APOPTOZIE
Może się w ydać paradoksem natury, że mitochondria,
będące organellami nieodzow nym i dla życia komórki, sta­
now ią zarazem narzędzie jej samobójczej śmierci. Apoptoza, będąca jedną z form program ow anej śmierci komórki,
stanow i skom plikow any ciąg w ydarzeń pozwalający w ie­
lokom órkow em u organizm ow i w yelim inow ać komórki,
które bądź stały się zbędne w w yniku rozw oju osobnicze­
go (np. w embriogenezie, selekcji klonalnej limfocytów, w
trakcie przeobrażenia owadów ), bądź uległy uszkodzeniu,
m ogącem u zagrażać całemu organizm owi. Między innymi
przyjmuje się, że na drodze apoptozy niszczone są kom ór­
ki, w których genomie nastąpiły nieodw racalne zmiany,
potencjalnie prow adzące do przekształcenia ich w komórki
now otw orow e. A poptoza jest zatem jednym z naturalnych,
być może głównych, procesów chroniących przed nowotworzeniem. Z drugiej strony, w zm ożona apoptoza może
być przyczyną niektórych chorób autoim m unologicznych
oraz zachodzi w limfocytach zakażonych HIV.
Rozróżniamy w zasadzie dw ie drogi apoptozy, które jed­
nak w kilku punktach m ogą się krzyżować [46]. Jedną z nich
zapoczątkowuje pobudzenie odpow iednich receptorów na
powierzchni komórki, przekazujących następnie sygnały do
jądra. D rugą drogę inicjują zm iany w m itochondriach i temu
m echanizm ow i poświęcimy nasze rozważania. Jednym z
najwcześniejszych zjawisk tow arzyszących tej drodze jest
uwolnienie do cytosolu cytochrom u c i niektórych innych
białek mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej. Biał­
ka te, a przede wszystkim sam cytochrom c i tzw. czynnik
indukujący apoptozę (ang. apoptosis-inducing factor, AIF), w
obecności ATP lub dATP, aktyw ują obecną w cytosolu kaspazę-9. Jest to jedna z proteaz cysteinowych rozrywających
łańcuch peptydo w y w sąsiedztw ie kw asu asparaginowego,
występujących w formie proenzym ów . Ich proteolityczna
aktywacja (w p rzypadku kaspazy-9 zainicjowana cytochromem c) urucham ia ciąg reakcji prow adzących do samostraw ienia komórki. W procesie tym bierze także udział, uw al­
niana rów nież z mitochondrialnej przestrzeni m iędzybłono­
wej, endonukleaza G, która degraduje jądrow e DNA.
Cytochrom c jest w przeważającej masie zw iązany z w e ­
w nę trz n ą błoną m itochondrialną, gdzie — jak pisaliśmy
wyżej — pełni funkcję przenośnika elektronów w łańcu­
chu oddechow ym . W ró w n o w a d ze z tą pulą znajduje się
w olny cytochrom c w przestrzeni m iędzybłonow ej. Prze­
rw anie zew nętrznej błony m itochondrialnej pow oduje w y ­
ciek do cytosolu tego w olnego cytochrom u c. A że jest on
w ró w n o w a d z e z cytochrom em c zw iązanym z w ew nętrz­
ną błoną, p row adzi to w końcu do praw ie całkowitego
uw olnienia do cytosolu m itochondrialnego cytochromu
c. Początkow o zakładano, iż taki jest w łaśnie mechanizm
uw alniania cytochrom u c z m itochondriów zapoczątko­
w ujący apoptozę. Późniejsze badan ia w ykazały jednak,
że zerw anie ciągłości zew nętrznej błony m itochondrialnej
wcale nie jest niezbędne dla uw olnienia m itochondrial­
nego cytochrom u c do cytosolu i że w czasie apoptozy
przew ażnie nie m a ono miejsca, co najwyżej w późnych jej
stadiach. Musi być zatem inny m echanizm , dzięki które­
m u cytochrom c wycieka na zew n ątrz z m itochondrialnej
przestrzeni m iędzybłonow ej.
136
Rycina 10. S tru ktura miejsca kontak to w ego m iędzy z ew n ętrzną i w ew nętrzną
błoną m itochondrialną, tw orzącego "kanał w ysokiej przepuszczalności" (m egakanał). O znaczenia: A N T — translokaza nuk leo ty d ó w adeninow ych; VDAC —
p oryna m itochondrialną; PBR — receptor benzodiazepinow y; HK — heksokinaza; C yp D — cyklofilina D; cyt c — cytochrom c; Bcl-2 — białko antyapoptotyczne
Bcl-2; Bax — białko p ro ap optotyczne Bax, którego przyłączenie do pokazanej
stru ktury pow o duje w ypływ cytochrom u c. R ysow ał d r M. R. W ięckowski (Insty­
tu t Biologii D ośw iadczalnej im. M. N enckiego, W arszaw a). Reprodukcja z [54].
W edług obecnych p o g lą d ó w [47-50] w uw aln ian iu
m itochon drialnego cytoch rom u c biorą udział: z jednej
strony tak zw an y kanał wysokiej przepuszczalności, tw o rz ą ­
cy się w określonych w a ru n k a c h w miejscach kon taktu
m iędzy z e w n ętrz n ą a w e w n ę trz n ą błoną m ito ch o n d rial­
ną, z drugiej strony — p ro a p o p to ty c z n e białka z rodziny
białek Bcl-2, w szczególności białka Bid, Bax i Bak. Kanał
wysokiej przepuszczalności, zw an y rów n ież m egakanałem, otw iera się, m iędzy innym i, w sk u tek p rzeład o w an ia
m itochondriów jonam i w apnia. Łączy on bezp ośrednio
przestrzeń m acierzy m itochondrialnej z przestrzenią cytosolow ą i pow o d u je uw olnienie do p rzestrzeni z e w n ę trz­
nej n a d m ia ru C a2+, ale ró w n ież um ożliw ia p rzech odzenie
jonów H +, co daje w efekcie deenergizację m itochondriów .
Budow a m eg ak an ału jest w ielce złożona [51,52]. Skła­
da się on zaró w n o z białek błony w ew nętrznej, p rz e d e
w szystkim tra n sp o rte ra n u k leo ty d ó w adeninow ych, jak
i typow ego białka błony zew nętrznej, m itochondrialnej
poryny, określanej ró w n ież skrótem VDAC (ang. voltagedependent anion channel) [53], Więcej szczegółów b u d o w y
m egakanału pokazuje Ryc. 10. Sam m egakanał nie jest
jednak tą stru k tu rą , p rzez którą cytochrom c m iałby w y ­
ciekać z m itoch ondriów , a to z d w ó ch p o d staw o w y ch p o ­
w odów . Po pierw sze, łączy on bez p o śre d n io w e w n ę trz ­
ną p rz estrz e ń m itocho ndrialną, prz e strz eń m acierzy, z
p rzestrzenią cytosolow a, podczas gdy w olny cytochrom
c zlokalizow any jest w p rzestrzeni m iędzybłonow ej. Po
drugie, m eg akanał m a średnicę pozw alającą na s w o b o d ­
ny p rzep ły w cząsteczek o rozm iarach do 1,5 kDa, p o d ­
czas gdy cząsteczka cytochrom u c jest p raw ie dziesięcio­
krotnie w iększa (masa cząsteczkow a 13 kDa). N atom iast
now sze b ad an ia w ykazały, że dopiero połączenie m e g a ­
kanału z obecnym i n orm alnie w cytosolu białkam i Bax i
Bak spraw ia, że z e w n ę trzn a błona m itochondrialną staje
się p rzep u szczaln a dla cy tochrom u c, AIF i innych pro-
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
a p o p to ty c zn y c h czynn ik ów p rzestrzen i m iędzy błonowej.
W yrażan o ró w n ież przy p u sz cz e n ie [50,55], że pierw szą,
najwcześniej u w a ln ia n ą porcją cyto chro m u c jest tenże
zw iązan y ze stru k tu rą m egakanału.
A zatem w edług obecnie przyjętych poglądów m echa­
nizm zapoczątkowujący m itochondrialną drogę apoptozy
w ygląda następująco. Pod w pływ em odpow iedniego sy­
gnału w ystępujące w cytosolu proapoptotyczne białko Bid
ulega proteolitycznej aktywacji, co z kolei indukuje oligomeryzację, obecnych rów nież w cytosolu lub luźno zw ią­
zanych z zew nętrzną błoną, białek Bax i Bak. W formie
oligom erów białka te silniej w iążą się z zew nętrzną błoną
m itochondrialną, umożliwiając utw orzenie kanału dla w y ­
cieku cytochrom u c. Temu procesowi z kolei przeciw działa­
ją białka antyapoptotyczne, Bcl-2 i B c l ^ . Tak więc subtelna
rów now aga m iędzy tym i pro- i antyapoptotycznym i białka­
mi i ich oddziaływ anie z m egakanałem decyduje o p rzeży­
ciu lub „samobójczej" śmierci komórki. Sytuację komplikuje
dodatkow o fakt, że rów nież niektóre białka szoku cieplne­
go, w szczególności białko HSP70, m ogą przeciwdziałać
uw alnianiu cytochrom u c do cytosolu lub zapobiegać opisa­
nem u wyżej działaniu już uw olnionego cytochrom u [56,57],
Działają zatem antyapoptotycznie.
Obecne w cytosolu prokaspazy m ogą stanowić pow ażne
zagrożenie dla komórki. Ich aktywacja w skutek p rz y p ad k o ­
wej proteolizy m ogłaby bow iem uruchom ić nieodw racalny
proces prow adzący nieuchronnie do śmierci komórki. By
tem u zapobiec, kom órka w yposażona jest rów nież w białka
ham ujące kaspazy. A zatem dla skutecznego uruchom ienia
ciągu reakcji zainicjowanych aktywacją kaspazy-9 przez cytochrom c potrzebne jest jeszcze jedno białko zw ane Smac
(ang. second mitochondrial activator of caspases) lub DIABLO,
które neutralizuje inhibitory kaspaz [46,58]. Jest ono uw al­
niane razem z cytochrom em c z mitochondrialnej przestrze­
ni m iędzy błonowej.
Jed n y m z bodźców zapoczątk ow ujący ch m itochondrialn y szlak a p o ptozy , są reak ty w n e form y tlenu
[38,46,47], Ich d ziałanie jest w ielorakie. U w aża się obec­
nie, iż jed n y m z m ech anizm ów jest p o tęgow an ie u w a l­
nian ia cyto ch ro m u c. Cząsteczka cytochrom u c jest bogata
w reszty lizyny, m a zatem ch arak ter po likationu . Dzięki
tem u w y k azu je w ysokie p o w in o w a c tw o do, obecnej w
w ew nętrzn ej błonie m itochondrialnej ujem nie n a ła d o ­
wanej, kardiolipin y. Jest to jeden z głó w n ych czynników
d eterm inu jących ró w n o w ag ę m iędzy zw ią za n ą a w olną
form ą cy tochrom u c. Z drugiej strony kardio lipin a, b o ­
gata w trójnienasycony kw as linolenow y, stanow i jeden
z p ierw szy ch celów p ero k sy d a ty w n e g o atak u w o ln ych
r o d n ik ó w tlenow ych. Z niszczenie k ard io lip in y p rz e su w a
ró w n o w ag ę w k ie ru n k u w olnego cy tochrom u c i sprzyja
jego u w a ln ia n iu do cytosolu w w a ru n k a c h u p rz e p u sz czalnienia błony zew nętrznej, jak to opisano wyżej.
W kom órkach podlegających apoptozie zaobserw ow a­
no rozpad sieci mitochondrialnej na mniejsze jej fragm en­
ty [59,60], Nie jest jednak do końca jasne, czy to właśnie ta
zm iana morfologii m itochondriów jest w jakiś sposób zw ią­
zana z uw alnianiem cytochrom u c i innych białek indukują­
cych apoptozę [61].
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
CHOROBY MITOCHONDRIALNE
M itochondria zawierają swój w łasny DNA (mtDNA).
Jest to kolista cząsteczka o wielkości około 16 tysięcy par za­
sad (u człowieka 16 569 par zasad), w której skład w chodzą
dwie nici, ciężka i lekka. M itochondrialny kod genetyczny
w ykazuje niewielkie odstępstw a od kodu właściwego dla
genom u jądrowego. Np. k odon UAA, oznaczający zakoń­
czenie translacji cytosolowej, w m itochondriach jest kodonem dla tryptofanu. Podobnie kodon UGA, zam iast zakoń­
czenia syntezy łańcucha polipeptydow ego, w m itochon­
driach oznacza dołączenie selenocysteiny. Geny w mtDN A
zw ierząt nie zawierają intronów, a DN A nie jest upakow ane
w postaci chrom atyny. W m itochondriach nie m a białek histonowych, co nie oznacza, że m tD N A nie jest zw iązany z
żadnym i innym i białkami.
M itochondrialny genom ssaków i praw ie wszystkich in­
nych zw ierząt zawiera 37 genów. Kodują one 13 białek, 2 ro­
dzaje rRN A i 22 rodzaje tRNA. W szystkie białka kodow ane
w genomie m itochondrialnym są zw iązane z oksydacyjną
fosforylacją. Jedenaście z nich to białka wchodzące w skład
łańcucha oddechow ego (Ryc. 11) [62,63], siedem w spółtw o­
rzy kom pleks oddechow y I, jedno w chodzi w skład kom ­
pleksu III i cztery w skład kom pleksu IV. Pozostałe dw a
białka kodow ane w m tD N A w chodzą w skład podjednostki
Fo m itochondrialnej syntazy ATP ( F ^ -ATP-azy; są to tzw.
p eptydy a i b, Ryc. 6). Pozostałe białka (a jest ich około dzie­
więćdziesiąt) bezpośrednio zw iązane z oksydacyjną fos­
forylacją, tworzące łańcuch oddechow y i m itochondrialną
ATP-azę, są kodow ane w genomie jądrow ym , syntetyzow a­
ne w cytoplazm ie i następnie im portow ane do m itochon­
driów. W sumie w m itochondriach jest około 1000 białek.
Należą do nich m.in. enzym y cyklu kw asów trikarboksylowych, p-oksydacji kw asów tłuszczowych, pierw szych eta­
pów glukoneogenezy (w w ątrobie i korze nerki) oraz cyklu
m ocznikowego (w wątrobie), a także niektórych etapów
steroidogenezy i m etabolizm u am inokwasów. Ponadto, w
macierzy mitochondrialnej znajdują się białka zw iązane z
replikacją m tD N A i ekspresją genów m itochondrialnych
oraz białka opiekuńcze. W obu błonach mitochondrialnych
w ystępują białkowe systemy transportujące jony, metaboli­
ty i białka. Synteza tych w szystkich białek w ym aga udziału
ok. 3000 genów kodow anych przez jądrow y DNA. A zatem
m itochondria jako całość, ich biogeneza i funkcjonowanie,
są pod kontrola dw óch genomów: dominującego ilościowo
genom u jądrow ego i bardzo ograniczonego ilościowo, ale
niezw ykle istonego ze w zględu na udział m itochondriów
w energetyce komórki — genom u m itochondrialnego. M u­
tacje w każdym z nich m ogą być przyczyną w rodzonych
pow ażnych chorób [63].
Pierwszy przypadek choroby o podłożu endogennym ,
spow odow anej zaburzoną organizacją enzym ów łańcucha
oddechow ego, został opisany w 1962 r. [64], Jej objawami
było przyspieszone zużycie tlenu, osiągające wartość bliską
maksymalnej, oraz obniżona kontrola oddechow a. Zm ie­
niony był także obraz m itochondriów w mikroskopie elek­
tronow ym . Odkrycie to zwróciło uw agę na fakt, że niepra­
w idłow ości w funkcjonowaniu m itochondriów m ogą być
przyczyną zaburzeń metabolicznych u ludzi, chociaż p o d ­
łoże m olekularne tej patologii nie zostało wówczas ustalo­
http://rcin.org.pl
137
ne. N atom iast w 1988 roku opisano przypad ek schorzenia
spow odow anego zaburzeniam i w obrębie m tD N A [65],
Odkrycie to zapoczątkow ało erę intensyw nych poszukiw ań
patogennych mutacji w m tD N A i stało się przełom ow e dla
zdefiniow ania nowej klasy chorób metabolicznych, tzw.
chorób mitochondrialnych. Obecnie kategoria ta została
poszerzona i obejmuje nie tylko zaburzenia spow odow a­
ne mutacjami w mtDNA, ale także mutacjami w jądrow ym
DNA, w genach kodujących białka m itochondrialne zarów ­
no zw iązane z procesami metabolicznymi jak i z biogenezą
tych organelli. Tak rozum iane choroby m itochondrialne są
najczęściej w ystępującym i w rodzonym i anomaliami, poja­
wiającymi się z częstością szacow aną na 1 na 10 000 żywych
u rodzeń [66],
D ziedziczenie chorób sp o w o d o w an y ch zm ianam i w
jąd row ym D N A podlega p raw o m M endla i przez to jest
stosunkow o łatw e do śledzenia i p rzew id y w an ia p ra w d o ­
podob ieństw a w ystąpienia objaw ów choroby w pokoleniu
potom nym . N atom iast ocena szans pojaw ienia się skutków
mutacji w m tD N A , zaburzających działanie system u oksy­
dacyjnej fosforylacji, jest o wiele trudniejsza. Po pierwsze,
dziedziczenie cech k odow any ch w m tD N A o dby w a się po
linii matczynej, poniew aż m itochondria obecne w plem niku
są bard zo nieliczne w po ró w n an iu z liczbą m itochondriów
oocytu i zaraz po zapłodnieniu ulegają eliminacji [67], A
zatem dziedziczenie to m a charakter niem endlow ski. Po
drugie, w przeciw ieństw ie do genom u jądro w ego w y stę ­
pującego w niedzielącej się kom órce w postaci jednej kopii,
m tD N A w przeciętnej kom órce ssaków w ystępuje średnio
w kilku tysiącach kopii, a w oocytach liczba ta osiąga ok.
100 tysięcy. W w aru n k ach norm y w szystkie kopie m tD N A
są identyczne i praw idłow e. Stan taki określany jest jako
hom oplazm ia. W p rz y p a d k u w ystąpienia mutacji w m tD ­
NA udział cząsteczek zm utow anych m oże wynosić od bli­
skiego zeru do 100% w stosunku do całkow itego m tD N A
(w tym d ru g im skrajnym p rz y p a d k u też m ożna mówić o
hom oplazm ii). Stan, w którym tylko część cząsteczek m tD ­
NA w kom órce jest zm u to w ana, nazy w am y heteroplazm ią.
Objawy choroby m itochondrialnej pojawiają się zazwyczaj
dopiero w tedy, gdy udział z m utow an ego m tD N A (stopień
heteroplazm ii) przekracza p ew ną krytyczną wartość. Z a­
zwyczaj mieści się ona w przedziale 50-80% całego m tD ­
NA w komórce, w zależności od ty p u mutacji [68], N ie­
jednakow a w rażliw ość różnych typó w kom órek na z a b u ­
rzenia oksydacyjnej fosforylacji spo w o d o w an e zm ianam i
w m tD N A zależy przede w szystkim od intensyw ności ich
m etabolizm u i zapotrzebow ania energetycznego. Dlatego
choroby m itochondrialne dotykają w pierwszej kolejności
tkanek o najbardziej akty w n y m m etabolizm ie energetycz­
nym , takich jak tkanka m ięśniow a i nerw ow a. W ydaje się,
że do m om en tu osiągnięcia
krytycznego poziom u h ete­
roplazm ii kom órki potrafią
skutecznie bronić się przed
niedoborem ATP.
Rycina 11. M apa genom u m tD N A człow ieka. G eny kodujące określone podjednostki kom pleksów łańcucha o ddechow ego
i syntazy ATP zaznaczono ró żnym i koloram i: siedem po djed n o stek kom pleksu I — różow ym , cytochrom b w chodzący w
skład kom pleksu III — pom arańczow ym , trzy p odjednostki ko m pleksu IV (oksydazy cytochrom ow ej) — niebieskim , dw ie
pod jedn ostk i syntazy ATP — żółtym . Tym i sam ym i koloram i są zaznaczone o d pow ied nie podjednostki na schem acie błony
w ew nętrznej w dolnej części rysunk u. Ponadto, n a m odelu m tD N A geny kodujące dw a rybosom alne RNA, 12S i 16S, za­
znaczono kolorem zielonym , a kodujące 22 rodzaje tRN A — kolorem granatow ym . Pętla D kontrolująca inicjację replikacji i
transkrypcji m tD N A , zaznaczona jest na szaro. W ed ług [62]; rep rod ukcja za zg o d ą w ydaw cy.
138
http://rcin.org.pl
Mutacje występujące u
danego osobnika zarów no
w DN A jądrow ym , jak i mitochondrialnym m ogą mieć
także charakter sporadycz­
nych zmian, które są p rz y ­
czyną w ystąpienia chorób
nie w ykryw anych wcześniej
u członków danej rodziny.
Szczególnie dotyczy to m u ta­
cji w mtDNA. M itochondrial­
ne DNA jest narażone na stałe
działanie stosunkow o w yso­
kich stężeń reaktyw nych form
tlenu [69] oraz nie jest osłonię­
te przez białka histonow e, co
spraw ia, że częstość mutacji
pojawiających się w obrębie
m tD N A jest naw et 100-krotnie w yższa niż obserw ow ana
w D NA jądrow ym [68]. Każ­
da z mutacji w m tD N A do ty ­
czy bezpośrednio (mutacje w
genach kodujących polipeptydy) lub pośrednio (mutacje w
genach kodujących m itochon­
drialne tRNA) białek zw iąza­
nych z oksydacyjną fosforylacją. A zatem mutacje te m ogą
upośledzać w ydolność ener­
w w w .postępy biochem ii.pl
getyczną m itochondriów, a w efekcie funkcjonowanie ko­
m órek i tkanek.
Dziedziczone po matce mutacje w mtDN A, podobnie jak
dziedziczone mutacje w DNA jądrow ym , pow inny być w y ­
kryw alne we w szystkich tkankach organizm u. Natom iast
mutacje nabyte w różnych fazach rozw oju em brionalnego
oraz w okresie postnatalnym są ograniczone do w ybranych
tkanek i narządów . Jednakże nie do końca zrozum iałe m e­
chanizm y segregacji m itochondriów w czasie dojrzewania
oocytów oraz niejednakow a wrażliwość różnych kom órek
na zaburzenia oksydacyjnej fosforylacji sprawiają, że prze­
w idyw anie stopnia heteroplazm ii m tD N A w różnych tkan­
kach organizm u, a także nasilenia objawów chorobowych
jest niezwykle trudne. U w aża się, że rozprzestrzenianie się
mutacji i rozkład heteroplazm ii w organizm ie potom nym
są zdeterm inow ane już na pierw szych etapach oogenezy
podczas rozwoju em brionalnego zarodka żeńskiego. W te­
dy m oże dojść do niejednakowego rozkładu heteroplazm ii
podczas podziału kom órek i pow stania linii kom órkow ych
różniących się stopniem zm utow ania m tD N A [70].
D odatkow ym utrudnieniem w przew idyw aniu rozw o­
ju i przebiegu chorób m itochondrialnych spow odow anych
zm ianam i w m tD N A jest w ystępow anie niejednakow ych
objawów w śród należących do jednej rodziny nosicieli
tej samej mutacji, a także zmieniający się obraz choroby i
zazwyczaj nasilanie się jej objawów w ciągu życia osobni­
czego. Co więcej, mutacje w obrębie różnych genów m ogą
prow adzić to takich samych objawów chorobowych. Inny­
mi słowy, w ażną cechą chorób m itochondrialnych jest brak
wyraźnej zależności m iędzy zm ianam i genotypow ym i i ich
manifestacją fenotypową.
Anom alie występujące w m tD N A dzieli się na trzy ka­
tegorie. Są to: mutacje punktow e, przearanżow anie dużych
fragm entów genów (delecje, duplikacje) oraz zmniejszenie
liczby kopii m tD N A (deplecje). W śród mutacji punktow ych
m ożna wyróżnić mutacje dotyczące genów kodujących biał­
ka oraz genów kodujących tRNA [71]. W ażnym przykładem
należącym do tej drugiej podkategorii jest mutacja A3243G
w genie kodującym tRNALeu. Skutkiem tej mutacji jest ze­
spół zw any MELAS (ang. Myopathy, ęncephalopathy, lactic
acidosis, stroke-like épisodes) [72]. Co ciekawe, ta sam a m u ­
tacja m oże być przyczyną innego zespołu zw anego MIDD
(ang. Mitochondrial inherited deafnes and diabetes), którego
objaw em jest obustronne upośledzenie słuchu i cukrzyca
spow o dow ana zaburzeniam i w ydzielania insuliny przez
kom órki beta trzustki [73], Przykład ten ilustruje brak ści­
słego zw iązku m iędzy zaburzeniem na poziomie genów a
fenotypem. Inna mutacja punktow a (A8344G), rów nież d o ­
tyczącą genu tRNA Leu, jest głów ną przyczyną zespołu zw a­
nego MERRF (ang. Myoclonie epilepsy with ragged red fibers)
[74]. O ile mutacje w genach dotyczących poszczególnych
tRNA m ogą w pływ ać na ekspresję w szystkich genów m i­
tochondrialnych, to mutacje genów kodujących białka p o­
w odują ściśle określone defekty. Ich skutkiem m oże być
wybiórcze zaburzenie funkcji kom pleksów oddechow ych
I, III i IV oraz ATP-azy. Takie zm iany leżą u podstaw p o ­
w ażnych patologii związanych z upośledzeniem oksydacyj­
nej fosforylacji, w tym zespołu LHON (ang. Leber hereditary
optic neuropathy), spow odow anego mutacjami dotyczącymi
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
białek kom pleksu I. Mutacja w genie kodującym jedno z
białek w chodzących w skład mitochondrialnej ATP-azy jest
przyczyną zespołu NARP (ang. Neurogenic muscle weaknessataxia-retinitis pigmentosa), charakteryzującego się miopatią,
ataksją i zw yrodnieniem siatkówki, połączonymi z dem encją i n apadam i epileptycznymi. Jeżeli stopień heteroplazmii
NARP przekracza 90%, rozwija się tzw. choroba Leigh'a,
będąca najpow ażniejszym i letalnym skutkiem tej mutacji.
W arto tu zaznaczyć, że jest to zespół objawów klinicznych,
który m oże być także w ynikiem mutacji w genomie jądro­
w ym (patrz niżej).
Przearanżow ania dużych fragm entów m tD N A (spo­
radyczne delecje lub duplikacje) następują zazwyczaj na
bardzo wczesnym etapie rozwoju zarodkow ego i rozprze­
strzeniają się podczas embriogenezy. Zm iany te są przyczy­
ną sporadycznych chorób mitochondrialnych, chociaż w
rzadkich p rzypadkach sugerow ana jest możliwość ich dzie­
dziczenia po linii matczynej [71]. Zmniejszenie liczby kopii
m tD N A jest stosunkow o rzadką, letalną anomalią, która
objawia sie pow ażnym i zaburzeniam i oddechow ym i oraz
dysfunkcją mięśni, w ątroby i nerek [71,75]. Jedną z cech
chorób m itochondrialnych spow odow anych mutacjami w
m tD N A jest nasilanie się lub wręcz pojawianie się objawów
w miarę starzenia się organizm u. Wydaje się, że może być
to spow odow ane postępującym i uszkodzeniam i m tD N A w
w yniku nieuniknionej ekspozycji na reaktyw ne formy tlenu
[69].
Choroby m itochondrialne spow odow ane mutacjami w
m tD N A stanow ą tylko 10% w szystkich genetycznie u w a ­
runkow anych zaburzeń dotyczących tych organelli. Pozo­
stałe 90% jest skutkiem mutacji w genach znajdujących się
w jądrow ym DNA. Mutacje te m ogą bezpośrednio dotyczyć
nie tylko genów kodujących białka w chodzące w skład łań­
cucha oddechow ego i ATPazy, ale także genów kodujących
białka odpow iedzialne za praw idłow ą aranżację łańcucha
oddechowego. Przykładem takiej choroby jest zespół Le­
igh'a sp ow odow any mutacją w genie SURF1, kodującym
białko opiekuńcze odpow iedzialne za praw idłow e składa­
nie oksydazy cytochromowej czyli kom pleksu IV. W efekcie
dochodzi do poważnej, letalnej w skutkach, dysfunkcji łań­
cucha oddechow ego [76,77],
Fakt, że zespół Leigh'a m oże być skutkiem różnych m u ­
tacji (np. SURF1 lub NARP albo COX III dotyczącej białek
oksydazy cytochromowej), dobrze ilustruje trudność posta­
wienia właściwej diagnozy na podstaw ie objawów. Podo­
bieństw o objawów tow arzyszących różnym mutacjom, a
także zróżnicow anie fenotypow e przy tej samej zmianie na
poziom ie DNA nie pozwalają na ustalenie przyczyny cho­
roby bez uciekania się do m etod biologii molekularnej [71].
Istnieje też grupa chorób, określanych jako choroby m ito­
chondrialne, spow odow anych mutacjami w genomie jądro­
w ym dotyczącymi białek nie uczestniczących w oksydacyj­
nej fosforylacji, ale kluczowych dla praw idłow ego działania
tych organelli. Przykładem takiego schorzenia jest ataksja
Friedreicha (zw yrodnienie m óżdżkow o-rdzeniow e). Jest to
choroba neurodegeneracyjna spow odow ana mutacją w ge­
nie jądrow ym kodującym frataksynę, której funkcja w mitochondriach polega na buforow aniu i m agazynow aniu jonów
http://rcin.org.pl
139
żelaza. Zmniejszenie ilości frataksyny pow oduje w zrost
stężenia w olnych jonów Fe2+ i w konsekwencji zwiększone
w ytw arzanie reaktyw nych form tlenu (w reakcji Fentona).
Frataksyna jest też konieczna w tw orzeniu kom pleksów
żelazow o-siarkow ych (Fe/S) wchodzących, m.in., w skład
kom pleksów I, II i III łańcucha oddechow ego oraz akonitazy (enzym cyklu kw asów trikarboksylowych). Skutkiem
tych zaburzeń jest degeneracja neuronów czuciowych, kardiom iopatia oraz zwiększone praw d opod obieństw o w ystą­
pienia cukrzycy typu 2 [78].
PIŚMIENNICTWO
1. Tzagoloff A (1982) M itochondria. Plenum Press, N ew York
2. Nicholls DG (1987) Bioenergetyka. PW N, W arszaw a
3. Nicholls 1X1, Ferguson SJ (2002) Bioenergetics 3. Academ ic Press, Lon­
don
4. Mitchell P (1961) C oupling of phosphorylation to electron and hydro­
gen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. N ature 191:144148
5. Wojtczak L, Żółkiewska A, Duszyński J (1986) Energy-storage capacity
of the m itochondrial proton-m otive force. Biochim Biophys Acta 851:
313-321
6. W ojtczak L, Zabłocki K (2008) Basic m itochondrial physiology in cell
viability and death. W: Dykens J, Will Y (red) D rug-Induced Mito­
chondrial Dysfunction. Wiley & Sons, w d ruku
7. Lenaz G, Fato R, Genova ML, Bergamini C, Bianchi C, Biondi A (2006)
M itochondrial Com plex I: structural and functional aspects. Biochim
Biophys Acta 1757:1406-1420
8. Ackrell BAC (2000) Progress in understanding structure-function rela­
tionships in respiratory complex II. FEBS Lett 466:1-5
9. Darrouzet E, M oser CC, D utton PL, Daldal F (2001) Large scale do­
m ain m ovem ent in cytochrom e bcx: a new device for electron transfer
proteins. Trends Biochem Sci 26: 445-451
10. C apaldi R (1990) Structure and function of m itochondrial cytochrome
c oxidase. A nnu Rev Biochem 59:569-596
11. Saraste M (1990) Structural features of cytochrom e oxidase. Q Rev Bio­
phys 23:331-366
12. Babcock GT, W ikstrôm M (1992) O xygen activation and the conserva­
tion of energy in cell respiration. N ature 356: 301-309
13. Racker E (1962) Studies of factors involved in oxidative phosphoryla­
tion. Proc Natl Acad Sci USA 48:1659-1663
14. Em ster L, Schatz G (1981) M itochondria: A historical review. J Cell Biol
91: 227s-255s
15. Penefsky HS, Cross RL (1991) Structure and m echanism of F0F|-type
ATP synthesis and ATPases. A dv Enzymol 64:173-214
16. A braham s JP, Leslie AG, Lutter R, W alker JE (1994) Structure at 2.8 Â
resolution of F^ATPase from bovine heart m itochondria. N ature 370:
621-628
17. Boyer PD (1997) The ATP synthase — a splendid m olecular machine.
Annu Rev Biochem 66: 717-749
18. Leslie AG, A braham s JP, Braig K, Lutter R, Menz RI, O rriss GL, van
Raaij MJ, W alker JE (1999) The structure of bovine m itochondrial FjATPase: an exam ple of rotary catalysis. Biochem Soc Trans 27: 37-42
19. Wojtczak L (2000) Siedem dziesiąt lat badań nad oksydacyjną fosforylacją, czyli od koncepcji chem icznego sprzężenia do wirującej ATPazy. Kosmos 49: 467-479
20. Wojtczak L (1998) N agroda Nobla z chemii za 1997 rok — mitochondrialna syntaza ATP. Postępy Biochem 44: 2-5
21. Noji H, Yasuda R, Yoshida M, Kinosita K jr (1997) Direct observation
of the rotation of F,-ATPase. N ature 386: 299-302
22. Itoh H, Takahashi A, Adachi K, Noji H, Yasuda R, Yoshida M, Kinosita
K jr (2004) Mechanically driven ATP synthesis by F^ATPase. Nature
427: 465-468
140
23. Halliwell B, G utteridge JM (1984) Oxygen toxicity, oxygen radicals,
transition m etals and disease. Biochem J 219:1-14
24. Turrens JF (2003) M itochondrial form ation of reactive oxygen species.
J Physiol 552: 335-344
25. Chen Q, Vazquez EJ, M oghaddas S, H oppel CL, Lesnefsky EL (2003)
Production of reactive oxygen species by m itochondria: central role of
complex III. J Biol Chem 278: 36027-36031.
26. Jeżek P, H lavatâ L (2005) M itochondria in hom eostasis of reactive oxy­
gen species in cell, tissues, and organism. Int J Biochem Cell Biol 37:
2478-2503.
27. Andreyev AY, K ushnareva YE, Starkov AA (2005) M itochondrial m e­
tabolism of reactive oxygen species. Biochemistry (Moscow) 70: 200214
28. Adam-Vizi V, C hinopoulos C (2006) Bioenergetics and the form ation
of m itochondrial reactive oxygen species. T rends Pharm Sci 27: 639645
29. G rivennikova VG, Vinogradov AD (2006) G eneration of superoxide
by the m itochondrial Com plex I. Biochim Biophys Acta 1757:553-561
30. Drahota Z, C how dhury SK, Floryk D, Mraćek T, W ilhelm J, Rauchovâ
H, Lenaz G, Housték J (2002) G lycerophosphate-dependent hydrogen
peroxide production by brow n adipose tissue m itochondria and its ac­
tivation by ferrocyanide. J Bioenerg Biomembr 34:105-113
31. Starkov AA, Fiskum G, C hinopoulos C, Lorenzo BJ, Browne SE, Pa­
tel MS, Beal MF (2004) M itochondrial a-ketoglutarate dehydrogenase
complex generates reactive oxygen species. J N eurosci 24: 7779-7788
32. Schnaitm an C, Erwin VG, G reenaw alt JW (1967) The subm itochondrial localization of m onoam ine oxidase: An enzym atic m arker for the
outer m em brane of rat liver m itochondria. J Cell Biol 32: 719-735
33. Skulachev VP (1996) Role of uncoupled and non-coupled oxidations in
m aintenance of safety low levels of oxygen and its one-electron reductants. Q Rev Biophys 29:169-202
34. Brand MD, Affourtit C, Esteves TC, Green K, Lam bert AJ, M iwa S,
Pakay JL, Parker N (2004) M itochondrial superoxide: production, bio­
logical effects, and activation of uncoupling proteins. Free Radie Biol
M ed 37:755-767
35. Brookes PS (2005) M itochondrial H + leak and ROS generation: an odd
couple. Free Radie Biol Med 38:12-23
36. Chen O, Cam ara AK, Stowe DF, H oppel CL, Lesnefsky EJ (2007)
M odulation of electron transport protects cardiac m itochondria and
decreases m yocardial injury d uring ischemia and reperfusion. A m J
Physiol Cell Physiol 292: C137-C147
37. Brennan JP, Southw orth R, M edina RA, D avidson SM, D uchen MR,
Shattock MJ (2006) M itochondrial uncoupling, w ith low concentration
FCCP, induces ROS-dependent cardioprotection independent of KATp
channel activation. Cardiovasc Res 72:313-321
38. Czarna M, Jarm uszkiewicz W (2006) Rola m itochondriów w w ytw a­
rzaniu i usuw aniu reaktyw nych form tlenu; zw iązek z przesyłaniem
sygnałów i program ow aną śmiercią komórki. Postępy Biochem 52:
145-156
39. Dröge W (2002) Free radicals in physiological control of cell function.
Physiol Rev 82: 47-95
40. Stone JR, Yang SP (2006) H ydrogen peroxide: a signaling m essenger.
Antioxid Redox Signal 8: 243-270
41. Lin MT, Beal MF (2006) M itochondrial dysfunction an d oxidative
stress in neurodegenerative diseases. N ature 443: 787-795
42. New sholm e P, H aber EP, H irabara SM, Rebelato ELO, Procopio J,
M organ D, Oliveira-Emilio HC, Carpinelli AR, Curi R (2007) Diabetes
associated cell stress and dysfunction: role of m itochondrial an d nonm itochondrial ROS production and activity. J Physiol 583: 9-24
43. Beckman KB, Am es BN (1998) The free radical theory of aging m atu­
res. Physiol Rev 78: 547-581
44. Lenaz G, Bovina C, Form iggini G, Parenti Castelli G (1999) M itochon­
dria, oxidative stress, and antioxidant defences. Acta Biochim Pol 46:
1-21
45. N ew m eyer DD (2003) M itochondria: releasing pow er for life an d unle­
asing the m achineries of death. Cell 112: 481-490
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
46. G rądzka I (2006) M echanizm y i regulacja program ow anej śmierci ko­
mórki. Postępy Biochem 52:157-165
47. O rrenius S, G ogvadze V, Zhivotovsky B (2007) M itochondrial oxidati­
ve stress: Im plications for cell death. A nnu Rev Pharm acol Toxicol 47:
143-183
48. VonA hsen O, W aterhouse NJ, K uw ana T, N ew m eyer DD, G reen DR
(2000) The 'harm less' release of cytochrom e c. Cell Death Differ 7:
1192-1199
49. Robertson JD, Zhivotovsky B, G ogvadze V, O rrenius S (2003) O uter
m itochondrial m em brane permeabilization: an open-and-shut case?
Cell D eath Differ 10: 485-487
50. G rim m S, Brdiczka D (2007) The perm eability transition pore in cell
death. Apoptosis 12: 841-855
51.Bernardi P, Krauskopf A, Basso E, Petronilli V, Blachly-Dyson E, Di
Lisa F, Forte MA (2006) The m itochondrial perm eability transition
from in vitro artifact to disease target. FEBS J 273: 2077-2099
52. W ięckowski MR (2008) M itochondrialny m egakanał w fizjologii i pa­
tologii kom órki — now e spojrzenie. Postępy Biochem 54: 71-81
53. Km ita H, Stobienia O (2006) Kanały VDAC jako regulator funkcji m i­
tochondriów. Postępy Biochem 52:129-136
54. W ojtczak L (2006) D w a oblicza cytochrom u c. Postępy Biochem 52:
122-128
55. W ięckowski MR, V yssokikh M, D ym kow ska D, A ntonsson B, Brdicz­
ka D, W ojtczak L (2001) Oligomeric C-term inal truncated Bax prefe­
rentially releases cytochrom e c b u t not adenylate kinase from m ito­
chondria, outer m em brane vesicles and proteoliposom es. FEBS Lett
505: 453-459
64. Luft R, Ikkos D, Palmieri G, Em ster L, Afzelius BA (1962) A case of
severe hyperm etabolism of non-thyroid origin w ith a defect in the m a­
intenance of m itochondrial respiratory control: a correlated clinical,
biochemical and m orphology study. J Clin Invest 41:1776-1804
65. H olt IJ, H arding AE, M organ-H ughes JA (1988) Deletions of muscle
m itochondrial DNA in patients w ith m itochondrial m yopathies. N a­
ture 331: 717-719
66. Sm eitink J, van den Heuvel L, DiM auro S (2001) The genetics and pa­
thology of oxidative phosphorylation. N ature Rev Gen 2: 342-352
67. Sutovsky P, Van Lezen K, M cCaulez T, Daz BN, Sutovskz M (2004)
D egradation of paternal m itochondria after fertilization: implications
for heteroplasm y, assisted reproductive technologies and m tD N A in­
heritance. Reprod Biomed Online 8:24-33
68. Kang D, Ham asaki N (2005) M itochondrial DNA in somatic cells: A
prom ising target of routine clinical tests. Clin Biochem 38:685-695
69.Jurgow iak M, Oliński R (1997) Oksydacyjne uszkodzenia mitochondrialnego DNA zw iązane z rozw ojem stanów patologicznych i starze­
niem się. Postępy Biochem 43: 30-40
70. C hinnery PF, T horbum DR, Sam uels DC, W hite SL, Dahl HM, T urn­
bull DM, Lightowlers RN, How ell N (2000) The inheritance of m ito­
chondrial DNA heteroplasm y: random drift, selection or both? Trends
Genet 16: 500-505
71. Rôtig A, M unnich A (2003) Genetic features of m itochondrial respira­
tory chain. J Am Soc N ephrol 14: 2995-3007
72. Goto Y, N onaka I, Horai S (1990) M utation in the tRNALeu (UUR) gene
associated w ith the MELAS subgroup of m itochondrial encephalom yopathies. N ature 348: 651-653
56. Bruey JM, Ducasse C, Bonniaud P, Ravagnan L, Susin SA, Diaz-Latoud C, G urbuxani S, Arrigo AP, Kroem er G, Solary E, G arrido C (2000)
Elsp27 negatively regulates cell death by interacting w ith cytochrom e
c. N at Cell Biol 2: 645-652
73. De A ndrade PBM, Rubi B, Frigerio F, Van den O uw eland JMW, Maassen JA, M aechler P (2006) Diabetes-associated m itochondrial DNA
m utation A3243G im pairs cellular metabolic pathw ays necessary for
beta cell function. Diabetologia 49:1816-1826
57. Klein SD, Brüne B (2002) Heat-shock protein 70 attenuates nitric oxideinduced apoptosis in RAW m acrophages by preventing cytochrom e c
release. Biochem J 362: 635-641
74. Shoffner JM, Lott MT, Lezza AM, Seibel P, Ballinger SW, Wallace CD
(1990) Myoclonic epilepsy and regged-red fiber disease (MERRF) is
associated w ith a m itochondrial D N A tRNAu'u m utation. Cell 61: 931937
58. Verhagen AM, Vaux DL (2002) Cell death regulation by the m am m a­
lian IAP antagonist D iablo/Sm ac. A poptosis 7:163-166
59. Karbowski M, Youle RJ (2003) Dynam ics of m itochondrial m orpholo­
gy in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ 10: 870-880
60. Perfettini JL, Rounder T, Kroem er G (2005) M itochondrial fusion and
fission in the control of apoptosis. Trends Cell Biol 15:179-183
75. M oraes CT, Shanske S, Tritschler HJ, Aprile JR, A ndreetta F, Bonilla
E, Schon EA, DiM auro S (1991) m tD N A depletion w ith variable tissue
expression: A novel genetic abnorm ality in m itochondrial diseases.
Am J H um Genet 48: 492-501
61. A m oult D (2007) M itochondrial fragm entation in apoptosis. Trends
Cell Biol 17:6-12
76. Z hu Z, Yao J, Johns T, Fu K, De Bie I, Macmillan C, C uthbert AP, Newbold RF, W ang J, Chevrette M, Brown GK, Brown RM, Shoubridge EA
(1998) Surf-1, encoding a factor involved in the biogenesis of cytochro­
m e c oxidase is m utated in Leigh syndrom e. N at Genet 20:337-342
62. D iM auro S, H irano M, Schon EA (2006) A pproaches to the treatm ent
of m itochondrial diseases. Muscle N erve 34: 265-283
77. Chinnery PF, Schon EA (2003) M itochondria. J N eurol N eurosurg Psy­
chiatry 74:1188-1199
63. Trębińska A, Golik P (2004) Choroby m itochondrialne w yw ołane za­
burzeniam i w kom unikacji m iędzy genom em jądrow ym i organellarnym . Postępy Biochem 50:45-56
78. Palau F (2001) Friedreich's ataxia and frataxin: m olecular genetics,
evolution and pathogenesis. Int J Mol M ed 7: 581-589
Mitochondria in cell life, death and disease
Lech Wojtczak , Krzysztof Zabłocki
D epartem ent of Biochemistry, N encki Institute of E xperim ental Biology, 3 P asteur St., 02-093 W arsaw , Poland
e-mail: l.wojtczak@ nencki.gov.pl
Key words: apoptosis, ATP synthase, m itochondria, m itochondrial diseases, oxidative phosphorylation, reactive oxygen species, respiratory
chain
ABSTRACT
In animal cell, mitochondria are the main sites of the synthesis of ATP required for cell functioning and survival. On the other hand, mito­
chondria play a key role in initiating cell programmed death (apoptosis). In addition, defects in the mitochondrial genom e and in the nuclear
genom e encoding mitochondrial proteins may result in m alfunctioning of these organelles and, as result, in diseases of the w hole organism.
This article contains basic information on the functioning of oxidative phosphorylation and on mitochondrial production of reactive oxygen
species. It also describes initiation of apoptosis at the mitochondrial level. Finally, it briefly presents some most common genetic defects re­
sponsible for "mitochondrial diseases".
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
141
Ewolucja mitochondrialnego DNA i jego systemu
ekspresji — porównanie królestwa zwierząt i roślin
STRESZCZENIE
Janusz Piechota
Hanna Jańska
Z akład Biologii M olekularnej Kom órki, U ni­
w ersytet W rocław ski
Zakład Biologii M olekularnej Kom órki,
U niw ersytet W rocław ski, ul. P rzybyszew skiego
66/73, 51-148 W rocław; tel. (071) 3756273; email: H a n n a .Janska@ ibmb.u n i.w roc.pl
A rtykuł otrzym ano 25 kw ietnia 2008 r.
A rtykuł zaakceptow ano 29 kw ietnia 2008 r.
Słowa kluczowe: genom m itochondrialny,
m tD N A , ewolucja, rośliny, zw ierzęta
Wykaz skrótów: CMS — cytoplazm atyczna
m ęskosterylność (ang. cytoplasmic male sterili­
ty); HSP — prom otor nici H (ang. H strand pro­
moter); LSP — prom otor nici L (ang. L strand
promoter); m tD N A — m itochondrialny D N A
(ang. mitochondrial DNA); mTERF — m ito­
chondrialny czynnik term inacji transkrypcji
(ang. mitochondrial termination factor); TFAM,
TFB1M, TFB2M — m itochondrialne czynniki
transkrypcyjne A, BI, B2 (ang. mitochondrial
transcription factors A, B l, B2)
nformacja o właściwościach komórek eukariotycznych jest zapisana nie tylko w jądrze
komórkowym, ale także w genomach zlokalizowanych w mitochondriach i chloropla­
stach. Porównanie genom ów mitochondrialnych roślin i zwierząt pozwala zauważyć dw ie
zupełnie odm ienne strategie ewolucyjne. Zwierzęta cechuje wyraźne dążenie do maksym al­
nej redukcji w ielkości genom u mitochondrialnego i uproszczenia odczytu zawartej w nim
informacji genetycznej. U roślin, przeciwnie, obserwuje się znaczne zw ięk szen ie wielkości
tego genomu oraz nagromadzenie bardzo nietypowych rozwiązań dotyczących utrzymywa­
nia oraz ekspresji informacji genetycznej.
I
WSTĘP
Rośliny oraz zwierzęta są najbardziej uorganizow anym i organizm am i wielo­
kom órkow ym i obecnymi na Ziemi. Te grupy organizm ów realizują dwie zu peł­
nie odm ienne strategie ewolucyjne. Rośliny nie potrafią się przemieszczać i są
organizm am i autotroficznymi, czerpiącymi energię potrzebną do życia w proce­
sie fotosyntezy. Natomiast zwierzęta, jako organizm y heterotroficzne, aktyw nie
poszukują pożywienia, co doprow adziło do pojawienia się takich cech, jak stałocieplność i złożony system nerw ow y. O bydw ie strategie ewolucyjne okazały
się niezwykle efektywne, przez co rośliny i zw ierzęta stały się dom inującym i
grupam i organizm ów na Ziemi.
W ymienienie i opis wszystkich cech różniących rośliny i zw ierzęta w ykra­
cza poza ram y niniejszego artykułu. Informacja o tych różnicach zapisana jest
w genom ach poszczególnych organizm ów . Używając słowa „genom ", zazw y­
czaj mam y na myśli DNA zlokalizowany w jądrze kom órkow ym . W arto jednak
pamiętać, że niewielka, aczkolwiek bardzo w ażna, część informacji genetycznej
każdego organizm u eukariotycznego jest zapisana poza jądrem kom órkow ym .
Tym dodatkow ym miejscem w ystępow ania informacji genetycznej są mitochondria, a w przypadku roślin — także chloroplasty. Zatem oprócz genom u
głównego, obecnego w jądrze kom órkow ym , typow a kom órka eukariotyczna
zaw iera kilkaset-kilka tysięcy kopii znacznie mniejszych genom ów obecnych na
terenie cytoplazmy. Celem niniejszego artykułu jest zaprezentow anie najistot­
niejszych i dobrze udokum entow anych różnic w strukturze i zawartości infor­
macji genetycznej obecnej w genom ach m itochondrialnych roślin i zwierząt.
Przedstaw ione zostaną rów nież najważniejsze różnice w systemie ekspresji tej
informacji. Większość prezentow anych danych dośw iadczalnych dotyczy roślin
okrytozalążkowych oraz ssaków, w szczególności człowieka. Wynika to z tego,
że prow adzone badania koncentrują się głównie na tych dw óch grupach syste­
matycznych.
POCHODZENIE I EWOLUCJA MITOCHONDRIÓW
Powszechnie uznaw aną obecnie teorią wyjaśniającą pochodzenie m itochon­
driów jest teoria endosym biozy [1-3], Endosym biotyczne pochodzenie m ito­
chondriów potwierdzają w szczególności analizy porów naw cze sekwencji ge­
nom ów mitochondrialnych oraz genom ów bakteryjnych. Ich w yniki dow odzą,
że m itochondria wszystkich eukariontów w yw odzą się od jednego w spólnego
przodka, którym był organizm z grupy a-proteobakterii [1,2,4].
Powstałe w w yniku endosym biozy protom itochondrium ulegało szybkiej
ewolucji, dostosowując się do w aru nków panujących w ew nątrz kom órki gospo­
darza. Jednym z najważniejszych etapów tej ewolucji było przenoszenie genów
z genom u protom itochondrium do jądra komórkowego. Prow adziło to do stop­
niowej redukcji genom u m itochondrialnego i tym sam ym — w zrostu zależności
m itochondriów od genom u jądrow ego [5], W ew nątrzkom órkow y transfer ge­
nów zachodził szczególnie intensyw nie w pierw szych etapach ewolucji mito-
142
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
chondriów . Liczba m itochondrialnych genów u kręgowców
osiągnęła stałą w artość i obecnie nie ulega już w iększym
zm ianom [6]. N atom iast u roślin okrytozalążkow ych znane
są przykłady współcześnie zachodzącego transferu genów
z m itochondriów do jądra kom órkow ego [7,8], W toku ew o­
lucji powstało szereg ścieżek sygnałow ych zapewniających
wzajem ną kom unikację pom iędzy genom em jądrow ym
i genom am i zlokalizow anym i w organellach: m itochon­
driach i chloroplastach. Jej celem jest koordynacja ekspresji
wszystkich genom ów obecnych w komórce eukariotycznej
[9-11].
ORGANIZACJA GENOMU MITOCHONDRIALNEGO
ZAWARTOŚĆ INFORMACJI GENETYCZNEJ
Obecnie znanych jest prawie 1300 pełnych sekwencji geno­
m ów mitochondrialnych, co umożliwia bardziej obszerną ana­
lizę porównawczą mitochondrialnego DNA (mtDNA) (baza
OGMP, http://m egasun.bch.um ontreal.ca/ogm p ). W praw ­
dzie większość z nich to genomy zwierzęce, ale obecnie pozna­
no również sekwencje siedmiu genomów roślin wyższych, ta­
kich jak: burak cukrowy, kukurydza, tytoń, ryż, rzepak, psze­
nica oraz rzodkiewnik pospolity — Arabidopsis thaliann [12].
Jedną z najistotniejszych różnic pom iędzy genom am i mitochondrialnym i roślin i zw ierząt jest ich wielkość. N a ogół
genom y m itochondrialne zw ierząt mają bardzo podobny
rozm iar (15-20 kb) oraz zestaw genów [6], N atom iast mitochondria roślinne zawierają olbrzymie genom y wielkości
rzędu 200-2500 kb [12]. Cechą charakterystyczną genom ów
m itochondrialnych roślin jest nie tylko ich duży rozmiar,
ale rów nież d uża zm ienność ich wielkości, naw et w obrębie
jednego gatunku. N a przykład, ekotyp NB ku kurydzy zw y­
czajnej posiada genom m itochondrialny o wielkości 570 kb,
podczas gdy w ekotypie CMS-C znaleziono genom o wiel­
kości 740 kb [12].
Pomimo dużych różnic w wielkości mitochondrialnych ge­
nom ów roślin i zwierząt liczba genów obecnych w obydw u ty­
pach genomów nie różni się aż tak znacznie. Typowy zwierzę­
cy mtDNA zawiera ok. 37 genów [6], W genomach mitochon­
drialnych roślin wyższych przeciętnie spotyka się ok. 50-60
genów. Informacja genetyczna zawarta w obu genomach obej­
muje dw a lub trzy geny rRNA, zmienny zestaw genów tRNA
i ograniczoną liczbę genów kodujących białka zaangażowane
w proces fosforylacji oksydacyjnej [13]. Na „nadmiarowe" 20
genów u roślin składają się głównie białka wchodzące w skład
mitochondrialnych rybosomów, kilka białek zaangażowa­
nych w syntezę cytochromu c oraz dodatkowe podjednostki
kompleksów łańcucha oddechowego [12]. Zestawy genów
obecnych w mitochondriach roślin i zwierząt zostaną bardziej
szczegółowo omówione na przykładzie człowieka (Ryc. 1) [14]
oraz rzodkiewnika A. thaliana (Ryc. 2) [15-17].
W m tD N A A. thaliana występują trzy geny
kodujące rRNA: 18S rRNA, budujące małą
podjednostkę rybosom u, oraz 26 rRNA i 5S
rRNA, w chodzące w skład dużej podjednost­
ki rybosom u. N atom iast w m tD N A człowie­
ka m ożna znaleźć tylko dw a geny rRNA. Są
to 12S rRN A i 16S rRNA, wchodzące w skład,
odpow iednio, małej i dużej podjednostki rybosomalnej. G en 5S rRNA jest nieobecny w
genomie m itochondrialnym człowieka, ale
koniec 3' ludzkiego 16S rRNA wykazuje 68%
hom ologię sekwencji do 5S rRNA Bacillus subtilis. Sugeruje to, że w toku ewolucji doszło u
zwierząt do połączenia dw óch genów rRNA
w jeden [18],
Rycina 1. O rganizacja geno m u m itochondrialnego człow ieka. Pow iększono o bszar zaw ierający ele­
m enty istotne w procesie transkrypcji. Kolory: czerw ony — geny tRNA, brą z o w y — geny rRN A ,
niebieski — geny kodujące białka, szary — sekw encje prom otorow e. D ok ładny opis w tekście.
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
W m itochondriach człowieka oraz rzo d ­
kiewnika A. thaliana zaw arta jest informacja o
22 cząsteczkach tRNA [14,17], W przyp adk u
człowieka jest to zestaw w zupełności w ystar­
czający do odczytania wszystkich kodonów
obecnych w m itochondrialnych genach ko­
dujących białka. Tak nie jest w przyp adku A.
thaliana. Osiemnaście z 22 genów tRNA obec­
nych w genom ie rzodkiew nika to geny unika­
towe, pozostałe 4 to ich kopie [17], Obecność
osiem nastu różnych cząsteczek tRNA jest nie­
wystarczająca do zakodow ania wszystkich
am inokw asów używ anych do syntezy białek.
Trzynaście dodatkow ych cząsteczek tRNA
jest transportow anych do m itochondriów z
cytoplazmy. Brak pełnego zestaw u genów
tRNA obserw uje się we wszystkich opisa­
nych do tej pory genom ach roślinnych [17],
143
o
zostałych 6 poznanych ge­
nom ach m itochondrialnych
roślin w yższych różnią się
nieznacznie, w głównej m ie­
rze liczbą genów kodujących
białka rybosom alne (od 6 do
11). Ponadto, w genomie m i­
tochondrialnym tytoniu zna­
leziono 2 podjednostki kom ­
pleksu II (geny sdh3 i sdh4),
a gen ccmFN u rzepaku i A.
thaliana został podzielony na
2 odrębne geny [12].
Jak widać z tego p o ró w n a­
nia,
genom m itochondrialny
człowiek
rzodkiew nika, pom im o że
jest 22-krotnie większy, ko­
duje tylko 1,5 raza więcej ge­
nów (Ryc. 2). Liczba genów
u tego gatunku może jeszcze
ulec zwiększeniu. W jego
genomie m itochondrialnym
odnaleziono bow iem ponad
150 otw artych ram ek o d ­
czytu, mogących kodować
białka o długości ponad 100
Arabidopsis thaliana
am inokw asów [17]. Stano­
wią one łącznie ponad 10%
Rycina 2. O rganizacja geno m u m itoch ondrialn eg o rzodkiew nika Arabidopsis thaliana. Dla p o rów nania u m ieszczono czą­
steczkę m tD N A człow ieka w skali 1:1. Kolory: czerw on y — geny tRNA, b rązow y — geny rRN A , niebieski — geny kodujące
genomu. Na ogół nie w yka­
białka.
zują one znaczącej homologii
do żadnych znanych genów.
N iektóre z nich zawierają
fragm enty „klasycznych" genów obecnych w genomie m i­
N astępna różnica pom iędzy genam i tRNA w genomie
tochondrialnym . Znaczenie tych dodatkow ych ram ek o d ­
m itochondrialnym roślin i zw ierząt dotyczy ich pochodze­
czytu pozostaje nieznane. W ykazano, że przynajmniej nie­
nia. U człowieka wszystkie geny tRNA, to geny w yw odzące
które z nich ulegają transkrypcji [20],
się od endosym bionta, który dał początek mitochondriom.
U rzodkiew nika tylko 12 unikatow ych genów tRNA to takie
UPAKOWANIE INFORMACJI GENETYCZNEJ
geny. Pozostałe 6 genów tRNA w ykazuje największe podo­
bieństw o do sekwencji genów tRNA obecnych w chloropla­
stach [17]. Ponadto, w genomie m itochondrialnym buraka
cukrow ego znaleziono gen tRNA, który nie w ykazuje istot­
nej homologii do żadnej znanej sekwencji tRNA [12]. Obec­
ność genów tRNA przejętych z innych system ów ekspresji,
a zwłaszcza z chloroplastów, jest cechą charakterystyczną
m itochondriów roślinnych.
Geny kodujące białka są ostatnią klasą genów w ystępują­
cych w genom ach mitochondrialnych. Liczebność tej klasy
genów wykazuje największe różnice pom iędzy roślinami i
zwierzętami. Ludzki m tD N A koduje zaledw ie 13 białek. Je­
denaście z nich w chodzi w skład kom pleksów łańcucha od­
dechowego, a 2 w skład syntazy ATP (Tabela 1). W mtDNA
rzodkiew nika zidentyfikow ano 32 geny. Osiemnaście z
nich, czyli ponad połowa, koduje podjednostki czterech
kom pleksów system u fosforylacji oksydacyjnej. Siedem
genów koduje białka rybosomalne, a 5 genów koduje biał­
ka zaangażow ane w syntezę cytochrom u c. Dwa pozostałe
geny kodują białko zaangażow ane w transport centrów żelazowo-siarkowych z m itochondriów (gen mttB) oraz maturazę uczestniczącą praw dopodobnie w w ycinaniu intronów
(gen tnat-R [19]). Zestaw y genów kodujących białka w po­
144
Cechą charakterystyczną genomu mitochondrialnego czło­
wieka jest jego ekstremalne upakowanie. Geny nie zawierają
intronów, a sekwencje międzygenowe są nieobecne lub obej­
mują zaledwie kilka par zasad. Niektórym genom struktural­
nym brakuje pełnej sekwencji kodonu STOP, która jest tw o­
rzona w wyniku potranskrypcyjnej poliadenylacji mRNA.
Geny dla rRNA i tRNA są niezwykle małe. Geny dla tRNA
nie zawierają sekwencji -CCA obecnej na końcu 3' cząsteczki.
Sekwencja ta jest później dodaw ana w wyniku potranskrypcyjnej modyfikacji. Sekwencje dwóch par genów: ATP8 i ATP6
oraz ND4L i ND4 zachodzą na siebie na obszarze, odpow ied­
nio, 46 i 7 nukleotydów. W mtDNA występują dw a regiony
niekodujące. Dłuższy (ok. 1,1 kb), określany mianem pętli D,
znajduje się pomiędzy genami kodującymi tRNAphe i tRNAPro
(Ryc. 1). W regionie pętli D znajdują się elementy regulujące
transkrypcję i replikację mtDNA, m.in. miejsca inicjacji trans­
krypcji dla obydw u nici oraz miejsce startu replikacji nici H
(Oh). Drugi obszar niekodujący jest krótki (ok. 30 pz) i zawiera
miejsce startu replikacji nici L (O,) [14,18,21], W sumie sekwen­
cje regulatorowe i niekodujące stanowią mniej niż 10%, co sta­
wia zwierzęce genomy mitochondrialne wśród najbardziej
„upakowanych" genomów występujących w przyrodzie.
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
Tabela 1. Po rów nanie genów obecnych w genom ie m itochon drialnym człow ieka i A. thaliana.
Rodzaj genu
G eny rRNA
C złow iek
2
G eny tRNA
22
22 (18)1
Podjednostki system u oksydacyjnej fosforylacji. W tym:
13
32
K om pleks I
7
9
K om pleks III
1
1
K om pleks IV
3
3
K om pleks V
2
5
Biogeneza cytochrom u c
-
5
Białka rybosom alne
-
7
A. thaliana 1
3
T ransport białek
1
Inne
1
'22 to całkow ita liczba genów tRNA w m tD N A rzodkiew nika. 18 genów tRNA to
geny unikatow e, pozostałe cztery to ich kopie.
Rośliny p od w zględem upakow ania informacji genetycz­
nej w genom ach m itochondrialnych stanow ią przeciw ień­
stw o zwierząt. U roślin sekwencje m tD N A kodujące geny
stanow ią zaledw ie kilkanaście procent całego genom u [12],
np. u A. thaliana jest to 18% (Ryc. 2) [17]. Pozostałe 82% to
sekwencje niekodujące. W śród nich są m. in. introny, pseudogeny oraz sekwencje pow tórzone. W om aw ianym geno­
mie m itochondrialnym A. thaliana introny stanow ią blisko
9% całej sekwencji mtDNA. Sekwencje pow tórzone o różnej
długości stanow ą kolejne 7% genomu. Jak dotąd w m tD N A
A. thaliana zidentyfikow ano 3 pseudogeny [12].
C harakterystyczne dla roślin jest w ystępo w anie w ge­
nom ach m itochondrialnych sekwencji nu kleotydow ych
hom ologicznych do sekwencji w ystępujących w DN A ją­
d ro w y m i chloroplastow ym . Obecność w m tD N A sekw en­
cji obecnych w innych genom ach jest zw iązana z dużą
skłonnością m itochondriów roślinnych do pobierania ob­
cego DNA. A nalizy porów naw cze w ykazały, że w geno­
mie m itochondrialnym A. thaliana 4% stanow ią sekwencje
obecne rów nież w jądrze kom órkow ym , a 1,2% to sekw en­
cje spotykane rów nież w chloroplastach. W m tD N A A. tha­
liana znaleziono także dw ie otw arte ram ki odczytu, któ­
rych sekwencje przypom inają polim erazy RNA zależne od
RNA typow e dla w irusów RNA znalezionych u niektórych
grzybów , będących roślinnym i patogenam i [17], O znacza
to, że do m itochondrialnych genom ów roślin dostają się
nie tylko fragm enty z genom ów znajdujących się w bezp o­
śred nim sąsiedztw ie (jądro kom órkow e, chloroplasty), ale
rów nież z genom ów organizm ów , z którym i roślina miała
styczność. Pochodzenie ponad połow y sekwencji niekodujących obecnych w genom ie m itochondrialnym A. thaliana
i innych roślin pozostaje nieznane [17]. Przypuszczalnie
są to rów nież sekwencje nabyte w w yniku h oryzontaln e­
go transferu genów , ale p raw d o p o d o b n ie w w yniku czę­
stych rearanżacji m tD N A szybko utraciły podobieństw o
do sw ych oryginałów.
W linii ewolucyjnej zw ierząt w yraźnie zauw ażalna jest
tendencja do zmniejszenia rozm iaru m tD N A oraz m aksy­
m alnego jego upakow ania. W genom ach m itochondrial­
nych roślin zaznacza się w praw d zie tendencja do eliminacji
kolejnych genów [7,8], jednak presja selekcyjna, faworyzują­
ca krótsze cząsteczki mtDNA, została w yraźnie utracona w
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
toku ewolucji. Najpraw dopodobniej stało się to
na etapie pow stania roślin okrytozalążkowych.
U tej grupy roślin obserwuje się bowiem gwał­
towne zwiększanie się wielkości genom ów mi­
tochondrialnych [12]. M itochondria roślin okry­
tozalążkow ych utraciły kontrolę nad wielkością
swojego genom u i chłoną jak gąbka wszelkiego
rodzaju cząsteczki DNA, które znajdą się na ich
terenie. Pow iększaniu rozm iarów genom u m ito­
chondrialnego sprzyja naturalna zdolność mito­
chondriów roślinnych do im portu zarów no RNA
[22], jak i DNA [23], co ułatw ia dostaw anie się do
nich obcego materiału genetycznego.
STRUKTURA GENOMU
MITOCHONDRIALNEGO
G enom m itochondrialny człowieka, podobnie
jak innych zwierząt, jest niewielką kolistą czą­
steczką DNA (Ryc. 1) [14]. Zwyczajowo genom m itochon­
drialny roślin w yższych również przedstaw ia się w postaci
kolistej cząsteczki DNA zawierającej całość informacji ge­
netycznej obecnej w mitochondriach. Taka cząsteczka nosi
nazw ę genom u głów nego (ang. master genome). Jednak jak
dotychczas nie udało się eksperym entalnie potw ierdzić ist­
nienia tak dużych cząsteczek w m itochondriach roślin. Po­
stuluje się, że mogą one w ystępow ać jedynie w komórkach
m erystem atycznych [24], W pozostałych kom órkach genom
mitochondrialny roślin jest złożony z wielu cząsteczek o róż­
nym rozmiarze, utrzym yw anych w dynamicznej ró w n ow a­
dze w w yniku rekombinacji zachodzącej pom iędzy długimi
sekwencjami pow tórzonym i [25]. Cząsteczki te przedstaw ia
się w m odelach organizacji genom ów roślinnych jako czą­
steczki koliste, ale in vivo najpraw dopodobniej m ogą one
przybierać również formę liniową. W m itochondriach ro­
ślin, obok cząsteczek kolistych i liniowych o różnej wiel­
kości, ale mniejszej niż genom główny, m ogą w ystępow ać
cząsteczki liniowe o długości przekraczającej kilkukrotnie
wielkość genom u głównego. Praw dopodobnie są one w y­
nikiem replikacji kolistego DNA w edług m odelu toczące­
go się koła lub też m ogą pow staw ać poprzez łączenie się
krótszych cząsteczek w w yniku rekombinacji. W m itochon­
driach roślin obserwuje się rów nież cząsteczki rozgałęzione
lub w kształcie rozety, a także cząsteczki jednoniciowego
mtDNA. Są one najpraw dopodobniej stanami pośrednim i
procesów replikacji i rekombinacji [25],
W m itochondriach roślin, jak również zwierząt, obok do ­
minującego genom u m itochondrialnego w ystępow ać mogą
alternatyw ne genom y mitochondrialne. Stan organizm u, w
którym występuje więcej niż jeden genom m itochondrialny
nazyw am y heteroplazmią. Stosunek alternatyw nych geno­
m ów m itochondrialnych w heteroplazamatycznej populacji
m oże być różny. Zazwyczaj jednak jeden z genom ów w y ­
raźnie dom inuje i decyduje o fenotypie. U zw ierząt pojawie­
nie się heteroplazm ii w iązano z chorobami mitochondrialnym i i procesem starzenia, ale ostatnio w ykryto ją rów nież
u ludzi zdrow ych [26], U roślin w ykazano, że zm iany w
heteroplazm atycznej populacji cząsteczek m tD N A mogą
doprow adzać do zm ian fenotypow ych, np. pojawienia się
cytoplazmatycznej męskosterylności (CMS, ang. cytoplasmic
małe sterility), polegającej na tym, że roślina nie jest w sta­
http://rcin.org.pl
145
nie w ytw arzać witalnego pyłku [27], Pom im o że heteroplazmia jest stanem obecnym w obu grupach organizm ów, to
głów ne m echanizm y odpow iedzialne za jej pow staw anie są
różne. U roślin najczęstszym m echanizm em , który dopro­
w adza do pow stania alternatyw nego genom u na poziomie
substechiom etrycznym , jest nieodw racalna rekombinacja
nieupraw niona. N atom iast u zw ierząt heteroplazm ia jest
najczęściej wynikiem błędów w czasie replikacji, nieefek­
tyw nych procesów napraw czych czy reakcji m tD N A z reak­
tyw nym i form am i tlenu. W w yniku tych procesów powstają
alternatyw ne genom y różniące się od w zorcow ego mutacja­
mi punktow ym i, małym i delecjami lub duplikacjami [26],
Oprócz genomu mitochondrialnego, w mitochondriach ro­
ślin mogą występować samoreplikujące się plazm idy liniowe
o wielkości 2-13 kb. Obecność takich cząsteczek stwierdzono
w mitochondriach 8 gatunków roślin, m.in. kukurydzy Zea
mays [28]. Kodują one zazwyczaj polimerazę RN A lub polimerazę DNA grupy B, charakterystyczne dla niektórych
w irusów i bakteriofagów. Ich budow a przypom ina DNA
transpozonów z charakterystycznymi krótkimi terminalny­
mi powtórzeniami. Analiza sekwencji wskazuje, że plazmidy
liniowe obecne w mitochondriach roślin są spokrewnione z
podobnym i plazmidami obecnymi w mitochondriach grzy­
bów fitopatogennych i praw dopodobnie trafiły do roślin w
w yniku horyzontalnego transferu genów [28]. Obecność pla­
zm idów liniowych wskazuje, że obcy DNA, który dostał się
do roślinnego m itochondrium jest nie tylko włączany do ge­
nom u mitochondrialnego, ale może utrzym yw ać się na tere­
nie mitochondriów w postaci niezależnych replikonów.
cjami powtórzonymi (ang. short repeats) [34], Rekombinacja
homologiczna, charakteryzująca się wysoką częstotliwością
i odwracalnością, jest odpowiedzialna za wielocząsteczkową
strukturę genomu mitochondrialnego. Rekombinacja między
krótkimi sekwencjami powtórzonymi zachodzi sporadycznie,
jest nieodwracalna i odpowiada za powstawanie alternatyw­
nych form genomu zwanych sublimonami. Przebudowane w
ten sposób cząsteczki mtDNA mogą być utrzymywane przez
wiele pokoleń bez zmian lub ulec selektywnej amplifikacji, sta­
jąc się formą dominującą mtDNA [35,36].
EKSPRESJA INFORMACJI GENETYCZNEJ
W MITOCHONDRIACH
TRANSKRYPCJA GENÓW KODOWANYCH W mtDNA
Biorąc pod uw agę pochodzenie m itochondriów, m ożna
byłoby się spodziewać, że polim eraza RNA, w ystępująca w
mitochondriach, będzie typ u bakteryjnego. Tymczasem za
transkrypcję w m itochondriach zwierzęcych i roślinnych,
i innych do tej pory zbadanych, odpow iedzialna jest poli­
m eraza RNA wykazująca największe podobieństw o do polimeraz w irusów bakteryjnych [37,38], Jedynym wyjątkiem
jest pierw otniak Reclinomonas ameńcana posiadający naj­
bardziej pierwotny, z dotychczas opisanych, genom mitochondrialny [1]. W genom ie tym w ystępują geny kodujące
wielopodjednostkow ą polim erazę podobną do polimeraz
RNA eubakterii. Sugeruje się, że w toku ewolucji, na bardzo
wczesnym etapie, doszło do w yelim inow ania polimerazy
RNA typu bakteryjnego i zastąpienia jej polim erazą RNA
pochodzącą z w irusów bakteryjnych.
REKOMBINACJA mtDNA
Obecność rekombinacji w mitochondriach ssaków, a
zwłaszcza w mitochondriach człowieka, była poddaw ana
bardzo w nikliw ym analizom. Związane jest to z tym, że brak
tego zjawiska zakładają wszelkie badania dotyczące ewolucji
człowieka oparte o analizę sekwencji mtDNA. Obecnie domi­
nuje pogląd, że w mitochondriach ssaków rekombinacja nie
zachodzi. Sporadycznie pojawiają się pojedyncze doniesienia
wskazujące na możliwość rekombinacji ludzkiego mtDNA.
Jednak interpretacja tych doniesień bywa kontrowersyjna.
Przykładem mogą być prace, które wskazywały, że przeja­
w em rekombinacji mtDNA u człowieka jest zjawisko homoplazji, polegające na w ystępow aniu tych samych mutacji w
różnych liniach ewolucyjnych mtDN A [29], Homoplazja w
ludzkim m tD N A jest zjawiskiem dosyć powszechnym. O b­
serwow ano ją m. in. w badaniach dotyczących populacji pol­
skiej [30], Jednak bardziej dokładne analizy wskazują, że zja­
wisko homoplazji jest wynikiem w ystępowania w mtDNA
tzw. gorących miejsc mutacji, czyli miejsc, w których mtDNA
szczególnie często jest narażony na mutacje [30-32],
Zjawisko rekombinacji mtDNA jest jedną z najbardziej w y­
różniających się cech mitochondriów roślinnych wpływającą
pośrednio na wiele innych właściwości tych organelli. Rekom­
binacja pomiędzy powtarzającymi się sekwencjami DNA jest
głównym czynnikiem wpływającym na obserwowaną struk­
turę genomu mitochondrialnego u roślin wyższych [33]. W
mitochondriach roślin zachodzą dw a typy rekombinacji: ho­
mologiczna pomiędzy długimi sekwencjami powtórzonymi
(ang. long repeats) i rekombinacja pomiędzy krótkimi sekwen­
146
G łów ne różnice pom iędzy m itochondriam i różnych
gru p system atycznych w ystępują na etapie inicjacji i terminacji transkrypcji. W p ew nym stopniu różnice te w y n i­
kają z odm iennej organizacji genom u m itochondrialnego.
Proces transkrypcji w m itochondriach zw ierzęcych został
dop asow any do „kom paktow ej" organizacji genom u m i­
tochondrialnego i obejmuje praktycznie całą cząsteczkę
DNA. W m tD N A człow ieka znajdują się d w a p rom otory
(LSP i HSP) zlokalizow ane w obrębie pętli D (Ryc. 1). K aż­
dy z nich służy do transkrypcji jednej z nici m tD N A (o dp o­
w iednio nici L i nici H). W obrębie obrębie prom o tora HSP
w ystępują dw a miejsca inicjacji transkrypcji (HSP1 i HSP2).
Transkrypcja z miejsca HSP2 obiega p raw ie całą cząsteczkę
m tD N A i ulega terminacji zaraz za genem tRN A Phe. P ro w a­
dzi to do pow stania długiego preku rso ra obejmującego całą
nić H. N atom iast transkrypcja rozpoczęta w miejscu HSP1
ulega terminacji za genem 16S rRN A i służy do syntezy
krótkiego transkryptu obejmującego głów nie geny rRNA.
Za terminację transkrypcji o d p o w ia d a białko mTERF w ią­
żące się w obrębie genu tR N A Leu(UUR) (Ryc. 1). Transkrypcja
nici L, rozpoczęta w obrębie prom otora LSP, obejmuje całą
sekwencję m tD N A i ulega terminacji najpraw dopodobniej
w obrębie w iązania czynnika mTERF [39].
Ze względu na znacznie większe rozmiary genomu i roz­
proszenie genów w obrębie całej sekwencji mtDNA, u roślin
występuje znacznie więcej promotorów. Dany prom otor
może kierować transkrypcją tylko jednego genu, ale czasami
pojedynczy prom otor służy do ekspresji kilku genów położo­
nych blisko siebie [40-42], Promotory dla różnych grup genów
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
(geny rRNA, tRNA oraz geny kodujące białka) są podobne
[20,40]. Sekwencje prom otorów w genomach mitochondrial­
nych są bardzo zmienne i słabo zachowane pom iędzy róż­
nymi gatunkam i roślin okrytozalążkowych [43,44]. Cechą
unikalną procesu transkrypcji w roślinnych mitochondriach
jest obecność kilku prom otorów dla pojedynczego genu [44],
Znaczenie tego zjawiska jest nieznane. Jednym z możliwych
jest regulacja poziomu transkrypcji poszczególnych genów.
Kolejną cechą charakterystyczną transkrypcji w m ito­
chondriach roślin jest to, że transkrypcji ulegają nie tylko
fragm enty m tD N A kodujące geny, ale rów nież obszary niekodujące. Ekspresji m ogą ulegać także nici antysensowe. Na
przykład, dla 5 przebadanych genów u A. thaliana oprócz
norm alnych transkryptów znaleziono rów nież ich antysensow e odpow iedniki [20], Nie w iadom o natomiast, w
jaki sposób przebiega terminacja transkrypcji w roślinnych
mitochondriach, bow iem jak dotychczas nie zdefiniowano
miejsc terminacji transkrypcji [20]. Niewykluczone, że ta­
kich miejsc nie ma, a terminacja transkrypcji jest w yznacza­
na określoną procesywnością polim erazy RNA.
Porów nanie ekspresji genom u m itochondrialnego u
roślin i zw ierząt wskazuje, że przepisaniu na RNA ulega
praktycznie cała, a przynajmniej znacząca część sekwencji
m tD N A u obydw u grup organizm ów . Jednak stan ten jest
osiągany w zupełnie odm ienny sposób. U zw ierząt obszary
m tD N A ulegające transkrypcji są ściśle zdefiniowane. N ato­
miast wydaje się, że u roślin etap transkrypcji m a zapewnić
syntezę cząsteczek RNA obejmujących duże i słabo zdefi­
niow ane obszary mtDNA, a kontrola tego, które cząsteczki
RNA są potrzebne zachodzi na etapach potranskrypcyjnych,
przede w szystkim na poziom ie degradacji RNA [20,42],
WYCINANIE INTRONÓW
Jednym z etapów potranskrypcyjnej obróbki RNA w mito­
chondriach roślinnych, nie występującym w mitochondriach
zwierzęcych jest wycinanie intronów. Brak intronów w geno­
mach mitochondriów zwierzęcych, jest związany zapew ne z
silną tendencją do eliminacji zbędnych sekwencji DNA z tych
genomów. W genomie mitochondrialnym A. thaliana introny
stanowią około 9% sekwencji mtDNA [17]. Geny znajdujące
się w tym genomie zawierają 23 introny grupy II o długości
od 485 do 4000 nukleotydów. Niektóre geny zawierają więcej
niż jeden intron. Jeden z intronów w genie nadl koduje maturazę (gen mat-R) [15,19]. Zupełnie wyjątkowym zjawiskiem,
które występuje w mitochondriach roślinnych jest obecność
intronów ulegających wycinaniu z pozycji trans (ang. transsplicing introns) [19]. W wyniku częstych rekombinacji w y­
stępujących w mitochondrialnych genomach roślin może
się zdarzyć, że gen zostanie rozerwany w obrębie intronu.
Powstałe dwie oddalone od siebie części genu ulegają nie­
zależnej transkrypcji. W procesie trans-wycinania dochodzi
do złożenia dwóch transkryptów kodujących odpowiadają­
ce sobie połówki genu, odtworzenia odpowiedniej struktury
rozerwanego intronu, a następnie do jego wycięcia. Przykła­
dowo, w genomie mitochondrialnym A. thaliana i ryżu zna­
leziono odpow iednio 5 i 6 takich „trans-intronów". Niektóre
geny zawierają dw a lub trzy „trans-introny", co oznacza, że
ostateczne cząsteczki mRNA są składane z 3-4 niezależnie
powstałych transkryptów [19].
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
REDAGOWANIE RNA
Jedną z najbardziej zdumiewających cech potranskrypcyj­
nej obróbki RNA w mitochondriach roślin jest wykorzystanie
na szeroką skalę zjawiska redagowania RNA, którego nie ob­
serwuje się w mitochondriach zwierząt. Redagowanie w mi­
tochondriach roślinnych polega na zamianie U w C, albo C w
U w RNA, przy czym ten drugi typ modyfikacji jest znacznie
bardziej rozpowszechniony. Wykonane w 1999 roku porów ­
nanie sekwencji mitochondrialnego genomu A. thaliana z se­
kwencjami cDNA pozwoliło na zidentyfikowanie 441 miejsc
ulegających redagow aniu [45], aczkolwiek od tamtego czasu
ukazały się prace opisujące kolejne miejsca ulegające redago­
waniu [20,41]. Redagowanie dotyczy głównie fragmentów
RNA kodujących białka. Stosunkowo niewiele miejsc ule­
gających redagow aniu występuje w sekwencjach niekodujących, zaś redagowanie rRNA i tRNA zdarza się stosunkowo
rzadko. Dokładna rola redagow ania RNA nie jest znana. Jed­
nak analizy w ykonane dla A. thaliana sugerują, że redagow a­
nie na ogół prow adzi do zwiększenia hydrofobowości białek
mitochondrialnych. Przykładowo, spośród 425 kodonów
ulegających redagowaniu u A. thaliana 41,5% koduje przed
redagow aniem aminokwasy o charakterze hydrofobowym.
Po ich przeredagow aniu udział am inokwasów hydrofobo­
wych w zrasta do 85% [45], W redagow aniu RNA uczestniczą
białka z rodziny PPR kodow ane w jądrze kom órkow ym [46],
Zatem, ostateczna sekwencja białek syntetyzowanych w mi­
tochondriach roślin wyższych zależy nie tylko od sekwencji
mtDNA, ale częściowo jest zapisana w DNA jądrow ym w
postaci białek odpowiedzialnych za redagowanie RNA.
DOJRZEWANIE KOŃCÓW 3' I 5' TRANSKRYPTÓW
W genomie mitochondrialnym człowieka geny rRNA i
prawie wszystkie geny kodujące białka są otoczone genami
kodującymi tRNA, które odgrywają kluczową rolę w obróbce
policistronowych transkryptów RNA. Postuluje się, że transkrypty rRNA i mRNA są niejako ubocznymi produktam i
wycinania cząsteczek tRNA z policistronowych prekursorów
[47], W pierwszej kolejności jest uw alniany koniec 5' tRNA, a
następnie jego koniec 3'. Za obróbkę końców 5' i 3' tRNA są
odpowiedzialne, odpowiednio, rybonukleaza P oraz tRNAza
Z [48,49], Uwolnione cząsteczki rRNA są w budow yw ane w
rybosomy, natomiast cząsteczki tRNA i mRNA są podd aw a­
ne dalszym obróbkom. W przypadku tRNA jest to dodanie
sekwencji -CCA przez nukleotydylotransferazę ATP(CTP)
specyficzną dla tRNA i modyfikacje określonych zasad
azotowych. Natomiast ostatnim etapem obróbki cząsteczek
mRNA jest ich poliadenylacja.
W mitochondriach roślin cząsteczki tRNA są syntetyzowa­
ne jako dłuższe, mono- lub policistronowe prekursory [40],
Nadm iarowe sekwencje po stronie 5' i 3' są następnie usu­
wane przez rybonukleazę P oraz RNAzę Z [38,50], Następnie
cząsteczka tRNA ulega dalszym modyfikacjom. Podobnie, jak
w przypadku mitochondriów zwierzęcych jest to dodanie se­
kwencji -CCA oraz modyfikacje zasad azotowych. Niedawno
okazało się, że w mitochondriach roślin rybonukleaza P oraz
RN Aza Z uczestniczą także w obróbce prekursorów cząsteczek
mRNA [41]. Jak już wcześniej wspomniano, mitochondrialne
transkrypty u roślin nie mają ściśle zdefiniowanych miejsc
terminacji. Tymczasem okazało się, że cząsteczki mRNA u A.
http://rcin.org.pl
147
thaliana mają ściśle zdefiniowany koniec 3'. Wykazano, że na
końcach 3' transkryptów mRNA występują struktury w po­
staci jednej lub kilku tzw. szpilek do włosów (ang. stem-loop
structures) lub tzw. elementy t, które swoją strukturą przypo­
minają strukturę tRNA. Jedną z funkcji tych struktur jest nakierowywanie RN Azy P i/lu b RN Azy Z w odpowiednie miejsce
prekursora mRNA w celu utworzenia odpowiedniego końca
3'. Drugą istotną funkcją elementów t i szpilek do włosów na
końcach 3', o której warto wspomnieć, jest regulacja stabilności
cząsteczek mRNA [51]. Sugeruje się, że RN Azy P i Z uczestni­
czą także w formowaniu końca 5' mRNA w mitochondriach
roślinnych [41]. Stwierdzono bowiem, że końce 5' niektórych
dojrzałych cząsteczek mRNA nie pokrywają się z początkiem
transkrypcji. Obecność na tych końcach elementów t, wskazu­
je, że najprawdopodobniej powstały one w wyniku endonukleolitycznego cięcia wykonywanego przez RN Azę P /R N Azę
Z. Zatem uzyskane dotychczas wyniki pozwalają stwierdzić,
że kluczową rolę w dojrzewaniu cząsteczek RN A w mitochon­
driach zwierzęcych, jak i roślinnych odgrywają dw a enzymy,
RN Aza P oraz RNAza Z.
POLIADENYLACJA CZĄSTECZEK mRNA
Ostatnim etapem obróbki mRNA spotykanym w mitochon­
driach roślin i zwierząt jest poliadenylacja, czyli dodanie frag­
mentu poli (A) na końcu 3' transkryptu, ale jej rola istotnie różni
się u tych dwóch grup organizmów. W mitochondriach roślin­
nych dodanie „ogona" poli(A) kieruje transkrypt na drogę de­
gradacji, podobnie jak to się dzieje u bakterii i w chloroplastach
[52]. Z kolei, funkcja poliadenylacji w odniesieniu do stabilno­
ści transkryptów mRNA w mitochondriach ssaków nie jest
całkowicie jasna. Usunięcie ogona poli(A) powoduje zmiany
(wzrost lub spadek) w poziomie poszczególnych transkryp­
tów mRNA, co sugeruje, że poliadenylacja może uczestniczyć
w regulacji stabilności RN A w mitochondriach człowieka [53].
Jedyną dobrze udokum entow aną funkcją poliadenylacji w
mitochondriach ssaków jest tworzenie kodonów STOP. Z po­
w odu wysokiego upakowania informacji genetycznej niektóre
transkrypty, takie jak ND1, ND2, ND3, ND4/4L, COX3 i Cyt.
b posiadają tylko jedną lub dwie litery kodonu STOP zakodo­
wane w mtDNA. Pełny kodon STOP UAA jest tworzony przez
dodanie adenin do końca 3' powstałego transkryptu [47].
TRANSLACJA I KOD GENETYCZNY
Jedną z cech odróżniających system translacji w mito­
chondriach roślin od zwierząt jest wielkość rybosomów.
Współczynnik sedymentacji rybosom ów w mitochondriach
roślinnych wynosi 70-80S i nie różni się znacząco od rybo­
somów bakteryjnych (ok. 70S). Natomiast rybosomy w mito­
chondriach zwierzęcych są zdecydowanie mniejsze (55-60S)
[54]. Jednak najbardziej wyróżniającą się cechą systemu
translacji w mitochondriach jest odm ienne wykorzystanie
niektórych kodonów. U zwierząt jest to przede wszystkim
związane z wykorzystaniem odm iennego kodu genetyczne­
go. W mtDNA zwierząt kodon TGA nie jest kodonem STOP,
ale koduje tryptofan. Ponadto, kodon AT A koduje metioni­
nę zamiast izoleucyny. Kodony AGA oraz AGG nie kodu­
ją argininy, lecz kodony STOP. Zmieniony kod genetyczny
m itochondriów zwierzęcych jest konsekwencją maksymal­
nego uproszczenia dekodowania informacji genetycznej. To
uproszczenie sprawia, że 18 am inokw asów posiada tylko po
148
jednym rodzaju tRNA, do którego może być przyłączone. Je­
dynie w przypadku leucyny i seryny występują po dw a ro­
dzaje tRNA. Dzięki temu uproszczeniu możliwe było zmniej­
szenie liczby genów tRNA do absolutnego minimum, jakim
jest liczba 22 genów obecnych w mtDN A zwierząt [18].
Kod genetyczny m itochondriów roślinnych nie odbiega
od uniwersalnego kodu genetycznego, chociaż doszukano
się kilku odstępstw dotyczących kodonu START. We w szyst­
kich opisanych dotychczas systemach translacji pierwszym
kodonem każdego białka jest kodon ATG kodujący metioni­
nę. Tymczasem w genie mttB obecnym w mtDN A A. thaliana
pierwszym kodonem jest kodon AAT, kodujący argininę, n a­
tomiast białko mat-R rozpoczyna się od kodonu GGG, białko
ccb203 — od kodonu GTG [17]. Kodon GTG służy również
jako kodon start w genie rplló w mitochondriach wiesiołka
[55]. O dstępstwo od standardow ego kodonu START zaobser­
w ow ano także w przypadku genu ND2 obecnego w m tD N A
człowieka. Gen ten zaczyna się od kodonu ATT, jednak w
przypadku mitochondriów zwierzęcych kodon ten koduje
metioninę, będącą typow ym aminokwasem, od którego za­
czyna się synteza białka [56].
REGULACJA EKSPRESJI mtDNA
G łó w ną funkcją g en o m u m ito ch o n d rialn eg o jest z a ­
pew nienie syntezy k ilk u n astu pod jed n o stek kom p lek só w
zlokalizow anych w w ew nętrzn ej błonie m itochondrialnej.
Pozostałe p odjed nostki tych kom pleksów są k o d o w a n e
w jąd rz e ko m ó rk o w y m i sy n tety z o w a n e w cytoplazm ie.
Zatem , jed n y m z w ażn y ch elem en tó w ekspresji g enów w
m ito chond riach jest koordynacja ilości p o d jed n o ste k ko­
d o w a n y c h w m tD N A z ilością po d je d n o ste k im p o rto w a ­
nych z cytoplazm y. Ta k ontrola m oże zachodzić na kilku
poziom ach. W m itoch ondriach zw ierzęcych głó w n a k o n ­
trola o d b y w a się na poziom ie inicjacji transkrypcji [57,58],
Transkrypcja m tD N A jest re g u lo w an a przez szereg c z y n ­
ników , takich jak: TFAM, TFB1M, TFB2M i mTERF [57],
U roślin regulacja transkrypcji m tD N A jest n a d a l p ro ce­
sem m ało zbadany m . Jednak sądzi się, że g łó w n a k o n ­
trola ekspresji gen om u m itoch ondrialneg o zac h o d z i na
etap ach potran skrypcyjn ych , takich jak degradacja RNA
oraz degradacja białek [20,42,59], D egradacja białek jest
procesem szczególnie istotnym dla biogenezy w ysokocząsteczkow ych kom pleksów m itocho ndrialnych , zło żo­
nych z białek k o d o w an y ch w genom ie m ito c h o n d ria ln y m
i jąd ro w y m [59], G łów ny m i en zym am i z a a n g a ż o w an y m i
w u su w a n ie białek niefunkcjonalnych, bądź białek sy n ­
tetyzow anych w n a d m iarz e są zależne od ATP proteazy.
Degradacja z ud z ia łe m tych p ro teaz jest procesem sp ecy ­
ficznym , co oznacza, że d a n y ty p proteazy m a określone
substraty. Z ależne od ATP p ro teazy w ykry to z a ró w n o w
m ito chond riach zw ierząt [60], jak i roślin [61,62], R egula­
cja ekspresji genów na poziom ie białka w m ito ch o n d riach
roślin m a d o d atk o w y , u nik alny aspekt z w ią za n y z d e ­
gradacją białek częściow o zred ag o w an y ch . P rz e p ro w a ­
d zo n e b ad an ia w skazują bow iem , że w szystk ie m RNA ,
niezależnie od ich sto pnia zre d a g o w an ia są m atrycam i
do syntezy białek, ale tylko białka w pełni z r e d a g o w a ­
ne są składnikam i k om pleksów m ito c h o n d ria ln y ch [59],
Zatem , selekcja p raw id ło w y ch białek następu je na etapie
potranslacyjnym .
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii. pl
PODSUMOWANIE
Przedstawione w tym artykule przeglądow ym różnice w
sposobie przechow ywania informacji genetycznej i jej odczy­
tywania obrazują kierunek ewolucji mitochondriów roślin­
nych i zwierzęcych. Wyróżniającą się cechą mitochondriów
zwierzęcych jest dążenie do maksymalnej redukcji informacji
genetycznej. Wiąże się to z małą liczbą genów i eliminowa­
niem zbytecznych sekwencji mtDNA. Dążenie do maksym al­
nego uproszczenia obserwuje się również na poszczególnych
etapach ekspresji mtDNA. O sile tego dążenia świadczy zmia­
na kodu genetycznego, który jest jedną z najbardziej uniw er­
salnych cech wspólnych wszystkim organizm ów żywych.
Mitochondria roślin charakteryzują się nagrom adzeniem
nietypowych rozwiązań dotyczących przechowywania i
ekspresji informacji genetycznej. Niektóre z nich (np. redago­
wanie RNA, w ystępowanie „trans-intronów", rekombinacja
mtDNA) są w praw dzie spotykane w mitochondriach innych
grup systematycznych, ale w żadnej z nich nie występują na
tak szeroką skalę. Nieliczne dane dotyczące roślin niższych
wskazują, że większość z tych nietypowych rozwiązań po­
jawiło się na etapie powstania roślin okrytozalążkowych.
Bodźcem do wielu zmian mogło być zmniejszenie kontroli
nad wielkością oraz strukturą genomu mitochondrialnego,
w której utrzym aniu pierwszoplanową rolę odgryw a rekom ­
binacja. Istotną cechą decydującą o wielu właściwościach
mitochondriów roślinnych jest ich otwartość na informację
genetyczną pochodzącą z zewnątrz. W m itochondrialnym
genomie roślin identyfikowane są nie tylko cząsteczki DNA
chloroplastowego czy jądrowego pochodzące z tego samego
organizmu, ale również DNA gatunków niespokrewnionych.
W niektórych przypadkach włączana informacja genetyczna
może zostać zaadoptow ana do pełnienia określonej funkcji.
Stosunkowo mała zmienność struktury mtDNA u kręgow­
ców, a zwłaszcza u ssaków, wskazuje, że główny cel ew olu­
cyjny został przez nie osiągnięty i ich genomy mitochondrial­
ne nie ulegają dużym zm ianom ewolucyjnym. Porównanie
opisanych dotychczas genomów mitochondrialnych różnych
gatunków roślin okrytozalążkowych pokazuje, że różnią się
one nie tylko wielkością, ale również zestawem genów i ich
ułożeniem w genomie. Wskazuje to, że genomy mitochon­
drialne u roślin nadal podlegają intensywnej ewolucji.
PIŚMIENNICTWO
1. Gray MW, Burger G, Lang BF (1999) M itochondrial évolution. Science
283:1476-1481
2. G abaldón T, H uynen MA (2007) From endosym biont to host-controlled organelle: the hijacking of m itochondrial protein synthesis and
metabolism. PLoS C om put Biol 3: e219
ated transfer and exon shuffling at the integration site. FEBS Lett 374:
152-156
9. Rhoads DM, Subbaiah CC (2007) M itochondrial retrograde regulation
in plants. M itochondrion 7:177-194
10. Pesaresi P, Schneider A, Kleine T, Leister D (2007) Interorganellar com ­
m unication. C urr O pin Plant Biol 10: 600-606
11. Leister D (2005) Genom ics-based dissection of the cross-talk of chloroplasts w ith the nucleus and m itochondria in Arabidopsis. Gene 18:
110-116
12. Kubo T, N ew ton KJ (2008) A ngiosperm m itochondrial genom es and
m utations. M itochondrion 8: 5-14
13. Burger G, Gray MW, Lang BF (2003) M itochondrial genomes: any­
thing goes. Trends Genet 19: 709-716
14. A nderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MH, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC, Nierlich DP, Roe BA, Sanger F, Schreier PH, Smith
AJ, Staden R, Young IG (1981) Sequence and organization of the h u ­
m an m itochondrial genome. N ature 290:457-465
15. U nseld M, Marienfeld JR, Brandt P, Brennicke A (1997) The m itochon­
drial genom e of Arabidopsis thaliana contains 57 genes in 366,924 nucle­
otides. N at Genet 15: 57-61
16. Klein M, Eckert-Ossenkopp U, Schm iedeberg I, Brandt P, Unseld M,
Brennicke A, Schuster W (1994) Physical m apping of the m itochon­
drial genom e of Arabidopsis thaliana by cosm idand YAC clones. Plant J
6: 447-455
17. M arienfeld J, U nseld M, Brennicke A (1999) The m itochondrial genom e
of Arabidopsis is com posed of both native and im m igrant information.
Trends Plant Sei 4: 495-502
18. T aanm an JW (1999) The m itochondrial genome: structure, transcrip­
tion, translation and replication. Biochim Biophys Acta 1410:103-123
19. Bonen L (2008) Cis- and trans-splicing of group II introns in plant mi­
tochondria. M itochondrion 8: 26-34
20. Holec S, Lange H, Kühn K, Alioua M, Börner T, Gagliardi D (2006)
Relaxed transcription in A rabidopsis m itochondria is counterbalanced
by RNA stability control m ediated by polyadenylation and polynucle­
otide phosphorylase. Mol Cell Biol 26: 2869-2876
21. C layton DA (1992) Transcription and replication of anim al m itochon­
drial DNAs. Int Rev Cytol 141: 217-232
22. Salinas T, D uchêne AM, Delage L, Nilsson S, Glaser E, Zaepfel M,
M aréchal-D rouard L (2006) The voltage-dependent anion channel, a
m ajor com ponent of the tRNA im port m achinery in plant m itochon­
dria. Proc Natl Acad Sei USA 103:18362-18367
23. Koulintchenko M, K onstantinov Y, Dietrich (2003) Plant m itochondria
actively im port DNA via the perm eability transition pore complex.
E M B O J22:1245-1254
24. Arrieta-M ontiel M, Łyżnik A, W ołoszyńska M, Jańska H, Tohm e J,
M ackenzie S (2001) Tracing evolutionary and developm ental im pli­
cations of m itochondrial stoichiometric shifting in the com m on bean.
Genetics 158: 851-864
25. Backert S, Nielsen BL, Börner TC (1999) The mystery of the rings: struc­
ture and replication of m itochondrial genom es from higher plants.
T rends in Plant Science 2: 477-483
3. A ndersson SG, K urland CG (1999) Origins of m itochondria and hydrogenosom es. C urr O pin Microbiol 2: 535-541
26. Kmieć B, W ołoszyńska M, Jańska H (2006) H eteroplasm y as a com­
m on state of m itochondrial genetic inform ation in plants and animals.
C urr Genet 50:149-159
4. Bullerwell CE, G ray MW (2004) Evolution of the m itochondrial genome: protist connections to animais, fungi and plants. C urr O pin Mi­
crobiol 7: 528-534
27. Carlsson J, Leino M, Sohlberg J, Sundström JF, Glimelius K (2008) Mi­
tochondrial regulation of flower developm ent. M itochondrion 8: 7486
5. Pow olny A, Jańska H (2000) W ew nątrzkom órkow y transfer genów.
Postępy Biochem 46: 227-233
28. H an d a H (2008) Linear plasm ids in plant m itochondria: peaceful co­
existences or m alicious invasions? M itochondrion 8:15-25
6. Boore JL (1999) Anim al m itochondrial genomes. Nucleic Acids Res 27:
1767-1780
29. Eyre-W alker A, Smith NH, Smith JM (1999) H ow clonal are hum an
m itochondria? Proc Biol Sei 266: 477-483
7. N ugent JM, Palm er JD (1991) RN A-m ediated transfer of the gene coxll
from the m itochondrion to the nucléus during flowering plant évolu­
tion. Celi 66: 473-481
30. Piechota J, Tońska K, N ow ak M, Kabzińska D, Lorenc A, Bartnik E
(2004) Com parison betw een the Polish population and European
populations on the basis of m itochondrial m orphs and haplogroups.
Acta Biochim Polon 51: 883-895
8. W ischm ann C, Schuster W (1995) Transfer of rpslO from the m itochon­
drion to the nucléus in A rabidopsis thaliana: evidence for RNA-mediPostępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
149
31. Galtier N, Enard D, R adondy Y, Bazin E, Belkhir K (2006) M utation hot
spots in m am m alian m itochondrial DNA. G enom e Res 16: 215-222
47. Ojala D, Montoya J, A ttardi G (1981) tRNA punctuation m odel of RNA
processing in hum an m itochondria. N ature 290: 470-474
32. Innan H, N ordborg M (2002) Recom bination or m utational hot spots
in hum an mtDNA? Mol Biol Evol 19:1122-1127
48. Puranam RS, A ttardi G (2001) The RNase P associated w ith HeLa cell
m itochondria contains an essential RNA com ponent identical in se­
quence to that of the nuclear RNase P. Mol Cell Biol 21: 548-561
33.Jańska H, W ołoszyńska M (1997) The dynam ic n ature of plant m ito­
chondrial genom e organization. Acta Biochim Polon 44: 239-250
34. W ołoszyńska M, Kieleczawa J, O rnatow ska M, W oźniak M, Jańska H
(2001) The origin and m aintenance of the sm all repeat in the bean m i­
tochondrial genome. Mol G enet Genom ics 265: 865-872
35. Jańska H, Sarria R, W ołoszyńska M, Arrieta-M ontiel M, Mackenzie
SA (1998) Stoichiometric shifts in the com m on bean m itochondrial ge­
nom e leading to m ale sterility and spontaneous reversion to fertility.
Plant Cell 10:1163-1180
36. A bdelnoor RV, Yule R, Elo A, Christensen AC, M eyer-G auen G, Mac­
kenzie SA (2003) Substoichiom etric shifting in the plant m itochondrial
genom e is influenced by a gene hom ologous to MutS. Proc Natl Acad
Sei USA 100: 5968-5973
49. D ubrovsky EB, D ubrovskaya VA, Levinger L, Schiffer S, M archfelder
A (2004) D rosophila RNase Z processes m itochondrial and nuclear
pre-tRNA 3' ends in vivo. Nucleic Acids Res 32: 255-262
50. K unzm ann A, Brennicke A, M archfelder A (1998) 5' end m aturation
and RNA editing have to precede tRNA 3' processing in plant m ito­
chondria. Proc Natl Acad Sei USA 95:108-113
51. K uhn J, Tengler U, Binder S (2001) Transcript lifetime is balanced be­
tw een stabilizing stem-loop structures and degradation-prom oting
polyadenylation in plant m itochondria. Mol Cell Biol 21: 731-742
52. Gagliardi D, Stepien PP, Tem perley RJ, Lightowlers RN, Chrzanow ska-Lightowlers ZM (2004) M essenger RNA stability in mitochondria:
different m eans to an end. Trends Genet 20: 260-267
37. Tiranti V, Savoia A, Forti F, D 'Apolito MF, C entra M, Rocchi M, Zeviani M (1997) Identification of the gene encoding the hu m an m itochon­
drial RNA polym erase (h-mtRPOL) by cyberscreening of the Expres­
sed Sequence Tags database. H u m Mol G enet 6: 615-625
53. Piechota J, Tomecki R, G ew artow ski K, Szczęsny R, Dm ochowska A,
Kudła M, Dybczyńska L, Stępień PP, Bartnik E (2006) Differential sta­
bility of m itochondrial m RNA in HeLa cells. Acta Biochim Polon 53:
157-168
38. Barr CM, N eim an M, Taylor DR (2005) Inheritance and recom bination
of m itochondrial genom es in plants, fungi an d anim als. N ew Phytol
168:39-50
54. Leaver CJ, H arm ey MA (1976) Lligher-plant m itochondrial ribosom es
contain a 5S ribosom al ribonucleic acid com ponent. Biochem J 157:
275-277
39. Falkenberg M, Larsson NG, G ustafsson CM (2007) DNA replication
and transcription in m am m alian mitochondria. A nnu Rev Biochem 76:
679-699
55. Bock H, Brennicke A, Schuster W (1994) Rps3 and rp ll6 genes do not
overlap in Oenothera m itochondria: GTG as a potential translation ini­
tiation codon in plant m itochondria? Plant Mol Biol 24: 811-818
40. Binder S, Brennicke A (1993) A tRNA gene transcription initiation site
is sim ilar to m RNA and rRNA prom oters in plant m itochondria. N uc­
leic Acids Res 21: 5012-5019
56. Peabody DS (1989) Translation initiation at non-AUG triplets in m am ­
m alian cells. J Biol Chem 264: 5031-5035
41. Fom er J, W eber B, Thuss S, W ildum S, Binder S (2007) M apping of
m itochondrial m RNA term ini in A rabidopsis thaliana: t-elements con­
tribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Res 35:3676-3692
42. Giegé P, H offm ann M, Binder S, Brennicke A (2000) RNA degradation buffers asym m etries of transcription in Arabidopsis m itochondria.
EMBO Rep 1:164-170
43. Binder S, Brennicke A (1993) Transcription initiation sites in mitochon­
dria of Oenothera berteriatia. J Biol Chem 268: 7849-7855
44. K ühn K, W eihe A, Börner T (2005) M ultiple prom oters are a comm on
feature of m itochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Res 33:
337-346
45. Giegé P, Brennicke A (1999) RNA editing in Arabidopsis m itochondria
effects 441 C to U changes in ORFs. Proc Natl Acad Sei USA 96:1532415329
46. Shikanai T (2006) RNA editing in plant organelles: machinery, physi­
ological function and evolution. Cell Mol Life Sei 63: 698-708
57. Scarpulla RC (2006) N uclear control of respiratory gene expression in
m am m alian cells. J Cell Biochem 97: 673-683
58. Piechota J, Szczęsny R (2004) W ybrane aspekty biogenezy białek łań­
cucha oddechow ego w m itochondriach ssaków. Postępy Biochem 50:
228-239
59. Binder S, Brennicke A (2003) Gene expression in plant m itochondria:
transcriptional and post-transcriptional control. Philos Trans R Soc
Lond B Biol Sei 358:181-189
60. K oppen M, Langer T (2007) Protein degradation within mitochondria:
versatile activities of AAA proteases and other peptidases. C rit Rev
Biochem Mol Biol 42: 221-242
61. Kołodziejczak M, Kołaczkowska A, Szczęsny B, Urantow ka A, K norpp
C, Kieleczawa J, Jańska H (2002) A higher plant m itochondrial hom ologue of the yeast m -AAA protease. M olecular cloning, localization,
and putative function. J Biol Chem 277: 43792-43798
62. U rantow ka A, K norpp C, Olczak T, Kołodziejczak M, Jańska H (2005)
Plant m itochondria contain at least tw o i-AAA-like complexes. Plant
Mol Biol 59: 239-252
Evolution of the mitochondrial DNA and its expression system
— comparison between animal and plant kingdom
Janusz Piechota, Hanna Jańska
L aboratory of M olecular Cell Biology, U niversity of W roclaw , 66/73 Przybyszew skiego St., 51-148 W roclaw , Poland
e-mail: H anna.Janska@ ibm b.uni.w roc.pl
Keywords: m itochondrial genom e, m tD N A , evolution, plants, anim als
ABSTRACT
The information about features of the Eukaryotic cells is maintained not only in the nucleus, but also in the extranuclear genom es localized
in mitochondria and chloroplasts. Comparison betw een plant and animal mitochondrial genom es allow s to perceive two extremely distinct
evolution strategies. Animals clearly tend to reduce the size of the mitochondrial genome to the m inimum . In accordance with this, the sim p li­
fication in decoding of genetic information present in the genome is observed. On the contrary, plant mitochondrial genom es tend to increase
their size. Accumulation of extraordinary solutions for maintaining and expression of genetic information present in the genome is the second
distinctive feature of plant mitochondria.
150
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
Występowanie mutacji w mtDNA i ich
potencjalny wpływ na strukturę białek
w wybranych typach nowotworów
STRESZCZENIE
adania ostatnich lat wskazują na występow anie w w ielu typach now otworów zw ięk szo­
nej częstości mutacji w mitochondrialnym DN A, jednak ich znaczenie dla struktury i
funkcji systemu fosforylacji oksydacyjnej nie zostało dotychczas podsumowane. W niniej­
szej pracy om ów iono mutacje genów mitochondrialnych kodujących białka w raku prostaty,
przełyku oraz w nabłoniaku rdzeniastym. Ze w zględu na fakt, że wszystkie kodowane przez
genom mitochondriów polipeptydy są podjednostkami kom pleksów systemu fosforylacji
oksydacyjnej, szczególną uwagę zwrócono na w p ły w mutacji tego genom u na metabolizm
tlenow y komórki.
B
WPROWADZENIE
Tabela 1. Skład p o djedn ostko w y kom pleksów system u fosforylacji oksydacyjnej, na p o d staw ie [49,50].
I
46
Podjednostki kodow ane
w DNA jądrow ym
39
Podjednostki
k odow ane w m tD N A
7
II
4
4
0
III
11
10
1
IV
13
10
3
V
16
14
2
Częstość pow staw ania mutacji w m tD N A jest w yższa niż w genom ie jądro­
wym . Jest to w aru nkow ane czynnikami, takimi jak pow staw anie reaktyw nych
form tlenu (RFT) w łańcuchu oddechow ym , brak białek histonow ych oraz mała
wydajność system ów napraw y DNA w m itochondrium [4]. Wysoka częstość
zm ian w m tD N A jest przyczyną pow staw ania licznych polim orfizm ów i m u ­
tacji [5].
Komórka now otw orow a w porów naniu ze zdrow ą wykazuje różnice w se­
kwencji nukleotydowej genom u oraz różnice epigenetyczne, za czym dalej idą
różnice na poziom ie transkryptom u i proteom u, a w końcu na poziom ie metabolomu. Komórki now otw orow e mają podw yższony poziom glikolizy oraz
upośledzoną produkcję ATP na drodze fosforylacji oksydacyjnej [6]. Z aburze­
nia m etabolizm u tlenowego kom órek now otw orow ych zostały po raz pierw szy
zaobserw ow ane przez Otto W arburga p onad 70 lat temu, stąd obecnie teoria o
obniżonym poziom ie fosforylacji oksydacyjnej i p odw yższony m poziomie o d ­
dychania beztlenow ego w kom órkach now otw orow ych nazyw ana jest hipotezą
W arburga [7],
W reakcjach dehydrogenacji, będących częścią procesów, takich jak: cykl
Krebsa, p-oksydacja kw asów tłuszczow ych i innych, uw olnione z substratów
protony i elektrony zostają przeniesione na cząsteczki przenośników N A D +
(dinukleotyd nikotynoam idoadeninow y) oraz FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy). Cząsteczki zredukow anych przenośników następnie oddają elektrony
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
Ewa Bartnik13
Paweł Golik13
Tomasz Krawczyk4
M itochondria są organellami, w których zachodzi wiele istotnych procesów
metabolicznych, takich jak cykl Krebsa, fosforylacja oksydacyjna i (3-oksydacja
kw asów tłuszczow ych [1], M itochondria posiadają własny genom (mtDNA); w
m itochondriach człowieka jest to kolista cząsteczka o wielkości 16569 pz [2] i
niosąca 37 genów: 13 kodujących polipeptydy, 2 geny rRNA (12S i 16S rRNA)
oraz 22 geny tRNA [3]. W szystkie polipeptydy kodow ane przez DNA mitochondrialny są podjednostkam i kom pleksów system u fosforylacji oksydacyjnej
(OXPHOS) (Tabela 1). Pozostałe białka m itochondrialne są kodow ane w geno­
mie jądrow ym [4].
Liczba
podjednostek
Wojciech Kukwa2
Anna Scińska2
BUDOWA I FUNKCJA MITOCHONDRIUM
K om pleks
Katarzyna Plak1
http://rcin.org.pl
Anna M. Czarnecka1'5'6'
’Instytut G enetyki i Biotechnologii, W ydział Bio­
logii U niw ersytetu W arszaw skiego, W arszaw a
2Klinika O tolaryngologii O ddziału Stom ato­
logii AM, Szpital C zerniakow ski, W arszaw a
’Instytut Biochemii i Biofizyki PA N, W arszaw a
4Z akład Patom orfologii Klinicznej Instytutu
C entrum Z drow ia M atki Polki w Łodzi, Łódź
’S tudium M edycyny M olekularnej, A kadem ia
M edyczna
w
W arszaw ie,
W arszaw a
6John Petros Lab, Em ory School of M edicine,
A tlanta, USA (obecny adres)
John Petros Lab, Em ory School of M edicine,
Clinic B uilding B, Room B4220, 1365 Clifton
Rd NE, 30322 A tlanta, GA, USA; tel.: (001) 404
778 4696 lub (001) 404 822 6849, e-mail: anna.
czamecka@ gmail.com lub aczam e@ em ory.edu
A rtykuł otrzym ano 3 gru d n ia 2007 r.
A rtykuł zaakceptow ano 15 kw ietnia 2008 r.
Słowa kluczowe: N ow otw ory, m itochondria,
m tD N A , fosforylacja oksydacyjnej, struktura
białek
Wykaz skrótów: A TPaza (6,8) — podjednostki
kom pleksu ATPazy V; C yt b — cytochrom b,
m tD N A — DNA m itochondrialny; ND (1-6)
— podjednostki kom pleksu dehydrogenazy
NADH; OXPHOS — łańcuch fosforylacji oksy­
dacyjnej; PIN — stan p rzednow otw orow y raka
prostaty
Podziękowania: Praca została w ykonana w ra­
m ach Polskiej Sieci M itochondrialnej i w trak­
cie realizacji projektów badaw czych MNiSW
N401232733 i N301238633. A utorzy dziękują
P anu Przem ysław ow i T om alskiem u (Centre
for Brain an d Cognitive D evelopm ent, Scho­
ol of Psychology, Birkbeck College, UK) oraz
P anu R adosław ow i E jsm ontow i (Max Planck
Institute of Celi Biology and Genetics, Tech­
nische U niversität D resden, Niemcy) za cenne
uw agi i w skazów ki podczas opracow yw ania
tekstu. AM C jest stypendystką S tudium Me­
dycyny M olekularnej, A kadem ii M edycznej
w W arszaw ie oraz FEBS Collaborative Expe­
rim ental Scholarship for C entral & Eastern
E uropę, Fulbright Junior Research G rant i The
Kościuszko F oundation Scholarship
151
kom pleksom łańcucha oddechow ego (NADH na kom pleks
I, natom iast FADH2 na kom pleks II). Energia uw olniona w
procesie przenoszenia elektronów w zd łu ż przekaźników o
wzrastających potencjałach redoks jest w ykorzystyw ana do
przenoszenia protonów H + w poprzek wew nętrznej błony
m itochondrium , co pow oduje ustalenie się różnicy po ten­
cjałów (Aip) i stężeń (ApH) w poprzek wew nętrznej błony
mitochondrialnej, z utw orzeniem tzw. potencjału elektro­
chemicznego (Ap) — siły protonom otorycznej. Zgodnie z
założeniam i teorii chemiosmotycznej Mitchella, utw orzona
siła jest w ykorzystyw ana do syntezy ATP przez tzw. p o m ­
pę protonow ą. Rolę p om py protonow ej odgryw a kom pleks
V system u fosforylacji oksydacyjnej czyli syntaza ATP (F1F0
ATPaza, ATPaza V) [8,9] Ponadto, łańcuch oddechow y b u ­
dują dw a ruchom e przekaźniki elektronów (ubichinon, cytochrom ć) oraz kompleksy: dehydrogenazy NADH , oksydoreduktazy bursztynianowej, cytochrom ów bc; i oksydazy
cytochrom u c [1,8].
Dehydrogenaza N A D H (czyli kom pleks I) zbudow ana
jest z 46 podjednostek i jest najw iększym z kom pleksów
łańcucha oddechow ego (masa około 1 MDa). Przenosi on
elektrony z N A D H na centrum zawierające FMN (mononukleotyd flawinowy), a potem przez serię centrów żelazo-siarkowych na ubichinon. U w olniona energia zostaje
w ykorzystana do przeniesienia protonów z macierzy m i­
tochondrialnej do przestrzeni m iędzy błonowej. Struktura
kom pleksu I nie jest jeszcze dostatecznie zbadana, jednak
z badań nad kom pleksem z serca w ołu w iadom o, że m a on
kształt litery L, której jedno ramię zanurzone jest w macie­
rzy mitochondrialnej, a drugie — w błonie wewnętrznej,
a w szystkie siedem podjednostek kodow anych mitochondrialnie znajduje się w ram ieniu błonow ym [1,9,10],
Kompleks II, którego częścią jest dehydrogenaza bursztynianow a, zbudow any jest z czterech podjednostek ko­
dow anych w genomie jądrow ym . Jest on zaangażow any
nie tylko w proces fosforylacji oksydacyjnej, ale też w cykl
Krebsa (utlenianie bursztynianu do fum aranu). Uwolnione
z bursztynianu elektrony są przenoszone na FAD znajdują­
cy się w centrum aktyw nym enzym u. Elektrony te przeno­
szone są na ubichinon z pominięciem kom pleksu I.
Kompleks III (czyli kom pleks cytochrom ów bej) w ystę­
puje w postaci dimeru. Każda m onom er składa się z 11 p o d ­
jednostek, w tym jednej kodowanej przez DNA mitochondrialne (cytochrom b). Cytochrom b posiada dw ie grupy
hem ow e zw ane grupam i b{ i bH (grupy hem ow e o dp o w ied ­
nio o niskim i w ysokim potencjale oksydoredukcyjnym).
O prócz cytochrom u b jeszcze dw ie podjednostki kom pleksu
III posiadają centra aktywne: białko żelazo-siarkowe z cen­
trum Rieske'go oraz cytochrom c; [11].
O ksydaza cytochrom owa (kompleks IV), składa się z 13
podjednostek, których struktura została dość dobrze zba­
dana. Rdzeń kom pleksu, a zarazem jego część katalityczną,
tw orzą trzy podjednostki kodow ane w genom ie mitochondrialnym (COX1, COX2 i COX3) [1], Cytochrom c oddaje
elektron na centrum zawierające m iedź w podjednostce
COX2 (centrum CuA), skąd przekazyw any jest na leżący
w pobliżu cytochrom a podjednostki COX1, a potem na cy­
tochrom a3 połączony z centrum m iedziow ym C uB, gdzie
152
następuje redukcja tlenu. Redukcji jednej cząsteczki tlenu
tow arzyszy pobranie czterech jonów w odorow ych z macie­
rzy mitochondrialnej (zostają zużyte do utw orzenia dwóch
cząsteczek wody) oraz jednoczesne przeniesienie czterech
protonów w poprzek w ewnętrznej błony mitochondrialnej
[1]. Protony przenoszone są poprzez trzy kanały (D, K i H),
które łączą centrum aktyw ne z macierzą m itochondrialną
[12].
Kompleks V (syntazy ATP), w którego skład w chodzą
dw a białka kodow ane przez genom m itochondrialny (ATP6
i ATP8), składa się z dw óch części: F1 i F0. Część F(1jest transbłonowa i stanow i kanał dla przepływ u protonów . Podjednostka Fj znajduje się po stronie m atriks mitochondrialnej i
była porów nyw ana do pęcherzyka na w ew nętrznej błonie
m itochondrium . Podjednostkę F, tw orzą dw ie części: rotor
i stator. Przepływ protonów przez podjednostkę transbłonow ą w ym usza ruch rotora w zględem statora. Z m iany w
konformacji, które zachodzą w trakcie ruchu w arunkują p o ­
w staw anie ATP [1].
MUTACJE W mtDNA A FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA
Dziedziczne mutacje w genach polipeptydów kod ow a­
nych w m itochondrialnym DNA m ogą pow odow ać zabu­
rzenia funkcji system u fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS),
których efektem jest szereg pow ażnych zespołów choro­
bowych, takich jak LHON (ang. Leber hereditary optic neuropathy), NARP (ang. neurogenic muscle weakness, ataxia and
retinitis pigmentosa), czy MELAS (ang. mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes) [13]. Bada­
nia p rzeprow adzone przez Plasterera i wsp. wskazują, że
mutacje zw iązane z rozwojem chorób m itochondrialnych
mogą w pływ ać na funkcjonowanie kom pleksów system u
fosforylacji oksydacyjnej m. in. w skutek zaburzenia stru k tu ­
ry białek — wpływając na stabilność białek OXPHOS lub na
oddziaływ ania między podjednostkam i kom pleksów [14].
Zaburzenia funkcji łańcucha fosforylacji oksydacyjnej m ogą
prow adzić do obniżenia efektywności syntezy ATP, jak też
do w zrostu produkcji reaktyw nych form tlenu. Reaktywne
formy tlenu powstają, gdy centra flawinowe lub żelazo-siar­
kowe łańcucha oddechow ego oddają elektrony bezpośred­
nio na tlen z pominięciem pozostałych elem entów łańcucha
[15]. Produkow ane w nadm iarze reaktyw ne formy tlenu
w yw ołują stres oksydacyjny, w w yniku którego pow staw ać
m ogą liczne uszkodzenia, w tym mutacje DNA.
ZABURZENIA W SYSTEMIE FOSFORYLACJI
OKSYDACYJNEJ W PROCESIE NOWOTWORZENIA
W ostatnich latach stw ierdzono, że w kom órkach n o ­
w otw o row y ch z d użą częstością pojawiają się som atyczne
m utacje w m tD NA . Bezpośrednie konsekw encje mutacji
m tD N A dla m etabolizm u i podziałów kom órki n o w o tw o ­
rowej pozostają jednak wciąż niew yjaśnione. Niemniej jed­
nak dw ie g ru p y badaw cze p rzeprow ad ziły eksperym enty
na m odelach zwierzęcych, mające ud ow odnić, iż mutacje
w m tD N A prom ują rozwój no w o tw o ru [16,17]. W b a d a ­
niach tych posłużono się tzw. cybrydam i, czyli liniami
kom órkow ym i pow stałym i przez przeniesienie m ito chon­
driów kom órek z różnym i w ariantam i m tD N A do k o m ó ­
rek pozbaw ionych u p rz e d n io w łasnego m tD N A (rhoO)
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
kom órek takich linii jak HeLa (rak szyjki macicy) lub PC3
(rak prostaty).
Shidara i wsp. [16] wykazali, że opisane wcześniej u p a­
cjentów z zespołem Leigha mutacje w podjednostce ATP6
— T8993G i T9176C [19,20] wpływ ają na szybkość form ow a­
nia się now otw oru u myszy bezgrasiczych (ang. nude mice).
M yszom w strzykiw ano cybrydy linii kom órkow ych HeLa:
1) z m itochondriam i kom órek chorych z zespołem Leigh'a
lub 2) z m itochondriam i o niezm utow anym mtDNA. U
myszy, którym podano komórki HeLa niosące zm utow ane
m tD N A rozwój now otw oru we w czesnym jego stadium był
szybszy niż u myszy, którym wstrzyknięto komórki z dzi­
kim typem mtDNA, co wskazuje, iż genotyp m tD N A ma
odbicie w fenotypie komórki nowotoworow ej. Szybszy roz­
rost now otw oru w tym eksperymencie spow odow any był
częstszymi podziałam i kom órek now otw orow ych [16].
Podobne w yniki otrzym ała grup a Petrosa i wsp. [17],
która badała w pływ mutacji T8993G na rozwój now otw oru
u myszy. Przygotow ano komórki cybrydow e linii PC3 (linia
w ypro w adzo na z now otw oru prostaty), z m itochondriam i
posiadającymi w m tD N A mutację T8993G, oraz komórki
kontrolne — linia PC3 z m itochondriam i o niezm utow anym
mtDNA. Po 110 dniach od wstrzyknięcia m yszom cybryd,
now otw ór, który rozw inął się z kom órek niosących z m u ­
tow ane m tD N A miał siedm iokrotnie większą objętość w
porów naniu do now otw oru powstającego z kom órek linii
cybrydowej z dzikim typem m tD N A [17],
pod jednostce ATP6. M utacja T8993G pow o d u je zam ianę
reszty leucyny (Leu) w pozycji 156 łańcucha po lipeptydow ego na resztę arg in iny (Arg). Z am iana leucyny, k tó ­
ra jest m ałym , h y d ro fo b o w y m am inokw asem , na dużą,
d o d a tn io n aład o w an ą, hydrofilow ą argininy [20] w ob­
rębie sekw encji silnie zachow yw anej ew olucyjnie m oże
być p rzy czy n ą patologicznego efektu, co zostało za su g e ­
ro w an e w pracy Plasterera i w sp. [14], M utacja T9176C,
opisana u pacjentów z lżejszym przebiegiem klinicznym
zespołu Leigha, p o w o d u je zam ianę reszty leucyny (Leu)
w pozycji 217 w resztę prolin y (Pro). M utacja ta także w y ­
stępuje w obrębie sekwencji zachow yw anej ew olucyjnie,
a p o n a d to reszta a m in o k w a su 217 znajduje się w o brę­
bie a-helisy sąsiadującej z resztą Leu 156 i ze w zg lęd u na
to położenie w ydaje się mieć p o d o b n ą funkcję. M utacja
m oże też zaburzać stru k tu rę samej a-helisy ze w zg lęd u
na w łaściw ości proliny, która nie tw o rzy o d p o w ied n ich
w ią za ń w o d o ro w y ch [20],
PATOFIZJOLOGIA MUTACJI mtDNA W
WYBRANYCH TYPACH NOWOTWORÓW
NOWOTWORY PROSTATY
N ow otw ory prostaty stanow ią 33% (234460 now ych
przypadków rocznie w edłu g danych z 2006 roku) zachoro­
w ań na wszystkie typy now otw orów w populacji mężczyzn
w Stanach Zjednoczonych. Stanowią też trzecią przyczynę
śmierci na raka w śród mężczyzn w USA [21], W Polsce w
roku 1999 now otw ór prostaty w ykryto u 6016 pacjentów,
a 3114 m ężczyzn zmarło z jego pow odu. Był to trzeci pod
O b y d w ie b a d a n e m utacje (T8993G i T9176C) p o w o d u ją
w zględem częstości w ystępow ania now otw ór u mężczyzn,
zm ianę zachow yw anej ew olucyjnie reszty a m in o k w a su w
a czw arty pod w zględem śmiertelności [22], N o w o ­
tw ory prostaty spotykane są głównie u starszych
Tabela 2. W arianty m ito chon drialn ego D N A oraz m utacje som atyczne znalezione w n o w o ­
mężczyzn. D okładne badania przeprow adzone na
tw orach p rostaty (pozycje 1-20 n a p odstaw ie [17], pozycje 21-24 na p odstaw ie [30]). M utacje
w niekodujących fragm entach m tD N A i tRNA nie zostały uw zględnione.
m ężczyznach zm arłych w wieku 60-70 lat z pow o­
dów innych niż rak prostaty wykazały, że tylko co
Z m iana nukleotydu
G en
Z m iana am inokw asu
3 z badanych nie miał żadnych zm ian now otw oro­
1
C5911T
COX1
Ala - Val
w ych w obrębie gruczołu krokowego [23].
2
G5913A
COX1
A sp — Asn
3
A5935G
COX1
Asn — Ser
4
G5949A
COX1
Gly - STOP
5
G5973A
COX1
Ala - Thr
6
G6081A
COX1
Ala - Thr
7
G6150A
COX1
Val - Ile
8
T6253C
COX1
M et - Thr
9
G6261A
COX1
Ala - Thr
10
G6267A
COX1
Ala - Thr
U
G6285A
COX1
Val - Ile
12
C6340T
COX1
Thr - Ile
13
G6480A
COX1
Val - Ile
14
A6663G
COX1
Ile - Val
15
G6924T
COX1
Ala — Ser
16
G7041A
COX1
Val - Ile
17
T7080C
COX1
Phe — Leu
18
A7083G
COX1
Ile - Val
19
A7158G
COX1
Ile - Val
20
A7305C
COX1
Met — Leu
21
A3434G
ND1
Cys — Tyr
22
A3505G
ND1
T hr - Ala
23
11032
ND4
del
24
G14053A
ND5
Ala - Thr
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
Tabela 2 p rezentuje zm ian y sekwencji nukleotydow ej w podjednostce COX l w no w o tw o rach
p rze b a d a n y ch p rzez g ru p ę Petrosa i w sp. [17],
Tylko dw ie z d w u d z ie stu znalezionych mutacji
(G5949A i G6924T) m ogą być u zn an e za m utacje
som atyczne; różnice w sekwencji w ystępują tylko
w tkance n o w o tw o ru , brak ich n ato m iast w m tD ­
N A lim focytów . Pozostałe zm iany są w arian tam i
m itoch ondrialneg o D N A obecnym i zaró w n o w
DN A tkanki zdrow ej jak i tkance zm ienionej now o tw o ro w o [17], Petros i w sp. w ykonali analizę
zależności m iędzy w y stę p o w an ie m w a rian tó w w
pod jedno stce CO Xl a w y stę p o w a n ie m n o w o tw o ­
rów prostaty. W g ru p ie 54 pacjentów bez n o w o ­
tw oru p ro staty (wiek pow yżej 50 lat, brak kom órek
rak o w y ch w biopsji prostaty) znaleziono w arian ty
m tD N A w p odjednostce COX l u 1,9% pacjentów ,
p odczas gdy w g ru p ie 260 pacjentów z n o w o tw o ­
rem p ro staty w a ria n ty w y stęp o w ały u 12% b a d a ­
nych. W g ru p ie 1019 osób z populacji ogólnej w a ­
rianty w podjed nostce COX l w y stęp o w ały u 7,8%
badanych. Badania te na poziom ie ufności 0,985
http://rcin.org.pl
153
Rycina 1. U liniow anie sekw encji białkow ych po djednostki COX1. W szystkie sekw encje pochod zą z bazy UniProtKB, z organizm ów : Homo sapiens (P00395), Bos ta ur us (P00396), Brachydanio rerio (Q9MIY8), Drosophila melanogaster (P00399), Aspergillus nidulans (P00402), Arabidopsis thaliana (P60620), Rhodobacter sphaeroides (P33517).
Pozycja, w której zaszła m utacja zaznaczona niebieską ram ką. U liniow anie w y kon an o za pom ocą pro g ram u
Tcoffee [53].
w skazują na istnienie zależności m ięd zy bad an y m i ce-
Zm iana C5911T pow oduje substytucję reszty waliny w
miejsce reszty alaniny w 3 pozycji polipeptydu COX1. Se­
kwencja, w obrębie której w ystępuje mutacja nie jest zacho­
w yw ana ewolucyjnie (Ryc. 1); reszty Ala i Val są niewiel­
kie i charakteryzują p odobnym punktem izoelektrycznym
(pl) (Ala pi 6,107, Val pi 6,002) [20]. Ze w zględu na niski
stopień zachow ania sekwencji w ewolucji m ożna przyp usz­
czać, że zam iana pojedynczej reszty am inokw asow ej nie ma
w pływ u na strukturę i funkcję polipeptydu. Również m u ­
tacja G5913A, pow odująca zm ianę reszty asparaginianu na
resztę asparaginy w pozycji czwartej podjednostki COX1,
nie wydaje się mieć w p ływ u na właściwości polipeptydu.
Sekwencja, w obrębie której znajduje się zm ieniona resz­
ta am inokw asu jest silnie zm ienna ewolucyjnie (Ryc. 1). Z
kolei zm iana A5935G pow oduje zm ianę reszty asparaginy
na resztę seryny w pozycji 11 łańcucha polipeptydow ego
podjednostki COX1. Sekwencja, w obrębie której znajduje
się mutacja jest silnie zachow yw ana ewolucyjnie (Ryc. 2). W
większości z przeanalizow anych sekwencji w ystępuje resz­
ta asparaginy (52 z 61) lub asparaginianu (7 na 61 przeanali­
zow anych sekwencji). Reszta seryny w tej pozycji występuje
tylko w 2 z przeanalizow anych sekwencji (u Crithidia oncopelithi, oraz Chlamydomonas reinhardtii). W ysoki stopień za­
chow ania tej sekwencji m oże świadczyć o istotnej roli reszty
asparaginy w funkcji polipeptydu. Łańcuch boczny aspara­
giny może tworzyć liczne wiązania w odorow e (Ryc. 3), a
Mutacja G5949A pow oduje powstanie
przedw czesnego kodonu STOP w genie
COX1, a w — rezultacie brak syntezy
funkcjonalnego polipepty du (kodon
STOP po w staw ieniu 15 aa z 513 w ystę­
pujących w polipeptydzie pełnej długości). W edług Petrosa
i wsp. [17] mutacja ta w ystępow ała w stanie hom oplazm ii
w tkance now otw oru prostaty. D odatkowo, badania imm unohistochem iczne p rzeprow adzone na w ycinku tkanki
badanego now otw oru w skazyw ały na bardzo niski poziom
podjednostki COX1 w porów naniu do tkanki zdrowej [17].
Badania nad liniami kom órkow ym i, do których w p ro w a­
dzono m tD N A posiadające przedw czesny kodon STOP w
genie COX1 (skrócenie p ro d u k tu genu COX1 do 324 reszt
am inokw asow ych w w yniku mutacji G6930A), wykazały że
skrócenie polipeptydu pow oduje jego w ysoką niestabilność,
a co za tym idzie — szybką degradację [24], W kom órkach
z mutacją powodującą pow stanie przedw czesnego kodo­
nu STOP w genie COX1, spada poziom białek COX1, jak
i COX2, poziom mRNA COX2 nie jest jednak zmieniony.
Obniżona jest także ilość praw idłow o złożonego kom pleksu
IV, co wskazuje na zaburzenia składania kom pleksu oksy­
dazy cytochrom u c [24]. Podobne wyniki otrzym ano też w
badaniach przeprow adzonych na drożdżach Saccharomyces
cerevisiae. W zw iązku z tym badacze przypuszczają, że przy
braku podjednostki COX1 niem ożliwe jest składanie kom ­
pleksu IV, a wolne podjednostki COX są niestabilne i ulega­
ją proteolitycznej degradacji [25]. Wyniki bad ań kom órek z
mutacją G6930A, przeprow adzone przez D 'A urelio i wsp.
[24] w ykazały upośledzenie w zrostu tych kom órek na po­
żywce z galaktozą, co rów nież wskazuje na uszkodzenie
fosforylacji oksydacyjnej. M ożna zatem przypuszczać, że
mutacja G5949A znaleziona w now otw orze prostaty m oże
prow adzić do pow ażnego zaburzenia
funkcjonowania system u fosforylacji
oksydacyjnej ze w zględu na silne skró­
cenie ramki odczytu COX1.
Rycina 2. U liniow anie sekw encji białkow ych podjedn ostk i COX1. W szystkie sekw encje po ch odzą z bazy UniProtKB, z organizm ów : Homo sapiens (P00395), Bos taurus (P00396), Gallus gallus (P18943), Brachydanio rerio
(Q9MIY8), Drosophila melanogaster (P00399), Albinaria coerulea (P48887) Schizosaccharomyces pombe (P07657),
Pseudomonas denitrißcans (P08305), Bacillus subtilis (P24010), Zea mays (P08742), Arabidopsis thaliana (P60620),
Caenorhabditis elegans (P24893). Pozycja, w obrębie której zaszła m utacja zaznaczona jest niebieską ram ką. Uli­
niow anie w y k o n an e zostało p rz y pom ocy p ro g ram u Tcoffee [53].
154
w p rzypadku zm iany reszty asparaginy
na resztę seryny nie ma możliwości ich
utworzenia. Brak ww. w iązań może de­
stabilizować strukturę III rzędow ą po­
lipeptydu. Reszta asparaginy 11 może
też odgryw ać rolę w tw orzeniu kanału
jonowego D (patrz powyżej, Kompleks
IV), z p ow od u jej lokalizacji w pobliżu
wejścia do kanału od strony macierzy
mitochondrialnej.
http://rcin.org.pl
M utacja G6081A p o w o d u je zm ianę
reszty alaniny 60 w resztę treo n in y w
pod jedno stce COX1. Pozycja, w k tó ­
rej m iała miejsce m utacja, jest silnie
z ac h o w y w an a ew olucyjnie w obrębie
Eukaryota (Ryc. 4), w w iększości se­
kwencji w y stęp ują reszty a m in o k w a ­
sów o m ałych ro zm iarach (alanina lub
glicyna). W ysoki stopień zach ow ania
stru k tu ry pie rw sz o rzę d o w ej w e w o ­
lucji jest za p e w n e z w iąz a n y z ko niecz­
nością ścisłego zach o w an ia stru k tu ry
p odjed n o stk i w obrębie tej sekwencji.
w w w .postepybiochem ii.pl
w y w iera ć w ięk szy w p ły w na s tru k tu rę lub funkcję polip e p ty d u .
Z m iana T6253C, pow odująca substytucję Met 117 Thr,
została opisana w podjednostce COXl u trzech pacjentów
z rozpozn aniem n o w o tw o ru prostaty. W edług badania Petrosa i w sp. [17] w szyscy pacjenci należeli do haplogru py
H. Polim orfizm T6253C w ystępuje natom iast u p rz e d sta ­
wicieli jednej z p o d g ru p haplo g ru p y H — H15. P ra w d o ­
pod obnie w szyscy trzej m ężczyźni mieli ten w ariant m i­
tochondrialnego D N A i w tym p rz y p a d k u m am y do czy­
nienia z polim orfizm em , a nie z mutacją. Jak do tej pory
nie m a danych epidem iologicznych dotyczących częstości
zap ad an ia na now otw ory prostaty w śród m ężczyzn w tej
haplogrupie.
Rycina 3. Fragm ent podjed nostk i CO X l z kom pleksu ok sydazy cyto chro m u c z
Bos taurus. S tru k tu ra pochodzi z bazy danych PDB [51], PDB ID lv 5 4 [26]. N a
zielono zaznaczona A sn 11, na fioletow o — am inokw asy, z którym i tw orzy w ią ­
zania w odo row e, a na czerw ono — am inokw asy kluczow e dla tw orzenia kanału
D. W izualizacja stru k tu ry o trzym ana za pom ocą p ro g ram u CH IM ERA [52].
Jest to zw iązan e z obecnością reszty h isty d y n y 61, stabi­
lizującej żelazo g ru p y hem ow ej (hem u a) [26]. P o d sta w ie ­
nie reszty treoniny w miejsce alaniny m oże p o w o d o w ać
lokalną destabilizację stru k tu ry helisy ze w z g lę d u na
fakt, że treo n in a posiadająca rozgałęziony łańcuch bocz­
ny, niechętnie lokalizuje się w obrębie helis [20]. M oże to
mieć w p ły w na destabilizację hem u a, a co za tym idzie
rów nież na tra n sp o rt elektronów p o p rze z hem a.
Z kolei z m ian a G6150A p o w o d u je z a m ia n ę re szty w aliny na re sz tę izo leu cy n y w p o d je d n o stc e COX1. Reszta
Val 83 z n ajd u je się p rz y C -końcu jednej z helis p rzezb łonow ych , p o stronie m acierzy m ito ch o n d rialn ej. P o z y ­
cja ta nie jest silnie z a c h o w y w a n a ew olucyjnie, a w jej
obrębie w y stę p u ją ró ż n e reszty am in o k w a só w z g ru p y
a lifatyczn ych , h y d ro fo b o w y ch (w aliny, leucyn y i iz o le u ­
cyny). W szystkie te am in o k w asy mają p o d o b n y p u n k t
iz o elek try czn y (w alina pi 5,97, izo leu cy n a pi 6,02, leucyna pi 6,036) [20]. N ie w ydaje się, aby za m ia n a reszty
a m in o k w a su w obrębie g ru p y tych a m in o k w a só w m iała
W arianty G6261A (ta zm iana została znaleziono u 6
p rzebadanych pacjentów, należących do 4 różnych haplogrup) i G6267A (znaleziony u jednego pacjenta) są
przyczyną zm ian A120T i A122T. O bydw ie pozycje znaj­
dują się w pętli po m iędzy dw iem a helisami podjedn ost­
ki CO Xl, po stronie przestrzeni m iędzybłonow ej (Ryc. 5).
Mutacja G6267A została opisana także w innych typach
now o tw o ró w (piersi i okrężnicy) oraz linii kom órkow ych
w yw odzących się z ludzkich kom órek no w otw orow ych
(trzustki, linii kostniakom ięsaka, a także linii raka śluzow o-naskórkow ego) [27], W ykazano też, że linie niosące tę
m utację mają obniżoną m ożliw ość w zrostu na pożyw ce
zawierającej galaktozę jako jedyne źródło w ęgla [27], Brak
m ożliwości w zrostu na podło żu nie zawierającym glukozy
św iadczy o uszkodzeniu łańcucha oddechow ego. Mutacja
G6267A m oże zatem pow od ow ać pow ażne zaburzenie
m etabolizm u kom órki.
Poniew aż mutacja G6261A rów nież pow oduje zm ianę
reszty alaniny na resztę treoniny w obrębie tej samej pętli, w
której znajduje się reszta Alal20 (Ryc. 5), wydaje się p raw ­
dopodobne, że mutacja może w ywierać podobny efekt na
m etabolizm komórki. Jednak w w y p ad k u mutacji G6261A
brak jest dokładnych danych mogących potw ierdzić tę hi­
potezę lub jej zaprzeczyć. Zm iana G6582A pow oduje p o d ­
stawienie reszty izoleucyny w miejsce reszty waliny w po­
zycji 128 polipeptydu. A m inokw as znajduje się w tej samej
pętli, co A120 i A122 (Ryc. 6). M ożna jednak przypuszczać,
że to podstaw ienie nie ma pow ażnych konsekwencji struk­
turalnych ze w zględu na duże podobieństw o
właściwości obu am inokw asów , które należą
do tej samej grupy i mają podobny pu n k t izo­
elektryczny (Val pi 5,97, Ile pi 6,02) [20],
Rycina 4. U liniow anie sekw encji białkow ych pod jednostki COX1. W szystkie sekw encje po ch odzą z
bazy UniProtKB, z organizm ów : Homo sapiens (P00395), Bos taurus (P00396), Gallus gallus (P18943),
Brachydanio rerio (Q9MIY8), Drosophila melanogaster (P00399), Albinaria coerulea (P48887) Schizosaccharomyces pombc (P07657), Pseudomonas denitrificans (P08305), Bacillus subtilis (P24010), Ze a mays (P08742),
Arabidopsis thaliana (P60620), Caenorlwbditis elegans (P24893). Pozycja, w obrębie której zaszła m utacja
zazn aczon a jest niebieską ram ką. U liniow anie w ykon ano prz y pom ocy p ro g ram u Tcoffee [53],
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
Zm iana C6340T pow oduje zastąpienie reszty
treoniny resztą izoleucyny w pozycji 148 poli­
peptydu. Analiza sekwencji, w której w ystępu ­
je reszta treoniny 148 w ykazała, że pozycja ta
nie jest zachow yw ana w ewolucji. Reszta tre­
oniny w tej pozycji w ystępuje jedynie u części
kręgowców, natom iast w większości pozosta­
łych sekwencji występuje w tej pozycji reszta
alaniny. Wydaje się więc, że obecność reszty
treoniny w omawianej pozycji nie jest koniecz­
na dla utrzym ania prawidłow ej struktury i
funkcji białka.
155
R ycina 5. F ragm ent pod jednostki C O X l z kom p lek su oksydazy cytochrom u c z
Bos taurus. S tru k tu ra p ochodzi z bazy dan ych PDB [51], PDB ID lv 5 4 [26]. Reszty
A lal2 0 (zaznaczona n a czerw ono) i A lal2 2 (zaznaczona n a fioletowo) p rz e d sta ­
w ione jako m odel kulkow y. W izualizacja stru k tu ry o trzy m an a została p rz y u ży­
ciu p ro g ram u CHIM ERA [52].
Mutacja G6480A pow oduje zam ianę reszty waliny 193
na resztę izoleucyny. Pozycja ta nie jest ewolucyjnie kon­
serw ow ana, a obydw a am inokw asy mają podobną budow ę
R ycina 6. F rag m ent pod jedn ostk i COX1 z ko m pleksu ok sydazy cytochrom u c z
Bos taurus. S truktura poch odzi z bazy dany ch PDB [51], PDB ID lv 5 4 [26], Val 128
p rz e d sta w io n a w kolorze niebieskim jako m od el k ulkow y. W izualizacja stru k tu ­
ry o trzy m an a została przy u życiu p ro g ram u CHIM ERA [52],
i właściwości, należą do tej samej g rup y am inokw asów ali­
fatycznych hydrofobow ych [20], więc nie w ydaje się, aby ta
mutacja miała w pływ na strukturę i/lu b funkcję polipepty-
du. Z kolei mutacja G7041A m oże mieć w pływ na funkcję
podjednostki COX1, pow oduje ona zm ianę reszty waliny
380 na resztę izoleucyny. Analiza genom ów różnych orga­
nizm ów prokariotycznych i eukariotycznych wykazała, że
sekwencja, w obrębie której występuje reszta Val 380, jest
mało zm ienna ewolucyjnie (Ryc. 7). W ysoki stopień za­
chow ania sekwencji w ewolucji jest też widoczny po prze­
analizowaniu stru ktu r oksydazy cytochrom u c z Bos taurus
(lv54), Thermus thermophilus (lm56) i Paracoccus denitrificans
(la rl) (Ryc. 8). Sekwencja am inokw asów , w obrębie której
m a miejsce zam iana reszt Val 380 Ile, jest zlokalizow ana w
obrębie helisy X podjednostki COX1. Fragm ent helisy X, w
którym znajduje się zmieniona reszta am inokw asu podlega
zm ianom konformacyjnym w czasie przechodzenia enzy­
m u ze stanu zredukow anego w utleniony i odw rotnie. Po
przejściu hem u a w stan zredukow any w iązanie w od orow e
pom iędzy seryną 282 a grup ą hydroksyfarnezyloetylow ą
hem u a ulega zerw aniu z jednoczesną rotacją grupy OH
seryny o 110° [28]. Zm iany konformacyjne spow odow ane
tym przejściem obejmują reszty am inokwasów: Ser 382, Leu
381 i Val 380 (Ryc. 9). Nie w iadom o dokładnie jaką rolę
może mieć ta zm iana konformacyjna, jednak postuluje się
jej udział w procesie przenoszenia protonów przez błonę
m itochondrialną [28]. M imo że w alina i izoleucyna należą
do tej samej grupy am inokw asów i mają podobny p un k t
izoelektryczny, wydaje się, że mutacja może upośledzać
funkcjonowanie białka. Świadczy o tym zarów no bardzo
wysoki stopień zachow ania sekwencji w obrębie gatunków
odległych ewolucyjnie, jak i bliskość centrów aktyw nych
enzymu. Ponadto, patologiczny efekt mutacji m oże być
rów nież zw iązany z różnicą wielkości łańcuchów bocznych
am inokw asów waliny i izoleucyny [20],
Ostatnia opisana przez Petrosa i wsp. [17] mutacja —
T7080C pow oduje zastąpienie reszty fenyloalaniny 393 resz­
tą leucyny. Reszta ta w ystępuje w obrębie sekwencji, która
jest zachow yw ana jedynie w śród w yższych Eukariota. U
grzybów i Prokariota sekwencja, w obrębie której w ystąpiła
mutacja, nie jest zachow yw ana i w ystępują tam reszty am i­
nokw asów o różnych właściwościach fizykochemicznych.
Reszta fenyloalaniny 393 w chodzi w skład tej samej helisy,
co reszta waliny 380, nie znajduje się jednak w bezpośred ­
niej bliskości centrum aktywnego. Może ona natom iast o d ­
działywać z jednym z fosfolipidów, który jest w b u d o w a n y
w kom pleks oksydazy cytochrom u c (Ryc. 10).
W edług Yoshikawy fosfolipid ten może brać
udział w wejściu cząsteczki tlenu do centrum
aktyw nego podjednostki COX1 [29].
R ycina 7. U lirtiow anie sekw encji białkow ych p od jedn ostk i COX1. W szystkie sekw encje po chodzą z
bazy U niProtKB, z organizm ów : Homo sapiens (P00395), Bos taurus (P00396), Gallus gallus (P18943),
Brachydanio rerio (Q9MIY8), Drosophila melanogaster (P00399), Albinaria coerulea (P48887) Schizosaccharomyces pombe (P07657), Pseudomonas denitrificans (P08305), Bacillus subtilis (P24010), Ze a rnays (P08742),
Arabidopsis thaliana (P60620), Caenorhabditis elegans (P24893). Pozycja, w obrębie której zaszła m u ta ­
cja zaznaczona jest niebieską ram ką. U liniow anie w y k o n an e zostało przy pom ocy pro g ram u Tcoffee
[53].
156
http://rcin.org.pl
Jerónimo i wsp. [30], którzy jako drud zy opi­
sali mutacje w m tDN A w now otw orach pro­
staty, badali mutacje w mitochondrialnej pętli
D, mitochondrialnych genach rRNA i podjednostkach kompleksu I zarówno now otw orów ,
jak i odpowiadających im PIN (ang. prostatic
intraepithelial neoplasia, stan przednow otw orowy) pobranych od 16 paqentów . O pisano 20
mutacji somatycznych u 3 pacjentów. U dw óch
pacjentów opisano po jednej mutacji, natom iast
u trzeciego aż 18 mutacji (mutacje nr 21, 22 i 24
w tabeli 3). Wydaje się jednak, iż bardzo duża
liczba mutacji znaleziona u jednego pacjenta
w w w .postepybiochem ii.pl
R ycina 8. W izualizacja i p o ró w n an ie stru k tu r fragm entów pod jedn ostek COX1
z Bos taurus (lv54) (kolor błękitny) Thermus themiophilus (lm 56) (kolor różow y)
i Paracoccus denitrificans (la r l) (kolor fioletow y) [51]. W alina 380 oraz h e m a3 p o ­
grubione. W izualizacja stru k tu ry o trzy m ana została przy użyciu p ro g ram u C H I­
MERA [52],
(które to mutacje są de facto polimorfizmami typow ym i dla
haplogrup W i K) może w skazywać na wymieszanie próbek
[31]. Nie można jednoznacznie stwierdzić czy próbki pocho­
dzą od jednego pacjenta, a w publikacji brak też danych na
temat haplogrupy, do której należały badane próbki, z tego
też pow odu dane te nie wydają się wiarygodne.
Tkanka now otw oru, w której znaleziono delecję adeniny
w pozycji 11032 jest pod jej w zględem heteroplazm atyczna (poziom heteroplazm ii trudn o dokładnie określić, ale
stosunek m tD N A zm utow anego do dzikiego w ynosi >0,6),
podczas gdy w m tD N A limfocytów oraz w tkance PIN po­
branych od tego sam ego pacjenta występuje w yłącznie se­
kwencja typu dzikiego [30]. A denina 11032 jest pierw szą w
szlaku 7 adenin następujących po sobie, a takie obszary są
szczególnie w rażliw e na błędy polim erazy w czasie replika­
cji mtDNA. W rezultacie mutacji tw orzy się kodon STOP, co
R ycina 10. Fragm en t podjednostki CO X l z kom pleksu oksydazy cytochrom u c
Bos taurus. S tru ktura pochodzi z bazy dany ch PDB [51], PDB ID lv 5 4 [26], N a ró­
ż o w o prz e d sta w io n y fragm ent helisy X po djednostki C O X l, na fioletow o — czą­
steczka fosfolipidu. Reszta fenyloalanina 393 zaznaczona jako m odel kulkow y.
W izualizacja stru k tu ry o trzym ana została prz y użyciu pro g ram u CHIMERA
[52],
pow oduje skrócenie polipeptydu. W ykazano, że homoplazm atyczna mutacja przesunięcia ramki odczytu w pozycji
10952, rów nież pow odująca pow stanie skróconego i niesta­
bilnego polipeptydu ND4, prow adzi do upośledzenia p ro ­
cesu składania podjednostek kodow anych mitochondrialnie w kom pleks I [32], W ydaje się zatem praw dopodobne,
że mutacja opisana w tkance n ow otw oru może mieć ana­
logiczny efekt. Z tego po w o d u u pacjenta z now otw orem
prostaty m ożna się spodziew ać pow ażnego upośledzenia
system u fosforylacji oksydacyjnej w tkance nowotworowej,
gdyż procent zm utow anego DN A w komórkach now otw o­
ru jest wysoki.
NABŁONIAK RDZENIASTY
N abłoniak rdzeniasty jest now otw orem ośrodkowego
układu nerw ow ego (OUN) [24]. Cechą charakterystyczną
rdzeniaków jest fakt, że w ystępują głównie u dzieci, z czę­
stością 0,5 na 100 000 urodzeń. U dorosłych opisywane są
niezw ykle rzadko [34], W ong i wsp. [34] przeanalizowali 15
p rzy padkó w rdzeniaków u dzieci. Łącznie zostało znalezio­
nych 18 mutacji m tD N A w 6 z 15 now otw orów . Większość
(11/18) mutacji znaleziono w pętli D, 3 mutacje w tRNA
oraz 4 we fragm entach m tD N A kodujących polipeptydy
(Tabela 3) [34],
M utacje T7389C oraz T7028C są w rzeczyw istości p o ­
lim o rfiz m am i c h a ra k te ry sty c z n y m i o d p o w ie d n io dla
h a p lo g r u p L lc2 oraz H. Tylko m utacja T11046C, p o ­
w o d u jąc a z a stą p ie n ie reszty leucyn y resztą pro liny, nie
w y stę p u je jako częsty p o lim o rfizm m ito ch o n d ria ln e g o
T a b e la 3. M utacje som atyczne w m tD N A znalezione w tkance nabłoniaków rdzeniastych (na p o dstaw ie [34]). M utacje w rR N A , tRN A oraz fragm entach niekodujących zostały pom inięte.
R ycina 9. W izualizacja i p o ró w n an ie stru k tu r fragm entó w helisy X podjed nostki
C O X l. Kolor ró żow y — konform acja fragm entu helisy X i h e m u w czasie, gd y
e n zy m jest w stanie zred u k o w an y m , kolor seledyn ow y — e n zy m w stanie u tle­
nionym . S truktury pochod zą z bazy d a n ych PDB [51], PDB ID lv54, lv 5 5 [26].
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
Zmiana nukleotydu
Gen
Zmiana aminokwasu
1
T7389C
COX1
Tyr — His
2
T11046C
ND4
Leu — Pro
3
T7028C
COX1
Ala — Ala
http://rcin.org.pl
157
1
ty d u ND4L. Reszta alaniny 11
jest za chow an a jedynie u w y ż ­
szych Eukaryota. Nie w ydaje się,
aby zm iana m ało zachow anej w
ew olucji reszty am inokw asow ej
m ogła mieć istotne k o n se k w e n ­
cje stru k tu raln e.
Tan i wsp. [36] sugerują, że
mutacja A9182G jest zm ianą po ­
w rotną, tzn. u pacjenta u którego
znaleziono mutację, w zdrow ych
kom órkach występuje w pozycji
9182 nietypowy dla tej sekwencji nukleotyd G (w p orów ­
naniu do sekwencji C am bridge — CRS m tD N A opubliko­
wanej przez A ndersona i w spółpracow ników ), natom iast
w tkance now otw orowej nastąpiło odw rócenie tej mutacji
i pow rót do nukleotydu A. W w yp adku mutacji powrotnej
nie m ożna w nioskow ać o jej patologicznym w pływ ie na
strukturę i funkcję podjednostki ND4L.
R ycina 11. P rzew id y w an ie stru k tu ry II rzędow ej dla p odjedno stki ND4 za pom ocą p ro g ram u H N N (hierarchical
ne u tra l netw ork) [35]. Leucyna 96 zaznaczona na żółto, s tru k tu ry d ru g o rzęd o w e oznaczone jako: h — a helisy, e — (3
kartki, c — pętle.
DNA. U ró żn y c h o rg a n iz m ó w e u k a rio ty c z n y c h w tej
samej pozycji z n ajd u ją się ró ż n e reszty am in o k w asó w ,
n a leżą one je d n a k do tej samej g ru p y h y d ro fo b o w y c h
a lifatyczny ch a m in o k w a s ó w (w alina, leucy na, izoleucyna) [21]. Brak m o d e lu s tru k tu ry nie p o z w a la na d o k ła d ­
ną ocenę p o ło ż en ia sekw encji, w obrębie której znajduje
się m utacja. P rz e w id y w a n ie s tru k tu ry d ru g o rz ę d o w e j
za p o m o cą p ro g ra m u H N N (ang. hierarchical neutrnl netioork) [35] w sk a z u je na to, że sekw encja z najdu je się w
o b sza rze a helisy (Ryc. 11). M ożna p rz y p u sz c z a ć , p o d ­
staw ien ie resz ty leucyn y w m iejsce reszty p ro lin y p o w o ­
duje z a b u rz e n ia w s tru k tu rz e d ru g o rz ę d o w e j polipepty d u ze w z g lę d u na w łaściw ości pro lin y , k tó ra za b u rz a
s tru k tu rę helisy [21].
P O D SU M O W A N IE
Ponad 70 lat po opublikow ania prac Otto W arburga w y ­
daje się, że obecność zaburzeń w szlaku fosforylacji oksyda­
cyjnej jest w yw ołana uszkodzeniam i struktury składników
system u w m itochondriach [7], Niezależne badania przepro­
NOWOTWORY PRZEŁYKU
w adzone do tej pory przez wiele g rup wykazały, że mutacje
w m itochondrialnym DNA w ystępują w wielu typach no ­
Rak p rzeły k u stanow i siód m ą p rzyczyn ę zgonów z
w otw orów u osób o różnym pochodzeniu etnicznym (różne
p o w o d u n o w o tw o ru w śró d m ężczyzn w Stanach Zjedno­
haplogrupy). Znaleziono mutacje zarów no w niekodujączonych (10736 zg onów rocznie wg. d an y c h z roku 2006)
cych, jak i w kodujących obszarach m tD N A [17,30,34,38-42],
[22], N ato m iast u kobiet w y stęp u je 3-4 razy rzadziej [24].
Mutacje w genach m t rRNA m ogą pow odow ać zm iany w
Rak p rz eły k u w y stęp u je zd e c y d o w a n ie częściej u osób po
strukturze rybosom ów , co z kolei może pow odow ać upośle­
50 roku życia. W Polsce w 1999 roku za n o to w a n o 1408
dzenie translacji polipeptydów kodow anych w m itochon­
p rz y p a d k ó w n o w o tw o ru przełyku u m ężczyzn oraz 305
drialnym DNA. Zm iany struktury rybosom alnego RNA
p rz y p a d k ó w u kobiet, p odczas gdy zm a rło 1113 m ęż­
w yw ołane przez mutacje w m tD N A są przyczyną chorób,
czyzn i 260 kobiet [23,24],
takich jak odbiorcze uszkodzenie słuchu (ang. sensorineural
hearing loss) [43] i opisano je, m iędzy innymi, w no w o tw o­
Tan i w sp. [36], badając n o w o tw o ry p rze ły k u (osiem­
rach jelita grubego [40], przełyku [41], nerek [38], czy jajni­
naście rak ó w płask onabłonk ow ych , jed en gruczolakorak
ka [37], Także mutacje w tRNA m ogą wpływ ać na syntezę
i jeden n o w o tw ó r innego typu), opisali 14 m utacji som a­
podjednostek kom pleksów fosforylacji oksydacyjnej. Jako
tycznych m tD N A , z których 4 z n ajdo w ały się w obsza­
że w m itochondriach są tylko 22 geny tRNA, praktycznie
rach kodujących p o lip e p ty d y (Tabela 4). Delecja 11 nukażdy am inokw as (z wyjątkiem seryny i leucyny) posiada
k leo ty d ó w w obrębie pod jedno stki ND4 p o w o d u je skró­
tylko jedną odpowiadającą m u cząsteczkę tRNA [4], M uta­
cenie ram ki o dczytu i skrócenie p o lip e p ty d u do 110 reszt
cje w genach tRNA m ogą zatem pow ażnie zaburzać tran s­
am in o k w a so w y c h (w p o lip e p ty d zie pełnej długości jest
lację, m.in. poprzez w pływ na rozpoznaw anie właściwego
ich 459). Brak p o w staw a n ia funkcjonalnego po lip ep ty d u
am inokw asu przez cząsteczkę tRNA, przyłączanie am i­
uniem o żliw ia skład anie do k om p lek su I podjednostek
nokw asu do cząsteczki przez aminoacylo tRNA syntetazy
ko d o w a n y c h m itochon drialnie, co p ro w a d z i do po w aż ­
oraz modyfikacje potranslacyjne, niezbędne do właściwego
nego z a b u rz e n ia funkcji system u fosforylacji oksydacyj­
rozpoznaw ania kodonu [44,45]. Mutacje w genach tRNA są
nej (patrz też N o w o tw o ry prostaty, 11032 del A) [32], Z
częstą przyczyną wielu schorzeń, których podłożem są za­
kolei m utacja G10500A p o w o d u je p o d sta w ie n ie reszty
burzenia fosforylacji oksydacyjnej m.in: MERRF (ang. myoc­
treoniny w miejsce reszty alaniny w pozycji 11 polipeplonic epilepsy and ragged red muscle fibers), MELAS
(ang. mitochondrial encephalomyopathy, lactic acido­
T abela 4. M utacje w m tD N A znalezione w tkance n o w o tw o ró w przełyku (na podstaw ie [41]).
sis, and stroke-like episodes), CPEO (ang. chronic pro­
M utacje w niekodujących fragm en tach m tD N A oraz w tR N A nie zostały uw zględnione.
gressive external ophthalmoplegia) [13] i były opisane
Gen
Zmiana aminokwasu
Zmiana nukleotydu
w m tD N A w raku nerki [37] oraz okrężnicy [45],
ND4L
Ala - Thr
i
G10500A
jednak są one stosunkow o rzadkie.
r
T rp — Trp
2
G9377A
COX3
3
A9182G
ATP 6
Asn — Ser
4
10941 del TAACAACCCCC
ND4
nie dotyczy
158
http://rcin.org.pl
Mutacje w polipeptydach kodow anych przez
DNA m itochondrialny są z kolei przyczyną po­
w w w .postepybiochem ii.pl
w staw ania zespołów chorobowych, takich jak LH ON (ang.
Leber Hereditary Optic Neuropathy) [13], a opisano je w bar­
dzo wielu różnych typach now otw orów [34,36,38,42]. M u­
tacje w genach kodujących polipeptydy m itochondrialne
m ogą wpływ ać na szlak fosforylacji oksydacyjnej na szereg
różnych sposobów, m.in. poprzez zm ianę struktury pow sta­
jącego prod uktu białkowego. Pomimo licznych p rzep row a­
dzonych do tej pory prac dotyczących zm ian w m tD N A w
nowotw orach, pytanie czy mutacje te są istotne w procesie
now otw orzenia, czy też nie wciąż pozostaje otwarte. Część
autorów sugeruje, że nagrom adzenie mutacji w mitochondrialnym DN A jest jedynie w ynikiem p rzy p ad k u a mutacje
te nie dają kom órkom przew agi selekcyjnej [47]. Inni a u ­
torzy uważają, że obecność mutacji w m itochondrialnym
DNA prom uje rozwój now otw oru. H ipoteza ta zgodna jest
z w ynikam i badań na m odelach mysich, gdzie komórki no­
w otw orow e niosące zm utow ane m tD N A dzieliły się szyb­
ciej i w efekcie pow odow ały pow staw anie guzów o w ięk­
szej objętości [16,17]. Istnieją dw ie hipotezy wyjaśniające
ten efekt: 1) mutacje w m itochondrialnym D N A pow odują
zwiększenie produkcji reaktyw nych form tlenu, które mogą
być przyczyną pow staw ania kolejnych mutacji w D NA m i­
tochondrialnym i jądrow ym , 2) komórki mające uszkodzo­
ny łańcuch fosforylacji oksydacyjnej i uzyskujące energię na
drodze glikolizy mają przew agę selekcyjną w w arunkach,
jakie występują w e w nętrzu guza (obniżona podaż tlenu).
O pisane dotychczas w now otow orach mutacje zdają się
upośledzać łańcuch fosforylacji oksydacyjnej. Są to przede
w szystkim delecje i insercje, których rezultatem jest przesu­
nięcie ramki odczytu, oraz mutacje punk to w e uderzające w
silnie zachow yw any ewolucyjnie am inokw as polipeptydu.
Mutacje te m ogą pow odow ać zaburzenia w funkcjonowaniu
szlaku fosforylacji oksydacyjnej. Powyższe zestawienie po­
zwala też przydzielić opisane dotychczas mutacje do dw óch
grup: potencjalnie patogennych i niepatogennych. Należy
jednak pamiętać, że analiza taka daje jedynie przybliżony
obraz stanu in vivo i dokładne określenie w p ływ u tych m u ­
tacji na szlak fosforylacji oksydacyjnej i ogólny m etabolizm
komórki nie jest możliwe in silico lub in vitro.
10. Carroll J, Fearnley I, Shannon R, Hirst J,Walker J (2003) Analysis of
the subunit com position of complex I from bovine heart mitochondria.
Mol Cell Proteomics 2:117-126
PIŚMIENNICTWO
24. D 'A urelio M, Pallotti F, Barrientos A, Gajewski CD, Kwong JQ, Bruno
C, Beal MF, M anfredi G (2001) Itr vivo regulation of oxidative phos­
phorylation in cells harboring a stop-codon m utation in m itochondrial
DN A-encoded cytochrom e c oxidase subunit I. J Biol Chem 276:4692549632
1. M etzler D (2001) Biochemistry: The Chemical Reactions of Living
Cells, Academic Press, San Diego
2. A nderson S, Bankier AT, Barrell BG, de Bruijn MH, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC, Nierlich DP, Roe BA, Sanger F, Schreier PH, Smith
AJ, Staden R, Young IG (1981) Sequence and organization of the h u ­
m an m itochondrial genome. N ature 9: 457-465
3. Leonard J, Schapira A (2000) M itochondrial respiratory chain disor­
ders I: m itochondrial DNA defects. Lancet 22: 299-304
4. Fem andez-Silva P, Enriquez JA, M ontoya J (2003) Replication and
transcription of m am m alian m itochondrial DNA. Exp Physiol 88: 4156
5. Finnila S, H assinen IE, Ala-Kokko L, Majamaa K (2000) Phylogenetic
netw ork of the m tD N A haplogroup U in N orthern Finland based on
sequence analysis of the complete coding region by conform ation-sen­
sitive gel electrophoresis. A m J H um Genet 66:1017-1026
6. G arber K (2004) Energy boost: the W arburg effect returns in a new
theory of cancer. J Natl Cancer Inst 96:1805-1806
7. W arburg O (1956) O n the origin of cancer cells. Science 123: 309-314
8. M urray R, G ranner D, Mayes P, Rodwell V (1999) Biochemia H arpera,
W ydaw nictw o Lekarskie PZWL Sp. z o.o., W arszaw a
9. Saraste M (1999) O xidative Phosphorylation at the fin de siecle. Science
283:1488-1493
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
11. Xia D, Yu CA, Kim H, Xia JZ, Kachurin AM, Z hang L, Yu L, Deisenhofer J (1997) Crystal structure of the cytochrom e bel complex from
bovine heart m itochondria. Science 277: 60-66
12. Papa S, Capitanio N, C apitanio G, Palese LL (2004) Protonm otive cooperativity in cytochrom e c oxidase. Biochim Biophys Acta 1658: 95105
13. Brandon MC, Lott MT, N guyen KC, Spolim S, N avathe SB, Baldi P,
Wallace DC (2005) MITOMAP: a hum an m itochondrial genom e data­
base-2004 update. Nucleic Acids Res 33: D611-D613
14. Plasterer TN, Smith TF, M ohr SC (2001) Survey of hum an m itochon­
drial diseases using new genom ic/proteom ic tools. G enom e Biol 2:
RESEARCH0021
15. T urrens JF (2003) M itochondrial form ation of reactive oxygen species.
J Physiol 552:335-344
16. Shidara Y, Yamagata K, Kanam ori T, N akano K, Kw ong JQ, M anfredi
G, O da H, O hta S (2005) Positive contribution of pathogenic m utations
in the m itochondrial genom e to the prom otion of cancer by prevention
from apoptosis. Cancer Res 65:1655-1663
17. Petros JA, Baum ann AK, Ruiz-Pesini E, Am in MB, Sun CQ, Hall J,
Lim S, Issa MM, Flanders WD, Hosseini SH, Marshall FF, Wallace DC
(2005) m tD N A m utations increase tum origenicity in prostate cancer.
Proc Natl Acad Sci USA 102: 719-724
18. Santorelli FM, Shanske S, Macaya A, DeVivo DC, DiM auro S (1993)
The m utation at nt 8993 of m itochondrial DNA is a com m on cause of
Leigh's syndrom e. Ann N eurol 34: 827-834
19. M akino M, Horai S, Goto Y, N onaka I (1998) Confirm ation that a T-toC m utation at 9176 in m itochondrial DNA is an additional candidate
m utation for Leigh's syndrom e. N eurom uscul Disord 8:149-151
20. Betts MJ, Russell RB (2003) A m ino Acid Properties and Consequences
of Substitutions, W: Michael R. Barnes ICG (red) Bioinformatics for
Geneticists str. 289-316
21. Jemal A, Siegel R, W ard E, M urray T, Xu J, Smigal C, T hun M (2006)
Cancer Statistics 2006. Can J Clin 1:106-130
22. Ferlay J, Bray F, Pisani P, Parkin D (2004) GLOBCAN 2002: Cancer
Incidence, Mortality and Prevalence W orldw ide. Lyon IARCPress,
Lyon
23. Kordek R, Jesionek-Kupicka D (2003) Podstaw y patologii onkologicz­
nej, W: Kordek R, Jassem J, Krzakowaski M, Jeziorski A (red) O nko­
logia. Podręcznik dla studentów i lekarzy Medical Press, Gdansk, str.
4-16
25.G lerum DM, Tzagoloff A (1997) Subm itochondrial distributions and
stabilities of subunits 4,5, and 6 of yeast cytochrom e oxidase in assem ­
bly defective m utants. FEBS Lett 412: 410-414
26. Tsukihara T, Aoyam a H, Yam ashita E, Tomizaki T, Yamaguchi H,
Shinzaw a-Itoh K, N akashim a R, Yaono R,Yoshikawa S (1996) The
whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrom e c oxidase at 2.8
A. Science 272:1136-1144
27. Gallardo ME, M oreno-Loshuertos R, Lopez C, Casqueiro M, Silva J,
Bonilla F, de Cordoba SR, Enriquez JA (2006) m.6267G>A: a recurrent
m utation in the hum an m itochondrial DNA that reduces cytochrome
c oxidase activity and is associated w ith tum ors. H um M utat 27: 575582
28. Tsukihara T, Shim okata K, K atayam a Y, Shim ada H, M uram oto K,
A oyam a H, M ochizuki M, Shinzaw a-Itoh K, Yamashita E, Yao M,
Ishim ura Y,Yoshikawa S (2003) The low -spin hem e of cytochrom e c
oxidase as the driving elem ent of the proton-pum ping process. Proc
Natl Acad Sci USA 100:15304-15309
29. Y oshikawa S (2005) Reaction m echanism and phospholipid structures
of bovine heart cytochrom e c oxidase. Biochem Soc Trans 33: 934-937
http://rcin.org.pl
159
30. Jeronimo C, N om oto S, Caballero OL, U sadel H, H enrique R, Varzim
G, Oliveira J, Lopes C, Fliss MS, Sidransky D (2001) M itochondrial m u­
tations in early stage prostate cancer and bodily fluids. Oncogene 20:
5195-5198
31. Salas A, Yao YG, M acaulay V, Vega A, Carracedo A, Bandelt HJ (2005)
A critical reassessm ent of the role of m itochondria in tumorigenesis.
PLoS M ed 2: e296
32. H ofhaus G, A ttardi G (1995) Efficient selection and characterization
of m utants of a hum an cell line w hich are defective in mitochondrial
DN A-encoded subunits of respiratory N A D H dehydrogenase. Mol
Cell Biol 15: 964-974
33. V agner-Capodano AM, Z attara-Cannoni H, Quilichini B, Giocanti G
(2003) From cytogenetics to cytogenom ics of brain tum ors: Medulloblastom a. Bull Cancer 90: 315-318
34. W ong LJ, Lueth M, Li XN, Lau CC, Vogel H (2003) Detection of m i­
tochondrial DNA m utations in the tum or and cerebrospinal fluid of
m edulloblastom a patients. Cancer Res 63: 3866-3871
35. Com bet C, Blanchet C, Geourjon C, Deléage G (2000) NPS@: Network
Protein Sequence Analysis. TIBS 25:147-150
36. Tan DJ, Bai RK, W ong LJ (2002) Com prehensive scanning of somatic
m itochondrial DNA m utations in breast cancer. Cancer Res 62: 972976
37 Liu VW, Shi HH, C heung AN, Chiu PM, Leung TW, Nagley P, W ong
LC, N gan HY (2001) H igh incidence of som atic m itochondrial DNA
m utations in hum an ovarian carcinomas. Cancer Res 61: 5998-6001
38. M eierhofer D, M ayr JA, Fink K, Schmeller N, Kofler B, Sperl W (2006)
M itochondrial DNA m utations in renal cell carcinom as revealed no
general im pact on energy m etabolism. Br J Cancer 94: 268-274
39. Parrella P, Xiao Y, Fliss M, Sanchez-Cespedes M, M azzarelli P, Rinaldi
M, Nicol T, Gabrielson E, Cuom o C, Cohen D, Pandit S, Spencer M,
Rabitti C, Fazio VM, Sidransky D (2001) Detection of mitochondrial
DNA m utations in prim ary breast cancer and fine-needle aspirates.
Cancer Res 61: 7623-7626
40. Polyak K, Li Y, Z hu H, Lengauer C, W illson JK, M arkow itz SD, Trush
MA, Kinzler KW, Vogelstein B (1998) Somatic m utations of the mito­
chondrial genom e in hum an colorectal tum ours. N at Genet 20: 291293
41. Tan DJ, Chang J, Liu LL, Bai RK, W ang YF, Yeh KT, W ong LJ (2006)
Significance of somatic m utations and content alteration of mitochon­
drial DNA in esophageal cancer. BMC Cancer 6: 93-94
42. Parrella P, Xiao Y, Fliss M, Sanchez-Cespedes M, M azzarelli P, Rinaldi
M, Nicol T, Gabrielson E, Cuom o C, Cohen D, Pandit S, Spencer M,
Rabitti C, Fazio VM, Sidransky D (2001) Detection of mitochondrial
D N A m utations in prim ary breast cancer and fine-needle aspirates.
Cancer Res 61: 7623-7626.
43. Ballana E, Morales E, Rabionet R, M ontserrat B, Ventayol M, Bravo
O, Gasparini P, Estivill X (2006) M itochondrial 12S rRNA gene m uta­
tions affect RNA secondary structure and lead to variable penetrance
in hearing im pairm ent. Biochem Biophys Res C om m un 341: 950-957
44. Mollers M, M aniura-W eber K, Kiseljakovic E, Bust M, H ayrapetyan
A, Jaksch M, Helm M, W iesner RJ, von Kleist-Retzow JC (2005) A
new m echanism for m tD N A pathogenesis: im pairm ent of post-transcriptional m aturation leads to severe depletion of m itochondrial
tRNASer(UCN) caused by T7512C and G7497A point m utations. N u ­
cleic Acids Res 33: 5647-5658
45. Yasukawa T, Suzuki T, Ohta S, W atanabe K (2002) W obble m odifi­
cation defect suppresses translational activity of tRNAs w ith MERRF
and MELAS m utations. M itochondrion 2:129-141
46. Lorenc A, Bryk J, Golik P, Kupryjanczyk J, Ostrow ski J, Pronicki M,
Sem czuk A, Szolkowska M, Bartnik E (2003) H om oplasm ic MELAS
A3243G m tD N A m utation in a colon cancer sam ple. M itochondrion 3:
119-124
47. Coller HA, Khrapko K, Bodyak ND, N ekhaeva E, H errero-Jim enez
P, Thilly WG (2001) H igh frequency of hom oplasm ic m itochondrial
DN A m utations in hum an tum ors can be explained w ithout selection.
N at Genet 28:147-150
48. Ugalde C, Vogel R, Huijbens R, van der Heuvel B, Sm eitink J, Nijtm ans
L (2004) H um an m itochondrial complex I assem bles through the com ­
bination of evolutionary conserved m odules: a fram ew ork to interpret
complex I deficiencies. H um Mol Genet 13: 2461-2472
49. Penta JS, Johnson FM, W achsm an JT, Copeland WC (2001) M itochon­
drial DNA in hum an malignancy. M utat Res 488:119-133
50. Ugalde C, Vogel R, Huijbens R, Van Den Heuvel B, Sm eitink J, N i­
jtm ans L (2004) H um an m itochondrial complex I assem bles through
the com bination of evolutionary conserved m odules: a fram ew ork to
interpret complex I deficiencies. H um Mol Genet 13: 2461-72
51. Berman HM, W estbrook J, Feng Z, Gilliland G, Bhat TN, W eissig H,
Shindyalov I, Bourne P (2000) The Protein Data Bank. Nucleic Acids
Res 28: 235-242
52. Pettersen EF, G oddard TD, H uang CC, Couch GS, G reenblatt DM,
Meng, EC, Ferrin TE (2004) UCSF Chimera — A Visualization System
for Exploratory Research and Analysis. J C om put Chem 25:1605-1612
53. Poirot O, O'Toole E, N otredam e C (2003) Tcoffee@igs: A web server
for com puting, evaluating and com bining m ultiple sequence align­
ments. Nucleic Acids Res 31: 3503-3506
The impact of mtDNA mutations on proteins
structure in selected types of cancer
Katarzyna Plak1, Wojciech Kukwa2, Ewa Bartnik13, Paweł Golik13, Anna Ścińska2, Tomasz
Krawczyk4, Anna M. Czarnecka1'56'
’Institute of Genetics and Biotechnology, U niversity of W arsaw , 5a Paw ińskiego St., 02-106 W arsaw , Poland
■O tolaryngology D epartm ent, M edical U niversity of W arsaw , 19/25 Stępińska St., 00-739 W arsaw , Poland
in s titu te of Biochem istry and Biophysics, PAS, 5a Paw inskiego St., 02-106 W arsaw , Poland
^Clinical Pathology Laboratory, CZMP, Lodz, Poland
P o s tg ra d u a te School of M olecular M edicine, 3 P asteura St., 02-093 W arsaw , Poland
’’present adress: John Petros Lab, Em ory School of M edicine, Clinic Building B, Room B4220,1365 Clifton Rd NE, 30322 A tlanta, GA, USA
e-mail: anna.czarnecka@ gm ail.com or aczarne@ em ory.edu
Key words: cancerogenesis, m itochondria, m tD N A , oxidative phosphorylation, protein structure
ABSTRACT
Recently published papers report a large number of mitochondrial D N A mutations in many different cancer types, but their significance for
electron transport chain proteins remains unknow n. This review covers structural mutations of mitochondrial genes, choosing prostate cancer,
esophageal cancer and epithelioma as research models. As all mitochondrial genes encode subunits of the electron transport chain, the review
focuses on the consequences of structural mutations on cell metabolism.
160
http://rcin.org.pl
w w w . postep y bio ch em ii.pi
STRESZCZENIE
horoby mitochondrialne u dzieci spow odow ane są głów nie mutacjami w genach nD NA.
D efekty te upośledzają funkcję podjednostek strukturalnych i składania kom pleksów
łańcucha oddechow ego oraz innych białek pośrednio związanych z fosforylacją oksydacyj­
ną. D o najlepiej poznanych fenotypów klinicznych należą defekty związane z deficytem
oksydazy cytochromowej i mutacjami w genach SURF1 czy SC02, deficyty podjednostek
jądrowych kom pleksu I oraz zaburzenia prowadzące do deplecji mtDNA. Mutacje m tD N A
odpowiadają zaledw ie za 10-20% mitochondropatii w w ieku wczesnodziecięcym. W poło­
w ie przypadków tło molekularne pozostaje nieustalone. Objawy chorób mitochondrial­
nych u dzieci są niespecyficzne. Wzrost stężenia kw asu m lekow ego w osoczu jest jedynym
znacznikiem biochemicznym, ale o małej czułości i specyficzności. Podstawą diagnostyki
pozostaje biochemiczne badanie bioptatu m ięśniow ego z zastosow aniem udoskonalanych
technik oceny funkcji mitochondriów. W pracy przedstawiono algorytm diagnostyczny cho­
rób mitochondrialnych u dzieci. Zaproponowano pożądane kierunki badań naukowych. Na
wyjaśnienie zasługuje m.in. fenom en identycznych zmian w mózgu o typie zespołu Leigha,
niezależnie od rozmaitego tła molekularnego.
C
WPROWADZENIE
Po raz pierw szy choroby m itochondrialne zostały w yodrębnione w patolo­
gii człowieka w latach 60. i 70. XX w ieku [1], na podstaw ie w ystępow ania w
mięśniach typow ych zm ian ultrastrukturalnych m itochondriów (Ryc. 1) oraz
widocznych w m ikroskopie św ietlnym tzw. poszarpanych czerw onych w łókien
m ięśniowych (RRF, ang. ragged red fibers) (Ryc. 2, barw ienie z zastosow aniem
barw nika Trichrom). Rozpoznanie ustalane jest zwykle dopiero u m łodzieży i
dorosłych, chociaż pierwsze objawy są uchw ytne wcześniej. Symptomatologia,
bardzo różnorodna, obejmuje zestaw postępujących zm ian w m ózgu, mięśniach,
gruczołach wydzielania w ew nętrznego, narządach zm ysłów (głuchota, oftalmoplegia) i innych tkankach i narządach, w najrozmaitszych układach [2]. C ha­
rakterystyczne jest dziedziczenie w linii matczynej (mitochondrialne) niezgodne
z zasadam i Mendla. Jedyne powtarzające się w chorobach m itochondrialnych
Ewa Pronicka1
Dorota PiekutowskaAbramczuk2
Maciej Pronicki3
'K linika
C horób
M etabolicznych, E ndo­
krynologii i Diabetologii, Instytut „Pom nik
— C en tru m Z drow ia D ziecka", W arszaw a
2Z akład G enetyki M edycznej, Instytut „Pom nik
— C entrum Z drow ia Dziecka", W arszaw a
3Z akład Patologii, Instytut „Pom nik — C en­
tru m Z drow ia D ziecka", W arszaw a
’Klinika
C horób
M etabolicznych,
E ndokrynologii i Diabetologii Instytut „Pom nik
— C entrum Z drow ia Dziecka", Aleja Dzieci
Polskich 20, 04-730 W arszaw a, tel.: (0 22) 815
7490; e-mail: e.pronicka@ czd.pl
A rtykuł otrzym ano 6 m aja 2008 r.
A rtykuł zaakceptow ano 8 m aja 2008 r.
Słowa kluczowe: choroby m itochondrialne,
dzieci, kryteria diagnostyczne, zespół Leigha
Skróty: FAO — m itochondrialna P-oksydacja
kw asów tłuszczow ych; FBP — fosfataza fruktozo-l,6-bisfosforanow a; GSD - glikogenozy;
H H H - zespół 3H (hiperornitynem ia, hiperam onem ia, hom ocytrulinuria); LCFA - długołańcuchow e kw asy tłuszczow e; M M A — acyd uria (kwasica) m etylom alonow a; OXPHOS
— fosforylacja oksydacyjna; PA — acyduria
(kwasica) propionianow a; PD H — d eh y d ro ­
genaza pirogronianow a; PEPCK — karboksykinaza fosfoenolopirogronianow a; RRF — po­
szarpane czerw one w łókna m ięśniow e (ang.
ragged red fibers
Podziękowania: A rtykuł pow stał w trakcie
realizacji projektu badaw czego MNiSW (PB
0 8 9 0 /P 0 5 /2005/29) oraz w ram ach Polskiej
Sieci M itochondrialnej M itoN et.pl
Rycina 1. Z m iany u ltrastru k tu raln e w m ięśniu szkieletow ym i w w ątrobie u pacjentów , u któ rych stw ier­
dz o n o obecność m utacji leżących u po dłoża chorób m itochondrialnych. W idoczne są zm iany liczby, kształtu
i w ew n ętrznej stru k tu ry m itochondriów . Z a rc h iw u m Z ak ładu Patologii In sty tu tu „P om nika — C en tru m
Z d ro w ia D ziecka" w W arszaw ie [42].
P ostępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
161
tacji m tD N A w 11 genach
strukturalnych podjednostek
kom pleksów I, III, IV, w 22
genach tRNA, d w ó ch rRNA
oraz
dw óch
kodujących
podjednostki syntazy ATP.
N iektóre mutacje opisano
tylko u pojedynczych pacjen­
tów. U większości chorych,
zwłaszcza w okresie d zie­
ciństwa, obraz kliniczny nie
spełnia kryteriów znanych
zespołów .
Rycina 2. Przekrój po przeczny p rzez m ięsień szkieletow y (pow iększenie oryginalne 400 x). W łókna RRF (A) w ykazują
d o d a tn ią reakcję w k ieru nku deh y d ro g en azy bursztyn ianow ej (B) i brak aktyw ności oksydazy cytochrom ow ej (C). U szko­
d zone w łókn a w ykazują niew ielki w z ro st aktyw ności kw aśnej fosfatazy (D). Z archiw u m Z a kład u Patologii In stytutu
„Pom nika — C en tru m Z d row ia D ziecka" w W arszaw ie.
odchylenia laboratoryjne to w zrost stężenia mleczanów i
alaniny w płynach ustrojowych [3,4].
W 1988 roku wyjaśniono podłoże m o lekularne pierw ­
szych zdiag nozow anych p rzy p ad k ó w chorób m itochon­
drialnych poprzez identyfikację mutacji w mtDNA. Po­
szczególne m utacje prób ow ano w iązać z w yodrębnionym i
wcześniej i uży w anym i do dziś zespołam i klinicznymi o
angielskich akronim ach i aponim ach [2]. I tak mutację w
pozycji 3243 tR N A Le" opisyw ano w MELAS (mitochondrial
encephalopathy, lactic acidosis, stroke like episodes), m u ­
tację 8344 tR N A Lvs — w MERRF (ang. myoclonic epilepsy,
ragged red fibers), mutację 8993T>C lub T>G w genie ko­
dującym podjednostkę 6 ATPazy — N A RP (ang. neuronal
atrophy, retinitis pigmentosa) lub MILS (ang. mitochondrially
inherited Leigh syndrome), d użą delecję m tD N A — w PEO
(ang. progressive external ophtalmoplegia) lub w KSS (zespół
Kearn-Sayre'a: cukrzyca, niedoczynność przytarczyc, blok
p rzew od nictw a w sercu). O kazało się jednak, że fenotyp
choroby m itochondrialnej zależy bardziej od p rz y p a d k o ­
wego p rzekazania ilości zm u to w an eg o m tD N A kom ór­
kom p o to m n y m na etapie rozw oju zarodka, płodu, n arzą­
du czy tkanki (czyli od stopnia heteroplazm ii) niż od geno­
typu [5], W zasadzie każdy pacjent choruje inaczej — pod
w zg lędem ciężkości, w ieku ujawnienia, stopnia rozw oju i
zakresu zajętych narządów . Różnice w ystępują niezależ­
nie od spokrew nienia chorych osób. Z d ro w a kobieta, no­
sicielka mutacji m tDNA , urodzić m oże dziecko niezdolne
do życia, ciężko uszkodzone już od urodzenia. Ustalone
wcześniej „dogm aty" diagnostyczne rz ad k o spraw dzają
się w praktyce. Do chwili obecnej opisano p o n a d 100 m u ­
162
Wyjaśnienie na przeło­
mie XX i XXI w ieku tła m o­
lekularnego deficytów kilku
białek składania oksydazy
cytochrom u c (SURF1, SC02,
SCOl, COXIO, COX15), któ­
rych geny zlokalizow ane są
w chrom osom alnym DNA
(nDNA), a mutacje przekazy­
w ane są w rodzinach zgodnie
z zasadam i M endla [6,7], było
otwarciem nowej ery, szcze­
gólnie w poznaniu patogene­
zy chorób m itochondrialnych
u dzieci. O d tej pory opisano
kilkadziesiąt defektów doty­
czących nD N A [8], a kolejne
kilkadziesiąt, czy naw et kil-
kaset, pozostaje do odkrycia.
Chorobą m itochondrialną, we współczesnym ujęciu,
nazyw am y stan chorobow y w yw ołany uw aru n k o w an ą ge­
netycznie zmianą b udow y białka, pierw otnie zaburzającą
przebieg procesów energetycznych w komórce. Przyczynę
defektu zidentyfikować m ożna na poziomie m olekularnym
(mutacje mtD NA i nDNA) lub jedynie na poziomie bioche­
micznym (lokalizacja defektu w procesie OXPHOS). Satys­
fakcjonujący poziom diagnostyki klinicznej zm ienia się i
odpow iada bieżącemu stanow i w iedzy w zakresie „ m edy­
cyny mitochondrialnej". W łaściwa diagnoza w ym aga więc
potw ierdzenia obecności patogennej mutacji w znanych
genach albo tylko — w ykazania defektu biochemicznego
w tkankach (najczęściej mięśniach, hodow anych fibroblastach, ostatnio też w wątrobie) [9,10], Na Ryc. 3 przedsta­
w iono lokalizację genów, w których identyfikow ane są m u ­
tacje odpow iedzialne za zaburzenie funkcji poszczególnych
kom pleksów łańcucha oddechow ego. W chwili obecnej w
ponad połowie przyp adków pierw otnych zaburzeń m ito­
chondrialnych u człowieka tło m olekularne pozostaje do
wyjaśnienia. Tło biochemiczne to najczęściej izolow ane de­
ficyty kom pleksów I i IV łańcucha oddechow ego, ale także
deficyty pozostałych kom pleksów lub uogólnione defekty
OXPHOS.
DEFICYTY KOMPLEKSU IV
Z aró w n o biosynteza ok sy d azy cytochro m u c u czło­
w ieka, jak sy m ptom atolo gia jej deficytu n ależą d o naj­
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
tyfikow anych p rz y p a d k ó w
stanow i
blisko
połow ę
w szystkich opublikow anych
na świecie [23],
DEFICYTY KOMPLEKSU I
Do chwili obecnej opisa­
no choroby m itochondrialne
z mutacjami w e wszystkich
siedm iu m itochondrialnych i
w ośmiu z 38 jądrow ych p o d ­
jednostek kom pleksu I [6].
Najczęściej opisyw anym (ale
nie wyłącznym) obrazem kli­
nicznym deficytu kom pleksu
I jest nietypow y zespół Le­
igha [24]. W większości przy­
padk ów obniżenia aktyw no­
ści enzymatycznej w mięśniu
i/lu b w fibroblastach tło m o­
Rycina 3. Po dstaw o w e geny kodujące podjednostki kom pleksów łańcucha oddecho w eg o, w których zid entyfikow ano
lekularne pozostaje nieznane.
m utacje o d p ow iedzialne za w ystąpienie choroby m itochondrialnej. K olorem c zerw on ym i niebieskim zaznaczono p o d ­
jed nostki struk turalne, k o d ow an e o dp ow ied nio p rzez geny m itoch ondrialn e i jądrow e. K olorem zielonym zaznaczono
Trudność z identyfikacją tych
po djednostki nD N A uczestniczące w skład an iu kom pleksów .
zaburzeń wiąże się z brakiem
odpow iedniego m odelu eks­
perym entalnego u drożdży, a
lepiej p o zn an y ch [11-15]. W ystępow ać m ogą w łaściw ie
także
brakiem
prostej
reakcji
histochemicznej
pozwalającej
w szystkie m ożliw e fenotyp y kliniczne. D w a z nich, naj­
na
detekcję
deficytu
w
m
ięśniu
[25],
U
powszechnienie
m e­
lepiej po znane, po w ią za n e zostały z m utacjam i w genach
tody
BN-PAGE
i
„in
gel
activity"
(patrz
artykuł
poświęcony
SURF1 i S C 0 2 , uczestniczących w procesie składania
tej m etodzie zamieszczony w niniejszym num erze „Postę­
kom p lek su IV. Deficyt białka SURF1 objaw ia się klinicz­
pów Biochemii) w diagnostyce mitochondrialnej popraw iło
nie klasycznym zespołem Leigha [16]. Dzieci ro d z ą się
co
p raw d a stopień rozpoznaw alności deficytów kompleksu
p ozornie zdrow e. W drugiej połow ie p ierw szego roku
I
na
poziom ie biochem icznym [26,27], ale do ostatecznego
życia pojaw iają się w ym ioty, brak p rz y b y tk u m asy ciała,
wyjaśnienia
ich patom echanizm u pozostaje daleka droga.
w iotkość, d rżenia, za b u rzen ie dysocjacji gałek ocznych,
W
ykazano,
że
w skomplikowanej biogenezie kom pleksu I
zm ian y ry tm u o d d ychan ia, acydem ia (kwasica) m leczaw
spółdziałają
dw
a kom plem entarne procesy: synteza p o d ­
now a. Przebieg choroby podlega w ahaniom . Postępująca
jednostek m tD N A tw orzących pierw otny pro d u k t składa­
encefalopatia p ro w a d z i do z gon u p rz e d 4 rokiem życia
nia i następow a w ym iana jego składu z udziałem podjed­
(brak skutecznego leczenia). P atom ech anizm u sz k o d z e ­
nostek now o im portow anych z cytozolu [28], Uszkodzenie
nia m ó zgu w iąże się p ra w d o p o d o b n ie z w y stę p o w a n ie m
każdego z uczestniczących w procesie składania białek, np.
e p izo d ó w alkalozy oddechow ej i hip o k ap n ii [17]. Deficyt
białka opiekuńczego B17.2L [29] i etapów stanowi potencjal­
o pieku ńczego białka S C 0 2 p ro w ad zi do postępującej n o ­
ną przyczynę choroby mitochondrialnej. N ieopublikow ane
w orod kow ej kard io m io p atii przerostow ej [12,13] lub ze­
badania aktywności kom pleksu I w liniach fibroblastów pa­
społu „dziecka w iotkiego" (ang. floppy child) z obrazem
cjentów w skazują na istnienie co najmniej 7 różnych niepoprzypo m inającym rd ze n io w y zanik m ięśni (SMA, ang.
znanych jeszcze defektów, które nie podlegają kom plem en­
spinal muscular atrophy). W cześnie w ystępu je n ie w y d o l­
tarnej korekcji [25].
ność od d e c h o w a w ym agająca sztucznej w entylacji. D zie­
ci um ierają w niem ow lęctw ie. Defekt m oże p ro w ad zić
do sam oistnych poro nień p ło d u [18]. Szansa leczenia
p o d sk ó rn y m i injekcjami h isty nianu m iedzi pozostaje do
u d o w o d n ie n ia [19]. N ależy podkreślić, że w p o n a d po ło ­
wie p rz y p a d k ó w chorych z deficytem COX nie ustalono
jeszcze tła m olekularnego [15]. Mutacje w genach s tru k ­
tu ralny ch p odjed n o stek ko m plek su (COI, COII, COIII)
w y k ry to tylko u pojedynczych chorych, m im o in te n sy w ­
nych p o sz u k iw a ń [20], Być m oże niektóre zab u rze n ia są
defektam i letalnym i. W ykazanie lub w yklu czenie deficy­
tu o ksydazy cytochrom ow ej w m ięśniu m e to d ą histochem iczną [21] (Ryc. 4) i / l u b sp ek trofotom etryczn ą w hom ogenacie tkanki [22], stanow i pierw szy etap diagn ostyki
enzym atycznej chorób m itoch ondrialny ch u dzieci. W
Polsce m utacje w genach SURF1 i S C 02 należą do szcze­
gólnie częstych przy czy n deficytu COX, a liczba z id e n ­
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
DEPLECJE mtDNA
Choroby m itochondrialne zw iązane z mutacjami genów
strukturalnych oraz genów kodujących białka składania
aktyw nych kom pleksów łańcucha oddechow ego, stanowią
zaledw ie część stale poszerzającego się spektrum zaburzeń
m itochondrialnych u człowieka. Znaczącą p o dgrupę stano­
w ią choroby m itochondrialne przebiegające z obniżeniem
ilości m tD N A w stosunku do nDNA, tzw. zespoły deplecji
m tD N A (MDS, ang. mitochondrial depletion syndromes). O d ­
kryte po raz pierw szy w początku lat 90. XX wieku u nie­
m ow ląt z postępującą dysfunkcją w ątroby o niepom yślnym
przebiegu, okazują się obecnie w zględnie częstą przyczyną
niew ydolności i marskości w ątroby u małych dzieci. W śród
nich na czoło w ysuw ają się zaburzenia syntezy nukleoty-
http://rcin.org.pl
163
Ponadto, upowszechnia
się pogląd, że poznanie
patom echanizm u choroby
u pacjenta z unikalnym
defektem
genetycznym
jest w ażne nie tylko dla
niego, ale rzuca światło
na przebieg procesów fi­
zjologicznych i m oże mieć
znaczenie uniw ersalne w
poszerzeniu naszej w iedzy
biologicznej. Przykładow o
wymienić m ożna trwające
kilka lat badania nad przy­
czyną choroby u now orod ­
ka, który zmarł wkrótce
po urodzeniu z objawami
choroby mitochondrialnej
o ciężkim przebiegu, które
doprow adziły do potw ier­
dzenia szerszej roli dynam in w patologii człowieka
[35], Przynajmniej pięć ge­
Rycina 4. Przekrój pop rzeczny przez m ięsień szkieletow y. Całkowity (tzw. rozlany) deficyt oksydazy cytochrom ow ej (A, re­
akcja k ontro lna — C), w zrost ilości lipidó w o śre d n im nasileniu (B). Barwienie hem atoksyliną i eozyną (D) oraz barw nikiem
nów jądrow ych odpow ie­
T richrom w e d łu g m etod y G om oriego (E) nie ujaw nia uchw ytnych zmian. Z arch iw u m Z a k ła d u Patologii Instytu tu „Pom nika
dzialnych za syntezę bia­
— C en tru m Z d ro w ia Dziecka" w W arszaw ie.
łek m itochondrialnych [31]
odkryto poprzez identyfi­
kację mutacji u pacjentów
dów purynow ych, ograniczających ilość substratu do pro­
z chorobami m itochondrialnym i, w tym gen MRPS16 (ang.
dukcji m tD N A w komórce, zaburzeń replikacji mtDNA, czy
mitochondrial ribosomcil protein subunit 16) u now orodka z
niepraw idłowej komunikacji międzygenomowej. Aktualną
kwasicą mleczanową, dysmorfią b udow y i obrzękami koń­
w iedzę na tem at MDS i udziału różnych genów w pow sta­
czyn i gen PUS1 (ang. pseudouridine synthase 1) w rodzinach
w aniu tego zjawiska (DGUOK, POLG1, TP, ANT1, MPV17,
z fenotypem MLASA (ang. myopatia, lactic acidosis, sideroblaTK2, SUCLA2, Twinkle) znaleźć m ożna w opublikowanych
stic
anemia).
ostatnio wyczerpujących pracach przeglądowych [30,31].
Jednak w ykryte do tej pory defekty wyjaśniają patogenezę
niewielkiego tylko odsetka przypadk ów deplecji mtDNA.
Z p u n k tu w idzenia klinicznego w ażne jest, że objawy MDS
ograniczać się m ogą do jednego narząd u czy tkanki (poza
w ątrobą, do mięśni szkieletowych, układu nerwowego, ser­
ca), wykraczając poza klasyczną formę wielonarządowego
schorzenia mitochondrialnego.
INNE WYBRANE ZABURZENIA
FUNKCJI MITOCHONDRIÓW
Proces poznaw ania patologii mitochondrialnej u człowie­
ka wydaje się wkraczać w okres kolejnych znaczących odkryć,
dzięki w prow adzaniu nowych wyrafinowanych i kosztow­
nych metod badawczych i technologii do badań ciekawych,
niewyjaśnionych przypadków . Podkreślana jest rola badania
żywych niezmienionych m itochondriów z uwzględnieniem
ich funkcji, np. poprzez pom iar syntezy ATP czy zużycia
znakow anych substratów [10,32,33], a nie tylko w statycz­
nym układzie zamrożonej tkanki. Okazuje się także, że me­
todyczne poszukiwanie mutacji mtD NA w podjednostkach
strukturalnych kompleksu I (ND1-ND6) daje pozytywny
efekt częściej niż poprzednio sądzono [8,34], Wyniki otrzy­
m ane w badaniach nad defektem w ykrytym u pojedynczego
pacjenta, przekładają się niekiedy na lepsze zrozumienie pa­
togenezy podobnych chorób, ale występujących powszech­
nie i mających charakter społeczny.
164
DIAGNOSTYKA KLINICZNA,
BIOCHEMICZNA I MOLEKULARNA
W iedza na temat częstości w ystępow ania chorób m i­
tochondrialnych w populacji, w tym u małych dzieci, jest
ograniczona. Dostępne są nieliczne, dobrze u do k u m en to ­
w ane publikacje pozwalające oszacować tę liczbę na 1:3.5
tysięcy mieszkańców [36,37]. Dane dotyczące w ystępow a­
nia zespołu Leigha w Polsce zostały ostatnio opublikow a­
ne. Wskazują one, że populacja polska (praw dopodobnie w
ogóle słowiańska) m a swój własny w zór epidemiologiczny
choroby mitochondrialnej, w yrażony bardzo częstym w y ­
stępow aniem zespołu Leigha zw iązanego z obecnością m u ­
tacji w genie SURF1 [23]. U w aża się, że w stępne rozpozna­
nie choroby mitochondrialnej jest bardzo trudn e z pow odu
niejednoznacznego obrazu chorobowego (przyjmującego
najróżniejsze maski dobrze znanych lekarzom chorób naby­
tych), nierów nom iernego przebiegu i braku niezaw odnych
znaczników biochemicznych. Jedynym w zględnie częstym
param etrem biochemicznym jest w zrost stężenia mleczanów
w płynach ustrojowych. Jest to jednak znacznik o niskim
stopniu wiarygodności (występuje u około 70% chorych) i
nieswoisty (towarzyszy np. każdem u niedotlenieniu), a w
praktyce nie jest on oznaczany rutynow o. Tabela 1 p rz e d ­
stawia algorytm różnicowania acydemii (kwasicy) mleczanowej z uw zględnieniem zalet i pułapek interpretacyjnych.
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
Tabela 1. D iagnostyka różnicow a acydem ii (kwasicy) mleczanowej*.
Identyfikacja
przyczyny
W ynik fałszyw y
Patomechanizm**
W artość w różnicow aniu,
jednostki chorobow e
trudności w pobraniu krw i, użycie
staży naczyniow ej przy pobieraniu
-
N aczyniow e
w strząs — u trata p ły n ó w /k rw i, inne
-
Infekcja
posocznica, m alaria, grzybica, inne
O ddechow e
niedotlenienie, stan astm atyczny
-
N eurologiczne
encefalopatia niedotlenieniow a,
niedotlenienie okołoporodow e
-
K ardiologiczne
kardiom iopatia, niew ydolność krążenia, inne
-
M etaboliczne
niew yrów nana cukrzyca (ketoacydoza)
(kwasica ketonow a)
w rodzone w ady m etabolizm u
zaburzenia OXPHOS (choroba
m itochondrialna)
deficyt karboksylazy pirogronianow ej
deficyt karboksykinazy
fosfoenolopirogronianow ej
deficyt kom pleksu dehydrogenazy
pirogronianow ej
defekty p rzem ian tiam iny
GSD I a /b
GSD III (po posiłku)
deficyt syntazy glikogenu (po posiłku)
deficyt fruktozobisfosfatazy
defekty LCFA, FAO
A cydem ie (kwasice) organiczne
(MMA, PA i inne)
deficyt b iotynidazy i holokarboksylazy
defekty cyklu Krebsa
zespół H H H (???)
P rzew ód
pokarm ow y
zespół krótkiego jelita (d-m leczan)
N erkow e
niew ydolność nerek, kw asica kanalikow a
W ątrobow e
m arskość
N ow otw ory
złośliw e
białaczki, ziarnica złośliw a
W pływ leków
m etform ina, alkohol, fruktoza,
probiotyki, statyny, leki w AIDS
W pływ diety
niedobór tiam iny
Skróty: OXPFIOS — fosforylacja oksydacyjna; LCFA - długołańcuchow e kw asy tłuszczow e; FAO —
m itochondrialna beta-oksydacja kw asów tłuszczow ych; GSD — glikogenozy. *(wg J L eonarda, EMG m eeting 2003,
dane niepublikow ane). ** Przyczyny kum ulacji kw asu m lekow ego są w ieloczynnikow e i złożone; poszczególne
m echanizm y m ogą nakładać się na siebie.
W literaturze medycznej dostępne są od pew nego czasu
algorytmy diagnostyczne dla dorosłych i dla dzieci z po­
dejrzeniem m itochondriopatii [10], a także próby ustalenia
prognozy u dzieci z już zdefiniowaną chorobą m itochon­
drialną [37,38], W opinii autorów szczególnie przydatna
jest zarów no w pierw szym podejściu, jak i w interpretacji
w yników biopsji mięśnia, punktacja zaproponow ana przez
m itochondrialny ośrodek w Nijmegen. Została ona ostatnio
pozytyw nie zweryfikowana w praktyce [39], N a podsta­
wie analizy objawów klinicznych, badań laboratoryjnych
i obrazowych można zakwalifikować pacjenta do różnego
poziom u pewności rozpoznania, od mało pra w d o p o d o b ­
nej choroby mitochondrialnej (1 pkt), przez m ożliwą (2-3
pkt), praw dop odobn ą (4-7 pkt), do dobrze zdefiniowanej
(8-12 pkt). W śród ważnych param etrów diagnostycznych,
poza w spom nianą wyżej acydemią (kwasicą) mleczanową,
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
jest obecność włókien
RRF, obniżenie aktyw ­
ności COX w mięśniu,
czy charakterystyczny
w ynik
obrazowania
m ózgu (zespół Leigha,
zm iany udaro-podobne). Skala oceny p rzed ­
stawiona w tabeli 2
pozwala na w ypełnie­
nie
indyw idualnego
form ularza
chorego,
zwiększając
obiekty­
w izm interpretacji i
w nioskow ania różnico­
wego. Wykrycie m u ta­
cji odpowiedzialnej za
w ystąpienie
choroby
mitochondrialnej
(w
około połowie bada­
nych
przypadków )
kończy proces dia­
gnostyczny.
Niestety
nie znam y leczenia
przyczynow ego
cho­
roby mitochondrialnej.
Meta-analiza Cochra­
n e 'a w ym ienia nie­
liczne nadające się do
oceny prace, które nie
potw ierdzają skutecz­
ności stosowanych dość
powszechnie
leków
(koenzym Q, witaminy,
karnityna). Szczęśliwie
nie ma też przesłanek,
że takie postępow anie
jest szkodliwe [41].
PODSUMOWANIE
- POŻĄDANE
KIERUNKI BADAŃ
Pacjent ze zdefinio­
w aną chorobą m ito­
chondrialną, u którego
nie w ykry to znanych mutacji m tD N A i nD NA , ani okre­
ślonych deficytów enzym atycznych, m oże uczestniczyć w
dalszych badaniach naukow ych. Zw ykle pacjenci z rz a d ­
kimi chorobam i i ich rodziny św iadom ie w nich uczestni­
czą zaró w n o z po w o d ó w osobistych, jak i solidarnościo­
wych. M etodyka p o szukiw ania now ych defektów funkcji
m itochondriów pow odujących choroby m itochondrialne
u ludzi m oże być bardzo różna. Klasyczne podejście po ­
lega na b ad an iu sprzężeń fenotypu z genotypem w d u ­
żych gru p ac h osób spokrew nionych. W ym aga ono jednak
wcześniejszej identyfikacji takich rodzin, co w polskiej p o ­
pulacji zw ykle nie jest możliw e. A naliza kom plem entar­
na linii kom ó rkow ych pochodzących od pacjentów z tym
sam ym deficytem jest także p rz y d atn ą m etodą lokalizacji
defektu m etabolicznego. M etoda ta doprow adziła, m.in.,
do w ykrycia w w ieloośrodkow ych badaniach pierw szego
http://rcin.org.pl
165
Tabela 2. K ryteria ro zp o zn an ia choroby m itochondrialnej u dzieci w g skali N ijm egen [39].
G rupa param etró w
Punktacja/
p aram etr
P a ra m e tr/o b ja w y
M axim um p u n k tó w
w po d g ru p ie A,B,C
I. O bjaw y kliniczne (m aksim um A+B+C = 4 punkty)
A. O bjaw y ze strony m ięśni
B. O bjaw y ze strony
ośrodkow ego układ u
nerw ow ego
C. C horoba w ielonarządow a
oftalm oplegia
2
tw arz m iopatyczna
1
nietolerancja w ysiłku
1
osłabienie m ięśniow e
1
rabdom yoliza
1
n iepraw idłow y zapis EMG
1
opóźnienie rozw oju
u trata nabytych um iejętności
epizody udaro -p o d o b n e
1
m igrena
1
1
1
drgaw ki
1
m ioklonie
1
ślepota korow a
1
objaw y p iram idow e
1
objaw y p o zapiram idow e
1
uszkodzenie pnia m ózgu
(oddech, połykanie)
1
u kład krw iotw órczy
1
przew ó d pokarm ow y
1
h o rm o n y / w zrost
2
1
serce
1
nerki
1
2
ne z n aturalnym lub
sztucznie w yw ołanym
defektem genetycznym.
To podejście nie zawsze
jednak się spraw dza.
W ywołany
do św iad­
czalnie u m yszy deficyt
białkaSurfl przypom ina
fenotyp pacjentów tyl­
ko w patologii dotyczą­
cej mięśni. Zaskakujące
jest natomiast, że zwie­
rzęta eksperym entalne
nie w ykazują obecnych
zaw sze u człowieka
zm ian neurologicznych
o typie zespołu Leigha.
Co więcej, w ykazano, że
w jednym z dw óch eks­
perym entów obecność
mutacji w genie SURF1
wiąże się z dłuższym
przeżyciem (dotąd brak
jest w ytłum aczenia tego
zjawiska) [40].
3
Patomechanizm, któ­
ry prow adzi do w ystą­
1
w zrok
pienia zespołu Leigha u
1
słuch
dzieci z różnym i defek­
1
n europatia
tami OXPHOS pozosta­
1
naw rac a ją c e/ro d zin n e objawy
je niewyjaśniony. Jest to
II. B adania m etaboliczne i obrazow e (m aksim um 4 punkty)
fenom en obecności p ra ­
2
- t kw as m lekow y (w ielokrotny pom iar)
wie identycznych zm ian
1
- 1 stosunek kw asu m lekow ego do pirogronow ego
patologicznych o sym e­
2
- J alanina
trycznej zbliżonej loka­
2
- 1 kw as m lekow y w CSF
lizacji, niezależnie od
4
1
rodzaju choroby m ito­
- 1 białko w CSF
2
chondrialnej i jej tła m o­
- 1 alanina w CSF
2
- t m etabolity cyklu Krebsa w m oczu
lekularnego [24], C zyn­
nikiem uszkadzającym
1
- acyduria etylom alonow a (EMA)
1
te same obszary m ózgu
- zm iany u d aro p o d o b n e w MRI głow y
(i w ten sam sposób) w
2
- zespół Leigha w MRI głowy
zaburzeniach OXPHOS
1
- w zrost stężenia m leczanów w MRS głow y
m oże być p ra w d o p o ­
III. M orfologia m ięśnia (m aksim um 4 punkty)
dobnie hiperwentylacja,
4
- w łókna RRF lub BRF (ang. blue ragged fibers)
alkaloza oddechow a i
4
- w łókna COX-ujem ne
hipokapnia [17]. W ia­
4
- i reakcja b arw na na COX
4
domo, że także w w a ­
1
- i reakcja b arw n a na SDH
runkach fizjologicznych
2
N aczynia krw ionośne SD H -dodatnie
alkaloza
oddechow a
2
N iepraw idłow a u ltra stru k tu ra m itochondriów
pow oduje w y ró w n a w ­
Skala: 1 pkt: choroba m itochondrialna m ało praw dopodobna; pkt 2-4: choroba m itochondrialna m ożliw a; pkt
cze kum ulow anie k w a­
5-7: choroba m itochondrialna praw d o p o d o b n a; 8-12: choroba m itochondrialna zdefiniow ana. MRI — rezonans
m agnetyczny; MRS — spektroskopia rezonansu m agnetycznego; COX — oksydaza cytochrom ow a; SDH —
su m lekowego w płynie
deh y d ro g en aza bursztynianow a; CSF — płyn m ózgow o-rdzeniow y.
zew nątrz- i w e w n ą trz­
kom órkow ym . Z akw a­
szenie poprzez k u m u la ­
defektu składania kom pleksu IV i mutacji w genie SURF1,
cję mleczanu m oże przeciwdziałać, szkodliwej dla kom órek
jako przyczyny zespołu Leigha z deficytem oksydazy cymózgowych, alkalizacji. Potw ierdzenie hipotezy o zw iązku
tochrom u c.
hipokapnii z w ystępow aniem zm ian o typie zespołu Leigha
m ogłoby mieć znaczenie terapeutyczne u pacjentów z tym
W badaniach nad patom echanizm em chorób mitochon­
zespołem.
drialnych w ażną rolę odgryw ają zw ierzęta doświadczal­
166
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
Innym tem atem badań pow inna być ocena stopnia szko­
dliwości dw óch czynników współobecnych w chorobie
mitochondrialnej, czyli kom órkow ego niedoboru energii
(produkcji ATP), związanego z sam ym defektem OXPHOS,
oraz nadprodukcji w olnych rodników , w tórnego zjawiska
chorobotwórczego. M ożna przypuszczać, że w niektórych
chorobach mitochondrialnych, takich jak uszkodzenie w ą­
troby w zespołach deplecji m tD N A lub w zespole Leigha,
rola tego drugiego patom echanizm u m oże okazać się klu­
czowa.
Dalsze intensyw ne badania nad przyczyną i patom echanizm em chorób m itochondrialnych stwarzają szansę
poznania w przyszłości m etod ich leczenia, a przynajmniej
spow olnienia procesu uszkodzenia narządow ego w pier­
w otnych zaburzeniach funkcji m itochondriów . Postępow a­
nie takie nie jest obecnie znane [41,42],
PIŚMIENNICTWO
1. DiM auro S (2004) The m any faces of m itochondrial diseases. Mito­
chondrion 4: 799-807
2. W alker UA, Collins S, Byrne E (1996) Respiratory chain encephalom yopathies; A diagnostic classification. Eur N eurol 36: 260-267
3. Barshop BA (2004) Metabolomic approaches to m itochondrial disease:
correlation of urine organic acids. M itochondrion 4: 521-527
4. Ueki I, Koga Y, Povalko N, Akita Y, Nishioka J, Yatsuga S, Fukiyam a
R, M atsuishi T (2006) M itochondrrial tRNA gene m utations in patients
having m itochondria disease w ith lactic acidosis. M itochondrion 6:2936
5. DiM auro S, Bonilla E, De Vivo DC (1999) Does the patient have a m ito­
chondrial encephalopathy? J Child N eurol 14 (suppl 1): S23-S35
6. Tiranti V, H oertnagel K, Carrozzo R, Galim berti C, M unaro M, Granatiero M, Zelante L, gasparini P, Marzella R, Rocchi M, Bayona-Bafaluy MP, Enriquez J-A, Uziel G, Bertini E, Dionisi-Vici C, Franco B,
Meitinger T, Zeviani M (1998) M utations of SURF-1 in Leigh disease
associated w ith cytochrom e c oxidase deficiency. Am J H um Genet 63:
1609-1621
7. Z hu Z, Yao J, Johns T, Fu K, De Bie I, Macmillan C, C uthbert AP, Newbold RF, W ang J-Ch, Chevrette M, Brown GK, Brown RM, Shoubridge
EA (1998) SURF1, encoding a factor involved in the biogenesis of cy­
tochrom e c oxidase, is m utated in Leigh syndrom e. N ature Genet 20:
337-343
8. DiM auro S, Hirano M (2005) M itochondrial encephalom yopathies: an
update. N eurom uscul Disorders 15:276-286
9. Bemier FP, Boneh A, Dennett X, Chow CW, Cleary MA, T horbum DR
(2002) Diagnostic criteria for respiratory chain disorders in adult and
children. Neurology 59:1406-1411
10. Wolf NI, Smeitink JAM (2002) M itochondrial disorders. A proposal for
consensus diagnostic criteria in infants and children. N eurology 59:
1402-1405.
16. Piekutow ska-A bram czuk D, Pronicka E, Krajewska-W alasek M (2008)
Rola genu SURF1 w patogenezie zespołu Leigha sprzężonego z defi­
cytem aktyw ności oksydazy cytochrom u c. Ped Pol 83: 211-216
17. Pronicka E, Piekutow ska-A bram czuk D, Popow ska E, Pronicki M,
Karczm arewicz E, Sykut-Cegielska J, Taybert J. (2001) Com pulsory
hyperventilation and hypocapnia of patients w ith Leigh syndrom e
associated w ith SURF-1 gene m utations as a cause of low serum bicar­
bonates. J Inherit Metab Dis 24: 707-714
18. Tay SK, Shanske S, Kaplan P, DiM auro S (2004) Association of m uta­
tions in SC 02, a cytochrom e c oxidase assem bly gene, w ith early fetal
lethality. Arch N eurol 61: 950 -951
19. Freisinger P, H orw ath R, MacMillan C, Peters J, Jaksch M (2004) Re­
version of hypertrophic cardiom yopathy in a patient w ith deficiency
of the m itochondrial copper binding protein Sco2: Is there a potential
effect of copper? J Inherit M etab Dis 27: 67-79
20. Jaksch M, H ofm ann S, Kleinie S, Liechti-Gallati S, Pongratz DE, Muller-Hocker J, Jedele KB, M eitinger T, Gerbitz K-D (1998) A systematic
m utation screen of 10 nuclear and 25 m itochondrial candidate genes
in 21 patients w ith cytochrom e c oxidase (COX) deficiency show s
tRNASer(UCD) m utations in a subgroup w ith syndrom al encephalopa­
thy. J M ed G enet 35: 895-900
21. K arczm arewicz E, Bielecka L, Kulczycka H, Lorenc LS, Pronicka E
(1997) Analytical raliabitity of spectrophotom etric analysis of the ac­
tivity of m itochondrial respiratory chain complexes in muscle hom ogenates. D iagn Lab 33:495-503
22. Pronicki M, Matyja E, Piekutow ska-A bram czuk D, Szymanska-Debinska T, Karkucinska-W ięckowska A, Karczm arewicz E, Grajkowska
W, Kmieć T, Popow ska E, Sykut-Cegielska J (2008) Light and electron
m icroscopy characteristics of the m uscle of patients w ith SURF1 gene
m utations associated w ith Leigh disease. J Clin Pathol 61:460-466
23. Piekutow ska-A bram czuk D, Popow ska E, Pronicki M, Karczmarewicz
E, Tylek-Lem anska D, Sykut-Cegielska J, Szymanska-Debinska T, Bi­
elecka L, Krajewska-W alasek M, Pronicka E (2008) H igh prevalence of
SURF1 c.845_846delCT m utation in Polish Leigh patients. Eur J Ped
N eurol, w d ruku
24. Piekutow ska-A bram czuk D (2008) M olekularne podłoże zespołu Le­
igha. N eurol N eurochir Pol, w druku
25. T hom burn DR (2004) M itochondria disorders: Prevalence, m yths and
advances. J Inherit M etab Dis 27: 349-362
26. Van Coster R, Smet J, George E, De Meirleir L, Seneca S, van Hove
J, Sebire G, Verhelst H, de Bleecker J, van Vlem B, Verloo P, Leroy J
(2001) Blue native polyacrylam ide gel electrophoresis: a pow erful tool
in diagnosis of oxidative phosphorylation defects. Pediatr Res 50: 658665
27. Karkucińska-W ięckowska A, Czajka K, W asilewski M, Sykut-Cegiel­
ska J, Pronicki M, C ukrow ska B, Pronicka E, Zabłocki K, Duszyński J,
W ięckowski M (2006) Blue native electrophoresis: an additional useful
tool to study deficiencies of m itochondrial respiratory chain complex­
es. A nn Diag Paediat Pathol 10: 89-92
28. Lazarou M, McKenzie M, O htake A, T horbum DR, Ryan MT (2007)
A nalysis of the assem bly profiles for mitochondria- and nuclear-DNAencoded subunits into complex I. Mol Cell Biol 27:4228-4237
11. Robinson BH (2000) H um an cytochrom e oxidase deficiency. Pediat
Res 48: 581-585
29. Oglivie I, Kennaw ay NG, Shoubridge EA (2005) A m olecular chaper­
one for m itochondrial complex I assem bly is m utated in a progressive
encephalopathy. J Clin Investig 115: 2784-2792
12. Shoubridge EA (2001) Cytochrom e c oxidase deficiency. A m J Med
Genet 106:46-52
30. Alm erio S, Mineri R, Tirani V, Zeviani M (2007) Depletion of mtDNA:
Syndrom es and genes. M itochondrion 7: 6-12
13. Pecina P, Houstkova H, Hansikova H, Zem an J, H oustek J (2004) Ge­
netic defects of cytochrom e c oxidase assembly. Physiol Res 53 (suppl
1): S213-S223
31. Spinazzola A, Zeviani M (2007) Disorders of nuclear-m itochondrial
intergenom ic com m unication. Biosci Rep 27: 39-51
14. Stiburek L, Hansikova H, Tesarova M, C em a L, Z em an J (2006) Bio­
genesis of eucariotic cytochrom e c oxidase. Physiol Res 55 (suppl 2):
S27-S41
15. Bohm M, Pronicka E, Karczm arewicz E, Pronicki M, Piekutow skaA bram czuk D, Sykut-Cegielska J, M ierzewska H, H ansikova H, Vesela K, Tesarova M, H oustkova H, H oustek J, Zem an J (2006) Retrospec­
tive, m ulticentric survey in 180 children w ith cytochrom e c oxidase
deficiency. Pediatr Res 59: 21-26
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
32. Miles L, W ong BL, D inopoulos A, M orehart PJ, Hofm ann IA, Bove KE
(2006) Investigation of children for m itochondriopathy confirms need
for strict patient selection, im proved m orphological criteria, and better
laboratory m ethods. H um Pathol 37:173-184
33. Pecina P, Capkova M, C how dhury SKR, D rahota Z, Dubot A, Vojtiskova A, H ansikova H, H oustkova H, Z em an J, G odinot C, H oustek J
(2003) Functional alteration of cytochrom e c oxidase by SURF1 m uta­
tions in Leigh syndrom e. Biochem Biophys Acta 1639: 53-63
http://rcin.org.pl
167
34. Malfatti E, Bugiani M, Invem izzi F, Fischinger-M oura de Souza C, Fa­
rina L, Carrara F, Lam antea E, Antozzi C, Confalonieri P, Sanseverino
MT, Guiliani R, Uziel G, Zeviani M (2007) Novel m utations of ND
genes in complex I deficviency associated w ith m itochondria encepha­
lopathy. Brain 130:1894-1904
35. C han DC (2007) M itochondrial dynam ics in disease. N Engl J Med 366:
17
36. U usim aa J, Remes AM, Rantala H, V ainionpaa L, H erva R, V uopala K,
N uutinen M, Majamaa K, H assinen IE (2000) Childhood encephalom yopathies and myopathies: a prospective study in a defined popula­
tion to asses the frequency of m itochondrial disorders. Pediatrics 105:
598-603
37. Phoenix C, Schaeffer AM, Elson JL, M orava E, Bugiani M, Uziel G,
Sm eitink JA, T urnbull DM, M cFarland R (2006) A scale to m onitor
progression and treatm ent of m itochondrial disease in children. N eu­
rom uscular Disord 16: 814-820
38. Garcia-Cazorla A, De Lonlay P, Nassogne MC, Rustin P, Touati G,
Saudubray JM (2006) Long-term follow-up of neonatal m itochondrial
cytopathies; A study of 57 patients. Pediatrics 116:1170-1177
39. M orava E, van den H euvel L, de Vries MC, Hogeveen M, R odenburg
RJ, Smeitink JAM (2006) M itochondrial disease criteria. Diagnostic ap­
plications in children. N eurology 67:1823-1826
40. Chinnery P, Majamaa K, Turnbull D, T horbum D (2006) Treatm ent for
mitochondrial disorders. Cochrane Database Syst Rev 1: CD004426
41. D ellA gnello C, Leo S, A gostino A, Szabadkai G, Tivernon C, Zullan A,
Prelie A, Roubertoux P, Rizzuto R, Zeviani M (2007) Increased longev­
ity and refractoriness to Ca2+-dependent neurodegeneration in Surfl
knockout mice. H um Mol G enet 16: 431-444
42. Pronicki M, Sykut-Cegielska J, Matyja E, Tonska K, Piechota J, Bartnik
E, Szymariska-Dçbinska T, Karczmarewicz E (2007) Diagnostic skele­
tal muscle biopsy in a boy w ith A3243G mitochondrial DNA (MELAS)
m utation — pathology of "classical" m itochondral disorder. A nn Diag
Paediat Pathol 11:41-44
Metabolic diseases in children including Leigh syndrome
— biochemical and molecular background
Ewa Pronicka1
,Dorota Piekutowska-Abramczuk2, Maciej Pronicki3
’D epartm ent of M etabolic Diseases, Endocrinology a n d Diabetology, C hildren's M em orial H ealth Institute; d e p a r tm e n t of M edical G enetics,
C hildren's M em orial H ealth Institute; d e p a r tm e n t of Pathology, C hildren's M em orial H ealth Institute, 20 Dzieci Polskich Av., 04-730 W arszaw a,
Poland
e-mail: e.pronicka@ czd.pl
Key words: M itochondrial diseases, children, diagnostic criteria, Leigh syndrom e
ABSTRACT
Mitochondrial diseases in children are more frequently caused by mutations in nuclear D N A then in m tDNA. Special clinical phenotypes
are associated w ith the mutations in SURF1 gene, in S C 0 2 gene and with m tDN A depletion syndromes. Leigh syndrome is the most com m on
clinical presentation of various mitochondrial disorders during childhood. Elevation of lactate in blood, cerebrospinal fluid and urine is a sim ­
ple biochemical marker of mitochondrial disorders but its specificity and sensitivity are low. Biochemical investigation of muscle biopsy and
search for mitochondrial mutations remain a gold standard in the diagnosis. The standarized diagnostic criteria to establish level of diagnostic
certainty (possible, probable, definite) are proposed to be used in practice; these include clinical features, neuroim aging and muscle biopsy
investigations. Further research directions to improve our understanding of mitochondrial pathologies in children are suggested.
168
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
STRESZCZENIE
itochondria są organellami pełniącymi kluczow e funkcje w m etabolizm ie komórki.
Obok udziału w syntezie ATP, mitochondria odgrywają rolę wewnątrzkom órkowego
bufora jonów wapnia oraz są miejscem wytwarzania reaktywnych form tlenu. To sprawia,
iż organelle te są aktywnie zaangażowane w przekazywanie sygnałów chroniących komór­
ki przed uszkodzeniem . Podstawą w ielu zjawisk neuroprotekcyjnych są zm iany spójności
błon mitochondrialnych. W pracy przedstawiono, m iędzy innymi, potencjalną neuroprotekcyjną funkcję mitochondrialnych kanałów jonowych.
M
WSTĘP
Mitochondria są organellami pełniącymi kluczowe funkcje w metabolizmie
komórki. Obok produkcji ATP, zachodzącej na drodze fosforylacji oksydacyj­
nej z udziałem syntazy ATP, m itochondria odgryw ają rolę w ew nątrzkom órko­
wego bufora jonów w apnia oraz są miejscem w ytw arzania reaktyw nych form
tlenu (ROS). Istotnym czynnikiem w regulacji w spom nianych procesów jest
gradient protonow y w poprzek wew nętrznej błony mitochondrialnej. Pow sta­
je on podczas transportu elektronów przez łańcuch oddechow y oraz w skutek
przeniesienia protonów do przestrzeni m iędzy błonowej. Ścisłe sprzężenie prze­
pływ u elektronów oraz fosforylacji ADP z transportem protonów sprawia, że
oba procesy nie m ogą zachodzić w oderw aniu od siebie, a gradient protonow y
jest niezbędny do produkcji ATP. Ponadto, błonow y potencjał elektryczny (ATU),
będący składow ą siły protonomotorycznej, stanow i siłę napędzającą transport
jonów i metabolitów w poprzek błony wewnętrznej, regulując m. in. akumulację
Ca2+ w m itochondriach. Proces ten katalizow any jest przez uniporter w apniow y
wewnętrznej błony mitochondrialnej w w arunkach w ysokiego stężenia Ca2+ w
cytosolu [1], N apływ jonów w apnia do macierzy mitochondrialnej m oże zwięk­
szać aktywność metaboliczną m itochondriów poprzez aktywację kluczowych
enzym ów regulatorow ych, takich jak dehydrogenaza pirogronianow a, dehy­
drogenaza izocytrynianowa i dehydrogenaza 2-oksoglutaranow a [2]. Z drugiej
strony jednak nadm ierna akumulacja jonów w apnia w m itochondriach p ro w a­
dzić może do aktywacji m egakanału m itochondrialnego (PTP, ang. permeability
transition pore), co pow oduje zwiększenie przepuszczalności wew nętrznej błony
mitochondriów, pęcznienie macierzy mitochondrialnej, a następnie przerw anie
ciągłości błony zewnętrznej i w ypływ białek apoptogennych (co stw ierdzono
z wykorzystaniem izolowanych m itochondriów ) [3]. Dotychczasowe badania
molekularnej budo w y m egakanału sugerują, że jest to kom pleks białkowy, w
skład którego w chodzi translokaza nukleotydów adeninow ych (ANT, ang.
adenine nucleotide translocase) obecna w błonie wewnętrznej, p oryna tworząca
w zewnętrznej błonie mitochondrialnej kanał anionow y zależny od potencjału
(VDAC, ang. voltage dependent anion channel) oraz białko macierzy m itochon­
drialnej — cyklofilina D (CyP-D, ang. cyclophilin D). Ponadto, postuluje się, iż
w regulacji tworzenia poru może brać udział szereg innych białek nie będących
bezpośrednim i składnikam i megakanału, m.in. anty- i proapoptotyczne białka
z rodziny Bcl-2, m itochondrialna kinaza kreatynow a (MtCK, ang. mitochondrial
creatine kinase), m itochondrialna heksokinaza (HK) i receptor benzodiazepinow y
(PBR, ang. peripheral benzodiazepine receptor) [3]. W zrost stężenia jonów w apnia
w mitochondriach jest p odstaw ow ym czynnikiem indukującym otwarcie m ega­
kanału. Procesowi tem u sprzyja rów nież obniżenie błonowego potencjału elek­
trycznego i alkalizacja macierzy mitochondrialnej [3]. W rażliwość m egakanału
na Ca2+ wydaje się być regulow ana poziom em syntezy CyP-D, co decydować
może o różnicach tkankow ych w odpow iedzi m itochondriów na jony w apniow e
[4], Wskazuje się także na rolę, jaką w modulacji indukcji PTP odgryw ać mogą
liczne szlaki sygnałow e zachodzące z udziałem kinaz oraz fosfataz. U d o w o d ­
niono, że aktywność m egakanału może być pośrednio regulow ana przez kinazę
białkową p38 aktyw ow aną przez mitogeny (p38 MAPK, ang. p38 mitogen-activa­
ted protein kinase), która poprzez fosforylację uniportera w apniow ego, w pływ a
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
Marta Piwońska
Adam Szewczyk
Pracow nia W ew nątrzkom órkow ych K anałów
Jonow ych, Z akład Biochemii, Instytut Biologii
D ośw iadczalnej PA N im. M arcelego N enckie­
go, W arszaw a
Pracow nia
W ew nątrzkom órkow ych
K anałów Jonow ych, Zakład Biochemii, Instytut
Biologii D ośw iadczalnej PA N im. M arcelego
N enckiego, ul. Pasteura 3, 02-093 W arszaw a,
e-mail: m.glab@ nencki.gov.pl
A rtykuł otrzym ano 9 m aja 2008 r.
A rtykuł zaakceptow ano 12 maja 2008 r.
Słowa kluczowe: m itochondria, apoptoza, megakanał m itochondrialny, kanały jonow e, biał­
ka rozprzęgające, neuroprotekcja
W ykaz skrótów: CsA — cyklosporyna; CyP-D
— cyklofilina D; m itoK ATp — m itochondrialny
kanał potasow y regulow any ATP; mitoBKCi
— m itochondrialny kanał potasow y o dużym
przew odnictw ie aktyw ow any jonam i w apnia;
PTP (ang. permeability transition pore) — m egakanał m itochondrialny; ROS — reaktyw ne for­
m y tlenu; UCP (ang. uncouplitig protein) — biał­
ko rozprzęgające; 5-HD (ang. 5-hydroxydecanoic
acict) — kw as 5-hydroksydekanow y
169
na hom eostazę Ca2+ [3]. Zaobserw ow ano także, iż fosforyla­
cja poryny, zachodząca z udziałem białkowej kinazy c typu
£ (PKCe, ang. protein kinase C e), której aktyw ność m odulo­
w ana jest przez reaktyw ne formy tlenu, m oże prow adzić do
zaham ow ania indukcji PTP [5].
R eaktyw ne form y tlenu (ROS), w y tw a rz an e w mito­
chondriach, to kolejny w ażn y czynnik sygnałow y zaan­
g ażow any w regulację m etabolizm u kom órki. Za główne
miejsca w ytw arzania ROS u w aża się kom pleksy łańcucha
oddechow ego, takie jak o k sy doreduktaza N A D H — ubichinon (kom pleks I) oraz kom pleks cytochrom ów bc,
(o ksydoreduktaza ubichinol — cytochrom c) (kompleks
III). W zm ożona produkcja ROS lub zaburzenia w funk­
cjonow aniu system u przeciw utleniaczy m ogą prowadzić
do uszk odzenia stru k tu r kom órkow ych w sk u tek utlenia­
nia białek, lipidów i kw asów nukleinow ych. D odatkow o
jednak ROS m ogą pełnić funkcję m etabolicznych przekaź­
ników sygnałów. Liczne dane w skazują na udział ROS
w indukcji syntezy białek p o p rzez aktyw ację czynników
transkrypcyjnych, takich jak czynnik jądrow y NF-kB (ang.
nuclear factor) i AP-1 (ang. activator protein-1) [6] oraz czyn­
nik in d u k o w a n y hipoksją (HIF-1, ang. hypoxia inducible
factor) [7]. Postuluje się także rolę ROS w regulacji szlaku
sygnalizacyjnego kinazy c-jun (JNK, ang. c-Jun N H -term i­
nal kinase) oraz kinazy białkowej MAPK (ang. mitogen acti­
vated protein kinase) [6]. W ydaje się rów nież, że stan redoks
kom órki m oże m odulow ać aktyw ność kinazy białkowej c
(PKC, ang. protein kinase C), jak rów nież białkow ych kinaz
tyrozy now ych oraz białkow ych fosfataz tyrozynow ych
[6], Na uw agę zasługuje także rola, jaką ROS odgryw ają w
inicjow aniu program ow anej śmierci kom órki. ROS mogą
indukow ać proces apoptozy po średnio po p rz e z uszkodze­
nia stru k tu r kom órkow ych, bądź urucham iając o dp o w ied ­
nią kaskadę p rzekazy w an ia sygnału w komórce.
A poptoza jest procesem fizjologicznym, umożliwiającym
kontrolow ane usuw anie kom órek podczas w zrostu i różni­
cowania oraz eliminację kom órek niepraw idłow ych oraz już
niepotrzebnych. W zm ożony proces program ow anej śmierci
obserw ow any w stanach patologicznych, takich jak choroby
autoim m unizacyjne czy schorzenia neurozw yrodnieniow e
wiąże się natom iast z przesunięciem rów now agi w kierun­
ku niekontrolow anego u suw ania komórek. Badania ostat­
nich lat bezspornie pokazują, że m itochondria odgrywają
istotną rolę w procesie apoptozy. Uwolnienie do cytosolu
AIF (ang. apoptosis inducing factor) oraz endonukleazy G, a
także apoptogennych białek m itochondrialnej przestrzeni
między błonowej, takich jak cytochrom c, białko S m ac/D IA ­
BLO (ang. second mitochondria-derived activator of caspases/direct IAP binding protein with low pi), proteaza O m i/H trA 2
(ang. high temperature requirement protein A2), jest bowiem
czynnikiem w arunkującym kluczowy etap programowanej
śmierci komórki, a mianowicie aktywację kaspaz. Proces
ten zapoczątkow uje aktywacja prokaspazy-9, zachodząca w
apoptosom ie utw orzonym przy udziale cytochrom u c, biał­
ka adpatorow ego Apaf-1 (ang. apoptosis protease-activating
factor 1) oraz A TP/dA T P. W yzwolenie kaskadow ej reakcji
kaspaz efektorowych możliwe jest natom iast dzięki oddzia­
ływaniu białek Smac/D IA BLO oraz O m i/H trA 2 z cytosolow ym i inhibitoram i apoptozy (IAP, ang. inhibitory apoptosis
protein). D odatkowo, przeniesienie białka AIF oraz endonu-
170
kleazy G do jądra kom órkow ego prow adzi do degradacji
DNA, zachodzącej niezależnie od kaspaz [8].
M olekularny mechanizm uprzepuszczalnienia błon
m itochondrialnych, prow adzący do przem ieszczenia bia­
łek apoptogennych do cytosolu, nadal pozostaje w sferze
hipotez. Wydaje się, że przebieg procesu uw alnian ia cy­
tochrom u c z m itochondriów zależeć może od typ u ko­
mórek, rodzaju czynnika proapoptotycznego, jak rów nież
stanu bioenergetycznego komórki. Proponuje się kilka m o­
deli opisujących m echanizm zachodzenia tego zjawiska.
W procesie apoptozy przebiegającym na dro d ze zależnej
od jonów w apnia kluczową rolę przypisuje się mitochondrialnem u megakanałow i (PTP) [3]. W zrost stężenia Ca2+
indukuje otwarcie PTP, co prow adzi do u p rzepuszczal­
nienia błony wewnętrznej, a w preparacie w yizolow anych
z tkanki mitochondriów, także ich pęcznienia, rozerw ania
błony zewnętrznej i w yp ływ u białek m itochondrialnych.
Dane dośw iadczalne wskazują także na udział proapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2 w regulacji m egakanału.
Zaobserw owano, między innymi, iż nadekspresja genu ko­
dującego białko Bax w kom órkach Jurkat indukuje śmierć
ham ow aną przez inhibitor m egakanału — cyklosporynę A
(CsA). Istnieją również doniesienia w skazujące na bezpo­
średnie oddziaływ anie białka Bax ze składnikam i m ega­
kanału — translokazą nukleotydów adeninow ych oraz
poryną [3]. O ddziaływ ania te m odulują aktyw ność PTP w
sposób zależny od CsA i białek antyapoptotycznych Bcl-2
i B c l ^ . O dm ienny m echanizm uw alniania cytochrom u c
z m itochondriów proponuje się dla szlaku transdukcji sy­
gnału apoptotycznego niezależnego od Ca2+. M odel ten za­
kłada, iż kluczową rolę w uprzepuszczalnieniu zew nętrznej
błony mitochondrialnej odgryw ają białka z rodziny Bcl-2.
Sugeruje się, że białka Bax i Bak w w yniku oligomeryzacji
indukow anej przez białko t-Bid, m ogą w zew nętrznej błonie
mitochondrialnej formować pory, przez które dochodzi do
w ypływ u białek apoptogennych z przestrzeni m iędzybłonowej [3]. Zaobserw ow ano także, że oligom eryczna forma
białka Bax może oddziaływ ać z translokazą nukleotyd ów
adeninow ych lub poryną, generując po w staw an ie kanałów
o d uży m przew odnictw ie [3], W yniki ostatnich ba d a ń po ­
kazują również, że procesowi uw alniania cytochrom u c z
m itochondriów towarzyszyć może reorganizacja grzebieni
m itochondrialnych. Czynnikiem inicjującym zm iany orga­
nizacji błony wewnętrznej wydaje się być białko tBid, które
poprzez oddziaływ ania z kardiolipiną, prow adzić m oże do
zm ian przepuszczalności w ewnętrznej błony m itochondrial­
nej, w zrostu produkcji ROS, i w konsekwencji, utleniania li­
pidów [9]. Zm iana struktury grzebieni m itochondrialnych
podlegająca dodatkow o kontroli białek zaangażow anych w
fuzję i fragmentację m itochondriów, m.in. O p a l (ang. Optic
atrophia 1) i D rp l, um ożliwia mobilizację puli cytochrom u c
zw iązanego z miejscami kontaktow ym i oraz zam kniętego
w obrębie grzebieni m itochondrialnych [10,11],
Obok utraty spójności błon m itochondrialnych, w p ro ­
cesie apoptozy obserwuje się także liczne zm iany m eta­
bolizmu mitochondriów, poprzedzające śmierć komórki.
Jednym z pierw szych sygnałów pojawiających się na d ro ­
dze przekazyw ania sygnału apoptotycznego jest obniże­
nie elektrycznego potencjału błonowego. P rzypuszcza się,
że spadek AT* może być w ynikiem otw arcia m egakanału,
http://rcin.org.pl
w w w .p ostep y bio ch em ii.pl
choć nie wyklucza się także scenariusza odw rotnego, w
którym to depolaryzacja błony, in dukow ana m. in. zabu­
rzeniam i transportu elektronów w łańcuchu oddechow ym
lub zw iększoną przepuszczalnością błony w ewnętrznej dla
protonów , prow adzić m oże do aktywacji PTP. Zjawiskiem
tow arzyszącym procesowi apoptozy jest rów nież w zm ożo­
na synteza ROS, za którą może odpow iadać zaham ow anie
szybkości oddychania lub w zrost stężenia Ca2+w macierzy
m itochondrialnej.
N eurony to kom órki szczególnie narażone na działanie
licznych czynników uszkadzających. Zablokowanie prze­
pły w u krwi, a zatem deficyt tlenu i glukozy prow adzi nie­
uchronnie do pow stania zm ian nekrotycznych w obrębie
obszaru niedokrw ienia mózgu. D odatkowo, niedobór tlenu
w sąsiadującym z rdzennym obszarem u d aru półcieniu,
pow oduje zw iększone w ydzielanie kw asu glutam inow ego,
aktywację receptorów glutaminergicznych, a co za tym idzie
— napływ jonów w apniow ych do w nętrza neuronów . N a d ­
m ierna akumulacja Ca2+ w cytoplazmie stanowi natom iast
czynnik wyzwalający proces apoptozy kom órek nerw o­
wych. Toksyczność pobudzeniow a, indukow ana n ad m ia­
rem neuroprzekaźnika, tow arzyszy także wielu chorobom
neurologicznym , takim jak choroba H untingtona i stw ard ­
nienie zanikow e boczne.
Bezsprzeczny udział m itochondriów w przekazyw aniu
sygnału apoptotycznego sprawia, że badania ostatnich lat
koncentrują się wokół poszukiw ania strategii neuroprotekcyjnych, których bezpośrednim obiektem działania by­
łyby mitochondria. Oprócz prób w ykorzystania substancji
chemicznych w celu zablokowania m egakanału m itochon­
drialnego, sugeruje się zasadność terapii z w ykorzystaniem
zw iązków przeciwutleniających lub regulację poziom u ROS
na drodze aktywacji m itochondrialnych białek rozprzęgających. Postuluje się również potencjalną cytoprotekcyjną
rolę m itochondrialnych kanałów potasowych. D odatkow o,
interesujący obiekt badań stanow ią białka zaangażow ane
w regulację fuzji i fragmentacji m itochondriów , procesów,
które obok kontroli kształtu i aktywności metabolicznej m i­
tochondriów , wydają się grać istotną rolę w procesie a p o p ­
tozy (Ryc. 1).
BIAŁKA REGULUJĄCE PROCES FUZJI/
FRAGMENTACJI MITOCHONDRIÓW
Fuzja i fragmentacja m itochondriów to procesy p row a­
dzące do form owania i rozpad u sieci m itochondrialnych w
komórce. Stabilizacja struktury m itochondriów, w aru n k o ­
w ana utrzym aniem rów now agi pom iędzy zachodzeniem
obu zjawisk, podlega ścisłej kontroli i regulacji przez sze­
reg białek zlokalizow anych zarów no w cytoplazmie, jak i
w m itochondriach. Jak dotąd w kom órkach ssaków ziden­
tyfikow ano trzy białka zaangażow ane w proces fuzji m i­
tochondriów. Należą do nich błonowe GTPazy, takie jak
M fnl (ang. mitofusin 2) i Mfn2 (ang. mitofusin 2), obecne w
zewnętrznej błonie mitochondrialnej, oraz O p a l zlokalizo­
w an a w przestrzeni m iędzybłonowej [12]. Spośród białek
regulujących proces fragmentacji m itochondriów należy
w ym ienić białko zewnętrznej błony mitochondrialnej, Fisi,
oraz białka cytosolowe, GTPazę D rp l (ang. dynamin-related
GTPase) oraz endofilinę BI [12]. Badania ostatnich lat poka­
zują, że białka odpow iedzialne za procesy fu zji/fragm en ­
tacji m itochondriów m ogą rów nież brać udział w regulacji
sygnału apoptotycznego, co sugerow ałoby potencjalną za­
leżność m iędzy zm ianam i morfologicznymi m itochondriów
a śmiercią komórki [13]. Zaobserw ow ano m.in., że w b u d o ­
w aniu aktyw nego białka Bax do zewnętrznej błony m ito­
chondrialnej tow arzyszy fragmentacja m itochondriów [14]
i zaham ow anie procesu fuzji [15]. Postuluje się, że zmiany
morfologii m itochondriów indukow ane procesem fuzji sta­
nowić m ogą czynnik utrudniający w budow anie oligome­
rów Bax/Bak do zewnętrznej błony mitochondrialnej [14].
W ykazano ponadto, iż w miejscach w których dochodzi do
fragmentacji m itochondriów, białko D rp l w spółwystępuje
w błonie zewnętrznej z białkami Bax i Mfn2 [16].
W yniki bad ań przeprow adzonych na kom órkach HeLa
pokazały, że wyciszenie genu kodującego białko Fisi lub
D rp l ham uje apoptozę indukow aną staurosporyną (STS),
aktynom ycyną D czy czynnikiem Fas [13]. Rola w spom nia­
nych białek w przekazyw aniu sygnału apoptotycznego
w ydaje się być jednak różna. Postuluje się, że etapem klu­
czow ym dla aktywności białka Fisi w apoptozie jest faza
poprzedzająca transport białka Bax do mitochondriów,
podczas gdy aktywność D rp l próbuje się wiązać z fazą w y ­
pływ u cytochrom u c do przestrzeni międzybłonowej [13],
Ponadto, zaobserw ow ano, że w zm ożona fuzja m itochon­
driów może być czynnikiem sprzyjającym przeżyw aniu
komórek. W zrost aktywności białka Mfn2 prow adzi do za­
ham ow ania aktywacji białka Bax i uw alniania cytochromu c
z m itochondriów [17].
Rycina 1. M itochondrialne białka regulujące p rzepuszczalność blon m itochon­
drialnych: U CP — białko rozprzęgające, PTP — m egakanał m itochondrialny,
YDAC — p oryna m itochondrialna.
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
N eurony są kom órkam i szczególnie w rażliw ym i na
zm iany struktury m itochondriów. Znane są przynajmniej
dw ie choroby neurozw yrodnieniow e wyw ołane mutacja­
mi w genach kodujących białka regulujące proces fuzji i
fragmentacji mitochondriów . Mutacje w genie OPA1 od p o ­
wiadają za rozwój choroby zwanej atrofią w zrokow ą typu I
http://rcin.org.pl
171
[18]. Punktow e mutacje w genie Mfn2 są natomiast główną
przyczyną choroby neurozw yrodnieniow ej Charcot-MarieTooth ty p u 2, prowadzącej do zaniku aksonów nerw ów
obw odow ych [19]. Zaobserw ow ano także, że białko Mfn2
jest niezbędne dla praw idłow ego rozwoju móżdżku, w tym
głównie dla kom órek Purkinjego [20]. Komórki Purkinjego
pozbaw ione genu Mfn2 charakteryzują się uboższą siecią
połączeń kolateralnych, mniejszą gęstością kolców dendrytycznych i dram atycznie obniżoną przeżywalnością. Zm ia­
nom morfologii neuronów tow arzyszą również zaburzenia
ultrastruktury i dystrybucji m itochondriów oraz spadek ak­
tywności kom pleksów łańcucha oddechow ego [20], Ponad­
to zaobserw ow ano, że proces fragmentacji mitochondriów
stanow i jeden z pierw szych etapów apoptozy zachodzącej
w neuronach zarów no in vitro [21-23], jak i in vivo [21], Do­
św iadczenia przepro w ad zon e z użyciem neuronalnych ho­
dow li pierw otnych wykazały, że w zm ożona synteza białek
biorących udział w procesie fuzji m itochondriów skutecz­
nie ham uje apoptozę kom órek nerw ow ych. Pokazano m.in.,
że w zrost aktywności białka Mfn2 prow adzi do ochrony
kom órek ziarnistych m óżdżku w w arunkach stresu oksy­
dacyjnego, bądź uszkodzenia DN A indukow anego inhibi­
torem topoizom erazy, kam ptotecyną [22], Neuroprotekcyjny efekt wzmożonej syntezy Mfn2 obserw owano również
w hodow li pierwotnej neuronów kory mózgowej poddanej
działaniu tlenku azotu, rotenonu i (3 am yloidu [21]. W obu
m odelach obserw ow ano w yraźne zaham ow anie fragmenta­
cji m itochondriów , co w skazuje na istotną rolę tego procesu
w przekazyw aniu sygnału apoptotycznego w neuronach.
Co więcej, podobny efekt uzyskany w doświadczeniach z
zastosow aniem kom órek nerw ow ych pozbawionych genu
kodującego D rp l sugeruje, że w łaśnie to białko może być
bezpośrednio zaangażow ane w proces fragmentacji mito­
chondriów indukow any czynnikiem apoptotycznym [23].
M echanizm ochrony, w yw ołany nadekspresją genu kodują­
cego Mfn2, próbuje się d odatkow o w iązać z funkcją sygna­
łową tego białka. Wyniki badań Johani-Asl i wsp. dowiodły
bowiem, że zm utow ane białko Mfn2 zdolne do wiązania
nukleotydów , ale pozbaw ione aktyw ności hydrolitycznej,
indukując podobny poziom fuzji mitochondriów, co białko
typu dzikiego, w ykazuje jednocześnie dużo większe dzia­
łanie neuroprotekcyjne. Sugeruje się więc, że stan nukleotydow y Mfn2, determinując oddziaływ ania z innymi biał­
kami zewnętrznej błony mitochondrialnej, może stanowić
czynnik krytyczny dla przeżyw alności neuronów . Hipotezę
tę wydają się potw ierdzać dane pokazujące, iż forma białka
Mfn2 zw iązana z GTP nie oddziałuje z oligomerami Bax/
Bak w bu dow yw any m i w błonę zew nętrzną we wczesnym
etapie apoptozy [17].
MEGAKANAŁ MITOCHONDRIALNY
W zrost stężenia jonów w apnia w cytoplazmie neuronów
tow arzyszy wielu procesom patologicznym, takim jak udar
m ózgu i neurozw yrodnienie. W tych w arunkach rola m i­
tochondriów jako w ew nątrzkom órkow ych buforów Ca2+
wydaje się być szczególnie istotna. Z drugiej strony jednak
nadm ierna akumulacja Ca2+ w m itochondriach prow adzi
do indukcji PTP i śmierci komórki. Jako jedną ze strategii
neuroprotekcyjnych proponuje się więc zastosowanie sub­
stancji chemicznych hamujących aktywność megakanału.
M egakanał m itochondrialny to kom pleks białkowy odgry­
172
wający kluczową rolę w mechanizmie uprzepuszczalnienia
zewnętrznej błony m itochondriów podczas apoptozy za­
chodzącej na drodze zależnej od Ca2+. Wrażliwość PTP na
wzrost stężenia jonów w apniow ych w macierzy mitochondrialnej jest zróżnicow ana tkankow o i zależy od poziomu
syntezy jednego ze składników m egakanału — cyklefiliny
D (CyP-D) [4,24], Cyp-D jest izomerazą peptydylo-prolinową cis-trans zlokalizowaną w macierzy mitochondrialnej.
Białko to uw rażliw ia m egakanał na aktywację Ca2+ [24 i sta­
nowi specyficzne miejsce w iązania cyklosporyny A (CsA),
im m unosupresyjnego cyklicznego oligopeptydu hamujące­
go aktywność PTP [25].
Wyniki badań prow adzonych na hodow lach pierwot­
nych dowiodły, że zastosowanie CsA prow adzi do cchrony neuronów w w arunkach toksyczności pobudzeniowej
indukowanej glutam inianem [26] i NM D A [27], Wykazano,
że CsA poprzez ham ow anie depolaryzacji wewnętrznej bło­
ny mitochondrialnej, zapobiega spadkow i poziom u ATP,
blokuje wzrost produkcji ROS i śmierć komórki [26,27]. Po­
dobne wyniki uzyskano także w dośw iadczeniach in vivo
[28,29] choć tu stopień neuroprotekcji uzależniony był od
dawki i drogi podania leku im m unosupresyjnego. Ponad­
to, słaba przenikalność przez barierę k rew -m ózg oraz n e u ­
rotoksyczność wysokich stężeń CsA sprawiają, że otecnie
duże zainteresowanie w zbudzają jej analogi, takie jak NMe-Val 4-cyclosporin A [30], NIM811 i UNIL025 [31], nie
mające właściwości im m unosupresyjnych.
Wyniki bad ań prow adzonych w ostatnich latach ookazały, że w porów naniu z m itochondriam i serca czy w ątro­
by, m itochondria m ózgow e cechuje w ysoka odporneść na
indukcję m egakanału jonami w apniow ym i, a poziom CyPD jest dużo niższy niż w innych tkankach [4], Podobne za­
leżności obserw ow ano także w obrębie mózgu. Wykazano,
m iędzy innymi, że m itochondria synaptyczne kory mózgo­
wej charakteryzujące się w ysokim poziom em syntezy CyPD są dużo bardziej w rażliw e na w zrost stężenia Ca2+ w m a­
cierzy mitochondrialnej niż m itochondria z obszarów pozasynaptycznych [32]. Bezpośrednich dow od ów na istnienie
związku pom iędzy poziom em CyP-D a zdolnością mito­
chondriów do akumulacji Ca2+ dostarczyły doświadczenia
przeprow adzone na m yszach transgenicznych pozbaw io­
nych genu Ppif kodującego CyP-D [24]. Indukcja PTP w
mitochondriach myszy knock-out w ym agała zastosowania
dw ukrotnie w yższych stężeń Ca2+ w porów naniu z aktyw a­
cją m egakanału m itochondriów m yszy ty pu dzikiego. D o­
datkow o proces ten był niewrażliw y na CsA. Brak CyP-D
nie w pływ ał natom iast na stan bioenergetyczny mitochon­
driów o czym świadczyć m oże niezm ieniona szybkość o d ­
dychania w w arunkach stymulacji ADP lub rozprzęgaczem
[24], Regulacja poziom u CyP-D w komórce wydaje się więc
być atrakcyjną strategią neuroprotekcyjną.
Ostatnio w ykazano, że wyłączenie genu Ppif prowadzić
może do ochrony neuronów w różnych m odelach śmierci
komórkowej. Zaobserw ow ano, iż pozbaw ienie myszy genu
kodującego CyP-D znacznie obniża stopień uszkodzenia
m ózgu w w arunkach niedotlenienia/reperfuzji [33]. Po­
nadto, doświadczenia z zastosow aniem eksperym entalne­
go m odelu stw ardnienia rozsianego dow odzą roli, jaką w
rozwoju tego schorzenia odgryw a, indukow ana Ca2+, akty­
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
wacja m egakanału m itochondrialnego [34], U myszy Ppif'f,
m im o rozwoju klinicznych sym ptom ów EAE, w yw ołanych
procesami zapalnym i, dużo szybciej w porów naniu do m y­
szy typu dzikiego obserw ow ano zanik objawów i znaczną
popraw ę stanu ogólnego. W ykazano rów nież w yraźne za­
ham ow anie procesów neurozw yrodnieniow ych prow adzą­
cych do uszkodzenia i redukcji gęstości aksonów w rdzeniu
kręgow ym , jak i w zrost odporności m itochondriów na ROS
i Ca2+ [34],
BIAŁKA ROZPRZĘGAJĄCE
Białka rozprzęgające (UCP, ang. uncoupling proteins) to
rodzina białek w ew nętrznej błony mitochondrialnej, pełnią­
cych funkcję transporterów anionów. Ich fizjologiczna rola
w metabolizmie energetycznym m itochondriów wydaje się
polegać na transporcie H + do w nętrza macierzy m itochon­
drialnej, co stanow i m echanizm biernego „przecieku" p ro­
tonów odpow iedzialnego za 10-27% spoczynkow ego zuży­
cia tlenu. Do tej pory zidentyfikow ano pięć białek UCP. Po
raz pierw szy opisane w brunatnej tkance tłuszczowej, UCP-1
odpowiada za termogenezę bezdrżeniow ą i produkcję cie­
pła u now orodków oraz praw dopodobnie bierze udział w
odpow iedzi dorosłych na stres zw iązany z niską tem pera­
turą. Białko UCP-3 w ystępuje w mięśniach szkieletowych,
mięśniu sercowym oraz brunatnej tkance gryzoni. UCP-2,
obecne w większości tkanek, zidentyfikowane zostało w
układzie nerw ow ym , gdzie obecne są także dw a inne specy­
ficzne dla m ózgu białka rozprzęgające: UCP-4 oraz UCP-5,
zw ane także BMPC-1 (ang. brain mitochondrial carrier protein1) [35].
W literaturze istnieją dw ie hipotezy wyjaśniające m echa­
nizm transportu protonów przez białka UCP. Jedna z nich
opiera się na założeniu, że białko rozprzęgające może tw o­
rzyć w błonie w ew nętrznej m itochondriów kanał anionow y
transportujący kw asy tłuszczowe w raz z protonam i [36],
D odatkow o nie wyklucza się także roli, jaką w tym procesie
odgryw ać m ogą translokaza nukleotydów adeninowych,
przenośnik a sparginian/glutam in ian [37], czy przenośnik
kw asów dikarboksylow ych [38], D ruga hipoteza zakłada
natom iast przemieszczanie kw asów tłuszczowych w obrę­
bie błony i udział UCP w transporcie anionowej formy k w a­
su tłuszczowego.
Niezależnie od m echanizm u transportu H + do w nętrza
mitochondriów , proces ten prow adzi do rozprzężenia fos­
forylacji oksydacyjnej i spadku elektrycznego potencjału
błonowego. Podczas gdy całkowite i długotrw ałe rozprzę­
żenie m itochondriów prow adzi do zaburzenia m etabolizmu
energetycznego komórki, przejściowy napływ protonów do
wnętrza macierzy mitochondrialnej stanowić m oże czynnik
regulujący zarów no akumulację Ca2+ w m itochondriach, jak
i produkcję ROS. Badania ostatnich lat pokazują, iż krótka
ekspozycja kom órek na egzogenne czynniki rozprzęgające,
takie jak FCCP czy DNP prow adzić m oże do neuroprotekcji
w modelu toksyczności pobudzeniow ej indukow anej glu­
tam inianem [39] lub w w arunkach pozbaw ienia tlenu i glu­
kozy [40]. D odatkow ych danych dostarczają eksperym enty
in vivo. Zaobserwow ano, m iędzy innymi, iż system owe po­
danie D NP w istotny sposób zmniejsza rozm iary uszkodze­
nia m ózgu w m odelu niedotlenienia/reperfuzji [41] oraz
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
aktywacji receptorów NM D A kw asem kw inolinow ym [42].
Dośw iadczenia przep row adzone z użyciem m itochondriów
izolowanych z m ózgu poddanego działaniu DN P dow odzą,
że m echanizm cytoprotekcji indukow anej przez substancję
rozprzęgającą polega w głównej mierze na zaham ow aniu
akumulacji jonów w apniow ych w m itochondriach i obniże­
niu poziom u ROS [41].
Pojawienie się danych wskazujących na neuroprotekcyjną
rolę egzogennych protonoforów sprawiło, że również endo­
genne białka rozprzęgające UCP wydały się ciekawym obiek­
tem badaw czym w kontekście zjawiska cytoprotekcji. Do­
świadczenia, w których stosowano hartowanie niedotlenie­
niem (IPC, ang. ischemic preconditioning) polegające na krót­
kotrwałym epizodzie niedotlenienia chroniącym mózg przed
następnym długotrw ałym pozbawieniem tlenu, wykazały,
że zjawisku tem u towarzyszy w zrost syntezy białka UCP2 w m ózgu [40], Autorzy postulują potencjalna rolę UCP-2
w regulacji stanu redoks komórki, który poprzez aktywację
czynników transkrypcyjnych, takich jak NF-kB lub AP-1,
w pływać może na poziom syntezy białek zaangażowanych
w proces neuroprotekcji, m. in. dysm utazy ponadtlenkowej
i Bcl-2 [40]. Pokazano także, że czynnikiem modulującym
poziom UCP-2 może być dieta. U szczurzych now orodków
karmionych wysokotłuszczowym mlekiem matki obserwo­
w ano wysoki poziom UCP-2 w mózgu, który pozytywnie
harm onizow ał z odpornością zwierząt na uszkodzenie neu­
ronów układu limbicznego, indukow ane kwasem kainowym
[43]. Zaobserw owano także, że wzm ożona synteza UCP-2 w
hodow lach pierwotnych kory mózgowej inkubowanych w
w arunkach pozbawionych tlenu i glukozy hamuje aktyw a­
cję kaspazy 3, prow adząc tym sam ym do ochrony neuronów
[40]. Podobne obserwacje pochodzą z doświadczeń prow a­
dzonych na myszach zdolnych do wzmożonej syntezy UCP2, u których operacyjnie dokonyw ano uszkodzenia kory
śród węchowej. W porów naniu ze zwierzętami kontrolnymi,
u myszy transgenicznych obserwow ano wyraźnie niższy po­
ziom aktywacji kaspazy 3 [44]. Ponadto, neuroprotekcyjnego efektu wzmożonej syntezy UCP-2 dowiedziono in vivo w
eksperym entalnym modelu udaru mózgu, w yw ołanym za­
mknięciem środkowej aorty mózgowej (MCAO, ang. middle
cerebral artery occlusion) [40], jak również w modelu choroby
Parkinsona indukowanej MPTP [45]. Przeprow adzone do­
świadczenia wykazały, że wzrostowi przeżywalności neu­
ronów towarzyszył obniżony poziom peroksydacji lipidów
i karbonylacji białek, jak również zaham owanie produkcji
ROS. Wydaje się więc, że neuroprotekcja, wynikająca z przej­
ściowego rozprzężenia m itochondriów zachodzącego na
drodze aktywacji UCP-2, wiąże się bezpośrednio z regulacją
poziom u ROS w komórce.
MITOCHONDRIALNE KANAŁY POTASOWE
Badania ostatnich lat w skazują na rolę jaką w zjawisku
cytoprotekcji odgryw ać m ogą kanały potasow e zlokalizo­
w ane w w ew nętrznej błonie mitochondriów . Mimo że fi­
zjologiczna rola m itochondrialnych kanałów potasowych
nadal pozostaje nie do końca poznana, wiadom o, iż mogą
one brać udział w regulacji objętości m itochondriów, poten­
cjału elektrycznego, a co za tym idzie — szybkości o d d y ­
chania, produkcji ROS i akumulacji Ca2+ w macierzy m ito­
chondrialnej. W ykazano także, że napływ jonów potasu do
http://rcin.org.pl
173
w nętrza m itochondriów prow adzi do ochrony komórek w
różnych m odelach śmierci. Sugeruje się, że aktywacja mito­
chondrialnych kanałów potasow ych poprzez w zrost objęto­
ści macierzy mitochondrialnej m oże korzystnie w pływać na
gospodarkę energetyczną komórki. Ponadto, przypuszcza
się, iż w zm ożony transport K+do m itochondriów pow odo­
wać m oże zaham ow anie akumulacji jonów w apniow ych w
macierzy mitochondrialnej, chroniąc tym sam ym komórkę
przed aktywacją m egakanału. D odatkowo, nie wyklucza
się także roli jaką w mechanizmie cytoprotekcji odgrywać
m ogą ROS (Ryc. 2).
MITOCHONDRIALNY KANAŁ
POTASOWY REGULOWANY ATP
M itochondrialny kanał potasow y regulow any ATP (mitoKATp), zidentyfikow any został w wew nętrznej błonie m i­
tochondriów w ątroby [46], serca [47], mięśni szkieletowych
[48] i m ózgu [49], Budowa m olekularna kanału mitoKATp,
choć nie do końca poznana, wydaje się być zbliżona do
struktury kanału KATp z błony plazmatycznej, utw orzonego
przez podjednostknostki Kir 6.x -tworzące por kanału oraz
podjednostki regulatorow e SUR, będące receptorami sulfonomoczników. Próby identyfikacji izoform podjednostki
Kir i SUR kanału mitoKATp z m ózgu pokazały, iż w mitochondriach obecne jest zarów no białko Kir 6.1, jak i Kir6.2,
SUR1 oraz SUR2. Wydaje się jednak, że izoformami dom i­
nującymi w m itochondriach m ózgu są praw dopodobnie
Kir6.1 i SUR2 [50],
W w a ru n k a c h fizjologicznych kanał m itoK ATp, p o d o b ­
nie jak kanał KATp obecny w błonie plazm atycznej, akty­
w o w an y jest p rzez GTP i GDP, a h a m o w an y przez ATP.
ADP i dłu g o łań cu ch o w e estry CoA ak ty w ujące kanał
KATp z błony plazm atycznej p o w o d u ją n a to m ia st za h am o ­
w anie aktyw ności kanału m itoK ATp. A kty w ność kanału
m itoK ATp m oże być ró w nież m o d u lo w a n a na szlaku p rz e ­
k azy w an ia sygnału z ud ziałem kinaz białkow ych, m.in.
PKC. O bserw uje się także aktyw ację k an ału m itoK ATp pod
w p ły w e m a n io n o ro d n ik a p o n a d tlen k o w e g o i nadtlenoa zo ty n u [50].
Oba typy kanałów regulow ane są przez grupę związków
farmakologicznych, w śród których w yróżnić można akty­
w atory kanałów potasow ych (ang. potassium channels openers), m.in. krom akalim ę i diazoksyd oraz inhibitory, w tym
pochodne sulfonomocznika, takie jak glibenklamid [50],
Mimo podobnej farmakologii, kanały te cechuje różna w raż­
liwość na te same stężenia m odulatorów . Pokazano m.in.,
że pow inow actw o diazoksydu do kanału m itoKATP jest
znacznie w yższe niż do kanału KATp z błony plazmatycznej.
W iadom o także, że wrażliwość podjednostek SUR kanału
mitoKATp na pochodne sulfonomocznika jest niższa w po­
rów naniu z receptorami SUR z błony plazmatycznej. Znany
jest rów nież selektywny aktyw ator mitoKATp — BMS191095,
jak rów nież specyficzny inhibitor tego kanału — kwas 5-hydroksydekanow y [50].
Kluczowe znaczenie w badaniach nad potencjalną rolą
kanałów mitoK
w zjawisku cytoprotekcji miało odkry­
cie pokazujące, że substancje zwiększające napływ jonów
potasu do m itochondriów prow ad zą do ochrony mięśnia
174
Rycina 2. M itochondrialne kanały potasow e: m itoK ATp — k anał po tasow y reg ulo­
w any ATP, mitoBKCa — kanał po tasow y o d u ż y m przew odnictw ie, aktyw ow any
jonam i w ap nia, K vl.3 — kanał p otasow y regulow any potencjałem błonow ym ,
TWIK — kanał potasow y „d w u p asm o w y "
sercowego w wielu modelach niedotlenienia. Ponadto, w y ­
kazano, że 5-HD, inhibitor kanału mitoKATp, ham uje efekt
ochronny, indukow any procesem hartow ania niedotlenie­
niem [51]. Dane te sugerują więc udział kanałów mitoKATp
w mechanizmie IPC, wskazując dodatkow o na rolę jaką w
naśladow aniu tego procesu odgryw ać m ogą substancje far­
makologiczne modulujące aktywność mitoKATp.
W stępne dane wskazujące na neuroprotekcyjne działanie
aktyw atorów kanału mitoKATp, pochodzą z doświadczeń
prow adzonych in vivo na now orodkach św iń p o d d aw a ­
nych globalnem u niedotlenieniu. Zastosowanie diazoksydu
ham ow ało uszkodzenie neuronów , a efekt ten blokowany
był przez 5-HD, inhibitor kanału mitoK p. U dow odniono
także, że diazoksyd skutecznie zmniejsza obszar martwicy
m ózgu u myszy i szczurów poddanych zamknięciu tętnicy
środkowej m ózgu, jak również u now orodków szczurzych
w m odelu hipoksji — niedokrwienia. W obu układach do ­
świadczalnych obserw ow ano w yraźne odw racanie efektu
diazoksydu przez 5-HD [50].
P odobne w yniki uzyskano także w dośw iadczeniach
in vitro p ro w ad zonych z użyciem hodow li pierw otnych
kom órek z m ózgu. W ykazano, iż aktywacja kanału mitoKATp p ro w ad zi do ochrony n eu ro n ó w hip okam pa szczura
w w aru n k ach chemicznej hipoksji, jak rów nież apo ptozy
indukow anej staurosporyną. Zjawisku cytooprotekcji to­
w arzyszyło zaham ow anie transp ortu białek Bax do m i­
tochondriów oraz w zrost syntezy białka Bcl-2 w e frakcji
m itochondrialnej [52], N europrotekcyjny efekt diazoksy­
du obserw ow ano także w m odelu apo ptozy indukow anej
stresem oksydacyjnym [53]. Preinkubacja n euron ów ziar­
nistych m ó żdżku ze 100 gM diazoksydem prow ad ziła do
sp a d k u aktyw ności kaspazy 3, stabilizacji elektrycznego
potencjału błonow ego m itochondriów i w rezultacie — do
w zrostu przeżyw alności komórek. O statnio proponuje się
rów nież udział kanału m itoKATP
ATD w ochronie neu ro n ó w w
m odelu d o św iadczalny m choroby Parkinsona [54], Po­
kazano, że diazoksyd, w sposób zależny od stężenia (1300 gM), chronił kom órki PC12 p o d d a n e działaniu rotenonu, inhibitora kom pleksu I łańcucha oddechow ego. Efekt
ten od w racany był przez 5-HD, podczas gdy HMR-1098,
selektyw ny inhibitor kanału K
z błony plazm atycznej,
pozostaw ał bez w p ły w u na przeżyw alność komórek.
http://rcin.org.pl
w w w .pos tepy biochem ii .pl
D odatkow o, badania ostatnich lat pokazują, że opóźnio­
ne hartow anie diazoksydem (ang. delciyed plmrmacological
preconditioning) skutecznie zmniejsza wrażliwość kom órek
na czynniki uszkadzające, indukując długotrw ały efekt
neuroprotekcyjny. W ykazano, m iędzy innymi, że godzinna
inkubacja n euronów korow ych z 500 lub 750 gM diazoksy­
dem pow tarzana przez trzy kolejne dni przed pozbaw ie­
niem kom órek tlenu i glukozy w istotny sposób zwiększa
przeżyw alność neuronów [55]. O chronne działanie diazoksydu znoszone było przez 5-HD, nie obserw ow ano nato­
m iast ham ow ania neuroprotekcji przez glibenklamid, p o­
chod ną sulfonomocznika, oddziałującą zarów no z kanałem
m itoK A|p, jak i jego o dpow iednikiem z błony plazmatycznej.
Co ciekawe, zastosow anie 500 gM diazoksydu w m odelu
toksyczności pobudzeniow ej indukow anej glutam inianem
prow adziło do ochrony neuronów kory mózgowej szczura,
a efekt ten był niewrażliw y na 5-HD [56]. W świetle danych
literaturowych, w skazujących na niespecyficzne działanie
diazoksydu, takie jak ham ow anie dehydrogenazy bursztynianowej, syntazy ATP, jak rów nież działanie rozprzęga­
jące, zastosow anie wysokich stężeń aktywatora, zdaje się
sugerow ać, że obserw ow any m echanizm neuroprotekcji
m oże być częściowo niezależny od aktywacji kanału mitoK XTp. Postuluje się więc w pływ diazoksydu na aktywność
kom pleksu II łańcucha oddechow ego. H ipotezę tę dod atko­
w o potw ierd za fakt, iż podobny efekt ochronny uzyskano
przy użyciu 3-nitropropionianu, inhibitora dehydrogenazy
bursztynianow ej [55], a inkubacji kom órek z diazoksydem
tow arzyszył w zrost produkcji ROS [55,56].
Zastosow anie BMS191095, specyficznego aktyw atora
kanału m itoK A|I„ pokazało, że napływ jonów potasu do
w nętrza macierzy mitochondrialnej prow adzi do ochrony
neu ronó w zarów no w w arunkach in vitro [57,58], jak i in
vivo [59], W yraźną redukcję obszaru m artw icy m ózgu ob­
serw ow ano u szczurów poddanych działaniu BMS191095
w m odelu niedokrw ienia w yw ołanego zamknięciem tętnicy
środkowej m ózgu [57], Ponadto, w ykazano w zrost przeżywalności neuronów kory mózgowej szczura w w arunkach
pozbaw ienia kom órek tlenu i glukozy [57], jak rów nież
toksyczności pobudzeniow ej indukow anej glutam inianem
[57,58], Uzyskane dane sugerują, że istotnym etapem w
m echanizm ie neuroprotekcji wywołanej BMS191095 jest
obniżenie poziom u ROS podczas działania czynnika uszka­
dzającego [57-59], Postuluje się także udział BMS191095 w
indukcji fosforylacji PKC [57], aktywacji szlaku kinaz PI3KAkt [58], jak rów nież regulacji poziom u katalazy [58].
MITOCHONDRIALNY KANAŁ POTASOWY O DUŻYM
PRZEWODNICTWIE AKTYWOWANY JONAMI WAPNIA
M itochondrialny kanał potasow y o duży m przew odnic­
twie regulow any jonami w apnia (mitoBKCa) po raz pierw ­
szy zidentyfikow any został w mitochondriach (mitoplastach) w yizolow anych z glejaka LN229 [60], Stosując tech­
nikę patch-clamp, udow odniono, że w środow isku 150 mM
KC1 kanał ten w ykazuje przew odnictw o 295 ±18 pS, a jego
otw arciu sprzyja zarów no depolaryzacja, jak i w zrost stęże­
nia jonów w apnia w roztworze. Ponadto, obserw ow ano h a­
m ow anie aktywności kanału przez 100 nM charybdotoksynę (ChTx), znany inhibitor kanałów BKtA zlokalizowanych
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
w błonie plazmatycznej wielu typów komórek. Podobne
wyniki uzyskano także w dośw iadczeniach przepro w adzo­
nych z użyciem m itoplastów pochodzących z kardiomiocytów świnki morskiej [61]. Dalsze badania wykazały także
obecność kanału mitoBKCi w w ew nętrznej błonie m itochon­
driów m ózgu [62],
Brak jest danych w sposób jednoznaczny określających
m olekularną budow ę kanału mitoBKCi Wydaje się, że tak
jak w p rzy p ad k u kanału BKCi z błony plazmatycznej, w jego
skład w chodzić m ogą 4 podjednostki a tworzące por kanału
oraz 4 podjednostki regulatorow e [3. Stosując przeciwciało
specyficznie wiążące C-koniec podjednostki a kanału BKCi
z błony plazmatycznej, zidentyfikow ano białko o masie czą­
steczkowej 55 kDa obecne w e frakcji mitochondrialnej kardiom iocytów świnki morskiej [61], jak rów nież w homogenacie serca m yszy [63]. Dane literaturow e wskazują ponadto
na rolę, jaką w regulacji aktywności kanału mitoBKcAw ser­
cu odgryw ać może podjednostka p i [64], Na podstaw ie do­
św iadczeń przeprow adzonych przy użyciu techniki hybryd
drożdżow ych postuluje się także możliwość bezpośrednie­
go oddziaływ ania podjednostki p i z oksydazą cytochro­
m u c [64], D odatkowo, zastosow anie m etody W estern Biot,
jak rów nież technik mikroskopii elektronowej i konfokalnej
pozwoliło na identyfikację podjednostek w chodzących w
skład kanału BKCAwew nętrznej błony m itochondriów m ó­
zgu. We frakcji mitochondrialnej w ykazano obecność białka
o masie cząsteczkowej 125 kDa, specyficznie znakow anego
przeciwciałem na podjednostkę a kanału BKt i [62], jak rów ­
nież białka 23- i 28 kDa rozpoznaw anych przez przeciwcia­
ło skierow ane na podjednostkę p4 kanału BKCA[65].
Kanał mitoBK( ulega aktywacji w skutek depolaryzacji
wewnętrznej błony m itochondriów lub w zrostu stężenia jo­
nów w apnia w macierzy mitochondrialnej. Znana jest także
grupa substancji farmakologicznych modulujących aktyw ­
ność kanału mitoBKCa. Spośród nich wymienić należy m.in.
pochodne benzoim idazolu, będące aktyw atoram i kanału
BKCA z błony plazmatycznej, takie jak NS1619 czy NS004.
Do inhibitorów kanału mitoBKtA należą natom iast indolowy alkaloid paksylina (Pax) oraz peptydy otrzym yw ane z
jadu skorpionów , takie jak iberiotoksyna (IbTx) i charybdotoksyna (ChTx). W ydaje się również, że aktywność kanału
mitoBKtA m oże być regulow ana przez białkową kinazę A
(PKA) [66].
D ośw iadczenia p rz e p ro w ad z o n e na kardiom iocytach
św inki morskiej pokazały, że 30 gM NS1619 pow oduje
znaczącą depolaryzację w ew nętrznej błony m itochon­
driów , p ro w ad ząc jednocześnie do zmniejszonej a k u m u ­
lacji C a2+ w m acierzy m itochondrialnej w w arun kach p o d ­
w yższonego stężenia jonów w ap nio w ych w cytoplazm ie
kom órki [66], Istnieje rów nież szereg danych w skazują­
cych na kardioprotekcyjne działanie NS1619 i udział akty­
wacji kanału mitoBKC) w m echanizm ie ochrony kom órek
serca w w aru n k ach niedotlenienia. W ykazano m.in., że
zastosow anie NS1619 w m odelu n ied o tlen ien ia/rep erfu zji w istotny sposób redukuje obszar m artw icy mięśnia
sercow ego u królika [61], m yszy [63], jak rów nież świnki
morskiej [67], a efekt ten blokow any jest przez paksylinę,
inhibitor kanału BKCi [61,63,67], D odatkow o postuluje się
udział kanału mitoBK0 w zjaw isku hartow ania niedotle­
http://rcin.org.pl
175
nieniem . Z aobserw ow ano, iż kardioprotekcja, w yw ołana
krótkim i cyklami niedotlenien ia/reperfuzji, o dw racana
jest przez zaham ow anie kanału mitoBKCa paksyliną [68].
M echanizm działania NS1619 i jego rola w ochronie ko­
m órek serca wciąż pozostają jednak nieznane. Sugeruje
się, że etapem kluczow ym w zjaw isku kardioprotekcji
indukow anej przez NS1619 m oże być przejściow y w zrost
produkcji anionu ponadtlenk ow ego [67] lub zablokow anie
aktyw ności m egakanału m itochondrialnego [68].
Identyfikacja podjednostki a i p4 w m itochondriach n e u ­
ro nów [62,65] oraz dane funkcjonalne w skazujące na obec­
ność kanału m itoBK ^ w m ózgu, stały się p u n k te m wyjścia
do ba d a ń nad rolą mitoBKCi w zjaw isku neuroprotekcji.
D ośw iadczenia p ro w ad zo n e z użyciem hodow li pierw ot­
nych n eu ro n ó w kory m ózgu szczura pokazały ochronny
efekt działania NS1619 w w aru nkach pozbaw ienia kom ó­
rek tlenu i glukozy oraz uszkodzenia induko w anego n a d ­
tlenkiem w o d o ru lub g lutam inianem [69]. We wszystkich
m odelach eksperym entalnych sześciogodzinna inkubacja
ze 100 pM NS1619 p ow tarzana przez 3 kolejne dni p o ­
w od ow ała w yraźn y w zrost przeżyw alności neuronów .
Co ciekawe, efekt ten nie był odw racany przez paksylinę,
charybdotoksynę czy iberiotoksynę, co w skazyw ać by m o­
gło na działanie NS1619 niezależne od aktywacji kanału
mitoBKCi. Istotną rolę w m echanizm ie neuroprotekcji in­
dukow anej przez NS1619 w ydaje się natom iast odgryw ać
aktywacja prożyciow ego szlaku sygnałow ego PI3K. W yka­
zano bowiem , że 100 gM NS1619 prow adzi do fosforylacji
kinazy Akt i Gsk3(3, a w ortm anina, zn any inhibitor kinazy
PI3K, ham uje efekt neuroprotekcyjny. O chronie kom órek
tow arzyszyły p o nadto obniżenie aktyw ności kaspazy 3
i 7 oraz w zrost produkcji reaktyw nych form tlenu, m.in.
anionu ponadtlenk ow ego [69], który tłum aczyć m ożna za­
h am ow aniem łańcucha oddechow ego przez w ysokie stę­
żenia NS1619 [70]. W świetle pow yższych danych, w ydaje
się, że w celu określenia roli kanału mitoBKCi w zjawisku
neuroprotekcji konieczne są dalsze badania z zastosow a­
niem niższych stężeń NS1619.
PODSUMOWANIE
Badania ostatnich lat bezsprzecznie pokazują, że m ito­
chondria odgryw ają kluczową rolę nie tylko w syntezie ATP
i w y tw arzaniu ROS, ale rów nież w regulacji m echanizm ów
odpow iedzialnych za inicjację i przebieg śmierci kom órko­
wej. Dane wskazujące na udział m itochondriów w przeka­
zyw aniu sygnału apoptotycznego stały się więc punktem
wyjścia dla poszukiw ania strategii cytoprotekcyjnych ce­
lujących w m itochondria. Interesującym obiektem b a d a w ­
czym, obok m egakanału m itochondrialnego bezpośrednio
zaangażow anego w przebieg procesu apoptozy, okazały się
być rów nież białka regulujące procesy fuzji i fragmentacji
m itochondriów, białka rozprzęgające, a także mitochondrialne kanały potasowe. Mimo intensyw nych badań, do ­
kładny m echanizm zjawiska neuroprotekcji zachodzącego z
udziałem m itochondriów nadal pozostaje w sferze hipotez.
Wydaje się, więc, że lepsze poznanie zależności istniejących
pom iędzy m etabolizm em m itochondriów a fizjologią neu­
ronów, może pomóc w znalezieniu skutecznych strategii
neuroprotekcji.
176
PIŚMIENNICTWO
1. G unter KK, G unter TE (1994) Transport of calcium by mitochondria. J
Bioenerg Biomembr 26:471-4852.
2. McCormack JG, H alestrap AP, Denton RM (1990) Role of calcium ions
in regulation of m am m alian intram itochondrial m etabolism . Physiol
Rev 70: 391-425
3. Rasola A, B em ardi P (2007) The m itochondrial perm eability transition
pore and its involvem ent in cell death and in disease pathogenesis.
A poptosis 12: 815-833
4. Eliseev RA, Filippov G, Velos J, Van W inkle B, G oldm an A, Rosier RN,
G unter TE (2007) Role of cyclophilin D in the resistance of brain m i­
tochondria to the perm eability transition. Neurobiol Aging 28: 15321542
5. Baines CP, Song CX, Z heng YT, W ang GW, Z hang J, W ang OL, Guo Y,
Bolli R, Cardw ell EM, Ping P (2003) Protein kinase Cepsilon interacts
with and inhibits the perm eability transition pore in cardiac m itochon­
dria. Circ Res 92: 873-880
6. Genestra M (2007) Oxyl radicals, redox-sensitive signalling cascades
and antioxidants. Cell Signal 19:1807-1819
7. Chandel NS, M altepe E, G oldw asser E, M athieu CE, Simon MC, Schu­
m acker PT (1998) M itochondrial reactive oxygen species trigger hypo­
xia-induced transcription. Proc Natl Acad Sci USA 95:11715-11720
8. O rrenius S (2004) M itochondrial regulation of apoptotic cell death. To­
xicol Lett 149:19-23
9. Kim TH, Zhao Y, Ding WX, Shin JN, H e X, Seo YW, Chen J, Rabinowich H, Am oscato AA, Yin XM (2004) Bid-cardiolipin interaction at
m itochondrial contact site contributes to m itochondrial cristae reorga­
nization and cytochrom e c release. Mol Biol Cell 15: 3061-3072
10. Frezza C, Cipolat S, M artins de Brito O, Micaroni M, Benzoussenko
GV, Rudka T, Bartoli D, Polishuck RS, Danial NN, De Strooper B,
Scorrano L (2006) OPA1 controls apoptotic cristae rem odeling inde­
pendently from m itochondrial fusion. Cell 126:177-189.
11. Frank S, G aum e B, Bergmann-Leitner ES, Leitner WW, Robert EGm,
Catez F, Smith CL, Youle RJ (2001) The role of dynam in-related protein
1, a m ediator of m itochondrial fissionm, in apoptosis. Dev Cell 1: 515525
12. Cheung ECC, McBride HM, Slack RS (2007) M itochondrial dynam ics
in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis 12:979-992
13. Lee YJ, Jeong SY, Karbowski M, Smith CL, Youle RJ (2004) Roles of the
m am m alian m itochondrial fission and fusion m ediators Fisl, D rp l,
and O p a l in apoptosis. Mol Biol Cell 15: 5001-5011
14. M artinou JC, Youle RJ (2006) W hich came first, the cytochrom e c rele­
ase or the m itochondrial fission? Cell Death Differ 13:1291-1295
15. Karbowski M, A m oult D, Chen H, Chan DC, Smith CL, Youle RJ
(2004) Q uantitation of m itochondrial dynam ics by photolabeling of in­
dividual organelles show s that m itochondrial fusion is blocked during
the Bax activation phase of apoptosis. J Cell Biol 164: 493-499
16. Karbowski M, Lee YJ, G aum e B, Jeong SY, Frank S, N echushtan A,
Santel A, Fuller M, Smith CL, Youle RJ (2002) Spatial and tem poral
association of Bax w ith m itochondrial fission sites, D rpl, and Mfn2
during apoptosis. J Cell Biol 159: 931-938
17. N euspiel M, Z unino R, Gangaraju S, Rippstein P, McBride H (2005)
Activated m itofusin 2 signals m itochondrial fusion interferes w ith Bax
activation and reduces susceptibility to radical induced depolariza­
tion. J Biol Chem 280: 25060-25070
18. Delettre C, Lenaers G, Griffoin JM, Gigarel N, Lorenzo C, Belenguer
P, Pelloquin L, Grosgeorge J, Turc-Carel C, Perret E, A starie-Dequeker
C, Lasquellec L, A rnaud B, D ucom m un B, Kaplan J, Ham el CP (2000)
Nuclear gene OPA1, encoding a m itochondrial dynam in-related pro­
tein, is m utated in dom inant optic atrophy. N at Genet 26: 207-210
19. Z uchner S, M ersiyanova IV, M uglia M, Bissar-Tadmouri N, Rochelle
J, Dadali EL, Z appia M, Nelis E, Patitucci A, Senderek J, Parm an Y,
Evgrafov O, Jonghe PD, Takahashi Y, Tsuji S, Pericak-Vance MA, Quattrone A, Battaloglu E, Polyakov AV, T im m erm an V, Schroder JM,
Vance JM (2004) M utations in the m itochondrial GTPase m itofusin 2
cause Charcot-M arie-Tooth neuropathy type 2A. N at Genet 36: 449451
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
20. Chen H, McCaffery JM, C han DC (2007) M itochondrial fusion protects
against neurodegeneration in the cerebellum. Cell 130: 548-562
21. Barsoum MJ, Y uan H, Gerencser AA, Liot G, K ushnareva Y, G raber S,
Kovacs I, Lee WD, W aggoner J, Cui J, W hite AD, Bossy B, M artinou JC,
Youle RJ, Lipton SA, Ellisman MH, Perkins GA, Bossy-Wetzel E (2006)
Nitric oxide-induced m itochondrial fission is regulated by dynam inrelated GTPases in neurons. EMBO J 25: 3900-3911
38. W ięckowski MR, Wojtczak L (1997) Involvem ent of the dicarboxylate
carrier in the protonophoric action of long-chain fatty acids in m ito­
chondria. Biochem Biophys Res C om m un 232: 414-417
39. Stout AK, Raphael HM, Kanterewicz BI, Klann E, Reynolds IJ (1998)
G lutam ate-induced neuron death requires m itochondrial calcium
uptake. N at Neurosci 1: 366-373
22. Jahani-Asl A, C heung EC, N euspiel M, M acLaurin JG, Fortin A, Park
DS, McBride HM, Slack RS (2007) M itofusin 2 protects cerebellar
granule neurons against injury-induced cell death. J Biol C hem 282:
23788-23798
40. M attiasson G, Sham loo M, Gido G, M athi K, Tomasevic G, Yi S, W ar­
den CH, Castilho RF, Melcher T, G onzalez-Zulueta M, Nikolich K,
W ieloch T (2003) U ncoupling protein-2 prevents neuronal death and
dim inishes brain dysfunction after stroke and brain traum a. N at M ed
9:1062-1068
23. Y uan H, Gerencser A A, Liot G, Lipton SA, Ellisman M, Perkins G A,
Bossy-Wetzel E (2007) M itochondrial fission is an u pstream and requ­
ired event for bax foci form ation in response to nitric oxide in cortical
neurons. Cell D eath Differ 14: 462-471
41. Korde AS, Pettigrew LC, Craddock SD, M aragos WF (2005) The m ito­
chondrial uncoupler 2,4-dinitrophenol attenuates tissue dam age and
im proves m itochondrial hom eostasis follow ing transient focal cere­
bral ischemia. J N eurochem 94:1676-1684
24. Basso E, Fante L, Fowlkes J, Petronilli V, Forte MA, Bernardi P (2005)
Properties of the perm eability transition pore in m itochondria devoid
of Cyclophilin D. J Biol C hem 280:18558-18561
42. M aragos WF, Rockich KT, Dean JJ, Young KL (2003) Pre- or post-treat­
m ent w ith the m itochondrial uncoupler 2,4-dinitrophenol attenuates
striatal quinolinate lesions. Brain Res 966: 312-316
25. H alestrap AP, Davidson AM (1990) Inhibition of Ca2+-induced largeam plitude sw elling of liver and heart m itochondria by cyclosporin
is probably caused by the inhibitor binding to m itochondrial-m atrix
peptidyl-prolyl cis-trans isom erase and preventing it interacting w ith
the adenine nucleotide translocase. Biochem J 268:153-160
43. Sullivan PG, D ube C, Dorenbos K, Stew ard O, Baram TZ (2003) Mi­
tochondrial uncoupling protein-2 protects the im m ature brain from
excitotoxic neuronal death. A nn N eurol 53: 711-717
26. W hite RJ, Reynolds IJ (1996) M itochondrial depolarization in glutam a­
te-stim ulated neurons: an early signal specific to excitotoxin exposure.
J Neurosci 16: 5688-5697
27. N iem inen AL, Petrie TG, Lem asters JJ, Selm an WR (1996) Cyclosporin
A delays m itochondrial depolarization induced by N-m ethyl-D-aspartate in cortical neurons: evidence of the m itochondrial perm eability
transition. Neuroscience 75: 993-997
28. Friberg H, Ferrand-D rake M, Bengtsson F, H alestrap AP, W ieloch T
(1998) Cyclosporin A, b u t not FK506, protects m itochondria and n eu ­
rons against hypoglycem ic dam age and implicates the m itochondrial
perm eability transition in cell death. J Neurosci 18: 5151-5159
29. O konkw o DO, M elon DE, Pellicane AJ, M utlu LK, Rubin DG, Stone JR,
H elm GA (2003) Dose-response of cyclosporin A in attenuating trau­
matic axonal injury in rat. N euroreport 14:463-466
30. K haspekov L, Friberg H, H alestrap A, Viktorov I, W ieloch T (1999)
Cyclosporin A and its nonim m unosuppressive analogue N-Me-Val-4cyclosporin A m itigate glucose/oxygen deprivation-induced dam age
to rat cultured hippocam pal neurons. Eur J Neurosci 11: 3194-3198
31. H ansson MJ, M attiasson G, M ansson R, Karlsson J, Keep MF, W aldm eier P, Ruegg UT, D um ont JM, Besseghir K, Elmer E (2004) The no­
nim m unosuppressive cyclosporin analogs NIM811 and UNIL025 di­
splay nanom olar potencies on perm eability transition in brain-derived
m itochondria. J Bioenerg Biomem br 36: 407-413
32. Naga KK, Sullivan PG, G eddes JW (2007) H igh cyclophilin D content
of synaptic m itochondria results in increased vulnerability to perm e­
ability transition. J Neurosci 27: 7469-7475
33. Schinzel AC, Takeuchi O, H u an g Z, Fisher JK, Z hou Z, Rubens J, H etz
C, Danial NN, M oskowitz MA, Korsmeyer SJ (2005) Cyclophilin D is
a com ponent of m itochondrial perm eability transition and m ediates
neuronal cell death after focal cerebral ischemia. Proc N atl Acad Sci
USA 102:12005-12010
34. Forte M, Gold BG, Marracci G, C haudhary P, Basso E, Johnsen D, Yu
X, Fowlkes J, Rahder M, Stem K, Bernardi P, Bourdette D (2007) Cyc­
lophilin D inactivation protects axons in experim ental autoim m une
encephalom yelitis, an anim al m odel of m ultiple sclerosis. Proc Natl
A cad Sci USA 104: 7558-7563
35. Sluse FE, Jarm uszkiewicz W, N avet R, D ouette P, M athy G, Sluse-Goffart CM (2006) M itochondrial UCPs: new insight into regulation and
impact. Biochim Biophys Acta 1757: 480-485
36. Skulachev VP (1991) Fatty acid circuit as a physiological m echanism of
uncoupling of oxidative phosphorylation. FEBS Lett 294:158-162
37. Sam artsev VN, Sm irnov AV, Zeldi IP, M arkova OV, M okhova EN,
Skulachev VP (1997) Involvem ent of aspartate/glutam ate antiporter
in fatty acid-induced uncoupling of liver m itochondria. Biochim Bio­
phys Acta 1319: 251-257
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
44. Bechm ann I, Diano S, W arden CH, Bartfai T, Nitsch R, H orvath TL
(2002) Brain m itochondrial uncoupling protein 2 (UCP2): a protective
stress signal in neuronal injury. Biochem Pharm acol 64: 363-367
45. Conti B, Sugam a S, Lucero J, W insky-Som merer R, W irz SA, M aher P,
A ndrew s Z, Barr AM, M orale MC, Paneda C, Pem berton J, G aidarova
S, Behrens MM, Beal F, Sanna PP, H orvath T, Bartfai T (2005) Unco­
upling protein 2 protects dopam inergic neurons from acute 1,2,3,6-methyl-phenyl-tetrahydropyridine toxicity. J N eurochem 93: 493-501
46. Inoue I, Nagase H, Kishi K, H iguti T (1991) ATP-sensitive K+ channel
in the m itochondrial inner m em brane. N ature 352: 244-247
47. Paucek P, M ironova G, M ahdi F, Beavis AD, W oldegiorgis G, G arlid
KD (1992) Reconstitution and partial purification of the glibenclamide-sensitive, A TP-dependent K+ channel from rat liver and beef heart
m itochondria. J Biol Chem 267: 26062-26069
48. Dębska G, Kicińska A, Skalska J, Szewczyk A, May R, Elger CE, Kunz
WS (2002) O pening of potassium channels m odulates m itochondrial
function in rat skeletal muscle. Biochim Biophys Acta 1556: 97-105
49. Bajgar R, Seetharam an S, Kow altowski AJ, G arlid KD, Paucel P (2001)
Identification and properties of a novel intracellular (mitochondrial)
ATP-sensitive potassium channel in brain. J Biol Chem 36: 3336933374
50. Busija DW, Lacza Z, Rajapakse N, Shim izu K, Kis B, Bari F, Domoki F,
H origuchi T (2004) Targeting m itochondrial ATP-sensitive potassium
channels — a novel approach to neuroprotection. Brain Res Rev 46:
282-294
51. Garlid KD, Paucek P, Yarov-YarovoyV, M urray HN M , Darbenzio RB,
D 'A lonzo AJ, Lodge NJ, Smith MA, G rover GJ (1997) Cardioprotective
effect of diazoxide and its interaction w ith m itochondrial ATP-sensiti­
ve K+ channels. Possible m echanism of cardioprotection. Cire Res 81:
1072-1082
52. Liu D, Lu C, W an R, A uyeung WW, M attson M (2002) Activation of
m itochondrial A T P-dependent potassium channels protects neurons
against ischem ia-induced death by a m echanism involving suppres­
sion of bax trnsloaction and cytochrom e c release. J Cereb Blood Flow
Metab 22: 431-443
53. Teshim a Y, Akao M, Li RA, C hong TH, B aum gartner WA, Johnston
MV, M arban E (2002) M itochondrial ATP-sensitive potassium channel
activation protects cerebellar neurons from apoptosis induced by oxi­
dative stress. Stroke 34:1796-1802
54. Tai KK, M cCrossan ZA, A bbott GW (2003) Activation of m itochondria
ATP-sensitive potassium channels increases cell viability against rotenone-induced cell H eath. J N eurosci 84:1193-1200
55. Kis B, Rajapakse NC, Snipes JA, N agy K, Horiguchi T , Busija DW
(2003) Diazoxide induces delayed pre-conditioning in cultured rat cor­
tical neurons. J Neurosci 87: 969-980
56. N agy K, Kis B, Rajapakse NC, Bari F, Busia DW (2004) Diazoxide pre­
conditioning protects against neuronal cell H eath by attenuation of
http://rcin.org.pl
177
oxidative stress u p o n glutam ate stimulation. J Neurosci Res 76: 697704
57. Kis B, N agy K, Snipes JA, Rajpakse NC, Horiguchi T, G rover GJ, Busija DW (2004) The m itochondrial KATP channel opener BMS-191095
induces neuronal preconditioning. N euroreport 15: 345-349
58. G aspar T, Snipes JA, Busija AR, Kis B, Dom oki F, Bari F, Busija DW
(2008) ROS-independent preconditioning in neurons via activation of
mitoK(ATP) channels by BMS-191095. J Cereb Blood Flow M etab doi:
10.1038/ sj .jcbfm.9600611
59. M ayangi K, G aspar T, Katakam PVG, Kis B, Busija D (2006) The m ito­
chondria Katp channel opener BMS-1911095 reduces neuronal dam age
after transient focal cerebral ischem ia in rats. J Cereb Blood Flow Me­
tab 27: 348-55
60. Siemen D, Loupatatzis C, Borecky J, Gulbins E, Lang F (1999) Ca2+-activated K channel of the BK-type in the inner m itochondrial m em brane
of a hu m an gliom a cell line. Biochem Biophys Res C om m un 257: 54954
61. Xu W, Liu Y, W ang S, M cDonald T, Van Eyk JE, Sidor A, O 'Rourke B
(2002) Cytoprotective role of Ca2+-activated K+ channels In the cardiac
inner m itochondria m em brane. Science 298:1029-1033
62. Douglas RM, Lai JCK, Bian S, Cum m ins L, M oczydłowski E, H ad d ad
GG (2006) 7he calcium -sensitive large-conductance potassium chan­
nel (BK/MAXI K) is present in the inner m itochondrial m em brane of
rat brain. Neuroscience 139:1249-1261
63. W ang X, Yin C, Xi L, Kukreja RC (2004) O pening of Ca2+-activated K+
channels triggers Elary and delayed proeconditioning against I /R in­
jury independent of NOS In mice. A m J Physiol H eart Circ Physiol 287:
H2070-H2077
64. O hya S, K uw ata Y, Sakamoto K, M uraki K, Im aizum i Y (2005) Car­
dioprotective effects of estradiol include the activation of large-conductance Ca2+-activated K+ channels in cardiac m itochondria. A m J
Physiol H eart Circ Physiol 289: H1635-H1642
65. Piwońska M, Wilczek E, Szewczyk AM, W ilczyński GM (2008) Diffe­
rential distribution of Ca2+-activated potassium channel beta4 subunit
in rat brain: imm unolocalization in neuronal m itochondria. N euro­
science 153: 446-460
66. Sato T, Saito T, Saegusa N, N akaza H (2005) M itochondrial Ca2+-activated K+ channels in cardiac myocytes. A m echanism of the cardio­
protective effect and m odulation by protein kinase A. Circulation 11:
198-203
67. Stowe DF, A ldakkak M, C am ara AKS, Riess ML, H einen A, Varadarajan SG, Jiang M-T (2006) Cardiac m itochondrial preconditioning by big
Ca2+-sensitive K+ channel opening requires superoxide radical genera­
tion. A m J Physiol H eart Physiol 290: H434-H440
68. Cao C-M, Xia Q, Gao Q, Chen M, W ong T-M (2004) Calcium-activated
potassium channel triggers cardioprotection of ischemic preconditio­
ning. J Pharm acol Exp Ther 312: 644-50
69. G aspar T, K atakam P, Snipes JA, Kis B, Dom oki F, Bari F, Busija DW
(2008) D elayed neuronal preconditioning by NS1619 is independent of
calcium activated potassium channels. J N eurochem 105:1115-1128
70. Dębska G, Kicińska A, Dobrucki J, D w orakow ska B, N urow ska E,
Skalska J, Dołowy K, Szewczyk A (2003) Large-conductance K+ chan­
nel openers NS1619 and NS004 as inhibitor of m itochondrai function
in gliom a cells. Biochem Pharm acol 65:1827-1834
Mitochondrial neuroprotection
Marta Piwońska-^, Adam Szewczyk
L aboratory of Intracellular Ion Channels, Biochem istry D epartm ent, N encki Institute of E xperim ental Biology, 3 P asteur St., 02-093 W arsaw , Po­
land
e-mail: m .glab@ nencki.gov.pl
Key words: m itochondria, apoptosis, ion channels, neuroprotection
SUMMARY
Mitochondria play a key function in cellular metabolism. Additionally to ATP synthesis, mitochondria may buffor cytosolic calcium ions and
generate reactive oxygen species. Due to these processes, mitochondria are involved in complex cytoprotective phenom ena. Neuroprotection
is very often based on changes in the integrity of mitochondrial membranes. In this report potential neuroprotective role of mitochondrial ion
channels is discussed.
178
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pi
STRESZCZENIE
iałk a rozprzęgające (ang. UCPs, uncoupling proteins) to n ieo d łą cz n y s k ła d n ik w e w n ę trz ­
nej b ło n y m ito c h o n d ria ln ej, um o żliw iający tzw . k o n tro lo w an y „przeciek" p ro to n ó w z
p rz estrz en i m ięd zy b ło n o w ej do m acierzy m ito chondriów . A ktyw ność rozprzęgająca UCPs
o b n iża p ro to n o w y g ra d ie n t elektrochem iczny, ApH+, w y tw o rz o n y przez łańcuch oddechow y,
n ie prow adząc do sy n te zy ATP. R ozpraszając uży teczn ą energię sw o b o d n ą, pochodzącą z
u tle n ia n ia su b stra tó w oddecho w ych, UCPs stan o w ią isto tn y p u n k t k o n tro ln y w gospodarce
energetycznej ko m ó rk i. A ktyw acja UCP1 (term ogeniny) w m ito c h o n d ria c h b ru n a tn e j tk a n k i
tłuszczow ej ssak ó w p ro w a d zi do u w a ln ia n ia dużej ilości ciepła (term ogenezy) w w y n ik u
ro z p rasz a n ia en erg ii ApH+. B iałka rozprzęgające są sty m u lo w an e p rzez w o ln e k w asy tłu sz ­
czow e, a ich allosterycznym i in h ib ito ra m i są n u k le o ty d y p u ry n o w e. D z iałan ie UCPs je st n a ­
p ę d za n e przez po ten cjał b ło n o w y (AT1, u jem n y w e w n ą trz m ito ch o n d riu m ) oraz różnicę pH
(kw aśne n a zew nątrz). O d k ry cie U CPs w e w szy stk ich w a ż n ie jszy c h g ru p ach eukario n tó w :
u ro ślin w yższych, n iek tó ry c h bezkręgow ców , p ierw o tn ia k ó w , grzybów i w w ie lu nieterm og en n y ch tk a n k a c h ssak ó w (UCP2 — w różnych tk an k a c h , UCP3 — g łó w n ie w m ięśn iach
szkieletow ych, UCP4 i UCP5 — w m ózgu), po zw ala przypuszczać, że te "n o w e" UCPs, p rz e ­
c iw nie do UCP1 b ru n a tn e j tk a n k i tłuszczow ej ssaków , sp e łn ia ją in n e fu n k c je n iż p ro d u k o ­
w a n ie ciepła p o p rz ez z w ięk sza n ie o d d y ch an ia m ito ch o n d rialn eg o . Je d n ą z n ich m oże być
o b n iża n ie p ro d u k c ji reak ty w n y c h fo rm tle n u w m ito ch o n d riach , a w ięc ochrona ko m ó rk i
p rz e d stresem oksydacyjnym . Jed n o cześn ie aktyw ność U CPs zw ierz ąt (poza UCP1) i ro ślin
m oże być sty m u lo w an a p rz ez p ro d u k ty pero k sy d acji lip id ó w (np. 4-hydroksy-2-nonenal,
HN E), pow stające w s k u te k po d w y ższo n eg o p o zio m u a n io n o ro d n ik a p o n a d tle n k o w e g o .
B
WPROWADZENIE
W bioenergetyce term in „rozprzęganie" (ang. u n cou pling ) odnosi się do pro­
cesów, których efektem jest rozpraszanie energii uwalnianej podczas utleniania
substratów oddechow ych w mitochondriach, przeciw nie do procesów p ro w a­
dzących do „zachow ania" energii (ang. energy conservation), czyli syntezy ATP.
Początkowo sądzono, że białko rozprzęgające (UCP, ang. un c ou pling protein) sta­
now i składnik jedynie brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT, ang. brown adipose tis­
sue) ssaków, będąc stosunkow o późn ym z ewolucyjnego p u n k tu widzenia, w ą ­
skim przystosow aniem m etabolicznym, um ożliw iającym przejściową termogenezę. Jednak obecnie, w oparciu o liczne odkrycia genów i badania funkcjonalne,
uw aża się, że białka rozprzęgające (UCPs) m ogą być standardow ym elem entem
wyposażenia wew nętrznej błony mitochondrialnej u w szystkich Eucaryota, a w
tym zw ierząt kręgow ych i bezkręgowych, roślin, grzybów (niefermentujących),
a naw et pierw otniaków [1,2]. Ta pow szechna obecność UCPs u Eucaryota, w ska­
zuje na w yew oluow anie pierw otnego genu ucp przed w yodrębnieniem się or­
ganizm ów będących przodkam i dzisiejszych reprezentantów w spom nianych
wyżej czterech królestw w obrębie Eukaryota. Funkcjonowanie UCPs w m ito­
chondriach prostych organizm ów am eboidalnych (Protista) wskazuje na w yspe­
cjalizowanie w e w czesnych etapach ewolucji system ów rozpraszających ener­
gię, m odulujących precyzję sprzężenia pom iędzy oddychaniem kom órkow ym
a syntezą ATP, czyli regulujących wydajność procesu fosforylacji oksydacyjnej.
W ten oto sposób kom órka m oże dokonyw ać starannej autokorekty tem pa prze­
m ian metabolicznych i tym sam ym sprawniej utrzym yw ać rów now agę pom ię­
dzy zapotrzebow aniem na energię a jej pozyskiw aniem z dostępnych źródeł.
Wiesława JarmuszkiewiczE
Andrzej Woyda-Płoszczyca
Instytut Biologii M olekularnej i Biotechnologii,
U niw ersytet im. A dam a M ickiewicza, P oznań
Zakład Bioenergetyki, Instytut Biologii
M olekularnej i Biotechnologii, U niw ersytet
im. A dam a M ickiewicza, ul. U m ultow ska
89, 61-614 Poznań; tel. (061) 828-58 81,
e-mail: w iesiaj@ am u.adu.pl
A rtykuł otrzym ano 15 kw ietnia 2008 r.
A rtykuł zaakceptow ano 21 kw ietnia 2008 r.
Słow a kluczow e: białka rozprzęgające, reak­
tyw ne form y tlenu, peroksydacja lipidów , m i­
tochondria, rozpraszanie energii
W ykaz skrótów : BAT — b ru n a tn a tkanka
tłuszczow a (ang. brown adipose tissue); FFA
— w olne kw asy tłuszczow e (ang. free fa tty
acid); LOOH — p ro d u k ty peroksydacji k w a­
sów tłuszczow ych lipidów (ang. lipid peroxide);
ROS (ang. reactive oxygen species) — reaktyw ne
form y tlenu; UCP(s) (ang. uncouplingprotein(s))
— białko(a) rozprzęgające; AgH+ — elektroche­
m iczny grad ien t protonow y; AT1 — elektrycz­
ny potencjał błonow y m itochondriów
P o d ziękow anie: Przygotow anie arty k u łu zo­
stało dofinansow ane ze środków budżetow ych
na naukę jako projekt badaw czy nr: 3 3 8 2 /B /
P 0 1 /2007/33
REGULACJA WYDAJNOŚCI FOSFORYLACJI OKSYDACYJNEJ
W skład wew nętrznej błony mitochondrialnej w szystkich organizm ów w cho­
dzą kom pleksy białkowe (pom py protonow e, kom pleksy I, III, IV), przenoszące
elektrony z substratów oddechow ych na tlen (Rye. 1). Transportując elektrony,
kom pleksy te w yp om po w ują protony z macierzy mitochondrialnej, wytw arzając
protonow y gradient elektrochemiczny (A|iH+) (złożony z gradientu protonow e­
go, ApH i potencjału błonowego, AW), który n ap ędza syntezę ATP w reakcji prze­
prow adzanej przez syntazę ATP. Poniew aż AgH+ sprzęga transport elektronów
w łańcuchu od dechow ym z syntezą ATP, brak możliwości w ytw orzenia ATP
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
179
niebiałkowe pory błonowe lub
m olekularne szczeliny tworzące
się przy powierzchniach p rzy­
legania białek i lipidów. Jest to
tzw. przeciek protonow y (ang.
proton leak) [3]. A zatem rozprzęganie stanow i nieodłączną cechę
funkcjonowania m itochondriów
i oznacza brak ścisłej zależności
pom iędzy ilością utlenianych w
trakcie oddychania kom órkow e­
go substratów a ilością energii
swobodnej zawartej w w y tw o ­
rzonych cząsteczkach ATP.
Ze w zględu na po dstaw o­
w y charakter działania w szyst­
kich UCPs w m itochondriach
eukariontów , tj. rozpraszanie
użytecznej energii swobodnej,
białka te stanow ią istotny pu n k t
kontrolny w gospodarce ener­
m acierz m itochondrialna
getycznej komórki. U kierunko­
w
an y i kontrolow any przeciek
R ycina 1. Schem at klasycznego łańcucha o ddechow ego w ew nętrznej błony m itochondrialnej zw ierząt. N ie zaznaczono
do d a tk o w y ch no śników elektronów (dehyd rog en azy N A D (P)H , o ksy daza alternatyw na) obecnych w m itoch ondriach
protonów , a więc zachodzący z
roślin i niektórych m ikro org an izm ów eukariotycznych. T ran sport elektronó w w dół łańcucha odd echo w ego p ro w a d z i
udziałem wyspecjalizowanych
do po m p o w a n ia p ro to n ó w do p rzestrzen i m iędzybłonow ej m ito ch ond rió w (aktyw ność kom p leksów I, III i IV; kom pleks
system ów rozpraszających ener­
II nie pom puje H +). W rezultacie pow staje pro to n o w y g rad ien t elektrochem iczny, AgH+, na który składa się potencjał bło­
no w y (A^P) oraz różnica p H p o obu stronach błony (ApH). G rad ien t ten n a p ęd z a m o leku larny m o to r Fo-F1 syntazy ATP,
gię (głównie UCPs), m a duże
która fosforyluje ADP. W określonych w a ru n k a ch AgH+m oże ulegać częściow em u ro z p ro sz en iu (dyssypacji) z ud ziałem
znaczenie fizjologiczne dla orga­
białka rozprzęgającego (UCP). Q, k o en zym Q, c — cytochrom c.
nizm u, chociażby ze w zględu na
potencjalną rolę efektywnego i
naturalnie bezpiecznego m echa­
m oże prow adzić do rozproszenia energii ApH+, a więc do
nizm u kontroli m asy ciała. W iąże się to z utrzym yw aniem
przekształcenia tej energii w ciepło. W ydajność fosforylacji
w kom órce odpow iednio wysokiej proporcji N A D /N A D H ,
oksydacyjnej oparta jest na nieprzepuszczalności w ew nętrz­
napędzającej utlenianie substratów oddychania kom órko­
nej błony m itochondrialnej dla protonów i na stałej stechio­
wego. Zmniejszanie stopnia redukcji m itochondrialnych
metrii działania każdej z trzech po m p protonowych. W ydaj­
kom ponentów łańcucha oddechow ego przez UCPs sprzyja
ność fosforylacji oksydacyjnej zależy także od obecności w
rów nież osłabianiu p ow staw ania ROS, a tym sam ym chroni
w ew nętrznej błonie m itochondrialnej wyspecjalizow anych
przed fizjologicznym w yniszczaniem organizm u [4], Jed­
białek rozpraszających energię, takich jak niew rażliw a na
nakże nadal brakuje wystarczająco przekonujących danych
cyjanek alternatyw na oksydaza czy dodatkow e dehyd roge­
dośw iadczalnych, wskazujących na celowość pośw ięcania
nazy NAD(P)H (mitochondria roślin w yższych i niektórych
nakładów energetycznych (części w ytw orzonego A|iH+) dla
m ikroorganizm ów eukariotycznych) oraz UCP (mitochon­
utrzym yw ania m itochondrialnego przecieku protonów [5],
dria w szystkich Eukaryota). M echanizm rozpraszania ener­
gii przez te białka jest różny: UCP rozprasza AfiH+tw orzony
OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA UCPs
przez łańcuch oddechow y m itochondriów a alternatyw na
oksydaza i dodatkow e dehydrogenazy NAD(P)H obniżają
W ew nętrzna błona m itochondrialna w yposażona jest
potencjał oksydoredukcyjny tego łańcucha. Mimo różnego
w swoisty zestaw nośników odpow iedzialnych za specy­
m echanizm u rozpraszania energii, aktywność tych białek
ficzną w ym ianę m olekuł pom iędzy cytosolem a macierzą
w yw iera podobny w pływ na stan energetyczny komórki, tj.
m itochondrialną. Ze w zględu na w yraźne podobieństw o
obniża poziom syntezy ATP w mitochondriach.
struktury pierw szorzędow ej UCP do translokazy nukleoty­
Ponadto, część w ytw orzonego przez łańcuch oddecho­
dów adeninow ych czy nośnika fosforanowego, postuluje
w y A(iH+ ulega niespecyficznemu rozproszeniu z udziałem
się istnienie rodziny hom ologicznych nośników m itochon­
niektórych białek w ew nętrznej błony m itochondrialnej (np.
drialnych (MCF, ang. mitochondrial carrier family) [6]. Pogląd
translokazy nu kleotydów adeninow ych czy nośnika fos­
ten dodatkow o potw ierdzają analizy struktury innych n o ­
foranu), głównie w w arun kach w ysokiego ATP (w niefosśników wew nętrznej błony mitochondrialnej oraz ziden­
forylującym stanie oddechow ym , stanie 4) [1,2]. W trakcie
tyfikow anych izoform UCPs zw ierząt i roślin. Jednakże to
wzmożonej fosforylacji oksydacyjnej (w fosfory lującym sta­
UCP, translokaza nukleotydów adeninow ych oraz nośnik
nie oddechow ym , stanie 3) nośniki te są głównie zaanga­
fosforanow y razem w yznaczają funkcjonalną p o d g ru p ę
żow ane w transport swoich specyficznych substratów. Czę­
nośników silnie zw iązaną z przekształcaniem energii w
ściowe rozproszenie ApPP m oże być także w ynikiem prze­
mitochondriach. A zatem, proces ten regulow any jest przez
chodzenia protonów do macierzy mitochondrialnej poprzez
strukturalnie bardzo podobne białka, które, co zaskakujące,
180
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
cza gdy jest to środow isko bogate w kardiolipinę [7], Analiza struktury pierwszorzędowej, profilu hydrofobowości
oraz spektroskopii w podczerw ieni
wskazuje na 40-50% zawartość struktur
a helikalnych w U C Pł. Jest to zgodne z
opracow anym m odelem topologii UCPs
w błonie, zakładającym obecność aż
sześciu transbłonow ych a helis (Ryc. 2).
W spólną cechą charakterystyczną UCPs
oraz innych nośników błonowych jest
organizacja strukturalna oparta na trójkrotności m o ty w u strukturalnego [7-9],
Praw dopodobnie jest to konsekwencją
zajścia dw óch niezależnych duplikacji
sekwencji DNA, odległego ewolucyjnie
pierw ow zoru dla całej obecnej rodziny
nośników m itochondrialnych (MCF).
Dlatego też łańcuch polipeptydow y
UCP dzieli się na trzy podobne dom eny,
R ycina 2. M odel p rz e strze n n y cząsteczki UCP. U CP zb u d o w an e jest z sześciu transbłon ow ych a-helis (I-VI),
połączonych hy drofilow ym i pętlam i. P rzery w ane linie w yznaczają do m e n y w obrębie trójkrotnej stru k tu ry
zawierające po około 100 am inokw a­
UCP. P o dob ny ty p organizacji b u d o w y m olekularnej charakteryzuje także innych członków ro d z in y m ito ­
sów. Pojedyncza dom ena obejmuje dw ie
chondrialnych nośników anionów w ew nętrznej błony m itochondriów .
transbłonow e a helisy, oddzielone po
stronie macierzy długim odcinkiem (pę­
zajmują się transportem cząsteczek różniących się znacznie
tlą złożoną z około 40 reszt) silnie hydrofilow ych am inokw a­
rozmiarem. Protony przenoszone przez UCPs są najmniej­
sów. Niewielka część tego odcinka w nika w hydrofobow e
szymi transportow anym i cząstkami, natom iast translokaza
środow isko błony i praw dopodobnie tw orzy wyściółkę dla
A D P /A T P transportuje jedne z największych m olekuł dla
obszaru białka zaangażow anego w przenoszenie protonów.
nośników m itochondrialnych [7].
Pętle łączące transbłonow e helisy od strony macierzy za­
wierają zachowane w ewolucji sekwencje (ang. energy trans­
Do tej pory najwięcej informacji zgrom adzono na temat
fer
protein signatures), występujące u w szystkich członków
UCP1 (wcześniej zw anego termogeniną), czyli UCP BAT
rodziny
nośników m itochondrialnych (MCF) [7,9]. Końce
ssaków. Często białko te określa się jako pierw otne UCP,
N
i
C
białka
UCP zwrócone są do przestrzeni m iędzybło­
choć określenie to m oże być mylące, zwłaszcza w kontek­
nowej.
Białka
rozprzęgające w yróżniają charakterystyczne,
ście odkryć licznych ortologów UCP1 u organizm ów znaj­
zachow
ane
w
ewolucji rejony zw ane podpisam i UCP (ang.
dujących się na niższym poziomie rozw oju ewolucyjnego.
UCP signatures), obecne w trzech helisach (1, 2 i 4).
Ogólnie akceptow aną rolą fizjologiczną UCP1 jest a d ap ta ­
cyjna term ogeneza u hibernujących i now o narodzonych
ssaków prow adząca do w zrostu tem peratury ciała (stąd
nazw a termogeniną) w rezultacie intensyw nego rozprzęgania oksydacyjnej fosforylacji w m itochondriach BAT. N a­
tom iast funkcja hom ologów UCP1 w ystępujących w m ito­
chondriach nieterm ogennych tkanek zw ierzęcych (UCP2-5)
i roślinnych oraz m ikroorganizm ów eukariotycznych nadal
nie jest w pełni poznana.
Informacja kodująca w pełni dojrzałe białka UCPs jest
zaw arta w jądrow ym DNA. W przeciw ieństwie do wielu
m itochondrialnych białek kodow anych przez genom jądro­
wy, polipeptyd UCP nie jest obdarzony sekwencją sygnało­
w ą odcinaną po imporcie do m itochondriów [8]. Regulacja
aktywności UCPs obejmuje zm iany zarów no na poziomie
syntezy białka, jak i specyficzną aktywację i ham ow anie
funkcjonalnego białka w m itochondrium .
STRUKTURA UCPs
MECHANIZM DZIAŁANIA UCPs
Mimo pew nych indyw idualnych cech izoform UCPs,
zwykle ich strukturę opisuje się na przykładzie UCP1, które
najpełniej scharakteryzowano. Białka rozprzęgające to biał­
ka w ew nętrznej błony mitochondrialnej, zbudo w ane z oko­
ło 300 reszt am inokw asow ych. Ich m asa m olekularna mieści
się w granicach 32-33 kDa (dla m onom eru). Określono ró w ­
nież masę 66 kDa dla potencjalnie funkcjonalnych struktur
hom odim eryczych, co potw ierdza koncepcję preferencyjnej
oligomeryzacji większości białek błonowych. Sum aryczny
ładunek elektryczny łańcuchów bocznych am inokw asów
jest dodatni, ze w zględu na przew agę am inokw asów zasa­
dow ych n ad kw asow ym i. O kreślona lokalizacja dodatnich
ładu nków jest praw do podo bnie konieczna dla praw idłow e­
go zakotwiczenia białka w dw uw arstw ie lipidowej, zwłasz-
Białka rozprzęgające są najprostszym i nośnikam i proto­
nów jakie dotychczas poznano [7], Nie wym agają energii
z hydrolizy ATP, nie prow adzą w spółtransportu oraz nie
działają na zasadzie w ym iennika jonowego. Kluczem do
uruchom ienia transportow ych właściwości UCPs jest A|iH+
w ewnętrznej błony mitochondrialnej, napędzający jednokie­
runkow y p rzepływ protonów . Aktywacja UCP, białkowego
rozprzęgacza łańcucha oddechow ego, jest zatem ściśle p o­
w iązana z pracą trzech pom p protonow ych tego łańcucha.
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
Działanie UCPs prow adzi do skrócenia (ang. short-circuit) obiegu protonów w procesie fosforylacji oksydacyjnej
w m itochondriach [10]. Aktywność syntazy ATP zależy od
ApTU w ytw orzonego w poprzek w ewnętrznej błony mito-
http://rcin.org.pl
181
a tym sam ym wyznacza rozm iar
potencjalnego efektu rozprzęga­
nia.
AKTYWACJA UCPs - ROLA
KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
Rozprzęgająca
aktyw ność
UCP1 oraz innych UCPs z p ew ­
nością w iąże się z transportem
protonów . Istnieją dość odm ienne
m odele opisujące przebieg tego
procesu, choć wszystkie zakładają
udział zjonizowanych FFA, które
są sw oistym i kofaktorami roz­
przęgania z udziałem UCPs.
M odel no śnik a H + (model
K lingenberga) zakłada, że rola
FFA sp ro w a d z a się do su b ­
stratow ej aktyw acji UCPs [12]
(Ryc. 3A). Sw oiste z ain stalo w a­
R ycina 3. P rop o n o w an e m od ele działania UCP. A — M odel K lingenberga — m odel nośnika pro to n ó w , z ak ład a tra n s­
nie się zjon izow anych FFA (ale
p o rt p ro to n ó w p o p rz e z w e w n ę trzn ą stru k tu rę UCP, dzięki specyficznem u o d d ziały w an iu z aniono w ym i form am i
w oln ych kw asów tłuszczow ych (FFA). B — M odel Skulacheva i G arlida zakłada tra n sp o rt FFA z u d z ia łem U C P z m a ­
nie stałe zw iązanie) w stru k tu rę
cierzy do p rzestrzeni m iedzybłonow ej m itochondriów . Przejście p ro to n ó w do m acierzy zależy w yłącznie o d zjaw iska
U CP skutkuje p o w sta n ie m p e ł­
flip-flop (przejścia w płaszczyźnie poprzecznej błony) u pro to now anej form y.
n ego szlaku tra n sp o rto w e g o dla
H +. Szlak ten tw o rz o n y jest p rzez
z jonizow ane g ru p y k arb o k sy lo ­
chondrialnej. Przy braku w olnego ADP (niefosforylujący,
w
e
p
ochod
zące
z
a
ró
w
n
o
od w p ro w a d z o n y c h w białko
spoczynkow y stan oddechowy), syntaza ATP nie zapew nia
FFA,
jak
i
od
bocznych
łań
cuchó
w a m in o k w a só w sam ego
pow rotnego transportu protonów do macierzy. Stan taki
U CP (Asp, Glu, His). K ażda z tych g ru p jest akceptorem
prow adzi do niebezpiecznej akumulacji H + w przestrzeni
i d o n o re m p ro to n ó w . Protonacja i d eprotonacja k ry tycz­
międzybłonowej. Zbyt w ysoki AgH+ m oże prom ow ać n a ­
n
ych g ru p uczestniczących w transporcie p ro to n ó w z a ­
silenie reakcji ubocznych pom iędzy łatwo reagującymi ze
leży
od AU7 i u m o żliw ia jedynie je d n o k ie ru n k o w y tra n s­
sobą cząsteczkami, jak np. semichinony i tlen cząsteczko­
p
o
rt
H +. W m o d elu ty m jony FFA, p o p rz e z dostarczenie
wy, pow odując nadm ierne pow staw anie ROS [11]. W takiej
d
o
d
a
tk
o w y ch g ru p karbok sylow y ch, u z u p ełn iają braki
sytuacji nieocenione staje się posiadanie awaryjnej ścieżki
reszt
d
o n o ro w o -a k c e p to ro w y ch dla H + w kryty cznych
konsumpcji AgH+, którą głównie stanowi aktywność UCPs.
pozycjach białka. Z ak ład a się rów nież, że FFA uczestn i­
Aktywność UCPs m oże ulegać zarów no pozytywnej, jak
czące w tran sp o rcie p ro to n ó w o d d ziału ją od stro ny cytoi negatywnej regulacji z udziałem kilku czynników. Do p o ­
solowej, co p o tw ie rd z a ją b a d a n ia z użyciem p o ch o d n y ch
zytyw nych regulatorów stymulujących proces rozprzęgania
k w asó w tłu szczo w y ch n iezd o ln y ch do p rzech o d zen ia
zaliczamy dostępność długołańcuchow ych w olnych kw a­
p rze z błonę [36],
sów tłuszczowych (FFA, ang. freefatty acids) w formie zjonizowanej. Przyjmuje się, że aktywacja transportu H +z u d zia­
Drugi propono w an y m odel (model Skulacheva i Garli­
łem UCP1 w iąże się z rekrutacją FFA przede w szystkim z
da) opiera się na cyklicznym obiegu FFA (ang.fatty acid-cycotaczające fazy lipidowej. Z fizjologicznego p u n k tu w id ze­
ling model) [13,14] (Ryc. 3B). Zgodnie z tym m odelem , FFA
nia w ym óg ten jest łatw y do spełnienia, gdyż często u rucha­
transportow ane są przez UCP do przestrzeni m iędzybłono­
m iane szlaki lipolityczne (zwłaszcza w BAT) dają wysokie
wej jako aniony i gdy tam ulegną uprotonow aniu, p o w ra ­
stężenia kw asów tłuszczowych (nawet do 20 mM). Z kolei
cają przez d w u w arstw ę lipidow ą do macierzy (flip-flop) w
nukleotydy pury n o w e (adeninow e i guaninowe) w ywołują
niezdysocjowanej formie. Pow rót do macierzy zneutralizo­
antagonistyczny efekt w stosunku do FFA i przyham ow ują
w anych (lipofilnych) kw asów nie zależy już od UCP, które
aktyw ność UCP. Obecny w m itochondriach ATP m oże więc
zapew nia jedynie jednokierunkow y transport anionów FFA
działać jako endogenny inhibitor UCP. A zatem przynajm ­
(do przestrzeni m iędzybłonowej) w trakcie ich w ahad łow e­
niej cztery czynniki w pływ ają na transport H + z udziałem
go przem ieszczania się. W rezultacie, ze w zględu na inną
UCP1: (i) stężenie ATP i innych nukleotydów purynow ych,
wartość p H w macierzy, kw asy tłuszczow e dysocjują, tym
(ii) dostępność FFA, (iii) AT7 oraz (iv) gradient protonow y
sam ym uwalniając protony. W m odelu tym UCP nie jest no ­
(ApH) m itochondriów [7], W artość p H środow iska jest w a ż­
śnikiem H +, lecz jedynie nośnikiem anionów FFA, które po
na ze w zględu na procesy protonacji i deprotonacji zm ie­
uprotonow aniu stanow ią faktyczny nośnik protonów . Dy­
niające zarów no właściwości aktyw atorów , inhibitorów, jak
fuzja poprzeczna uprotonow anych form FFA (na zasadzie
i specyficznych rejonów regulatorow ych białka. N atom iast
flip-flop) w p oprzek błony stanowi kluczow y element tego
wielkość AT7 m a istotnie znaczenie przy sprzężeniu trans­
m odelu [13].
portu elektronów w łańcuchu oddechow ym z syntezą ATP,
182
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
N iezależnie od m ech an izm u , oba p rz e d sta w io n e m o ­
dele zakładają, że d ziałanie UCP polega n a b u rz en iu
ApH+ w y tw o rz o n e g o p rz ez łańcuch o d d e ch o w y p o p rze z
zw ro tn e w p ro w a d z e n ie H + do m acierzy (ang. short-circuit). W obu m o d elach d ziałanie UCP p o z w ala n a regulację
procesu ro zp rz ę g a n ia w zależności od dostępności FFA,
któ re nie są na stałe z w ią z an e z UCP. Ich usun ięcie p o ­
zw ala n a szybki p o w ró t U CP do stan u inaktyw acji. Co
więcej, kw asy tłuszczow e oprócz o d g ry w a n ia roli ind uktora p rocesu ro z p rzę g a n ia (b ezpośredn ia aktyw acja UCP)
oraz głów nych su b stra tó w dla procesu term o g e n e zy (jako
su b straty (3-oksydacji), m ogą ró w n ie ż p o śre d n io aktyw ow a ekspresję genó w białek rozp rzęgający ch u zw ie rz ąt
[15].
IN AKTYWACJA UCPs - ROLA
NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH
W spólny m ianow nik dla obecnie znanych UCPs stanowi
swoiste oddziaływ anie z nukleotydam i purynow y m i (ade­
nino w ym i i guaninow ym i). A m inokw asy UCP1, które od ­
działują z nukleotydem są w pełni zachow ane w e w szyst­
kich znanych UCPs [5], O ddziaływ anie nukleotydów purynow ych p row adzi do zaham ow ania nośnikowej aktywności
UCP i m oże zajść wyłącznie od cytosolowej strony białka
[7], Efekt ham ow ania jest dodatkow o silnie zależny od p H
środowiska.
N ajw ydajniejszym i inhibitoram i są tri- i difosforany n u ­
kleotydów (NTP: GTP i ATP oraz NDP: GDP i ADP). Stan
całkow itego zjonizow ania g ru p fosforanow ych w N TP4" i
N D P 3" nadaje przew ag ę w h a m o w an iu UCP n a d form am i
N T P H 3" i N D P H 2" oraz tym i jeszcze bardziej zre d u k o w a ­
nymi. Białka rozprzęgające często w ykazują nieco większe
pow inow actw o do n u k leo ty d ó w guaninow ych niż ad e­
ninow ych. W artość p H w p ły w a rów nież na odblo kow a­
nie sam ego miejsca w iążącego nukleo ty d y p u ry n o w e w
białku, gdyż decyduje ona o w ybiórczym u p ro to n o w a n iu
p ew ny ch krytycznych am ino kw asów zaan gażow an ych
w przyjm ow anie n u k le o ty d u przez UCP. Do specyficznej
protonacji białka m u si dojść p rzed zw iązaniem nu k le­
o ty d u [7], Z p o w o d u w ysokiego po w in o w actw a UCP do
n u k leo ty d ó w p u ry n o w y c h oraz dużego stężenia n u k le ­
o ty d ó w w cytosolu w y d aw ało b y się, iż UCPs są w stanie
ciągłej inaktywacji. Jednakże w yłącznie stężenie w olnych
(zjonizowanych) A T P / ADP czy G T P /G D P jest istotne dla
procesu ham ow ania. W w a ru n k a ch fizjologicznych m oże
dojść do zniesienia w p ły w u ATP (i innych nukleotydów )
n a przykład z p o w o d u ich chelatacji jonam i M g2+ [5,7],
które jednocześnie pełnią funkcję kofaktorów w ielu en zy­
m ów . W p rz y p a d k u UCP1 p ro p o n o w a n y jest m echanizm
w sp ółzaw od nictw a m iędzy n u k leoty dam i p u ry n o w y m i
i FFA o miejsce regulatorow e na białku [16]. O znacza to,
że zw iększenie stężenia FFA m oże przezw yciężyć h a m o ­
w an ie aktyw ności UCP1 przez nukleotydy. W p rz y p a d k u
roślinnych, zw ierzęcych i w ystępujących u m ikroo rgani­
z m ó w eukariotycznych h om ologów UCP1 efektyw ność
h am ow ania aktyw ności tych UCPs przez nuk leo ty d y p u ­
ry now e m oże być m o d u lo w a n a przez stopień redukcji ko­
e nzym u Q w błonie m itochondrialnej [17],
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
TERMOGENEZA BRUNATNEJ TKANKI TŁUSZCZOWEJ
Term ogenina (UCP1) ulega intensywnej syntezie w BAT.
Przeciek protonów z udziałem UCP1 silnie rozprasza AgH+,
co znacznie redukuje liczbę p rotonów przechodzących
przez syntazę ATP. Procesowi tem u tow arzyszy szybkie
tem po oddychania (zużycie tlenu), niezw iązane z syntezą
ATP. W ten sposób UCP1 rozprzęga utlenianie substratów
w łańcuchu oddechow ym i fosforylację ADP do ATP, a ener­
gia A(iH+ jest rozpraszana i uw alniana jedynie jako ciepło
(produkt uboczny). Prow adzi to do term ogenzy (wzrostu
tem peratury) BAT, która tym sam ym reguluje tzw. ad ap ta­
cyjną bezdrżeniow ą term ogenezę (ang. nonshivering thermogenesis). Zjawisko to występuje u now orodków , drobnych
ssaków (zwłaszcza gryzoni) oraz u ssaków hibernujących
i przystosow anych do chłodnego klim atu [18], A zatem
UCP1 m oże stanowić swoiste narzędzie sam oobrony sporej
grupy ssaków przed stresem niskiej tem peratury.
W ielu b adaczy u w aża, że jedyn ie UCP1 jest „ p ra w d z i­
w y m " białkiem rozprzęgającym . Tylko aktyw ność UCP1
w BAT m oże bo w iem p ro w ad zić do zjaw iska bezdrżeniowej term ogenezy , czyli produk cji ciepła zw iązanej ze
w z ro stem te m p e ra tu ry tkanki lub całego ciała, w której
procesy od d e ch o w e nie są sp rzę ż o n e z procesam i fos­
forylacji oksydacyjnej. W zrost te m p e ra tu ry na poziom e
całego ciała (ang. whole body thermogenesis) jest skutkiem
su m aryczneg o ro z p rz ę g a n ia o d d y c h a n ia m ito c h o n d ria l­
nego BAT z u d z ia łe m UCP1, które m oże stanow ić n a w et
do 8% puli białek m ito c h o n d ria ln y ch tej tkanki [15,19], Z
kolei białka m ito ch o n d rialn e re p rez e n tu ją aż około 50%
w szy stkich białek BAT. W e w n ę trz n ą błonę m ito ch o n ­
drió w a d ip o c y tó w BAT, oprócz olbrzym iej koncentracji
UCP1, ch arakteryzuje b a rd z o niski p o zio m sy n tazy ATP.
W k o m órkach tych z łatw ością m oże d ochodzić do a k ­
tyw acji ro z p rzę g a n ia o d d y ch an ia m itoch ondrialneg o
(aktywacji UCP1) kw asam i tłuszczow ym i u w a ln ia n y ­
mi z w e w n ą trz k o m ó rk o w y c h zap a só w triacylogliceroli
[20]. B runatną tk ankę tłuszczow ą bez p o śre d n io u n erw ia
w sp ó łczu ln y system nerw ow y. W o d p o w ied zi n a zim no
doch o d zi do aktyw acji w cy to plazm ie zależnej od cAM P
lipolizy w sk u te k stym ulacji recep to ra (3-adrenergicznego
p rzez n o rad ren alin ę. U w olnione k w asy tłuszczow e nie
tylko a ktyw ują UCP1, ale także są g łów ny m i su b stratam i
napędzającym i proces term ogenezy. W m ito ch o n d riach
kw asy tłuszczow e zasilają proces p-oksydacji, który z ko­
lei n a p ę d z a tra n sp o rt elek tro n ó w w łańcu chu o d d e c h o ­
w y m m ito ch o n d rió w p o p rz e z dostarczanie siły re d u k ­
cyjnej (FADH2 i N A D H ). E nergia w y tw o rz o n e g o p rzez
łańcuch ApH+ jest ro z p ra sz a n a (zam ieniana w ciepło) w
w y n ik u aktyw acji UCP1.
W oparciu o najnow sze badania nie m ożem y już pow ie­
dzieć, że UCP1 jest wyłącznie specyficzne dla BAT. UCP1
w ykryto np. w podłużnych w arstw ach mięśni gładkich
przew o d u pokarm ow ego, czy macicy, gdzie p ra w d o p o ­
dobnie pełni funkcję przy rozluźnianiu skurczu [5], UCP1
znaleziono rów nież w szczurzej i mysiej grasicy, która, p o ­
dobnie jak BAT, zanika w trakcie ontogenezy [21], Jednak­
że naturalnie wysoki poziom syntezy UCP1 in vivo dotyczy
nadal wyłącznie BAT.
http://rcin.org.pl
183
HOMOLOGI UCP1W MITOCHONDRIACH ZWIERZĄT
Pierw szych obserwacji wskazujących na istnienie UCP1
w m itochondriach BAT ssaków dokonano pon ad 30 lat
temu. Przez długi czas UCP1 było uw ażane za unikalny
element radiacji adaptacyjnej ssaków, odpow iedzialny za
bezdrżeniow ą termogenezę. Jednakże identyfikacja tzw.
„now ych" UCPs rozpoczęła zupełnie no w ą erę b ad a ń bio­
energetycznych [22], Ssaki m ogą syntetyzow ać aż pięć róż­
nych izoform UCPs (UCP1 do UCP5), choć stopień p o d o ­
bieństw a sekwencji aminokwasowej „nowych" UCPs do
„pierw otnego" UCP1 nie przekracza 60%. W przeciw ień­
stwie do UCP1, jego homologi występują w m itochondriach
wielu tkanek innych niż BAT, a poza tym ich synteza nig­
dy nie osiąga tak wysokiego poziom u jak UCP1 (tj. naw et
do 8% puli białek m itochondrium ) [23]. Dlatego też udział
UCP1 oraz jego hom ologów w kontrolow anym przecieku
protonów w m itochondriach ssaków m oże znacznie się róż­
nić. D odatkowo, stabilność poszczególnych izoform UCPs
rów nież jest odm ienna [24]. Bardzo niestabilne jest UCP2,
którego czas połowicznego ro zp ad u w ynosi około 30 min.
To znacznie mniej w porów naniu z UCP1 (30h). Różnica ta
m oże uw ydatniać odm ienną fizjologiczną rolę hom ologów
UCP1 w m itochondriach zwierząt.
Najpospoliciej w ystępującą izoformą jest UCP2, które
zidentyfikow ano m. in. w śledzionie, grasicy, kom órkach
(3 trzustki, sercu, płucach, białej i brunatnej tkance tłusz­
czowej, żołądku, jądrach i m akrofagach oraz w mniejszych
ilościach w m ózgu, nerkach, wątrobie i m ięśniach [15,25].
Zauw ażono, że w p rz y p ad k u tej izoformy ilość syntetyzo­
w anego m RN A w danej tkance nie jest proporcjonalna do
ilości funkcjonalnego białka w błonie [5]. Obecnie aktyw ­
ność UCP2 głównie w iąże się z regulacją poziom u p ro d u k ­
cji ROS p rzez m itochondria.
Synteza UCP3 ogranicza się do mięśni szkieletowych,
mięśnia sercowego oraz BAT [15]. Ilość UCP3 jest 200-700
razy mniejsza w m itochondriach mięśni szkieletowych czy
BAT w porów naniu z poziom em UCP1 w m itochondriach
adipocytów BAT [26]. Przypuszcza się, że UCP3 jest głów ­
nie zaangażow ane w m etabolizm tłuszczów.
Odkrycie UCP4 i UCP5 w niosło jeszcze więcej niew iado­
m ych na polu bad ań UCPs, zw ażyw szy na ich niewielkie
podobieństw o do UCP1, sięgające zaledw ie 30% identycz­
ności sekwencji am inokw asowej [5]. Największą ekspre­
sję genów ucp4 i ucp5 zaobserw ow ano w m ózgu, choć d o ­
tychczas nie ustalono dokładnej roli tych białek w różnych
tkankach m ózgu. Przez analogię m ożem y przypuszczać, iż
UCP4 i UCP5 rów nież w pływ ają na wydajność syntezy ATP
w m itochondriach kom órek nerwow ych.
Dysproporcja pom iędzy poziom em syntezy UCP1 w BAT
oraz jego hom ologów w pozostałych tkankach zw ierzęcych
m oże być odzwierciedleniem wielofunkcyjności UCPs ssa­
ków, u której pod staw leży w spółw ystępow anie w jednym
organizmie aż pięciu różnych reprezentantów tej podrodziny m itochondrialnych białek nośnikowych. Działanie „no­
wych" UCPs (homologów UCP1) nie w iąże się z adaptacyj­
ną term ogenezą w odpow iedzi na bodziec tem peraturow y.
Poziom ekspresji ich genów jest bow iem stanowczo za mały
184
i w yklucza taką funkcję w norm alnych
gicznych. Aczkolwiek postuluje się, że
poziom syntezy hom ologów UCP1 jest
regulacji wielu procesów zw iązanych z
w tym ludzi [5,26].
w arunkach fizjolo­
fizjologicznie niski
bardzo istotny dla
kondycją zwierząt,
UCPs W MITOCHONDRIACH ROŚLIN I
MIKROORGANIZMÓW EUKARIOTYCZNYCH
UCPs stanowią, obok niewrażliwej na cyjanek oksydazy
alternatywnej i dodatkow ych nie uczestniczących w tran s­
porcie protonów dehydrogenaz NAD(P)H, systemy ro zpra­
szające energię obecne w m itochondriach roślin i niektórych
m ikroorganizm ów eukariotycznych. Równoczesne w ystę­
pow anie UCP i oksydazy alternatyw nej w ykazano w m ito­
chondriach w szystkich badanych dotąd roślin wyższych, w
m itochondriach takich m ikroorganizm ów , jak niefotosyntetyzująca am eba Acanthamoeba, niefermentujące patogenne
drożdże Candida, grzyby Aspergillus, pasożytnicze pierw ot­
niaki Plasmodium oraz u m ycetazoa Dictyosteliiim discoideum,
wykazującego prym ityw ną wielokom órkow ość i różnico­
w anie kom órkow e [2,7,9], UCPs roślin i m ikroorganizm ów
eukariotycznych przypom inają działaniem homologi UCP1
m itochondriów zwierząt, pozwalając na zw rotny transport
H + do macierzy mitochondrialnej, w którym uczestniczą
FFA. Fizjologiczna rola tych białek jest nadal przedm iotem
dyskusji. Stwierdzono, że obniżają one produkcję ROS w
m itochondriach, co sugeruje ich udział w m echanizm ach
obronnych tow arzyszących stresowi tlenow em u w kom ór­
ce. Ponadto, poniew aż w szystkie UCPs m ogą w pływ ać na
wydajność fosforylacji oksydacyjnej w m itochondriach po­
przez rozprzęganie transportu elektronów i syntezy ATP,
białka te m uszą odgryw ać istotną rolę w utrzym yw aniu
rów now agi energetycznej i metabolicznej komórki.
UCPs JAKO SYSTEMY ANTY OKSYDACYJNE;
AKTYWACJA UCPs PRZEZ ROS
Spośród poznanych UCPs ssaków, najwięcej danych
świadczących o ich udziale w m echanizm ach obronnych
przed stresem oksydacyjnym dotyczy UCP2 i UCP3. Pierw ­
szych w skazów ek dostarczyły badania ukazujące zw iększo­
ną produkcję H 20 2 w izolow anych m itochondriach ssaków
w w arun kach ham ow ania aktywności UCP2 przez GDP
[16,27]. Założono więc, że zwiększone rozprzężenie m ito­
chondriów w w arunkach stresu oksydacyjnego stanowi
odzw ierciedlenie m echanizm u negatyw nego sprzężenia
zw rotnego [28] (Ryc. 4). UCPs są aktyw ow ane produktam i
stresu oksydacyjnego (np. zw iązkam i pow stałym i w skutek
peroksydacji lipidów), co prow adzi do łagodnego rozprzęgania (ang. mild uncoupling) oddychania m itochondriów,
które z kolei zmniejsza generację ROS. Działanie UCPs
zw iązane jest bow iem ze zmniejszoną redukcją nośników
elektronów m itochondrialnego łańcucha oddechowego,
czemu tow arzyszy obniżenie pow staw ania ROS. Dzięki
tem u m itochondria, które mają tendencję do hiperpolaryzow ania swojej błony w ew nętrznej, uw alniają mniej szkodli­
w ych ROS [29]. Istnieje bow iem ścisła zależność pom iędzy
wartością m itochondrialnego AT1 a ilością powstających
ROS. N aw et niewielki spadek AT1 (o 10 mV) m oże h am o­
wać w ytw arzanie H 20 2 do 70% [5,30]. Dlatego też, pier­
wotnej funkcji UCPs być m oże należy doszukiw ać się w
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
induk ow anym łagodnym rozprzęganiu m itochondriów ,
przeciwdziałającym oksydacyjnym zniszczeniom, kosztem
niewielkiej utraty energii [31].
Pojęcie łagodnego rozprzęgania (częściowego rozprzęgania) z udziałem UCPs wiąże się zatem z subtelnym obniża­
niem wartości AT*, zmniejszającym praw dopodobieństw o
w ystąpienia stresu oksydacyjnego. Ten sposób obniżania
AT* nie jest term ogenny, nie prow adzi do zw iększenia tem ­
peratu ry organizm u, lecz stanow i swoisty, samoregulujący
się przeciwutleniający system ochrony kom órki [32]. Za
ochronnym efektem łagodnego rozprzęgania z udziałem
UCPs przem aw ia rów nież kardioprotekcyjny i neuroprotekcyjny efekt działania m itochondrialnych rozprzęgaczy
[33].
A nionorodnik ponadtlenkow y m oże aktyw ow ać UCPs
od w ewnętrznej strony (macierzy) błony mitochondrialnej
[34]. Obserwacja ta jest istotna przy rozw ażaniu fizjologicz­
nej funkcji hom ologów UCP1. Założono, że fizjologicznie
niski poziom hom ologów UCP1 w m itochondriach może
uczestniczyć w oczyszczaniu w ew nętrznego listka w e­
wnętrznej błony mitochondrialnej z utlenionych form nie­
nasyconych kw asów tłuszczowych, będących prod uktam i
peroksydacji (tworzenia grup nadtlenkow ych) (LOOH, ang.
lipid peroxide) [35]. Stężenie LOOH jest stosunkow o małe,
dlatego też związki te m ogą być docelowym i substratam i
pew nych izoform UCPs. P rodukty peroksydacji kw asów
tłuszczowych po przejściu przez błonę (w oparciu o jeden z
modeli działania UCPs, ryc. 3B) są pozbaw ione możliwości
łatwego pow rotu do macierzy na drodze flip-flop. O grani­
czeniem staje się zm iana chemicznego charakteru cząstecz­
ki na niekorzyść hydrofobowości. Potw ierdzają to wyniki
badań z pochodnym i kw asów tłuszczowych, które poza
grupą karboksylow ą posiadają resztę hydroksylow ą [36], Z
biologicznego p u n k tu w idzenia większe stężenie LOOH w
zew nętrznym listku w ew nętrznej błony mitochondrialnej
jest korzystniejsze [35]. Ma to zw iązek z odm iennym skła­
dem m acierzy mitochondrialnej i przestrzeni międzybłonowej. Macierz zaw iera DNA, liczne mRNA oraz np. enzym y
cyklu Krebsa, w śród nich akonitazę, która jest jednym z
najbardziej w rażliw ych na ROS białek w komórce. Znacze­
nie obrony macierzy przed w olnym i rodnikam i wydaje się
szczególnie w ażne ze w zględu na odw rotną zależność po­
m iędzy długością życia ssaków a stopniem utlenienia m tD ­
NA [35],
Powiązanie m iędzy ROS, prod uktam i peroksydacji lipi­
dów oraz aktyw nością UCPs udow odniono, stosując zw iąz­
ki w ytwarzające wolne rodniki oraz przeciwutleniacze.
Zw iązkiem w ydajnie przenikającym do macierzy o właści­
wościach „w ym iatacza" w olnych rodników , jest mitoPBN
[37]. MitoPBN to syntetyczny przeciw utleniacz fenylobutylnitron (PBN), kowalencyjnie połączony z lipofilnym ka­
tionem trifenylofosfoniowym. Postuluje się, że związek ten
bardzo skutecznie zapobiega aktywacji UCPs przez ROS,
gdyż ham uje łańcuch przekształceń wolnorodnikow ych,
prow adzących do w ytw orzenia np. 4-hydroksy-2-nonenalu (HNE) — cząsteczki
sygnałowej aktywującej
UCPs [31], MitoPBN nie
reaguje z anionorodnikiem ponadtlenkow ym
oraz końcow ym i p ro­
duktam i peroksydacji
lipidów. Dlatego też
produkty
pośrednie
procesu
peroksydacji
lipidów m ogą stano­
wić jedynie w aru nek
w stępny dla aktywacji
UCPs. Dla m itochon­
driów zw ierząt (oprócz
m itochondriów BAT z
UCP1) oraz m itochon­
driów roślin z a pro po­
now ano m odel wiążący
aktywację UCPs przez
ROS z funkcją UCPs,
jako system ów przeciwutleniających [5,31,38]
(Ryc. 4). W m odelu tym
w olne rodniki tlenowe
R ycina 4. M odel aktyw acji U C P p rz e z re aktyw ne form y tlenu, które inicjują peroksydację (tw orzenie g ru p nadtlenkow ych) k w asów
pełnią funkcję sygnału
tłuszczow ych lipidów . W m itochon driach an io n o ro d n ik po n a d tle n k o w y (O,*-) oraz ro d n ik h yd ro p e ro k sy lo w y (HO,*-) pow stają
aktywującego UCP, co
najczęściej w sk u tek „w ycieku" elektro nów z łańcucha oddechow ego. O becna w m acierzy m an g an o w a d y sm u ta za ponadtlenko w a (MnSOD) neutralizuje w iększość O ,'-, przekształcając ten ro d n ik w n a d tle n ek w o d o ru (H20 2). Część 0 2*~ u szk ad za enzym y
prow adzi do obniżenia
zaw ierające centra Fe-S, np. b ard zo w ra ż liw ą n a O ,-' akonitazę, przyczyniając się do uw alniania jo nów żelaza (Fe2+). Jony Fe2+
produkcji ROS. W m i­
katalizują p rodukcję ro d n ik a hy drok sy lo w eg o (’O H ) z H 20 2w reakcji Fentona. R odniki ‘O H i H O z
reagując z acylow ym i łań­
tochondriach, w w a ru n ­
cucham i w ielonienasyconych k w asów tłuszczow y ch (składników fosfolipidów błonow ych), zapo czątkow u ją proces peroksydacji
lipidów . Złożona m ieszan ina końcow ych p ro d u k tó w peroksydacji lipidów , obejm uje głow nie reaktyw n e alkeny w tym kluczow y 4kach w ysokiego ApH+,
hy droksy-2-nonenal (HNE). H N E, aktyw ując UCP, zw ięk sza przep uszczaln ość w ew nętrznej błony m itochondrialnej dla protonów .
dochodzi do w y tw a­
In d u k o w a n e p rzez ROS, łag odne ro z p rzęganie z u d z ia łem U C P stan ow i p o d staw ę no w o poznanej ścieżki regulującej uw alnianie
rzania
anionorodnika
w olnych ro d n ik ó w w m itochondriach.
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
185
ponadtlenkow ego i innych ROS. Po w ew nętrznej stronie
w ew nętrznej błony mitochondrialnej anionorodnik ponadtlenkow y uw alnia jony Fe2+ z białek zawierających centra
Fe-S (np. akonitazy). Jony Fe2+ reagują z H 20 2, tworząc ro d ­
nik hydroksylow y, rozpoczynający łańcuch przekształceń
wolnych rodników , który inicjuje peroksydację lipidów
błonowych. Tw orzony jest H N E i inne alkenowe pochodne
kw asów tłuszczowych. H N E aktyw uje UCP, co prow adzi
do obniżenia ApH+ i w konsekwencji do spadku uw alnia­
nia ROS przez mitochondria. M echanizm ten zapobiega
pogłębianiu się zniszczeń w yw ołanych przez stres oksyda­
cyjny. Ceną którą m itochondria „płacą" za taki ochronny
m echanizm redukujący poziom ROS, jest mniejsza w ydaj­
ność fosforylacji oksydacyjnej. Jednakże do tej pory nie m a
pełnej zgodności, co do faktycznego zaangażow ania UCPs
w odpow iedź na stres oksydacyjny i urucham iania lokalnej
ścieżki zwrotnej (ang. feedback), prowadzącej do tłum ienia
pow staw ania ROS. Jak dotąd brak także informacji na tem at
aktywacji UCPs przez ROS w m itochondriach organizm ów
jednokom órkowych.
9. Vercesi AE, Borecky J, Maia I, A rruda P, Cuccovia IM, Chaim ovich H
(2006) Plant uncoupling m itochondrial proteins. A nnu Rev Plant Biol
57, 383-404
10. W acker M, W anek P, Eder E (2001) Detection of l,N 2-propanodeoxyguanosine adducts of trana-4-hydroxy-2-nonenal after gavage of
trana-4-hydroxy~2-nonenal or induction of lipid peroxidation w ith
carbon tetrachloride in F344 rats. C hem Biol Interact 137: 269-283
11. K orshunov SS, Skulachev VP, Starkov AA (1997) H igh protonic poten­
tial actuates a m echanism of production of reactive oxygen species in
m itochondria. FEBS Lett 416:15-18
12. Klingenberg M (1990) M echanism and evolution of the uncoupling
protein of brow n adipose tissue. T rends Biochem Sei 15:108-112
13. Skulachev VP (1991) Fatty acid circuit as a physiological m echanism of
uncoupling of oxidative phosphorylation. FEBS Lett 264:246-248
14. G arlid KD, Orosz DE, M odriansky M, Vassanelli S, Jezek P (1996) O n
the m echanism of fatty acid-induced proton transport by m itochon­
drial uncoupling protein. J Biol Chem 271: 2615-2620
15. Villarroya F, Iglesias R, Giralt M (2007) PPARs in the control of uncou­
pling proteins gene expression. PPAR Res 74364
16. C annon B, Shabalina IG, K ram arova TV, Petrovic N, N edergaard J
(2006) U ncoupling proteins: a role in protection against reactive oxy­
gen species - or not? Biochim Biophys Acta 1757:449-458
PODSUMOWANIE
Przełom XX i XXI w ieku to okres odkryć kolejnych hom ologów UCP1. Identyfikacja UCPs we w szystkich w a ż­
niejszych grupach eukariontów : u roślin wyższych, niektó­
rych bezkręgowców, pierw otniaków , grzybów i w wielu
nieterm ogennych tkankach ssaków sugeruje, że przeciwnie
do UCP1 BAT ssaków, spełniają one inne funkcje niż p ro d u ­
kow anie ciepła poprzez zw iększanie oddychania m itochon­
drialnego. Jedną z nich m oże być obniżanie produkcji ROS
w m itochondriach, a więc ochrona kom órki przed stresem
oksydacyjnym. Z badanie regulacji aktywności poszczegól­
nych hom ologów UCP1 u różnych organizm ów , w różnych
tkankach czy organach roślin i zw ierząt pom oże wyjaśnić
nadal niejasną funkcję fizjologiczną spełnianą przez te biał­
ka. Rosnące zainteresow anie m itochondrialnym i UCPs
zw iązane jest z efektem ich działania na poziom ie kom ór­
kow ym , tj. regulacją poziom u ATP, rów now agi oksydoredukcyjnej czy stresu oksydacyjnego. Z drugiej strony zabu­
rzenia w funkcjonow aniu UCPs m ogą przyczyniać się do
wielu stanów patologicznych u zwierząt.
PIŚMIENNICTWO
1. Jarmuszkiewicz W (2001) Uncoupling proteins in mitochondria of
plants and some microorganisms. Acta Biochim Polon 48:145-155
2. Sluse FE, Jarmuszkiewicz W (2002) Uncoupling proteins outside the
animal and plant kingdoms: functional and evolutionary aspects.
FEBS Let 510:117-120
3. Skulachev VP (1998) Uncoupling: new approaches to an old problem
of bioenergetics. Biochim Biophys Acta 1363:100-124
4. Czarna M, Jarmuszkiewicz W (2006) Rola mitochondriów w wytwa­
rzaniu i usuwaniu reaktywnych form tlenu; związek z przesyłaniem
sygnałów i programowaną śmiercią komórki. Postępy Biochem 2:145156
5. Echtay KS (2007) Mitochondrial uncoupling proteins-What is their
physiological role? Free Rad Biol Med 43:1351-1371
6. Ricquier D, Bouillaud F (2000) The uncoupling protein homologes:
UCP1, UCP2, UCP3, StUCP and AtUCP. Biochem J 345:161-179
7. Klingenberg M, H uang SG (1999) Structure and function of the uncou­
pling protein from brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta 1415:
271-296
186
8. Ledesm a A, Garcia de Lacoba M, Rial E (2002) The m itochondrial u n ­
coupling proteins. G enom e Biol 12: 3015.1-3015.9
17. Sluse FE, Jarm uszkiew icz W, N avet R, D ouette P, Ma thy G, Sluse-Goffart CM (2006) M itochondrial UCPs: new insights into regulation and
impact. Biochim Biophys Acta 1757: 480-485
18. Cannon B, N edergaard J (2004) Brown adipose tissue: function and
physiological significance. Physiol Rev 84: 277-359
19. M ozo J, Emre Y, Bouillaud F, Ricquier D, Criscuolo F (2005) Therm o­
genesis: W hat role for UCPs in m am m als and birds? Biosci Rep 3/4:
227-249
20. K lingenberg M, Echtay KS (2001) U ncoupling protein: the issues from
a biochem ist point of view. Biochim Biophys Acta 1504:128-143
21. Carroll AM, H ainess LR, Pearson TW, Fallon PG, W alsh CM, Brennan
CM, Breen EP, Porter RK (2005) Identification of a functioning m ito­
chondrial uncoupling protein 1 in thym us. J Biol Chem 280: 1553415543
22. H arper ME, Gerritis MF (2004) M itochondrial uncoupling proteins as
potential targets for pharm acological agents. C urrent O pinion in Phar­
macology 4: 603-607
23. Pecqueur C, A lves-Guerra MC, Geliy C, Levi-M eyrueis C, C ouplan E,
Collins S, Ricquier D, Bouillaud F, M iroux B (2001) U ncoupling prote­
in 2, in vivo distribution, induction u p o n oxidative stress, and evidence
for translational regulation. J Biol Chem 276: 8705-8712
24. Rousset S, M ozo J, D ujardin G, Emre Y, M asscheleyn S, Ricquier D,
Cassard-Doulcier AM (2007) UCP2 is a m itochondrial transporter w ith
an unusual very short half-life. FEBS Lett 581: 479-482
25. N edergaard J, Cannon B (2003) The 'novel' 'uncoupling' proteins
UCP2 and UCP3: w h at do they really do? Pros and cons for suggested
functions. Exp Physiol 88: 65-84
26. Bezaire V, Seifert EL, H arper ME (2007) U ncoupling protein-3: clues in
an ongoing m itochondrial mystery. FASEB J 2: 312-342
27. Negre-Salvayre A, H irtz C, Carrera G, Cazenave R, Troly M, Salvayre
R, Penicaud L, Casteilla L (1997) A role for uncoupling protein-2 as a
regulator of m itochondrial hydrogen peroxide generation. FASEB J 11:
809-815
28. Echtay KS, Roussel D, St Pierre J, Jekabsons MB, Cadenas S, Stuart JA,
H arper JA, Roebuck SJ, M orrison A, Pickering S, C lapham JC, Brand
MD (2002) Superoxide activates m itochondrial uncoupling proteins.
N ature 415: 96-99
29. W iederkehr A, W ollheim CB (2006) M inireview: Im plication of m i­
tochondria in insulin secretion and action. Endocrinology 147: 26432649
30. Votyakova TV, Reynolds IJ (2001) D eltaPsi(m )-Dependent and -inde­
pendent production of reactive oxygen species by rat brain m itochon­
dria. J N eurochem 79:266-277
http://rcin.org.pl
w w w .po step yb iochem ii.pi
31. Brand MD, Affourtit C, Esteves TC, G reen K, Lam bert AJ, M iwa S,
Pakay JL, Parker N (2004) M itochondrial Superoxide: production, bio­
logical effects and activation of uncoupling proteins. Free Radie Biol
M ed 37: 755-767
32. Skulachev VP (1997) M em brane-linked system s preventing superoxi­
de formation. Biosci Rep 17: 347-366
33. McLeod C, Aziz A, H oyt RF Jr, McCoy JP Jr, Sack M N (2005) Unco­
upling proteins 2 and 3 function in concert to augm ent tolerance to
cardiac ischemia. J Biol Chem 39: 33470-33476
34. Echtay KS, M urphy MP, Smith RA, Talbot DA, Brand MD (2002) Su­
peroxide activates m itochondrial uncoupling protein 2 from the m a­
trix side. Studies using targeted antioxidants. J Biol C hem 277: 4712947135
35. Goglia F, Skulachev VP (2003) A function for novel uncoupling prote­
ins: antioxidant defense of m itochondrial m atrix by translocating fatty
acid peroxides from the inner to the outer m em brane leaflet. FASEB J
17:1585-1591
36. W ojtczak L, W ięckowski MR, Schönfeld P (1998) Protonophoric acti­
vity of fatty acid analog and derivatives in the inner m itochondrial
m em brane: a further argum ent for the fatty acid cycling model. Arch
Biochem Biophys 357: 76-84
37. M urphy MP, Echtay KS, Blaikie FH, A sin-Cayuela J, Cocheme HM,
Green K, Buckingham JA, Taylor ER, H urrell F, H ughes G, M iwa S,
Cooper CE, Svistunenko DA, Sm ith RA, Brand MD (2003) Superoxide
activates uncoupling proteins by generating carbon-centered radicals
and initiating lipid peroxidation: studies using a m itochondria-targeted spin trap derived from a-phenyl-N -tert-butylnitrone. J Biol Chem
278: 48534-48545
38. Smith AM, Ratcliffe RG, Sweetlove LJ (2004) Activation and func­
tion of m itochondrial uncoupling proteins in plants. J Biol Chem 279:
51944-51952
Mitochondrial uncoupling proteins: regulation and physiological role
Wieslawa Jarmuszkiewicz J, Andrzej Woyda-Ploszczyca
Institute of M olecular Biology an d Biotechnology, Faculty of Biology, M ickiewicz U niversity, 89 U m ultow ska St., 61-614 Poznan, Poland
e-mail: w iesiaj@ am u.adu.pl
Key words: m itochondria, u ncoupling proteins, reactive oxygen species, lipid peroxidation
ABSTRACT
U ncoupling proteins (UCPs), members of mitochondrial carrier family, are present in mitochondrial inner membrane and mediate free fatty
acid-activated, purine-nucleotide-inhibited H + re-uptake. UCPs can modulate the tightness of coupling betw een mitochondrial respiration
and ATP synthesis. A physiological function of the first described UCP, UCP1 or termogenin, present in mitochondria of mammalian brown
adipose tissues is w e ll established. UCP1 plays a role in nonshivering therm ogenesis in mammals. The widespread presence of UCPs in
eukaryotes, in non-thermogenic tissues of animals, plants and in unicellular organisms im plies that these proteins may elicit other functions
than thermogenesis. H owever, the physiological functions of UCP1 hom ologues are still under debate. They can regulate energy m etabolism
through m odulation of the electrochemical proton gradient and production of ROS. Functional activation of UCPs is proposed to decrease
ROS production. Moreover, products of lipid peroxidation can activate UCPs and promote feedback down-regulation of mitochondrial ROS
production.
P ostępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
187
Udział białek rozprzęgających w modulacji funkcji
mitochondriów — perspektywy terapeutyczne
STRESZCZENIE
Andrzej Woyda-Płoszczyca
Wiesława Jarmuszkiewicz
Insty tu t Biologii M olekularnej i Biotechnolo­
gii, U niw ersytet im. A dam a M ickiewicza w
Poznaniu
Z akład Bioenergetyki, Insty tu t Biologii
M olekularnej i Biotechnologii, U niw ersytet im.
A dam a M ickiewicza, ul. U m ultow ska 89, 61614 Poznań; tel. (061) 828 5881, e-mail: wiesiaj®
am u.adu.pl
A rtykuł otrzym ano 28 kw ietnia 2008 r.
A rtykuł zaakceptow ano 3 m aja 2008 r.
Słowa kluczowe: białka rozprzęgające, reak­
tyw ne form y tlenu, otyłość, cukrzyca ty p u 2,
onkogeneza, u szkodzenia niedokrw ienno-reperfuzyjne, neurodegeneracja
W ykaz skrótów: BAT (ang. brown adipose tissue)
— b ru n a tn a tkanka tłuszczow a; koenzym A —
CoA; FFA (ang. free fa tty acids) — w olne kw asy
tłuszczow e; LDL — lipoproteina o malej gęsto­
ści; LMF (ang. lipid mobilising factor) — czynnik
m obilizujący lipidy; NF-kB (ang. nuclear factor
kappaB) — jądrow y czynnik transkrypcyjny kB;
P G C -la (ang. peroxisome proliferator-activated
receptor coactivator-la) — k oaktyw ator recepto­
ra PRAR; PPAR (ang. peroxisome proliferator-ac­
tivated receptor) — receptor aktyw ow any przez
proliferatory peroksysom ów ; pRB (ang. retino­
blastoma protein) — białko retinoblastom y; ROS
(ang. reactive oxygen species) — reaktyw ne for­
m y tlenu; TZD (ang. thiazolidinedione) — leki
z g ru p y tiazolidinedionów ; UCP(s) (ang. un­
coupling protein(s)) — białko(a) rozprzęgające;
W AT (ang. white adipose tissue) — biała tkan­
ka tłuszczow a; ApH+ — p ro tonow y gradient
elektrochem iczny; A T — elektryczny potencjał
błonow y m itochondriów
Podziękowanie:
Przygotow anie
artykułu
zostało dofinansow ane ze środków b u d ż eto ­
w ych na naukę (projekt badaw czy n r 33 8 2 /B /
P 0 1 /2007/33)
ziałanie białek rozprzęgających (UCPs), m itochondrialnych system ów rozpraszających
energię, m oże mieć istotny w p ły w na funkcjonow anie komórek, tkanek, narządów
i całych organizm ów ssaków. Regulacja aktywności UCPs m oże okazać się w przyszłości
kluczow ym celem działania terapeutycznego w w ielu zaburzeniach funkcjonowania orga­
nizm u ludzkiego. Dotyczyć to m oże na przykład zaburzeń gospodarki tłuszczowej, otyłości,
cukrzycy typu 2, procesu starzenia się, a naw et chorób neurodegeneracyjnych i zmian n o w o ­
tworowych. Ponieważ fizjologiczna rola UCPs (poza UCP1, białkiem brunatnej tkanki tłusz­
czowej) nie jest w p ełni poznana, zbadanie m echanizm ów regulacji aktywności h om ologów
UCP1 (UCP2-5) na poziom ie molekularnym w różnych tkankach i narządach jest ważnym
w yzw aniem . Ma to istotne znaczenie dla zrozum ienia fizjologii m itochondriów zwierząt
oraz patofizjologii związanych z zaburzeniami działania UCPs. Informacje te przyczynią się
także do stworzenia bazy dla wykorzystania UCPs w klinice.
D
WPROWADZENIE
M itochondria zajmują specjalną pozycję w świecie Eucaryota. O prócz pełnienia
funkcji „elektrowni" dostarczających kom órce cząsteczek ATP, m itochondria są
także w ażnym miejscem przebiegu szlaków metabolicznych, co istotnie w pływ a
na utrzym yw anie hom eostazy komórkowej. Ponadto, m itochondria w komórce
stanow ią główne źródło reaktyw nych form tlenu (ROS) i m ogą być istotnym
czynnikiem urucham iającym m echanizm fizjologicznej śmierci kom órki [1]. Dla­
tego też m itochondria m ogą być przyczyną wielu stanów patologicznych, tak
różnych jak now otw ory, cukrzyca, otyłość, uszkodzenia niedokrw ienno-reperfuzyjne, zaburzenia neurodegeneracyjne (choroby A lzheim era i Parkinsona), a
także m ogą w pływ ać na proces starzenia się [2].
Białka rozprzęgające (UCPs, ang. uncoupling proteins), będące białkami w e­
wnętrznej błony mitochondrialnej, rozprzęgają oddychanie mitochondriów, bu­
rząc protonow y gradient elektrochemiczny (ApH+) w ytw orzony przez łańcuch
oddechowy mitochondriów. UCPs są aktyw ow ane przez niezestryfikowane (wol­
ne) kw asy tłuszczowe (FFA, ang.freefatty acids), a ich allosterycznymi inhibitora­
mi są nukleotydy purynow e [3], Działanie UCPs jest napędzane przez potencjał
błonowy (AT, ujemny w w ew nątrz mitochondrium) oraz różnicę p H (kwaśne na
zewnątrz). UCPs występują w m itochondriach wielu tkanek ssaków: UCP1 (termogenina) w brunatnej tkance tłuszczowej (BAT, ang. brown adipose tissue), UCP2
w różnych tkankach zwierząt, UCP3 w mięśniach szkieletowych, mięśniu serco­
w y m oraz w BAT, UCP4 i UCP5 w mózgu. Ze w zględu na charakter działania
wszystkich UCPs w m itochondriach organizm ów eukariotycznych, tj. rozprasza­
nie użytecznej energii swobodnej pochodzącej z utleniania substratów oddecho­
wych, białka te stanowią w ażny pun k t kontrolny w gospodarce energetycznej
komórki [3], Upośledzenie działania UCPs może mieć istotny w pływ na funkcjo­
now anie komórek, tkanek, narządów i całych organizmów. Dlatego też regulacja
aktywności UCPs może okazać się kluczowym celem działania terapeutycznego
w wielu zaburzeniach funkcjonowania organizm u ludzkiego [4-8].
UCP3 A GOSPODARKA TŁUSZCZOWA
A ktywność rozprzęgająca UCPs zw iązana jest z transportem protonów z
przestrzeni międzybłonowej do macierzy m itochondriów , co obniża ApH+ [3],
FFA są swoistymi kofaktoram i tego procesu. Jeden z m odeli opisujących m echa­
nizm działania UCPs (model cyklicznego obiegu FFA) zakłada ciągłe krążenie
kw asów tłuszczow ych przy ich udziale w zew nętrznym i w ew nętrznym listku
w ew nętrznej błony m itochondrialnej w zależności od uprotono w an ia g rup k ar­
boksylowych tych kwasów. W ten sposób po dtrzym yw anie stałego obiegu FFA
w pływ a pozytyw nie na m etabolizow anie kw asów tłuszczowych. Dodatkowo,
usuw anie z m itochondriów utlenionych, bądź zjonizow anych (anionów) form
188
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
FFA m oże stanowić bardzo skuteczne narzędzie ochronne
przed toksycznym i właściwościami tych cząsteczek [9].
W przeciwieństwie do kw asów tłuszczow ych zw ią­
zanych w iązaniem tioestrow ym z koenzym em A (acyloCoA), długołańcuchow e FFA nie są metabolizowane. Brak
rów now agi pom iędzy ilością dostarczanego do macierzy
m itochondriów acylo-CoA a tem pem procesu ß-oksydacji
jest często przyczyną niekorzystnej akumulacji niezestryfikow anych kw asów tłuszczow ych w m itochondriach [7],
M itochondrialna pula FFA jest w y tw arzana przez mitochondrialną tioesterazę-1 (MTE-1), enzym, który poprzez
hydrolizę w iązania tioestrowego acylo-CoA regeneruje w
macierzy w olny koenzym A (HS-CoA). Z w iązek ten jest
czynnikiem ograniczającym szybkość procesu ß-oksydacji
kw asów tłuszczow ych i cyklu Krebsa [10]. W ten sposób
MTE-1 podtrzym uje ciągłość w ażnych szlaków m etabolicz­
nych, odsuwając groźbę ich spow olnienia bądź zatrzym a­
nia. W ystępow anie UCP3 jest ograniczone do m itochon­
driów tkanek, które silnie zależą od procesu utleniania
kw asów tłuszczow ych (mięśnie szkieletowe, mięśnie serca
i BAT). W tkankach tych w spółdziałanie obu białek, UCP3 i
MTE-1, m oże skutecznie zwiększać szybkość cyklu Krebsa
i ß-oksydacji (MTE-1 poprzez uw alnianie HS-CoA a UCP3
poprzez zwiększanie transpo rtu elektronów w łańcuchu
oddechow ym ) i rów nolegle podtrzym yw ać szybkie utle­
nianie kw asów tłuszczowych, dzięki ich transportow i do
przestrzeni międzybłonowej (UCP3). Tam FFA są p o now ­
nie przekształcane do acylo-CoA przez syntazę acylo-CoA
[10]. Co ciekawe, p odw yższony poziom białek UCP3 i MTE1 stw ierdzono w m itochondriach serc szczurów cierpiących
na cukrzycę [11]. W spółdziałanie obu białek dodatkow o za­
pew nia ochronę przed podw yższeniem poziom u anionów
FFA w macierzy [12]. Hipotezę, zakładającą działanie UCP3
jako rezerwowej ścieżki przepływ u FFA w w aru nkach ich
nadm iernego dostarczenia do m itochondriów [10], po­
tw ierdza spadek ilości triacylogliceroli w cytosolu włókien
mięśniowych, obserw ow any przy podw yższonej ekspresji
ucp3. U ludzi i gryzoni, zw iększona ekspresja ucp3 m a także
miejsce w w arunkach intensyw nego m etabolizm u tłuszczo­
wego, tj. w trakcie poszczenia, nieregularnego ostrego tre­
ningu czy podczas diety wysokotłuszczowej [7,12], Dlatego
też odpow iedni poziom ekspresji genu ucp3 m oże chronić
p rzed typow ą otyłością w yw ołaną dietą. W spom niana hi­
poteza w ym aga dalszego potw ierdzenia dośw iadczalnego
ze w zględu na założenie, że UCPs są transporteram i anio­
nów FFA, co nie jest w pełni akceptow ane [7,12], Ponadto,
istnieją pew ne rozbieżności wynikające z ba d a ń z w ykorzy­
staniem techniki „gene knock-out". Jak stw ierdzono m yszy
pozbaw ione UCP3 w m itochondriach mięśni (ucp3 -/-) nie
mają upośledzonego utleniania kw asów tłuszczowych.
W yw ołany niew łaściw ą dietą n adm iar kw asów tłuszczo­
w ych m a w p ływ na funkcjonow anie m itochondriów [9,10].
Z p o w o d u braku syntazy acylo-CoA w macierzy niem ożli­
w e jest m etabolizow anie FFA w mitochondriach. P o w o d u ­
je to stan podw yższonego ryzyka peroksydacji m itochon­
drialnych lipidów błonow ych oraz zjawiska lipotoksyczności. W tych w arunkach, głów nym zadaniem UCP3 mógłby
być eksport (zjonizowanych) FFA z m itochondriów [9,10],
zgodnie z m odelem działania UCP zapro ponow an ym przez
Skulacheva i G arlida [3], N a przykład farmakologiczne
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
blokowanie procesu utleniania kw asów tłuszczowych za
pom ocą etom oksyru (inhibitor acylotransferazy karnitynowej I) indukuje w zrost poziom u UCP3, co wskazuje na
zaangażow anie UCP3 w znoszenie nierów now agi m etabo­
licznej, wynikającej z nadm iernego dostarczania kw asów
tłuszczowych do m itochondriów a zdolnością do ich utle­
niania [9,10], Pozytyw nym efektem ubocznym tak ukierun­
kow anego działania rozprzęgającego UCP3 jest oczywiście
także obniżanie ApH+ oraz zmniejszanie uw alniania ROS
przez mitochondria. W w arunkach podw yższonego pozio­
m u FFA w cytosolu, zwiększony poziom UCP3 w błonie m i­
tochondrialnej prow adzi do intensyw nego u suw ania z w e­
w nętrznego listka błony wew nętrznej anionów FFA, które
przedostały się tam niezależnie od system u karnitynowego,
co paradoksalnie sprzyja utlenianiu kw asów tłuszczowych
(acylo-CoA) w procesie (3-oksydacji [10]. Jednocześnie p o­
stuluje się, że UCP3 (a także pow szechne w tkankach zw ie­
rzęcych UCP2) m ogłoby rów nież usuw ać aniony kw asów
tłuszczowych fosfolipidów błonowych, które uległy perok­
sydacji, oczywiście po ich wcześniejszym uw olnieniu z fos­
folipidów z udziałem fosfolipaz [13].
Sform ułow ano hipotezę, zakładającą działanie UCP3 jako
m olekularnego przełącznika, który decyduje o rodzaju w y ­
korzystyw anych substratów energetycznych w mięśniach
(kwasy tłuszczow e versus glukoza) [14]. Potrzeba przesta­
wienia się na m etabolizm tłuszczow y czy w ęglow odanow y
często jest po dyktow ana stanem fizjologicznym mięśni, za­
leżnym od dostarczanego pożywienia. Zwiększone w yko­
rzystyw anie lipidów m a miejsce podczas głodzenia, gdy
dostęp do glukozy jest ograniczony. N atom iast redukcja
spalania tłuszczów wiąże się z p o now nym zasilaniem po­
karm o w ym organizm u, zwłaszcza gdy w znow iona dieta
jest dietą niskotłuszczową. Jest to konieczne dla uzupełnie­
nia lipidów zapasowych, m agazynow anych na okres zw ięk­
szonej wydajności metabolicznej. G dy głodzenie zastępo­
w ane jest obfitym odżyw ianiem się (i odwrotnie), zm iany w
ilości syntetyzow anego UCP3 są większe i bardziej w yraźne
w m itochondriach w łókien m ięśniow ych typu II (głównie
IIB), charakteryzujących się szybkimi skurczami, które p o ­
zyskują energię głównie z beztlenowej glikolizy. Przeciw ­
nie, zm iany w poziomie UCP3 nie dotyczą w łókien mięśnio­
wych ty p u I, które kurczą się wolniej, a energetycznie ich
funkcjonowanie oparte jest na fosforylacji oksydacyjnej oraz
utlenianiu lipidów jako substratów paliwowych. A zatem,
to szybkie, bazujące na glikolizie w łókna m ięśniow e ty p u II
cechuje zdolność do przestaw iania się na dostępny substrat
oddechow y (z glukozy na lipidy i odw rotnie) w zależności
od stanu fizjologicznego organizm u [14]. Zasilane fosforylacją oksydacyjną w łókna m ięśniow e ty p u I mają większą za ­
wartość m itochondriów , m ogą więc łatwiej poradzić sobie
z drastycznie po dw yższonym poziom em kw asów tłuszczo­
wych, dzięki możliwości intensyfikacji procesu (3-oksydacji.
Takie fizjologiczne przystosow anie włókien typu I oznacza
brak silnego zaangażow ania UCP3 w m etabolizm tej tkanki
[12]. W świetle tych rozw ażań, funkcjonowanie UCP3 nie­
koniecznie m usiałoby wiązać się z ułatw ianiem utleniania
kw asów tłuszczowych, lecz raczej stanowiłoby adaptację do
zwiększonej dostaw y tych kwasów.
Mimo że homologi UCP1 nie uczestniczą w procesach termogennych, to jednak w przypadku UCP3 zaobserwowano
http://rcin.org.pl
189
pew ne ciekawe zjawisko. Termogenezę pośrednio pow ią­
zaną z UCP3 wykazano w w arunkach silnej adrenergicznej
aktywacji wywołanej aplikacją MDMA (3,4-metylenodioksymetamfetamina czyli ecstasy), w komórkach tkanki mięśnio­
wej myszy [15]. W zrostu tem peratury nie obserwowano w
mięśniach m utantów myszy pozbawionych ucp3 (-/-), mimo
identycznego traktowania zwierząt substancją narkotycz­
ną. Obserwacja ta nadal pozostaje niewyjaśniona. Jednakże,
obok faktu powszechnego w ystępow ania UCP3 w mięśniach
szkieletowych, obserwacja ta sprawiła że UCP3 zaczęto trak­
tować jako interesujący obiekt nowatorskiego podejścia do
problem u otyłości z w ykorzystaniem ukierunkow anych far­
maceutyków (Ryc. 1). W ywołane rozprzęgającą aktywnością
UCP3 zwiększone oddychanie mitochondrialne oraz w y ­
datkowanie energii (poprzez w zm ożone utlenianie kw asów
tłuszczowych, acylo-CoA) m oże być włączone w regulację
bilansu energetycznego całego ciała [12],
UCP1 - SPOSÓB NA OTYŁOŚĆ?
Efektem funkcjonow ania UCP1 nie jest przechow yw anie
zasobów energetycznych w postaci tłuszczu w BAT, termogennej tkance ssaków [3]. Dlatego też, aktywność różnych
UCPs (zwłaszcza UCP1) m ożna także rozpatryw ać jako
działającą przeciw ko stanom otyłości (Ryc. 1) [5], Takie
spojrzenie zw iązane jest z oczekiwaniami szerokich kręgów
społeczeństwa, szukających kolejnych środków o dchud za­
jących.
występow anie
zwiększony
poziom
(aktywność)
zm niejszony
poziom
(aktywność)
BA T
większość tkanek
ochrona przed
niską tem peraturą
działanie
antyoksydacyjne
zapobieganie
powstawaniu
otyłości (?)
zwiększone ryzyko
cukrzycy typu II
mniejsza skuteczność
chemoterapii
nowotworów (?)
Bilans energetyczny ssaków zależy od w ydatkow ania
energii oraz jej pobierania w raz z pokarm em . Brak rów n o­
w agi objawia się albo jako m agazynow anie energii w posta­
ci triacylogliceroli (pobieranie przew yższa w ydatkow anie),
co często łączy się z otyłością, albo jako całkowite zużycie
energii (w ydatkow anie przew yższa pobieranie), co może
prow adzić do kacheksji (wychudzenia i osłabienia orga­
nizmu) [8,16], W zw iązku z tym term ogeneza zw iązana z
UCP1 rodzi pew ne nadzieje zw iązane z opracow aniem m e­
tody redukcji otyłości u ludzi, g dyż białko to indukuje m o­
bilizację zapasów triacylogliceroli. W yjściowym założeniem
nowatorskiej strategii mającej przeciw działać otyłości jest
kontrolow ana aktywacja adipocytów BAT, bądź nadanie
adipocytom WAT cech adipocytów BAT, czyli przekształce­
nie białej tkanki tłuszczowej (WAT, ang. white adipose tissue)
w tkankę przypom inającą BAT.
Tkanka tłuszczow a jest m agazynem tłuszczu oraz narzą­
dem w ydzielania w ew nętrznego. Występujące u ssaków
dw a typ y adipocytów (komórek tłuszczowych) budu ją­
cych BAT i WAT pełnią przeciw staw ne fizjologiczne funk­
cje. A dipocyty WAT to największy m agazyn energetycz­
ny tłuszczu w organizmie, adipocyty BAT — term ogenne
kom órki rozpraszające energię metaboliczną jako ciepło,
które rozpro w ad zane jest po całym ciele. Duże ilości białej
tkanki tłuszczowej zw iązane są z otyłością, wysoki poziom
brunatnej tkanki tłuszczowej pow iązany z intensyw ną ak-
m ięśnie szkieletowe
i serce
centralny układ nerwowy
regulacja
metabolizmu
tłuszczów
neuroprotekcja (?)
zapobieganie
powstawaniu
cukrzycy typu II
powiązanej z
otyłością
neurom odulacja (?)
ii
h
A
1
1
przeciwdziałanie
rozwojowi
cukrzycy typu II
nietolerancja
zimna
ryzyko pojawienia
się otyłości (?)
w zm ocnienie
odporności
im m unologicznej (?)
inicjacja i w czesna
progresja
nowotworu (?)
\
/
kl
ii
lipotoksyczność
neurodegeneracja (?)
zwiększone ryzyko
rozwoju cukrzycy
typu II powiązanej
z otyłością
przyspieszony rozwój chorób
Alzheimera i Parkinsona (?)
zwiększone ryzyko
rozwoju zm ian
m iażdżycowych (2)
R ycina 1. M ożliw e patologiczne, b ą d ź terap eu ty czne efekty w ynikające ze zm ienionego po zio m u sy ntezy (aktyw ności) pięciu izoform U CPs ssakó w (UCP1-5).
190
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
R ycina 2. Rola receptoró w PPAR w regulacji procesu term ogen ezy BAT ssaków . K luczow y czynnik białkow y, tj. P G C -la ,
inicjuje urucho m ienie term ogen nego p ro g ra m u BAT p op rz e z w spółaktyw ację receptorów PPAR y i PPA R a, a także reg ula­
cję syntezy czynnika transkrypcyjnego ty p u NRF. TZD (przeciw cukrzycow e leki z g u p y tiazolidinedionów ), specyficznie
aktyw ujące receptory PPARy, m ogą ró w nież p o b udzać adipo genezę oraz biogenezę m itochondriów . W te n sposób docho­
d z i do obejścia klasycznej ścieżki indukcji syntezy P G C -la p o p rzez ad renergiczną stym ulację w o d p o w ie d zi na od p o w iedn i
bodziec tem p e ra tu ro w y w y w ołujący syntezę cAMP. A goniści z arów no PPA R a, jak i PPARy m o gą in d u k o w ać ekspresję
ucpl, p ra w d o p o d o b n ie n a różny ch e tap ach rozw oju BAT. A ktyw acji p rocesu term o genezy BAT, fizjologicznie zależnej od
cAM P, to w arzyszy oprócz indukcji syn tezy P G C -la ró w n ież in tensy w n a lipoliza z apaso w ych triglicerydów . U w olnione
FFA pełn ią funkcję g łów nego su b stratu zasilającego proces term o genezy oraz in d u k to ra rozprzęgającej aktyw ności UCP1.
FFA m ogą rów n ież działać jako ak ty w ato ry recep torów PPAR. S tw ierdzono ró w n ież zw iększenie sy ntezy P G C -la p op rzez
autoregulacyjną pętlę, w której w spółakty w acja PPARy p rz e z białko P G C -la u ru c h a m ia transkrypcję gen u pgc-la.
tywnością metaboliczną zwykle zw iązany jest z redukcją
w agi ciała [17,18]. Trzeba jednak pamiętać, że BAT u ludzi
(i u innych w iększych ssaków) zanika w trakcie ontogenezy
(po okresie niem ow lęctw a czy wczesnego dzieciństwa) i je­
dynie szczątkowe ilości tkanki utrzym ują się u osobników
dorosłych.
Kwasy tłuszczowe oprócz pełnienia funkcji zw iązków
indukujących proces rozprzęgania (bezpośrednia aktyw a­
cja UCP) oraz głów nych substratów w term ogenezie (jako
substraty [3-oksydacji), m ogą rów nież pośrednio aktyw o­
wać ekspresję ucpl u zw ierząt, poprzez w p ływ na receptory
PPAR (Ryc. 2). Kilka po d ty p ó w jądrow ych receptorów typu
PPAR (ang. peroxisome proliferator-activated receptor) ziden­
tyfikow ano jako czynniki kontrolujące transkrypcję genów
ucps w tkankach tłuszczow ych [17]. Forma PPARy ulega
silnej syntezie zarów no w adipocytach WAT i BAT, i jest
zw iązana głównie z przebiegiem procesu adipogenezy. For­
m a PPA Ra przew aża w kom órkach BAT. Dzięki unerw ie­
niu w spółczulnem u, BAT w przeciw ieństwie do WAT jest
efektorem działania bodźca niskiej tem peratury. Bodziec
ten, poprzez ścieżkę sygnalizacyjną angażującą cAMP, in­
dukuje w zm ożoną syntezę P G C -la, koaktyw atora recepto­
ra PRARy. W ydaje się, że P G C -la odgryw a zasadniczą rolę
w regulacji transkrypcji genu ucpl. Postuluje się, że PGCl a , indukując syntezę UCP1, jest niezbędny dla p ow staw a­
nia adipocytów BAT bogatych w UCP1 [19]. A zatem silna
synteza receptorów PPARy w połączeniu z syntezą koakP ostępy Biochemii 54 (2) 2008
tyw atora P G C -la stanow i
kluczow y zestaw czynni­
ków decydujących o różni­
cow aniu się adipocytów w
kierunku BAT. Dodatkowo,
PG C -la, w spółpracując z
receptorem typ u PPARa,
kontroluje ekspresję genów
kodujących białka o d p o ­
w iedzialne za p rzeprow a­
dzanie katabolizm u tłusz­
czu w BAT, niezbędnego
do w yw ołania term oge­
nezy [17]. W przeciw ień­
stwie do adipocytów WAT,
kom órki BAT niezwykle
wydajnie utleniają kw asy
tłuszczowe. Wskazuje na
to obfitość m itochondriów
z silnie rozw iniętym i grze­
bieniami, a także wysoki
poziom syntezy PPA Ra w
tych komórkach. PPA Ra
praw dopo dobnie jest także
induk torem genu ucpl w
pełni wykształconych, doj­
rzałych kom órkach BAT
[20]. Obecność PG C -la,
aktywującego
zarów no
PPARa, jak i PPARy, jest
pod staw ow a dla realizacji
całego procesu term ogene­
zy BAT (Ryc. 2).
Stwierdzono, że u m y ­
szy skłonność do otyłości jest ściśle zw iązana z obniżoną
aktywnością BAT [21]. Przeciwnie, „odporność" na otyłość
m oże być zw iązana z zw iększoną aktywnością BAT, bądź
indukcją w WAT informacji genetycznej norm alnie przy pi­
sanej BAT. W ykazano na przykład, że ektopow a ekspresja
genu pgc-la w WAT człowieka m oże urucham iać adipoge­
nezę w kierunku kom órek BAT, której tow arzyszy ekspre­
sja genu ucpl [22,23]. Zjawisko konwersji kom órek WAT w
BAT m oże okazać się pom ocne w poszukiw aniu sposobu
stymulacji term ogenezy (a więc i w zm ożonego utleniania
kw asów tłuszczowych) u dorosłych, co potencjalnie m oże
wyw ołać efekt zmniejszenia w agi ciała.
W kom órkach tłuszczow ych WAT d o d a tk o w ą in d u k ­
cję syntezy P G C -la (którego w ysoki poziom w ystępuje
w kom órkach BAT) m ożna osiągnąć chemicznie, stosując
przeciw cukrzycow y lek rosiglitazon (z g ru p y tiazolidine­
dionów , TZD) [24], O d po w iedzią adipocytów WAT na p o ­
danie TZD jest rów nież w zm ożo na synteza m RN A UCP1.
Jak stw ierdzono, TZD m ogą bezpośrednio w pływ ać na
transkrypcję ucpl p o p rzez specyficzną aktywację recepto­
ró w PPARy kom órek tłuszczow ych (WAT i BAT). Recep­
tory te z kolei in dukują ekspresję genu pgc-la koniecznego
dla syntezy UCP1 (Ryc. 2) [17,24]. A zatem, w stosunku
do wcześniej poznanej adrenergicznej regulacji, TZD m ogą
w yw oływ ać n ow ą ścieżkę regulującą ekspresję genu pgcla [24], In vitro TZD jako ligandy PPARy także silnie p o ­
http://rcin.org.pl
191
budzają adipogenezę białej i brunatnej tkanki tłuszczowej.
W adipocytach WAT TZD indukują zm iany w m orfologii
m itochondriów w kierun ku w ykształcenia licznych grze­
bieni [21]. Co ciekawe, chroniczne po d a w a n ie leków przeciw w irusow ych m oże prow adzić do w zm ożonej ekspresji
genu ucpl u dorosłych, w znacznej m ierze p ozbaw ionych
przecież BAT [25],
Białkiem w pływ ającym na pow staw anie kom órek tłu sz­
czow ych jest także białko pRB (ang. retinoblastoma prote­
in). Będąc w a żn y m regulatorem cyklu kom órkow ego ssa­
ków, a także supresorem zm ian now otw orow ych, białko
pRB uw a ż n e jest za przełącznik m olekularny decydujący
o tym czy różnicow anie adipocytów zm ierza w kierun ku
kom órek WAT czy BAT [21,26]. Białko pRB jest p o trzeb ­
ne do różnicow ania adipocytów WAT, natom iast h a m u ­
je po w staw an ie kom órek BAT. W skazuje na to obecność
pRB w jądrze tylko preadipo cytów WAT [26], W zw iązku
z tym zap ro p o n o w an o m odel dośw iadczalny, w którym
selektyw na inaktyw acja pRB po w in n a w yw ołać zm iany
prow adzące do po w staw an ia adipocytów BAT, co w ią za ­
łoby się z in tensyw ną syntezą UCP1, w yd ajn y m spalaniem
tłuszczu oraz redukcją m asy ciała. Być m oże w przyszłości
zam ierzona ingerencja w rów now agę pom iędzy różnico­
w aniem się adipocytów WAT i BAT, okaże się istotną w
regulacji w agi ciała, a więc i w leczeniu otyłości oraz cho­
rób zw iązanych z otyłością [26].
UCPs JAKO PRZECIWUTLENIACZE
Konsekwencją życia opartego na metabolizmie tlenow ym
jest nieustanne w ytw arzanie ROS, a w śród nich kluczow e­
go wolego rodnika, anionorodnika ponadtlenkow ego. We
w szystkich organizm ach obniżanie się wydajności pracy
narządów , tkanek czy kom órek wiąże się z postępującym
procesem starzenia się. W edług w olnorodnikowej teorii sta­
rzenia się, jednym z głównych po w odó w starzenia się orga­
nizm u jest nagrom adzanie się zniszczeń makrocząsteczek
kom órki w w yniku ich reakcji z w olnym i rodnikam i (utle­
nienia) [27], Przykładem m oże być skracanie się telom erów
chrom osom ów w w yniku oddziaływ ań z ROS. G łów nym
miejscem uw alniania ROS w kom órkach są mitochondria,
a dokładnie centra oksydo-redukcyjne kom ponentów łań­
cucha oddechow ego [1]. Ilość uw alnianych ROS w d u żym
stopniu zależy od metabolicznego stanu m itochondriów [7],
W tzw. spoczynkow ym stanie oddechow ym (stan „niefosforylujący", stan 4), zw olnionem u oddychaniu m itochon­
driów, wysokiej wartości ApH+ oraz silnem u zredukow aniu
kom pleksów łańcucha oddechow ego tow arzyszy intensyw ­
ne uw alnianie ROS. Stan spoczynkow y reprezentuje fizjolo­
giczną sytuację chw ilowo nikłego zapotrzebow ania na ATP,
bądź niewystarczającej ilości dostępnego ADP koniecznego
do syntezy ATP. Rozpoczęcie syntezy ATP (uruchomienie
syntazy ATP) prow adzi do przejścia w stan „fosforylujący"
(stan 3), którem u tow arzyszy zwiększenie szybkości o d d y ­
chania m itochondriów, zmniejszenie ApH+ i w efekcie ob­
niżenie w ytw arzania ROS. In vivo m itochondria utleniające
substraty oddechow e znajdują się więc w stanie m ieszanym
pom iędzy stanem spoczynkow ym i „fosforylującym" [7],
Stosunek szybkości oddychania.stanu 3 do stanu 4 określany
jest kontrolą oddechow ą, param etrem , który opisuje stopień
sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w m itochondriach.
192
Stres oksydacyjny w komórce, brak rów now agi pom ię­
dzy system am i pro- i antyoksydacynym i), pow oduje znisz­
czenia wielu m akrom olekuł w komórce. Szczególnie niebez­
piecznymi akceptoram i ROS są kw asy tłuszczowe, zw łasz­
cza te wielonienasycone pochodzące np. z fosfolipidów
błonowych. Pod w pływ em działania ROS w ytw arzanych w
m itochondriach, kw asy tłuszczow e są przekształcane do sil­
nie reaktyw nych aldehydów , jak 4-hydroksy-2-nonenal (4HNE) [28], 4-HNE, jeden z głów nych p ro d u k tó w peroksydacji lipidów, jest sw oistym m arkerem stresu oksydacyjne­
go. Zw iązek ten m oże rów nież inaktyw ow ać geny poprzez
oddziaływ anie z resztą guanozyny w łańcuchu DNA [29].
Co więcej, peroksydacja lipidów jest bardzo niebezpieczna,
poniew aż związki przejściowe i pro d u k ty końcowe tego
procesu przyczyniają się do samoczynnej propagacji u w al­
niania zw iązków w olnorodnikow ych na zasadzie kaskad
reakcyjnych [30]. Poza tym peroksydacja lipidów m oże za­
burzać organizację błony, pow odując zm iany jej płynności
i przepuszczalności dla jonów oraz ham ow ać procesy m e­
taboliczne.
Działanie UCP prow adzące do łagodnego (częściowego)
rozprzęgania m itochondriów (ang. mild uncoupling), które­
m u tow arzyszy zw iększony poziom oddychania oraz sub­
telne obniżanie wartości ApEP, zw iązane jest z obniżaniem
produkcji ROS oraz zm niejszeniem praw dopodobieństw a
w ystąpienia stresu oksydacyjnego [1,3]. W ten sposób UCPs
m ożna traktow ać jako endogenne system y antyoksydacyjne, stanowiące system ochrony kom órki przed stresem
oksydacyjnym. Za cytoochronnym znaczeniem łagodnego
rozprzęgania z udziałem UCPs przem aw ia rów nież kardioprotekcyjny i neuroprotekcyjny efekt zw iązków farm akolo­
gicznych o działaniu m itochondrialnych rozprzęgaczy [31],
Ciekawy aspekt wynikający z braku aktywności UCP2
prezentują w yniki analizy fenotypu m yszy pozbawionej
tego białka [32]. Osobniki zm ienione genetycznie (ucp2 -/-)
w ykazyw ały całkowitą odporność na zakażenie w ew n ątrz­
kom órkow ym pasożytem Toxoplasma gonidii w przeciw ień­
stwie do efektu letalnego obserw ow anego u osobników
ucp2 + /+ . Z aproponow ano, iż jest to w ynik p odw y ższo­
nego poziom u ROS w pozbaw ionych UCP2 makrofagach,
które skuteczniej m ogą zwalczać niepożądane antygeny.
Jednakże ceną za większą odporność na czynnik zakaźny
m oże być skrócony czas życia m akrofaga z p o w o d u w ła­
snych zniszczeń oksydacyjnych makrocząsteczek [33]. Przy­
puszcza się, iż jedynie subtelna regulacja syntezy UCP2 in
vivo m oże w iązać się z podnoszeniem wydajności układu
im m unologicznego. Poniew aż zakażenie patogenem należy
do zdarzeń przejściowych, m oże to być osiągnięte dzięki
krótkiem u czasowi połowicznego ro z p a d u funkcjonalnego
UCP2 [34], Podobne zjawisko dotyczy cyklu miesięczne­
go kobiet, podczas którego przed uw olnieniem dojrzałego
oocytu szybko spada ekspresja ucpl. Jest to p raw d o p o d o b ­
nie zw iązane z koniecznością w ytw orzenia ROS w ilości
niezbędnej dla uw olnienia oocytu. Aby uniknąć efektów
ubocznych (uszkodzenia oocytu) cały proces m usi być p re­
cyzyjnie kontrolow any [34], Przeciwnie, na przykład term ogeneza induk ow ana niską tem peraturą nie należy do
stanów przejściowych, co zw iązane jest z 60 razy większą
stabilnością UCP1 w BAT.
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
Miażdżyca, schorzenie związane ze zw ężaniem się św ia­
tła tętnic, może być także pow iązane z działaniem UCP2.
Jedną z ważniejszych przyczyn m iażdżycy może być stres
oksydacyjny w kom órkach krwi oraz naczyń krw iono­
śnych. Na przykład transplantacja mysich kom órek szpiku
kostnego pozbaw ionych UCP2 (ucp2 -/-) do myszy pozba­
wionej receptora dla LDL (lipoproteiny o małej gęstości)
m oże znacznie przyspieszyć wczesne zm iany m iażdżyco­
w e w aorcie [35]. Z aaw ansow anie zm ian m iażdżycow ych w
kontroli, tzn. gdy przeszczepiono komórki szpiku z UCP2
(ucp2 +/ +), było w yraźnie mniejsze. Dlatego przypuszcza
się, że czynniki zwiększające syntezę UCP2 w układzie na­
czyniowym mogłyby zapobiegać rozwojowi m iażdżycy u
pacjentów, zwłaszcza z p odw yższonym poziom em ROS, tj.
chorych na cukrzycę i nadciśnienie [36].
Postuluje się, aby współczesne strategie terapeutyczne
zmierzające do obniżania poziom u uw alniania ROS w m i­
tochondriach, bądź ich elim inowania zanim dokonają p o ­
w ażnych zniszczeń, pow inny skupiać się na w yw oływ aniu
ukierunkow anego rozprzęgania m itochondriów (m.in. po ­
przez kontrolowanie aktywności UCPs) oraz na stosow aniu
przeciwutleniaczy [7]. Być może manipulacje takie w płyną
na długość i jakość życia. Ponadto, jeśli faktycznie aktyw ­
ność UCPs łagodzi stres oksydacyjny i opóźnia starzenie się,
również FFA (aktywatory UCPs) m ogą odgryw ać bardzo
w ażną rolę w regulacji długości życia [37], Dlatego też zbi­
lansowana, oparta na tłuszczach dieta, która zw ykle u w a ­
żana jest za niezdrow ą, być może stanowi jeden z kluczy do
długowieczności.
UCPs A USZKODZENIA
NIEDOKRWIENNO-REPERFUZJNE
Intensyw na produkcja wolnych rodników w m itochon­
driach odbyw a się przy niskim tempie fosforylacji ADP do
ATP, mimo dużej dostępności tlenu i substratów oddecho­
wych. Taki stan dotyczy m. in. zjawiska reperfuzji, czyli
ponow nego ukrw ienia mięśnia na przykład tych obszarów
serca, które wcześniej uległy niedokrw ieniu (ischemii) [38].
Mechanizm hartow ania przez niedokrwienie, które w y w o ­
łane jest przejściową ischemią tkanek, stanow i jeden z m e­
chanizm ów „kom órkow ego program u przetrw ania" (ang.
cell survival program) i jest ewolucyjnie zachow any w wielu
tkankach i narządach [31]. H artow anie ischemiczne zw ięk­
sza zdolność przyw racania praw idłow ych funkcji mitochondriom (np. syntezy ATP) po udarze niedokrw iennym .
W znowienie skurczów mięśnia serca podczas reperfuzji
następuje z opóźnieniem w stosunku do natychm iastow ego
rozruchu oddychania mitochondrialnego, co w ywołuje na
początku silną redukcję kom ponentów łańcucha oddecho­
wego oraz wysoką wartością AgH+ [38]. Dlatego też okres
reperfuzji wiąże się z nasilonym uw alnianiem ROS w m ito­
chondriach. Wysoki potencjał błonowy (AT1, jeden z kom ­
ponentów ApH+) w zm aga rów nież napływ jonów w apnia
do m itochondriów [39], Wobec tego reperfuzja niesie za
sobą groźbę połączenia dw óch negatyw nych czynników,
tj. zwiększonego poziom u Ca2+ i ROS, które m ogą w y w o ­
łać otwarcie m egakanału (PTP, ang. permeability transition
pore) i w konsekwencji doprow adzić do śmierci komórki.
Poprzez obniżanie wartości AW, działanie UCPs m ogłoby
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
przeciwdziałać zaburzaniu praw idłow ych param etrów p ra­
cy mięśnia sercowego w trakcie trw ania reperfuzji.
Funkcję UCPs w kontekście uszkodzenia niedokrw ienno-reperfuzyjnego badano w izolowanych sercach myszy
zm ienionych genetycznie, tzn. charakteryzujących się w y­
sokim poziom em UCP1 w m itochondriach serca (gdzie nor­
malnie nie występuje) [38]. Mimo że w yw ołana ekspresja
ucpl nie zmieniła wrażliwości narządu na ischemię, to zna­
cząco popraw iła jego zdolność do regeneracji funkcjonowa­
nia po reperfuzji. Na przykład kurczliwość serca w 60 m inut
po reperfuzji była 2-krotnie w iększa w p rzy padku narządu
pochodzącego od osobnika transgenicznego w porów na­
niu do osobnika stanowiącego kontrolę. Ponadto, w sercu
z UCP1 poziom zużycia tlenu obserw ow any po reperfuzji
był taki jak sprzed ischemii, co w skazyw ało na zwiększone
rozprzęganie oddychania (zużycie tlenu) w yw ołane aktyw ­
nością UCP1. W sercach kontrolnych zużycie tlenu znaczą­
co się obniżyło. Niska aktywność UCPs w sercu (UCP2 i
UCP3) praw dopodobnie w iąże się z utrzym yw aniem normoksji (normalny, fizjologiczny poziom tlenu), natom iast
znaczne zwiększenie aktywności rozprzęgającej m oże w y ­
nikać z ischemii oraz następującej po niej reperfuzji [38]. W
sercu, w stanie normoksji, duże stężenie ATP i niski poziom
kw asów tłuszczowych zapew nia praw ie całkowite zaham o­
w anie UCPs. Z kolei ischemia, prow adząc do zatrzym ania
syntezy ATP i utleniania kw asów tłuszczowych, stw arza
w arunki do aktywacji UCPs, gdyż rośnie stężenie aktyw ato­
rów (FFA) tych białek [38]. Przypuszcza się, że złagodzenie
dysfunkcji pracy serca po reperfuzji, zw iązane z obecnością
heterologicznego UCP1, w iąże się z niedopuszczaniem do
hiperpolaryzacji m itochondriów , która leży u podstaw ne­
gatyw nego w pływ u jonów w apnia oraz ROS w komórce.
Podobne wnioski wyciągnięto z badań nad rolą UCP2 w
kardiomiocytach oraz UCP2 i UCP3 w mioblastach serca
[31,40]. Dlatego też, homologi UCP1 w ystępujące w sercu,
UCP2 i UCP3, są potencjalnym celem działania terapeutycz­
nego w chorobach niedokrwiennych. Jest to o tyle istotne,
iż w edług Światowej Organizacji Z drow ia choroby układu
krążenia (w tym choroby naczyń wieńcowych) plasują się
w czołówce zm ian patologicznych u ludzi z krajów rozw i­
niętych.
Podobnie jak reperfuzja, rów nież hiperoksja (nadmiar,
zw iększony poziom tlenu) prow adzi do stresu oksydacyj­
nego upośledzającego funkcjonowanie tkanek i narządów
(np. płuc, serca czy mięśni). W p rzypad ku mięśni szkie­
letowych szczura poddanych hiperoksji zaobserw ow ano
zw iększony poziom syntezy UCP3 [41]. Stanowi to kolejny
dow ód w skazujący na udział UCPs w kontrolowaniu stresu
oksydacyjnego.
UCP2 A ONKOGENEZA
Stres oksydacyjny w pływ a na rozwój now otw oru [42,43],
ROS m ogą przyczyniać się do niekontrolow anego nam nażania się komórek, trwałego lub przejściowego zaham ow ania
wzrostu, a także apoptotycznej, bądź nekrotycznej śmierć
komórki. W ykazano, iż brak UCPs, które ograniczają stres
oksydacyjny poprzez obniżanie uw alniania ROS w mito­
chondriach, m oże wiązać się z podw yższonym ryzykiem
rozwoju pew nych typów now otw orów [44], Mysz pozba­
http://rcin.org.pl
193
w ioną funkcjonalnego genu ucp2 (ucp2-/~) w porów naniu
z m yszą typu dzikiego, jest bardziej w rażliw a na chemicz­
ną indukcję raka okrężnicy. Brak UCP2, i w konsekwencji
zwiększenie stresu oksydacyjnego, wiąże się praw d o p o ­
dobnie z aktywacją NF-kB (ang. nuclear factor kappaB) oraz
zakłóconą rów now agą pom iędzy nam nażaniem się nabłon­
kow ych kom órek jelita a ich apoptozą. Plejotropowy czyn­
nik transkrypcyjny NF-kB reguluje wiele genów, w tym
te, które prom ują w zrost komórki oraz ham ują apoptozę
[44]. Przy braku UCP2 niewystarczający poziom apoptozy,
jako w ynik odpow iednio silnej syntezy Bcl-2 (białko antyapoptotyczne), przyczynia się przypuszczalnie do nasilonej
onkogenezy. U myszy z aktyw nym UCP2 (ucp2+/+) niski
poziom Bcl-2 współgrał z w iększym tem pem apoptozy ko­
m órek jelita i tym sam ym nadaw ał większą odporność na
chemiczną indukcję now otw oru.
Inne badania wskazują, że zw iększona synteza UCP2
może chronić przed stresem oksydacyjnym zarów no ko­
mórki rakow e oraz te, które nie uległy transformacji no­
w otw orowej [45], Stwierdzono na przykład 3-4 krotne
zwiększenie syntezy UCP2 w większości przyp adków raka
okrężnicy u ludzi. Przy czym poziom zw iększenia syntezy
tego białka wydaje się pozytyw nie współistnieć ze stop­
niem pogłębiania się zm ian now otw orow ych. Wskazują na
to rów nież obserwacje linii kom órkow ych różnych typów
raka odpornych na leki. Linie te odznaczają się zwiększo­
ną ekspresją ucp2, niższym AT1 oraz słabą wrażliwością na
stres oksydacyjny [46]. Jak dotąd nie w yjaśniono przypusz­
czalnej roli UCP2 w inicjacji zm ian now otw orow ych i ich
wczesnego rozwoju w p rzypadk u ludzi [44],
Poziom ekspresji ucp2 i pew ne typy now otw orów łąćzy
rów nież czynnik mobilizujący lipidy (LMF, ang. lipid mobilising factor), będący glikoproteiną [47], N ow otw ory pow od u­
jące kacheksję (zespół w yniszczenia now otw orow ego połą­
czony z utratą wagi) wydzielają LMF, który prow adzi do
rozkładu tkanki tłuszczowej, aby pozyskać substancje od­
żywcze potrzebne do dalszego w zrostu. O prócz bezpośred­
niego w pływ u na lipolizę, LMF rów nież w zm aga utlenianie
kw asów tłuszczowych (uwolnionych z triglicerydów) po­
przez indukcję ekspresji genów kodujących różne izoformy
UCP. W skazuje na to np. zwiększenie ilości UCP2 w kom ór­
kach MAC13 (komórki raka jelita grubego, nie produkujące
w łasnego LMF), zależne od stężenia podaw anego egzogen­
nie LMF [47]. A zatem LMF, indukując ekspresję UCP2 w
guzie now otw orow ym , mógłby prow adzić do obniżenia
poziom u ROS, których generacja jest nasilona w stanie kacheksji, w skutek zwiększonej oksydacji zw iązków energe­
tycznych. Działanie wielu leków przeciw now otw orow ych
oparte jest na w ytw arzaniu szkodliwych dla komórki ROS.
Wobec tego indukcja ekspresji ucp2 przez LMF może przy­
czyniać się do ochrony kom órek guza przed toksycznymi
skutkam i intensyw nego m etabolizm u prow adzonego przez
te kom órki [47], Niestety m oże to być jednym z pow odów
słabej odpow iedzi guza indukującego kacheksję na chemo­
terapię.
Zmieniający się poziom syntezy UCP2 m oże być zwią­
zany zarów no z zapoczątkow yw aniem zm ian now otw o­
rowych, jak i zw iększaniem przeżyw alności zmienionych
komórek. Oznaczałoby to, że działanie UCP2 jest częścią
194
reakcji adaptacyjnej, dzięki której komórki raka okrężnicy
m ogą kontrolować stres oksydacyjny i unikać apoptozy po­
wodow anej przez ROS [45]. Ponadto, w komórkach now o­
tw orow ych negatyw na kontrola uwalniania ROS poprzez
zw iększoną syntezę UCP2 wydaje się ważniejsza niż utrzy­
m yw anie wydajnej fosforylacji oksydacyjnej. O d daw na
zresztą w iadom o, że w szybko rosnących komórkach raka
preferencyjnym szlakiem dostarczającym energii jest gli­
koliza. Jest to zgodne z niedaw no przyjętą tezą traktującą
UCP2 jako czujnik i negatyw ny regulator w ytw arzania ROS
w mitochondriach, a więc i stresu oksydacyjnego [45], UCP2
mogłoby pełnić taką funkcję w wielu tkankach (praw idło­
wych i ze zmianami now otw orow ym i), ze w zględu na po ­
wszechne w ystępow anie tej izoformy w tkankach ssaków.
Dobroczynne dla kom órek rakow ych działanie UCP2
może dotyczyć jedynie zjawiska łagodnego (częściowego)
rozprzęgania. Silne rozprzęganie oddychania m itochon­
drialnego poważnie uszczupla ilość syntetyzowanego ATP
i m oże okazać się zgubne dla rozwoju guza z pow odu bra­
ków energii potrzebnej do nam nażania. Dlatego też w y w o ­
łanie stanu całkowitego rozprzężenia komórek rakowych
poprzez znaczną nadekspresję ucp2 może stanowić kieru­
nek potencjalnej strategii walki z nowotworem .
UCPs W UKŁADZIE NERWOWYM
Badania z ostatnich lat wykazały obecność UCPs w w ie­
lu strukturach m ózgowych, włączając w to podw zgórze,
hipokam p, móżdżek, rdzeń kręgowy, pień mózgu, korę
m ózgow ą i system limbiczny [5]. W układzie nerw ow ym
odnaleziono UCP2, UCP4 oraz UCP5. W przypadku UCP2
zwykle poziom jego syntezy w CUN jest niski, z w yjątkiem
np. obszaru jądra łukow atego podw zgórza, które kontro­
luje przyjm ow anie pokarm u [5]. Przypuszcza się, że UCPs
obecne w układzie nerw ow ym m ogą m odulow ać funkcje
neuronów poprzez regulację biogenezy mitochondriów, go­
spodarki wapniowej, poziom u uw alniania ROS czy też lo­
kalnej tem peratury komórki. Rozprzęganie m itochondriów
(poprzez działanie UCPs) m oże prow adzić do zmniejszenia
poziom u produkcji wolnych rodników (zmniejszenia stresu
oksydacyjnego), obniżenia napływ u jonów wapnia (zależ­
nego od AW) do m itochondriów oraz do lokalnego w zro ­
stu tem peratury [5]. Paradoksalnie, w efekcie końcowym,
rozprzęganie może także sprzyjać wzmożonej syntezie
ATP, gdyż indukuje biogenezę mitochondriów. Dlatego też
w ysunięto hipotezę, iż UCPs układu nerw ow ego dodatnio
wpływ ają na funkcjonowanie neuronów (neuromodulacja),
tj. przesyłanie im pulsów elektrycznych oraz plastyczność
synaptyczną, a także opóźniają stopniow e zanikanie aktyw ­
ności neuronalnej (neuroprotekcja), która leży u podstaw
procesów neurozw yrodnieniow ych (Ryc. 1). W rozprzęganiu m itochondriów kom órek nerw ow ych upatruje się sw o­
isty system chroniący te kom órki przed przedw czesnym
starzeniem się i śmiercią, procesami których zaburzenia
mają zw iązek m.in. z chorobą Parkinsona czy Alzheimera
[48]. O dnotow ano rów nież pew ien stopień synergizm u po­
m iędzy ekspresją genów ucps i etiologią Schizofrenii [49].
Co ciekawe w mózgu, u zn aw anym za najważniejszą struk­
turę w organizmie, poziom UCP2 rośnie w raz z wiekiem
[13]. W skazuje to na istnienie m echanizm u zapobiegającego
rozwojowi stresu oksydacyjnego sprzężonego z wiekiem.
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
UCPs A CUKRZYCA
Cukrzyca stanow i jedną z najpoważniejszych chorób
cywilizacyjnych współczesnego świata. Nowe, obiecujące
podejście terapeutyczne w leczeniu cukrzycy typu 2 w y ­
nika z faktu, że UCP2 negatyw nie reguluje stym ulow ane
przez glukozę w ydzielanie insuliny (Ryc. 3) [50], M etabo­
lizm m itochondriów i wydzielanie insuliny połączone są
poprzez ATP. G dy w kom órkach (3 w ysepek trzustkow ych
stężenie glukozy jest wysokie, poziom cytosolowego ATP
zw iększa się o około 40%. Dochodzi do zw iększenia utle­
niania glukozy, co prow adzi do w zrostu wartości ApH+ w
m itochondriach, a tym sam ym do przesunięcia rów now agi
A T P / ADP w kierunku ATP. Większe stężenie ATP w cyto­
solu blokuje kanały potasow e w rażliw e na ATP (KATp) i w
konsekwencji pow oduje depolaryzację błony plazmatycznej. To z kolei zw iązane jest z otwarciem kanałów w apnio­
w ych bram kow anych napięciem. N apływ jonów w apnia
do kom órek prow adzi do w ydzielenia insuliny z gruczołu
trzustkow ego [50].
glukozy w kom órkach [3 trzustki [52], Zwiększona aktyw ­
ność UCP2 (wynikająca z nadekspresji ucp2) w pływ a na
obniżanie AT w ewnętrznej błony mitochondrialnej oraz
zmniejszanie ilości cytosolowego ATP, co w rezultacie osła­
bia w ydzielanie insuliny stym ulow ane przez glukozę. W
mysich komórkach [3 trzustki pozbawionych UCP2 (ucp2-/~)
stwierdzono wyższy poziom ATP i zwiększone w ydzielanie
insuliny w porów naniu do kom órek myszy typu dzikiego
[51]. Przypuszcza się, że zm iany w poziomie UCP2 m ogą
istotnie wiązać się z patogenezą prow adzącą do w ystąpie­
nia cukrzycy, jak w spom niano wcześniej, podw yższony
poziom kw asów tłuszczowych (hyperlipidemia), związany
np. z otyłością, prom uje ekspresję genów ucps w w yniku
bezpośredniej aktywacji receptorów PPAR (Ryc. 2). Stan
taki może przyczyniać się do dysfunkcji kom órek ¡3 trzustki
[17]. A zatem, inaktywacja UCP2 w trzustce, w yraźnie po ­
prawiająca wydzielanie insuliny (na co wskazują badania
z m yszam i ucp2-/-) może w przyszłości odegrać kluczową
rolę w opracow yw aniu now ych technik leczenia cukrzycy
typ u 2 [17,51]
Postuluje się, że łagodne rozprzęganie oddychania mi­
tochondrialnego z udziałem UCP2 może stanowić fizjolo­
giczny elem ent negatywnej regulacji w ydzielania insuliny,
poprzez w p ływ na poziom ATP powstających z utleniania
Zjawisko oporności na insulinę w mięśniach szkieleto­
w ych może z kolei wiązać się z niew łaściwym poziom em
kw asów tłuszczowych, gdy poziom syntezy UCP3 odbiega
od norm y [53], Pacjenci z cukrzycą typu 2 mają zmniejszo­
ne tem po utleniania
kw asów
tłuszczo­
w ych oraz zwiększo­
ny poziom FFA w
błonie plazmatycznej
[53], Brak w ystarcza­
jącej ochrony przed
zjawiskiem lipotoksyczności
(poprzez
brak praw idłow ego
poziom u UCP3 w m i­
tochondriach) może
bezpośrednio wiązać
się z cukrzycą typu 2
i, w konsekwencji, z
otyłością. Farm ako­
logiczna
aktywacja
ekspresji ucp3 w mię­
śniach mogłaby w spo­
magać ich fizjologicz­
ną funkcję w regulacji
m etabolizm u lipidów
i zwiększać w rażli­
wość na insulinę [17].
Taki typ terapii sta­
nowi potencjalne n a­
rzędzie przeciw dzia­
łające negatyw nem u
w pływ ow i wysokie­
go poziom u kw a­
sów tłuszczowych w
R ycina 3. R egulacja sekrecji insuliny z u d ziałem UCP2 w k om órkach p trzustki. G lu koza jest tra n sp o rto w a n a do kom órki na nośniku
mięśniach. Postuluje
glukozow ym . U tlenianie glukozy, na które składa się glikoliza, cykl k w asów trikarb oksy lo w y ch (TCA) oraz tra n sp o rt elektro nów w
się, że zwiększone
łańcuchu o d d e ch o w y m (RC) m itoch ond riu m , p ro w a d z i do w y tw o rzen ia pro to n o w eg o g ra d ie n tu chem icznego (A|iH+), któ ry z kolei
zasoby
triacyloglin a p ęd z a syntezę ATP. W zrastający poziom ATP w kom órce p trzustki, jako konsekw encja po d w y ższo n eg o poziom u c u k ru w e krw i,
przyczynia się d o zam knięcia w rażliw ych n a ATP kanałów potasow ych (KATP) błony plazm atycznej. P ro w adzi to do depolaryzaq'i
ceroli w mięśniach
błony i otw arcia kanałów w apniow y ch b ram ko w any ch napięciem . N a p ły w w a p n ia do kom ó rki u ru c h a m ia proces w y dzielania in su ­
oraz
zredukow ana
liny. A ktyw ność U C P2 ro zp rasza ApH+ i tym sam ym obniża w ydajność syntezy ATP. U C P2 m oże w ięc pełnić funkcję negatyw n eg o
reg ulato ra sty m u lo w a n eg o glukozą w ydzielania glukozy w kom órkach p w y sep ek trzustk ow ych.
wrażliwość na insuli­
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
195
nę m ogą w ynikać z zakłóceń w p row adzany ch przez acyloCoA (produkt ro zp adu triacylogliceroli) do ścieżki oddzia­
ływania insuliny angażującej aktywację kinazy białkowej C
[12]. Potw ierdza to obserwacja, że pacjenci z cukrzycą typu 2
w ykazują 50% obniżenie poziom u UCP3 w mitochondriach
mięśni szkieletowych [54], Co więcej, w mięśniach tych pa­
cjentów obserwuje się mniejsze i uszkodzone mitochondria,
co może wynikać z zaburzeń w aktywności UCP3 [9].
PODSUMOWANIE
Regulacja funkcjonowania m itochondriów powinna stać
się jednym z ważniejszych celów w spółczesnego podejścia
terapeutycznego. Obecnie m edycyna w niewielkim jeszcze
stopniu w ykorzystuje potencjał drzem iący w mitochon­
driach, choć u podstaw wielu jednostek chorobowych leży
dysfunkcja mitochondriów. Podejm ow ane próby mogą w
niedalekiej już przyszłości spow odow ać pojawienie się zu ­
pełnie now ych m etod leczenia, które być m oże przyczynią
się do zwalczania tak pow szechnych schorzeń, jak: otyłość,
cukrzyca typu 2, przedw czesne now otw orzenie czy przy­
spieszone starzenie się. Z coraz większą pewnością m oże­
my stwierdzić, iż uwalnianie ROS, jako skutek uboczny nor­
malnego m etabolizm u komórki, stanow i p un k t wyjściowy
wielu procesów zw yrodnieniow ych i patofizjologicznych.
Dzięki działaniu UCPs (łagodnem u rozprzęganiu) poziom
stresu oksydacyjnego może być skutecznie regulowany.
Dlatego też coraz częściej UCPs, jako swoiste przeciwutleniacze, brane są pod uw agę przy opracow yw aniu strategii
leczenia w ielu schorzeń. Wydaje się, że z pu nktu widzenia
korzyści płynących dla komórki, negatyw na kontrola uw al­
niania ROS z udziałem UCPs pow inna mieć pierwszeństwo
nad utrzym yw aniem wydajnej fosforylacji oksydacyjnej
(produkcji ATP). Zaprzęgnięcie UCPs w walkę z różnymi
zespołami chorobowymi, poprzez opracow anie środków
farmakologicznych selektywnie indukujących, bądź bloku­
jących aktywność bądź syntezę różnych izoform UCPs, sta­
nowi nowe, w ażne w yzw anie początku XXI wieku.
PIŚMIENNICTWO
1. Jarm uszkiewicz W, W oyda-Ploszczyca A (2008) M itochondrialne biał­
ka rozprzęgające. Postępy Biochem 54:
2. C zarna M, Jarm uszkiewicz W (2006) Rola m itochondriów w w ytw a­
rzaniu i usuw aniu reaktyw nych form tlenu; zw iązek z przesyłaniem
sygnałów i program ow aną śmiercią kom órki. Postępy Biochem 53:
145-156
3. Halliwell B, G utteridge JMC (1999) Free radicals in biology and m edi­
cine, third ed. Oxford University Press, N ew York
4. N übel T, Ricquier D (2006) Respiration under Control of Uncoupling
Proteins: Clinical Perspective. H orm Res 65: 300-310
5. N edergaard J, Ricquier D, Kozak LP (2005) U ncoupling proteins: cur­
rent status and therapeutic prospects. M eeting on Uncoupling Pro­
teins. EMBO Rep 6: 917-921
6. Flarper ME, Gerritis MF (2004) M itochondrial uncoupling proteins as
potential targets for pharmacological agents. C ur O pin Pharmacol 4:
603-607
7. Echtay KS (2007) M itochondrial uncoupling proteins-W hat is their
physiological role? Free Rad Biol Med 43:1351-1371
8. Jezek P (2002) Possible physiological roles of mitochondrial uncou­
pling proteins — UCPn. Int J Biochem Cell Biol 34:1190-1206
9. Schrauw en P, Hesselink MK (2004) The role of uncoupling protein 3 in
fatty acid metabolism: protection against lipotoxicity? Proc N utr Soc
63: 287-292
196
10. Him m s-Hagen J, H arper ME (2001) Physiological role of UCP3 may
be export of fatty acids from m itochondria w hen fatty acid oxidation
predominates: an hypothesis. Exp Biol Med 226: 78-84
11. Gerber LK, Aronow BJ, Matlib MA (2006) Activation of a novel longchain free fatty acid export system in m itochondria of diabetic rat he­
arts. Am J Physiol Cell Physiol 291:1198-1207
12. Bezaire V, Seifert EL, H arper ME (2007) Uncoupling protein-3: clues in
an ongoing m itochondrial m ystery. FASEB J 21: 312-324
13. Goglia F, Skulachev VP (2003) A function for novel uncoupling prote­
ins: antioxidant defense of m itochondrial m atrix by translocating fatty
acid peroxides from the inner to the outer m em brane leaflet. FASEB J
17:1585-1591
14. Dulloo AG, Samec S (2000) U ncoupling proteins: Do they have a role
in body weight regulation? N ew s Physiol Sci 15: 313-318
15. Mills EM, Banks ML, Sprague JE, Finkel T (2003) Pharmacology: unco­
upling the agony from ecstasy. N ature 426:403-404
16. Mozo J, Emre Y, Bouillaud F, Ricquier D, Criscuolo F (2005) Thermo­
genesis: W hat role for UCPs in m am m als and birds? Biosci Rep 3/4:
227-249
17. Villarroya F, Iglesias R, Giralt M (2007) PPARs in the control of unco­
upling proteins gene expression. PPAR Res 2007: 74364
18. Ricquier D, Bouillaud F (2000) The uncoupling protein homologues:
UCP1, UCP2, UCP3, StUCP and AtUCP. Biochem J 345:161-179
19. Puigserver P, Wu Z, Park CW, Graves R, W right M, Spiegelman BM
(1998) A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to ada­
ptive thermogenesis. Cell 92: 829-839
20. Barbera MJ, Schliiter A, Pedraza N, Iglesias R, Villarroya F, Giralt M
(2001) Peroxisome proliferator-activated receptor activates transcrip­
tion of brow n fat uncoupling protein-1 gene. A link betw een regula­
tion of the therm ogenic and lipid oxidation pathw ays in the brow n fat
cell. J Biol Chem 276:1486-1493
21. H ansen JB, Kristiansen K (2006) Regulatory circuits controlling w hite
versus brow n adipocyte differentiation. Biochem J 398:153-168
22. Tiraby C, T avem ier G, Lefort C, Larrouy D, Bouillaud F, Ricquier D,
Langin D (2003) A cquirem ent of brow n fat cell features by hum an
w hite adipocytes. J Biol Chem 278: 33370-33376
23. W u Z, Puigserver P, A ndersson U, Z hang C, A delm ant G, Mootha V,
Troy A, Cinti S, Lowell B, Scarpulla RC, Spiegelm an BM (1999) Mecha­
nism s controlling m itochondrial biogenesis and respiration through
the therm ogenic coactivator PGC-1. Cell 98:115-124
24. H ondares E, Mora O, Yubero P, Rodriguez de la Concepcion M, Igle­
sias R, Giralt M, Villarroya F (2006) Thiazolidinediones and rexinoids
induce peroxisome prolifrrator-activated receptor-coactivator (PGC)l a gene transcription: an autoregulatory loop controls P G C -la expres­
sion in adipocytes via peroxisome proliferator-activated receptor-y
coactivation. Endocrinology 147: 2829-2838
25. Rodriguez de la Concepcion ML, Dom ingo JC, Dom ingo P, Giralt M,
Villarroya F (2004) U ncoupling protein 1 gene expression implicates
brow n adipocytes in highly active antiretroviral therapy-associated
lipomatosis. AIDS 18: 959-960
26. H ansen JB, Jorgensen C, Petersen RK, Hallenborg P, De Matties R,
Boye HA, Petrovic N, Enerback S, N edergaard J, Cinti S, te Riele H,
Kristiansen K (2004) Retinoblastom a protein functions as a m olecu­
lar sw ith determ ining w hite versus brow n adipocyte differentiation.
P N A S 101: 4112-4117
27. W olkow CA, Iser WB (2006) Uncoupling proteins hom ologes m ay
provide a link betw een m itochondria, m etabolism and lifespan. Age­
ing Res Rev 5:196-208
28. Echtay KS, Esteves TC, Pakay JL, Jekabsons MB, Lambert AJ, Portero-Otin M, Pam plona R, Vidal-Puig AJ, W ang S, Roebuck SJ, Brand
MD (2003) A signalling role for 4-hydroxy-2-nonenal in regulation of
m itochondrial uncoupling. EMBO J 22: 4103-4110
29. W acker M, W anek P, Eder E (2001) Detection of l,N 2-propanodeoxyguanosine adducts of frans-4-hydroxy-2-nonenal after gavage of trans4-hydroxy-2-nonenal or induction of lipid peroxidation with carbon
tetrachloride in F344 rats. Chem Biol Interact 137: 269-283
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
30. N igam S, Schewe T (2000) Phospholipase A2s and lipid peroxidation.
Biochim Biophys Acta 1488:167-181
31. McLeod C, Aziz A, Hoyt RF Jr, McCoy JP Jr, Sack M N (2005) Uncou­
pling proteins 2 and 3 function in concert to augm ent tolerance to car­
diac ischemia. J Biol Chem 280: 33470-33476
32. Arsenijevic D, O num a H, Pecqueur C, Raim bault S, M anning BS, Miroux B, C ouplan E, Alves-Guerra MC, G oubern M, Surw it R, Bouillaud
F, Richard D, Collins S, Ricquier D (2000) D isruption of the uncoupling
protein-2 gene in mice reveals a role in im m unity and reactive oxygen
species production. N at Genet 26:435-439
44. D erdak Z, Fülöp P, Sabo E, Tavares R, Berthiaume EP, Resnick MB,
Paragh G, W ands JR, Baffy G (2006) Enhanced colon tum or induction
in uncoupling protein-2 deficient mice is associated w ith NF-kB activa­
tion and oxidative stress. Carcinogenesis 5: 956-961
45. H orim oto M, Resnick MB, Konkin TA, Routhier J, W ands JR, Baffy
G (2004) Expression of uncoupling protein-2 in hum an colon cancer.
Clinical Cancer Research 10: 6203-6207
33. Argiles JM, Busquets S, Lopez-Soriano FJ (2002) The role of uncoupling
proteins in pathophysiological sates. Biochem Biophys Res C om m un
293:1145-1152
46. H arper ME, A ntoniou A, Villalobos-Menuey E, Russo A, Trauger R,
Vendem elio M, George A, Bartholom ew R, Carlo D, Shaikh A, Kupperm an J, New ell EW, Bespalov IA, W allance SS, Liu Y, Rogers JR,
Gibbs GL, Leahy JL, Camley RE, M elam ende R, Newell MK (2002)
Characterization of a novel metabolic strategy used by drug-resistant
tum or cells. FASEB J 16:1550-1557
34. Rousset S, Mozo J, D ujardin G, Emre Y, M asscheleyn S, Ricquier D,
C assard-Doulcier AM (2007) UCP2 is a m itochondrial transporter w ith
an unusual very short half-life. FEBS Lett 581: 479-482
47. Sanders PM, Tisdale MJ (2004) Role of lipid-m obilizing factor (LMF) in
protecting tum or cells from oxidative damage. Brit J Cancer 90:12741278
35. Blanc J, Alves-Guerra MC, Esposito B, Rousset S, G ourdy P, Ricquier
D, Tedgui A, M iroux B, M allat Z (2003) Protective role of U ncoupling
protein 2 in atherosclerosis. Circulation 107: 388-390
48. A ndrew s ZB, Diano S, H orvath TL (2005) M itochondrial uncoupling
proteins in the CNS: in support of function and survival. N at Rev Neurosci 6: 829-840
36. Kim HS, Park KG, Koo TB, H uh S, Lee IK (2007) The m odulating ef­
fects of the overexpression of uncoupling protein 2 on the form ation of
reactive oxygen species in vascular cells. Diabetes Research and Clini­
cal Practice 77S: 46-48
49. Yasuno K, A ndo S, M isum i S, Makino S, Kulski JK, M uratake T,
Kaneko N, A m agane H, Som eya T, Inoko H, Suga H, Kanemoto K,
Tam iya G (2007) Synergistic association of m itochondrial uncoupling
protein (UCP) genes w ith schizophrenia. A m J M ed Genet N europsychiatr G enet Part B 144B: 250-253
37. Kua C H (2006) Hypothesis. Uncoupling the relationship betw een fatty
acids and longevity. IUBMB Life 3:153-155
38. H oerter j, Gonzalez-Barroso MM, Couplan E, Mateo P, Geliy C, Cas­
sard-D oulcier AM, Diolez P, Bouillaud F (2004) M itochondrial u n ­
coupling protein 1 expressed in the heart of transgenic mice protects
against ischem ic-reperfusion dam age. Circulation 5: 528-533
39. Suleim an MS, H alestrap AP, Griffiths EJ (2001) Mitochondria: a target
for m yocardial protection. Pharm acol Ther 89: 29-46
40. Teshim a Y, Akao M, Jones SP, M arban E (2003) U ncoupling protein-2
overexpression inhibits m itochondrial death pathw ay in cardiom yocytes. Circ Res 93:192-200
41. Flandin P, Donati Y, Barazzone-Argiroffo C, M uzzin P (2005) Hyperoksja-m ediated oxidative stress increases expression of UCP3 m RNA
and protein in skeletal muscle. FEBS Lett 579: 3411-3415
42. H ussain SP, Hofseth LJ, H arris CC (2003) Radical causes of cancer. N at
Rev Cancer 3: 276-285
43. M artindale JL, H olbrook NJ (2002) Cellular response to oxidative
stress: signaling for suicide and survival. J Cell Physiol 192:1-15
50. W iederkehr A, W ollheim CB (2006) Minireview: Im plication of m i­
tochondria in insulin secretion and action. Endocrinology 147: 26432649
51. Zhang CY, Baffy G, Perret P, Krauss S, Peroni O, Grujic D, H agen T,
Vidal-Puig AJ, Boss O, Kim YB, Zheng XX, W heeler MB, Shulm an GI,
C han CB, Lowell BB (2001) U ncoupling protein-2 negatively regulates
insulin secretion and is a major link betw een obesity, beta cell dysfunc­
tion, and type 2 diabetes. Cell 105: 745-755
52. C han CB, De Leo D, Joseph JW, M cQuaid TS, H a XF, Xu F, Tsushim a
RG, Pennefather PS, Salapatek AM, W heeler MB (2001) Increased un­
coupling protein-2 levels in ß-cells are associated w ith im paired glu­
cose-stim ulated insulin secretion: m echanism of action. Diabetes 50:
1302-1310
53. Hoeks J, Hesselink MKC, Schrauw en P (2006) Involvem ent of UCP3 in
m ild uncoupling and lipotoxicity. Exp Gerontology 41: 658-662
54. Schrauw en P, Hesselink MK, Blaak EE, Borghouts LB, Schaart G, Saris
W H, Keizer HA (2001) U ncoupling protein 3 is decreased in skeletal
muscle of patients w ith type 2 diabetes. Diabetes 50: 2870-2873
Uncoupling proteins in modulation of mitochondrial
functions — therapeutic prospects
Andrzej Woyda-Ploszczyca, Wieslawa Jarmuszkiewicz
L aboratory of Bioenergetics, Faculty of Biology, A dam M ickiewicz U niversity, 89 U m ultow ska St., 61-614 Poznan, Poland
e-mail: w iesiaj@ am u.adu.pl
Key words: uncoupling proteins, reactive oxygen species, lipid peroxidation, obesity, type-2 diabetes, oncogenesis, ischem ia-reperfusion injury,
neurodegeneration
ABSTRACT
Enormous interest in mitochondrial uncoupling proteins (UCPs) is caused by relevant impact of these energy-dissipating system s on cellular
energy transduction. A key role of UCPs in regulation of mitochondrial metabolism is supported by existence of their different isoforms in
various mammalian tissues. Recent studies have show n that UCPs have an important part in pathogenesis of various disorders, such as obe­
sity, type-2 diabetes, cachexia, aging or tumor. The obscure roles of UCPs in normal physiology and their em erging role in pathophysiology,
provide exciting potential for further investigation. However, neither the exact physiological nor biochemical roles of UCP hom ologues are
w ell understood. Therefore, providing mechanistic explanation of their functions in cellular physiology may be the basis for potential farmacological targeting of UCPs in future on clinical scale.
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
197
Mitochondria śródbłonka — nowy cel dla
farmakologii dysfunkcji śródbłonka
STRESZCZENIE
Antoni Wrzosek1
Agnieszka Łojek12
Iwona Stanisławska3
Antonina Chmura-Skirlińska1
Krzysztof Dołowy2
Stefan Chłopicki3'
Adam Szewczyk1
’Pracow nia W ew nątrzkom órkow ych K ana­
łów Jonow ych, Instytut Biologii D ośw iad­
czalnej PA N im. M. N enckiego, W arszaw a
2K atedra
Fizyki,
Szkoła
G łów na
Go­
sp o d arstw a
W iejskiego,
W arszaw a
’Z akład Farm akologii D ośw iadczalnej, Kate­
d ra Farm akologii, U niw ersytet Jagielloński,
Collegium M edicum , Kraków
^P racow nia W ew nątrzkom órkow ych K ana­
łów Jonow ych, Z akład Biochemii, Instytut
Biologii D ośw iadczalnej PA N im. M. N enckie­
go, ul. Pasteura 3, 02-093 W arszaw a; e-mail:
a.szewczyk@ nencki.gov.pl lub
Z akładFarm akologii D ośw iadczalnej, K atedra
Farm akologii,
U niw ersytet
Jagielloński,
Collegium M edium , ul. G rzegórzecka 16, 31531 Kraków; e-mail: s.chlopicki@ jmrc.org.pl
A rtykuł otrzym ano 13 m aja 2008 r.
A rtykuł zaakceptow ano 19 m aja 2008 r.
Słowa kluczowe: śródbłonek, m itochondria,
kanały jonow e, apoptoza, z a p a le n ie /d y sfu n k ­
cja śródbłonka, farm akologia śródbłonka
Wykaz skrótów: AMPK — białkowa kinaza ak­
tyw ow ana AMP; A ngll — angiotensyna II; Bax,
Bak — białka proapoptyczne z rodziny Bcl-2;
CAT-3 - katalaza 3; COX-1, COX-2 - cyklooksygenazy 1 i 2; EDHF — śródbłonkow y czynnik
hiperpolaryzacyjny; EET — kwas epoksyeikozatrienowy; ET-1 — endotelina 1; GSH — glutation;
IAP — inhibitor apoptozy; ICAM-1, PECAM-1,
VCAM-1 — cząstki adhezyjne; IL-1, IL-6, IL-8
— interleukiny 1,6 i 8; LDL — lipoproteiny o ni­
skiej gęstości; MCP-1 — czynnik chemotaktyczny monocytów; m tD NA- m itochondrialne DNA;
m tNOS — m itochondrialna syntaza tlenku azo­
tu; N F - k B — jądrow y czynnik transkrypcyjny k B;
NOS — syntaza tlenku azotu; PGI2 — prostacyklina I2; ROS — reaktyw ne form y tlenu; RyR —
receptor rianodynow y; TM — trom bom odulina;
TNF-a — czynnik m artwicy now otw oru; t-PA
— tkankow y aktyw ator plazm inogenu
Podziękowanie: Praca pow stała w ram ach Pol­
skiej Sieci M itochondrialnej (M itoNet.pl)
198
s
ródbłonek naczyniowy składa się z jednej warstwy komórek wyściełających każde na­
czynie krwionośne. Choć rozproszony, stanowi ważny narząd ustroju, który przez swoją
prawidłową czynność (parakrynną, autokrynną i endokrynną) utrzymuje homeostazę ukła­
du krążenia. Natomiast dysfunkcja śródbłonka prowadzi do rozwoju w ielu chorób, takich
jak miażdżyca, cukrzyca i niewydolność serca. Dysfunkcja śródbłonka jest ściśle związana
z nadmiernym wytwarzaniem w olnych rodników tlenowych, rozwojem stresu oksydacyj­
nego i odpowiedzią zapalną. W tych procesach ważną rolę odgrywają prawdopodobnie mitochondria. W przeciwieństwie do w ielu innych komórek, komórki śródbłonka wytwarzają
ATP głównie na drodze glikolizy, a zatem w tych komórkach mitochondria mają n iew iel­
kie znaczenie w syntezie ATP. Jednakże, jak wykazują ostatnie badania, w olnorodnikowe
mechanizmy mitochondrialne w powiązaniu ze zmianami wewnątrzmitochondrialnej i
wewnątrzkomórkowej homeostazy jonowej mogą brać udział w regulacji szlaków sygna­
łowych, prowadzących do rozwoju stanu zapalnego śródbłonka, stresu oksydacyjnego oraz
apoptozy komórek śródbłonka. W tym kontekście mitochondria komórek śródbłonka zaczy­
nają być uznawane za now y cel farmakoterapii dysfunkcji śródbłonka i w chorobach układu
krążenia.
Ś
WPROWADZENIE
Śródbłonek już daw no aw ansow ał ze statusu „płachty celofanu z pow kle­
janymi jądrami kom órkow ym i" do statusu ważnego n arządu ustroju, którego
harmonijna czynność autokrynna, parakrynna i endokrynną w pływ a na p ra­
w idłow e funkcjonowanie układu krążenia. Praw idłow a czynność śródbłonka
utrzym uje zdrowie układu krążenia, a dysfunkcja (zapalenie) śródbłonka o d ­
gryw a kluczową rolę w rozwoju miażdżycy, cukrzycy, jak rów nież wielu innych
chorób układu krążenia. W iedza o śródbłonkow ych m echanizm ach regulacji
układu krążenia pochodząca z badań podstaw ow ych i klinicznych zarysowuje
now y paradygm at choroby układu krążenia, którego wyznacznikiem jest dys­
funkcja śródbłonka [1-5]. Dysfunkcja śródbłonka związana jest z upośledzeniem
w ytw arzania naczynioochronnych przekaźników śródbłonka, takich jak tlenek
azotu (NO) i prostacyklina (PGI,), nadm iernym w ytw arzaniem anionorodnika
ponadtlenkowego (Oy ), zw iększoną syntezą prozapalnych cytokin (np. IL-6, IL8), chemokin (np. MCP-1), cząsteczek adhezyjnych (np. selektyny P, selektyny
E, ICAM-1, VCAM-1), aktywacją czynników prozakrzepow ych w śródbłonku
(np. PAI-1). Ostatnie badania w skazują na istotną rolę sygnalizacji zależnej od
mitochondriów w m echanizm ach dysfunkcji śródbłonka. Celem niniejszego
artykułu jest przedstaw ienie zarysu w iedzy o m itochondriach kom órek śród­
błonka ze szczególnym uw zględnieniem sygnalizacyjnej roli mitochondriów,
roli mitochondriów w utrzym aniu hom eostazy jonowej śródbłonka i regulacji
odpow iedzi zapalnej śródbłonka przez m echanizm y w olnorodnikow e zależne
od mitochondrialnego łańcucha oddechow ego.
MITOCHONDRIA KOMÓREK ŚRÓDBŁONKA
Mitochondria to organelle, których w nętrze otoczone jest dw iem a błonami
lipidowo-białkowymi, w ew nętrzną oraz zewnętrzną. W w ewnętrznej błonie
mitochondrialnej znajdują się enzym y łańcucha oddechow ego odpow iedzialne
za w yrzut jonów H + z macierzy kosztem energii uwalnianej podczas utlenia­
nia substratów oddechowych. W ew nętrzna błona m itochondrialna jest nieprze­
puszczalna dla H +, co um ożliw ia w ytw orzenie gradientu protonow ego i różnicy
potencjału elektrycznego (Aip) w poprzek tej struktury, który na wew nętrznej
błonie mitochondrialnej m oże osiągać w artość około -180 mV. Różnica stężenia
jonów H + (ApH) między macierzą m itochondrialną a przestrzenią międzybłonow ą może osiągać niekiedy wartość 1,5 jednostki pH (zazwyczaj jest to 0,5-1
jednostki pH). Zewnętrzna błona m itochondrialna stanow i półprzepuszczalną
barierę, w której znaczącą rolę odgryw a zależny od potencjału kanał anionow y
YDAC prace przeglądow e [6,7], Powstałe ApH oraz Aip tworzą wspólnie silę
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
protonom otoryczną [8], W celu osiągnięcia stanu ró w n o w a­
gi protony wracają do macierzy mitochondrialnej, transpor­
tow ane przez syntazę ATP (EC 3.6.3.14), czemu tow arzyszy
synteza ATP z ADP i fosforanu nieorganicznego.
W ostatnich latach pojawiły się jednak dane sugerują­
ce, że m itochondria są bardziej organellam i sygnałow ym i
niż „elektrow nią" [9] i taką rolę odgryw ają w kom órkach
śródbłonka. Pom im o tego że kom órki śródbłonka zaw ie­
rają liczne m itochondria, nie są one głów nym miejscem
syntezy ATP w tych kom órkach (Ryc. 1). W kom órkach
śródbłonka zachodzi bow iem intensyw na glikoliza. Może
mieć to zw iązek z d u ż ą ilością w y tw arzan ego N O przez
kom órki śródbłonka, który z kolei w iąże się z oksydazą
cytochrom ow ą, końcow ym enzym em łańcucha o dd echo­
w ego [10]. O d działy w an ie oksydazy cytochrom owej z NO
w yw ołuje spadek zużycia 0 2 w cytosolu i kom pensuje o d ­
pow ied ź kom órki na obniżoną zaw artość tlenu. Z ap ew ­
ne jest to jednym z po w o dów , dla którego w kom órkach
śródbłonka czynnik in d u k o w an y niedotlenieniem (HIF,
ang. hipoxia-inducable factor) l a ulega stabilizacji dopiero
poniżej 0,5% stężenia O r
Ś ródbłonek jest w a rstw ą kom órek bez p o śre d n io k o n ­
taktującą się z krw ią, sto su n k o w o niew rażliw ą na u sz k a ­
dzające d ziałanie niskiego stężenia tlenu. K om órki śró d ­
błonka jed nak jako pierw sze „odczytują" zm iany stężenia
O, w e krwi. N a zasadzie analogii z kom órkam i m ięśni
oddecho w ych, które reagują na lokalne zm iany stężenia
tlenu (p ra w d o p o d o b n y u d z ia ł ROS) [11], liczni badacze
postulu ją p o d o b n ą rolę m ito ch o n d rió w kom órek śró d ­
błonka [12].
UDZIAŁ MITOCHONDRIÓW W APOPTOZIE
KOMÓREK ŚRÓDBŁONKA
W w ielu ty pach kom órek m ito chond ria odgryw ają
kluczo w ą rolę w procesach a p o p to zy i analogiczne m e­
ch an izm y w ystępu ją w k o m ó rkach śródbłonka. O g rom ną
uw ag ę pośw ięca się procesow i ap o p to z y w kom órkach
śródbłonka, b ow iem ten proces jest ściśle zw iązany z
jego z a p alan iem (dysfunkcją) i m a istotne znaczenie w
rozw oju m iażd życy w n aczyniach krw ionośnych. C zy n ­
nikam i, które w yw ołują zapalen ie śró dbło nka są m iędzy
innym i: stres oksydacyjny, a ngiotensy na II (Ang II), czy
też cholesterol. Bodźce w yw ołujące ap o p to zę m ożna p o ­
dzielić na fizjologiczne (realizow aną p o p rze z receptory
dla TNF, CD95) lub streso w e (np. p ro m ienio w an ie UV,
u sz k o d z en ie DNA, n a d m ie rn y n ap ły w jonów w apnia,
zakażenia bakteryjne lub w iru sow e) [13]. Bardzo często
a p o p to z a jest w ynikiem u sz k o d z e ń m itochond riów , a
z w łaszcza białek m itochon drialnych, en zym ów , których
u sz k o d z en ia przyczyniają się do p o w staw an ia ROS [14],
W procesie ap o p to zy u czestniczą białka sygnałow e, takie
jak kasp a z y i białka z ro d zin y Bcl-2, a także sfingomieliny. Szczególną funkcję pełnią białka z ro d zin y Bcl-2, takie
jak białka p ro a p o p to ty c zn e Bax i Bak, które uczestniczą w
fo rm o w a n iu się po ró w w zew nętrznej błonie m itochon ­
drialnej i tym sam y m czynią ją p rz ep u szc z aln ą dla w ielu
sk ład n ik ó w kom órk ow ych. Inn ym m echan izm em w p ły ­
w ającym na zm ian ę przepuszczalno ści błon m ito chon­
d rió w w procesie a p o p to z y jest o d d ziały w an ie białek
Bcl-2 z siateczką śró d p laz m a ty c zn ą , co w konsekw encji
p o w o d u je u w a ln ia n ie dużej ilości C a2+, które aktyw ują
kanał PTP (ang. permeability transition pore), znajdujący się
w m ito ch o n d riach [15], W zależności od rodzaju bodźca
szlaki a p o p to z y m ogą być różne, ale elem entem łączącym
je w ydają się być m itochon dria, np. w p rz y p a d k u a k ty ­
wacji receptorów CD95 i TNFR (receptor TNF) następuje
e n zy m aty czn e cięcie białka Bid, co p ow o d u je zm ianę konform acyjną oraz oligom eryzację białka Bax, które n a stę p ­
nie w b u d o w u je się ze w n ę trz n ą błonę m itochondrialną.
W szystkie te procesy mają n a stęp stw o w postaci zm iany
p rzep u szczaln o ści błon m itochondrialnych, co skutkuje
w y p ły w e m z m ito ch o n d rió w takich czynników pro ap o p totycznych, jak cytochrom c, Sm ac/D IA B L O (ang. second
tnitochondria-derived activator of caspases/direct IAP binding
protein with low pi), A IF , H trA 2, e n d o n u k lea z y G [16], C y­
tochrom c inicjuje u tw o rze n ie k om plek su w ra z z Apaf-1,
dATP, ka sp a z ą 9, tzw. ap o p to so m u , który następnie ak­
tyw uje kasp azę 3. Sm ac/D IA B L O , H trA 2 z kolei inaktyw ują IAP- inhibitor ap o p to zy , a do k ład n ie ap optosom u.
N ato m iast AIF i en d o n u k lea z a G działają na m ateriał
genetyczny (Ryc. 2). W szystkie te procesy p ro w a d z ą do
z m ian m orfologicznych k om órki i fragm entacji DNA, a w
konsekw encji do a p o p to zy [13,17,18].
MITOCHONDRIA KOMÓREK ŚRÓDBŁONKA
JAKO MIEJSCE POWSTAWANIA
REAKTYWNYCH FORM TLENU I AZOTU
11.9 ąm
Rycina 1. M itochondria kom órek śród błonk a linii EA.hy 926. M itochondria ko­
m órek linii EA.hy 926 w yz n ak o w a n o fluorescencyjnie p o p rzez transfekcję ko­
m órek plazm idem zaw ierającym sekw encję kodującą białko GFP, sp rzężoną z
sekw encją kierującą d o w ew nętrznej błony m itochondrialnej.
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
N a d m iern e w y tw a rz a n ie an io n o ro d n ik a ponadtlenkow ego p rzez m ito ch o n d rialn y łańcuch od d e c h o w y lub
w inn ych reakcjach (np. katalizo w an y ch p rzez oksydazę
N A D (P)H , o ksyd azę k san ty n o w ą lub m ono m er syntazy
http://rcin.org.pl
199
dechow y jest elim in ow any po p rz e z m a n g an o w ą d js m u tazę p o n ad tle n k o w ą (MnSOD), która katalizuje przejście
0 2*' w H 20 2. Reakcja m oże przebiegać ró w n ie ż spon ta­
nicznie.
O.
Rycina 2. Rola m itochon driów w procesach energetycznych kom órki i przekazy­
w a n iu sygnałów . A. P odstaw ow a rola m itochon drium , czyli w ytw arzanie energii
użytecznej w postaci ATP i p o w staw an ie re ak ty w n ych form tlenu (kom pleksy I i
III) oraz u d ział w u trz y m y w a n iu hom eostazy w apnia. B. Szlaki sygnałow e takich
procesów , jak: apo ptoza, m o nito row anie lokalnego stężenia tlenu i zm iana eks­
presji genów . ROS — reak ty w ne form y tlenu; P — fosforan nieorganiczny; ATP
— adenozynotrifosforan; CD59 — receptor błonow y; TNF — czynnik m artw icy
n ow otw o ru; Bcl-2 — ro d z in a białek biorących ud ział w apoptozie; AIF — czynnik
indukcji apo ptozy; SM AC — ang. second mitochondria-derived activator o f caspases;
DIABLO — ang. direct inhibitor o f apoptosis-binding protein with a low isoelectric
point; H trA 2 /O m i — proteaza serynow a; IA P — inhib ito r apoptozy; APAF-1
— ang. apoptotic protease activating factor 1; dA TP — deoksyadenozynitrifosforan;
H IF — ang. hypoxia inducible factor. N a rycinie schem atycznie rozdzielono aktyw ­
ność m ito ch ond rió w z aan gażo w an ą w syntezę A TP (A) oraz szlaki sygnałow e
zw iązan e m.in. z apoptozą.
NO) jest cen traln y m p u n k te m o d p o w ie d z i zapalnej śródbłonka. W m itochon driach w y tw a rz a n y jest jednak nie
tylko O f ' , ale rów nież inne ROS, takie jak H ^02 i rodnik
h y d ro k sy lo w y (H O ’), których działanie, ze w zględu na
w ysoką reaktyw no ść tych cząstek w sto sunk u do pozo­
stałych sk ładnik ów kom órek, najczęściej kojarzone jest z
u sz k a d z a n ie m licznych stru k tu r kom órkow ych poprzez
reakcje z substancjam i o d u ż y m biologicznym znaczeniu,
jak m tD N A , białka i lipidy błon ow e [19]. W macierzy
m itochondrialnej 0 2‘" g en ero w an y p o p rz e z łańcuch o d ­
200
+ 0 2- + 2H20
0 2 + 2H 20 2
Ze w z g lę d u na zd olność H 20 2 do u tle n ia n ia jonów
m etali w tzw . reakcji Fentona, p o z o rn ie n ieszk o d liw y
H 20 2 p rz ek sz ta łc a się w je d e n z najbardziej re ak ty w n y ch
ro d n ik ó w , ro d n ik h y d ro k sy lo w y (H O ’). P e ro k sy d aza
g lu ta tio n o w a katalizuje reakcję przejścia n a d tle n k u w o ­
d o ru w H 20 . G lu ta tio n (GSH), k tó ry pełni funkcję kofa k to ra p e ro k sy d a z y g lu tatio n o w ej oraz a n ty o k sy d a n ta
i z m iatacza re a k ty w n y c h form tlenu jest o d tw a rz a n y
w tym procesie p o p rz e z re d u k ta z ę g lu ta tio n o w ą . H , 0 2
pow stający w m ito c h o n d ria c h m o że być u s u w a n y z a ­
ró w n o p rz ez p e ro k sy d a z ę g lu ta tio n o w ą , p ero k sy d a zę
cy to c h ro m u c, jak i z lo k alizo w an ą w m ito ch o n d riac h katalazę CAT-3. N ależy w sp o m n ie ć ró w n ie ż o m itochond ria ln y m sy stem ie p rz e ciw u tle n iają c y m tio red o k sy n y
(Trx, ang. thioredoxin), która, jak w y n ik a z ostatnich b a ­
dań , pełni w aż n ą funkcję o ch ro n n ą w o d p o w ie d z i z a ­
palnej śró d b ło n k a [20], Ze w z g lę d u na to, że H 20 2 m a
zdo ln o ść szybkiej dyfuzji p rze z bło ny lip id o w e może
być także ro z k ła d a n y p rz e z k atalazę z lo k alizo w an ą w
cytoplazm ie. A n io n o ro d n ik p o n a d tle n k o w y m o ż e ró w ­
nież reag o w ać z NO, tw o rzą c n a d tle n o a z o ty n (ON OO').
N O jest cząsteczką o c h a ra k te rz e ro d n ik o w y m , która ze
w z g lę d u na historię sw ojego odkry cia, jako naczynioro zk u rczający c zy n n ik p o c h o d z en ia śró d b ło n k o w eg o
(EDRF, ang. endothelium-derived relaxing factor), kojarzy
się ściśle z k o m ó rk a m i śró d b ło n k a [5,21]. G azow y c h a ­
ra k ter, n iew ielk ie ro zm iary cząsteczki oraz lipofilność
po w o d u ją , że N O , p o m im o k rótkiego czasu życia, ła­
tw o p rze n ik a p rz e z błony biologiczne bez p o śre d n ic tw a
u k ła d ó w tra n sp o rtu ją cy ch na re la ty w n ie d u ż e od leg ło ­
ści. Synteza N O w ko m ó rk a c h o d b y w a się z u d z ia łe m
e n z y m u sy n taz y tlen k u a z o tu (NOS, EC 1.14.13.39), k tó ­
ry k atalizuje reakcję jego sy n tezy z a m in o k w a su L-argi­
niny. NOS jest je d n y m z najbardziej sk o m p lik o w a n y c h
en z y m ó w , któ ry d o swojej ak ty w n o ści w y m a g a obecno­
ści 0 2, N A D PH , , FAD, FM N, h em u , tetra h y d ro b io p te ry n y (BH ) i k alm o d u lin y . D o m inującą izoform ą syntazy
N O w k o m ó rk a ch śró d b ło n k a jest NOS-3. O p ró cz trzech
d o b rz e sc h a ra k te ry z o w a n y c h izoform NO S (NOS-1,2,3),
o sta tn io z id e n ty fik o w a n o form ę m ito c h o n d ria ln ą tego
e n z y m u (mtNOS) w k o m ó rk ach ssak ó w p o ch o d zący ch z
ró ż n y c h tk a n e k [22] oraz w y k a z a n o fu n k cjo n aln y z w ią ­
zek p o m ię d z y a k ty w n o śc ią m tN O S i m ito c h o n d ria ln e g o
k o m p le k su I w regulacji sy n tezy N O i czynności m ito ­
c h o n d rió w [23,24].
SYGNALIZACYJNA ROLA MITOCHONDRIALNYCH
ROS W ŚRODBŁONKU
Do n ie d a w n a pro dukcja ROS p rzez m itochon dria ko­
m ó rek śródbłonka była pom ijana, gd yż uw ażano, że ko­
m órki te ch arakteryzują się m ałą aktyw nością m itochon ­
drialneg o łańcucha o dd ech o w eg o oraz niskim stężeniem
p ro d u k o w a n y c h ROS w stosu n k u do innych kom órek.
Jedn ak b a d an ia ostatnich lat w yra źn ie w skazują, że ROS
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
p ełn ią b ard z o w aż n ą funkcję sygnalizacyjną i regulacyj­
ną. W kom órkach śró d b ło n k a n aczy ń krw io n o śn y ch ROS
są za a n g a ż o w an e w regulację napięcia n aczyń k rw io ­
no śn y ch w o d p o w ie d ź na niedotlenienie, n am nażanie,
w z ro st k o m órek oraz apoptozę. W szczególności ROS o d ­
g ryw ają istotną rolę w o d p o w ie d z i zapalnej śró d b ło n k a
[25,26],
W m ito c h o n d ria ln y m łańcuch u o d d ec h o w y m ROS
pow stają głów nie w kom pleksie III łańcucha, p ra w d o ­
po d o b n ie p o p rz e z utlenienie sem iub ichin onu, oraz przy
u d z iale kom p lek su I głów nie na d ro d z e od w ro tn e g o
tra n sp o rtu elek tro n ó w [27], Jednak źródło ROS zależy
od bod źca stym ulującego o d p o w ie d ź śródb ło nka. A k ­
tyw no ść k o m p le k su III łańcucha o d d ech o w eg o kom órek
śró d b ło n k a żyły pępo w inow ej w produkcji ROS obser­
w uje się p odczas n ie d o tle n ie n ia /n a tle n ie n ia lub po sty­
m ulacji TN F-a [28], W y tw arzan ie ROS w tych kom órkach
u ru c h a m ia ró w n ież ich stym ulacja lizofosfatydylocholiną
[29]. K om pleksy I i III o d p o w ie d z ia ln e są za p rodukcję
ROS także p odczas rozszerzen ia naczyń w ieńcow ych,
w y w o ła n e g o p rzez siły ścinające [30],
P o w sta w a n ie ROS m oże być s ty m u lo w a n e p rzez
ró ż n e czyn niki, z czego na n ajw ięk szą u w a g ę z a s łu g u ­
ją: d e p o la ry z a c ja w e w n ę trz n e j bło ny m ito ch o n d rialn ej,
p o d w y ż s z o n e stężenie C a2+ i / l u b z m ia n y stężen ia NO.
Istnieją d a n e w sk azu jące na z w ią ze k p o m ię d z y w y so ­
kim s tę ż en ie m C a2+ w m acierzy m ito ch o n d ria ln e j a w y ­
tw a rz a n ie m ROS p rz e z łań cu ch o d d e ch o w y . Rozw ażając
w p ły w stężenia C a2+ na p ro d u k c ję ROS, b ierze się p o d
u w a g ę m ięd z y in n y m i zw ięk sz a n ie p rz e p ły w u elek­
tro n ó w p rz e z łań cu ch o d d e c h o w y jako w y n ik a k ty w a ­
cji cyk lu k w a só w trik arb o k sy lo w y c h o raz zw ięk szen ie
p ro d u k c ji tlen k u a z o tu p rz e z NOS [25]. N O w y tw a rz a n y
p rz e z m tN O S w m ito c h o n d ria c h k o m ó re k śró d b ło n k a ,
m oże lokalnie w p ły w ać na łańcuch o d d e c h o w y i p o ­
w sta w a n ie 0 2‘". N ajbardziej p o z n a n y m do tej p ory m e ­
c h a n iz m e m regulacji w y tw a rz a n ia ROS p o d w p ły w e m
N O w m ito c h o n d ria c h k o m ó rek śró d b ło n k a jest jego
o d d z ia ły w a n ie z k o m p lek se m IV łań cu ch a o d d e c h o w e ­
go. N isk ie stężenie N O h am u je o d w ra c aln ie o k sy d azę
c y to c h ro m o w ą (kom pleks IV łań cu ch a o d d e ch o w e g o ) i
w ten sp o só b zw ię k sza p ro d u k c ję H 2O r Z drugiej stro ­
ny N O zm niejsza ak ty w n o ść b io log iczn ą O / ’ p o p rz e z
b e z p o śre d n ią reakcję z 0 2*‘, p ro w a d z ą c do u tw o rz e n ia
O N O O '. P o śre d n io u ła tw ia u su w a n ie 0 2*' p rz e z cytoc h ro m c p o p rz e z sta b ilizo w an ie białka i b lo k o w a n ie jego
w y p ły w u z m ito c h o n d riu m [25]. P o n a d to , N O m oże b lo ­
kow ać a k ty w n o ść k o m p le k su I łań cu ch a o d d e c h o w e g o
p o p rz e z tw o rz e n ie S-nitrozotioli [31]. N O m oże w ięc re ­
g u lo w a ć w y tw a rz a n ie ROS łańcu cha o d d e c h o w e g o i jest
to u w a ru n k o w a n e m iejscem jego o d d z ia ły w a n ia z ła ń ­
cu c h e m o d d e c h o w y ch , lo k aln y m ś ro d o w isk ie m red o k s
i tow arzyszącej o d p o w ie d z i w o ln o ro d n ik o w ej łańcucha
o d d e ch o w e g o .
Interesujący jest fakt, że p o w staw a n ie ROS i z a h a m o ­
w anie aktyw ności m ito chond rialn ego łańcuch o d d e c h o ­
w ego p o w o d u je aktyw ację kinazy białkowej zależnej od
AM P (AMPK) [9]. Tak więc czynność m ito ch o n d rió w m a
w p ły w na m etabo lizm kom órek śró d b ło n k a p rzez w y ­
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
tw a rza n ie ROS i n a tej d ro d z e reguluje tw orzen ie ATP w
śró d b ło n k u , a jego klasyczna rola bio energetyczna ma, jak
się w ydaje, m niejsze znaczenie. M itochondria, po p rzez
z w iększon ą syntezę ROS, regulują czynność śród błonka
nie tylko p rz ez aktyw ację AMPK, ale ró w n ież p op rze z
reakcję z szeregiem innych białek sygnalizacyjnych. ROS
m ogą być też ko m ó rk o w y m i cząsteczkam i sygnałow ym i,
regulując aktyw no ść niektórych e n zy m ó w i genów [32].
W arto dodać, że ROS w y tw a rz a n e w w ysokich stężeniach
m o gą w y w o ły w ać n ieo d w racaln e zm ian y czynności i
stru k tu ry śró d b ło n k a oraz p ro w ad zić do uszk o d zen ia
m tD N A [33,34].
Z w iększenie w y tw a rz a n ia ROS p rze z m ito ch o n d ria
jest ściśle p o w ią z a n e ze z m ian am i h o m eo sta z y jonowej
k o m ó re k śró d b ło n k a i ich m ito ch o n d rió w . W zrost a k ­
tyw ności ROS m oże być b o w iem w y w o łan y przez zw ię k ­
szenie w e w n ą trz k o m ó rk o w e g o stężenia jonów w a p n ia
([Ca2+].). Z m ia n a [Ca2+], w p ły w a na zm ian y stężenia Ca2+
w m ito ch o n d riac h , a to z kolei m a w p ły w na aktyw ność
w ielu e n z y m ó w m ito ch o n d rialn y ch . P o d w y ż szo n e stęże­
nie C a2+ p rz y c zy n ia się do w zm ożonej aktyw no ści ła ń c u ­
cha o d d e c h o w e g o i syn tezy ATP w ko m órkach, w łą c za ­
jąc w to ko m ó rk i śró d b ło n k a (Ryc. 3) [35]. W zrost [Ca2+].
p ro w a d z i nie tylko do aktyw acji m ito ch o n d rió w , ale też
do aktyw acji śró dbłonko w ej NOS. N ie m o żliw e jest więc
z ro z u m ie n ie sygnalizacyjnej roli m ito c h o n d ria ln y c h ROS
w śró d b ło n k u bez szczegółow ego p rze a n a liz o w a n ia m e ­
c h a n iz m ó w ho m e o sta zy jonow ej śródbłonk a.
HOMEOSTAZA JONOWA W
KOMÓRKACH ŚRÓDBŁONKA
Jony w a p n ia są p rzek aźn ik am i sygnałów , które m ogą
regulow ać w iele różnych funkcji kom órkow ych. K ażdy
ty p k o m ó rek syntetyzuje u n ik aln y zestaw system ów re ­
gulujących [Ca2+]., w celu w y tw o rze n ia sygnałow ej „ m a­
szynerii" opartej o jony w ap n ia, o różnej przestrzennej
i czasowej charakterystyce [36,37]. K om órki śród bło nka
ró w n ież d y sp o n u ją o d p o w ie d n im zestaw em „narzęd zi"
reg ulującym [Ca2+]., a ka ż d e z ab u rzen ie ich hom eostazy
Rycina 3. Schem t od d ziały w an ia N O z ROS i kom pleksam i łańcucha odd ech o­
w ego. R eaktyw ne form y tlen u w y tw a rz a kom pleks I i III m itochondrialnego łań­
cucha od dech ow ego . O znaczenia n a rycinie: m tN O S — m ito chondrialna syntaza
N O ; C yt C — o ksyd aza cytochrom ow ą; U CP — m itocho ndrialne białka ro z p rz ę ­
gające; A T — ró żnica potencjału n a w ew nętrznej błonie m itochondrialnej.
http://rcin.org.pl
201
m oże p ro w a d zić do zm ian, czasam i n ieo d w racaln y ch dla
kom órki. Sygnał w a p n io w y m oże pochodzić z przestrzeni
zew n ątrzk o m ó rk o w ej lub też z w e w n ą trz k o m ó rk o w y ch
m a g a z y n ó w w apn iow ych.
POTENCJAŁ BŁONOWY KOMÓREK ŚRÓDŁONKA
Kom órki śró dbłon ka należą do g ru p y kom ó rek niepob u d liw y ch elektrycznie, różniących się funkcją, m echani­
zm em , jak i szlakam i n a p ły w u jonów w a p n ia do ich w n ę­
trza od kom órek p o b u d liw y ch elektrycznie. Ich potencjał
bło now y (Vm) oraz [Ca2+], o dg ryw ają je d n a k istotną rolę
w procesach kontroli sk u rczu kom órek m ięśni gładkich.
Biorą one także u d ział w regulacji n a p rę ż e n ia naczynio­
w ego, a w efekcie in vivo — ciśnienia krw i, p o p rz e z kon­
trolę n aczy n io w o -ak ty w n y ch sygn ałów i ko n tak tó w m ię­
d z y k o m ó rk o w y c h zależnych od śró dbłonka. Potencjał
bło now y naczyn iow ych kom órek śró d b ło n k a jest ujemny
w sto su n k u do krw i i p rz e d z ia łu tkankow ego . Jego w a r­
tość, jak rów nież pojem ność i o pór wejścia (ang. input
resistance), różnią się znacząco w zależności od procesu
izolacji kom órek oraz sp osobu ich h o dow li. Upraszczając,
potencjał błonow y zależy od ty p u ko m ó rek śró dbłonka i
jest bardziej ujem ny w ko m órkach z m a k ro n a cz y ń niż z
m ikronaczyń.
Dla d an y ch uzy sk an y ch w izolo w anych kom órkach
śródb łonka potencjał sp oczy nkow y w a h a się w grani­
cach od 0 do -80 mV, pojem ność błony od 30 do 80 pF,
a op ó r wejścia p o m ięd z y 1 a 10 GQ. O kazało się, że w
hod ow li kom órki zlew ające się (ang. confluent) posiadają
w yższą w artość pojem ności błony (aż do 160 pF) i niższy
opór wejścia od 0.01 do 0.4 GD. C hociaż o statnie w arto ­
ści są dość n iepew ne, m im o w szystko w p lata ją się one
w spójny obraz z w iązan y z w y stę p o w a n ie m m ię d z y k o ­
m ó rko w y ch połączeń szczelinow ych [38-40], W o d n ie sie ­
niu do spoczynkow ego potencjału bło now ego izolo w ane
kom órki śródbłonka m ożna podzielić na d w ie p o d g ru p y
— typ-K oraz typ-Cl [39,41], Typ-K kom ó rek śró d b ło n k a,
w który ch sp oczynk ow y Vm sp a d a do w artości m ięd zy
-70 i -60 mV, jest potencjałem zbliżonym d o potencjału
N e rn sta dla jonów K+ (E J i w ten sposób ok reśla d o m i­
nującą rolę p rz e w o d n ictw a błonow ego dla K+, g łów nie w
odniesien iu do dok om ó rk o w eg o p rą d u p ro sto w n icz e g o
K+ (K.J. Z drugiej strony, typ-Cl kom órek śró d b ło n k a,
których potencjał spoczynkow y jest zw ykle p o m ię d z y -40
i -10 mV i zbliżony jest do potencjału N ern sta dla Cl (Ec|),
co sugeruje dom inujące p rz ew o d n ic tw o Cl' w o d n iesie ­
n iu do w a ru n k ó w spo czynk ow ych [42].
P oczątkow y w zro st w e w n ą trz k o m ó rk o w e g o stężenia
C a2+ po stym ulacji agonistą jest zw ykle s p o w o d o w a n y
w y p ły w e m jonów w a p n ia z w e w n ą trz k o m ó rk o w y c h
m agazynów , a utrzym ujące się p o d w y ż sz o n e [Ca2+], s p o ­
w o d o w a n e jest n a p ły w e m Ca2+ ze śro d o w isk a z e w n ą trz kom ó rk o w eg o [43,44]. W ydaje się zatem , że o p ró ż n ien ie
w ew n ątrz k o m ó rk o w y c h m a g a z y n ó w w a p n io w y c h i elek­
trochem iczna siła napędzająca regulują n a p ły w jonów
w a p n ia do kom órki z otaczającego ją śro d o w isk a. Je d n a k ­
że istnieją rozbieżności dotyczące u d zia łu V w regulacji
n a p ły w u jonów w ap n ia do śródbłonka. D ane o p u b lik o ­
w an e p rzez jednych au to ró w sugerują istotny w p ły w Vm
na hom eo stazę w a p n io w ą [44,45], jak i szczególnie n o w ­
sze d an e czyniące z Vm mniej znaczący czy n n ik [46,47],
faktycznie tru d n y do o szacow ania w n a p ły w ie C a 2+ do
w n ę trz a kom ó rek śródbłon ka. Z ro z u m ien ie pro cesów
T a b e la 1. K anały po tasow e w ystępujące w kom ó rkach śródb ło nka naczyniow ego.
N azw a
Przew odnictw o (pS)
C harakterystyka
A ktyw atory
Inhibitory
23-30
h o m o /h e tero te tra m ery apodjednostek (Kirl.x, Kir2.1-4)
brak
Ba2+, C s+, TEA, M g2ł
NS1619,
NS004
charybdotoksyna,
iberiotoksyna, TEA
BKrCa
165-240
tetram etr a-podjednostek
7TM D' (np. hSlo) z 2TM czuły na
C a2+ regulatorow a [3-podjednostka
zależność od potencjału
30-80
tetram etr a-podjednostek 6TMD
niezależny od potencjału
EBIO
IK_Ca
c harybdotoksyna,
TEA, klotrim azol
SK Ca
4-14
tetram er a-podjednostek, 6TMD
niezależny od potencjału
K ,r
SKI
TEA, d-TC
SK2
apam ina, TEA, d-TC
SK3
IZ
ATP
Kv
K
apam ina, TEA, 4-AP, d-TC
25
tetram etr a-podjednostek (Kir6.1 lub 6.2)
plu s receptor sulfonom ocznika (SUR)
pinacidil,
chrom akalin,
diazoksyd
glibenklam id,
tolbutam id
12
6TMD
brak
4-AP, TEA
Kir2.1
inhibitory kinazy
tyrozynow ej
Ba2+, sprzężona a k tyw ność
kinazy tyrozynow ej
4-AP — 4-am inopirydyna; EBIO — l-etylo-2-benzim idazolina; TMD — dom eny transbłonow e; d-TC-d — tubokurarina; K.r
— prostow niczy kanał potasow y; BKCa — kanał p otasow y o dużym przew odnictw ie regulow any Ca2+; IKCa — kanał potasow y o
pośrednim przew odnictw ie regulow any przez C a2+ ; SKCa - kanał potasow y o m ałym przew odnictw ie regulow any Ca2+; K
— kanał
potasow y regulow any ATP; Kv — kanał p otasow y zależny od potencjału; Ks — kanał potasow y zależny od sił ścinających
202
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
w ykorzystyw anych przez śródbłonek do kontroli [Ca2+]t jest
niezbędne, gdyż po m im o dużej liczby głów nych szlaków
k o m órkow ych reg u lo w a n y c h C a2+, n a d m ia r tych kationów
jest n iezw yk le toksyczny dla kom órek, n ato m iast zm niej­
szenie jego stężenia jest łączone z patologią nadciśnienia
[48], N ależy zauw ażyć, że w kom órkach śró dbło nka u le ­
ga syntezie ogrom na liczba kanałów jonow ych specyficz­
nych dla K+, o d p o w ie d zialn y c h za regulację potencjału
błonow ego, których rola i znaczenie, p rzy u w zg lę d n ie­
n iu istnienia szeregu izoform , są tru d n e do oszacow ania i
zro zu m ien ia (Tabela 1). U tru d n ien ie m jest rów n ież to, że
kanały, które ulegają syntezie w h o d o w la ch pierw o tnych
linii kom órkow ych różnią się od tych w ystępujących in
vivo. K om órki śródbłonk a w ykazują zró żnicow anie w za­
leżności od rejonu z jakiego są uzy skiw ane. Z a obserw o­
w a n o różnice w [Ca2+]| p rz e k a zy w an ia sygnału, w im m u ­
nologicznych i m etabolicznych w łaściw ościach oraz w
charakterystyce w zorca u w a ln ia n y c h m e d iato ró w dla z a ­
leżnego od śród błon ka ro zk u rcz u naczyń krw ionośnych
[49,50], Jednym z p rz y k ła d ó w ró żnoro dności w p ły w u
otoczenia są o d d z ia ły w an ia śród błonek-ściana naczynia.
W hipoksji naczynia płucne kurczą się (tzw. ang. hypo­
xic pulmonary vasoconstriction), n ato m iast w szystkie inne
łożyska naczyniow e, np. naczynia krążenia sercow ego i
m ięśni, ulegają relaksacji, zw iększając p rz ep ły w krw i w
o d p o w ie d z i na niedotlenienie. Regulacja w e w n ą trz k o ­
m ó rkow ego sygnału w a p n io w e g o jest p ra w d o p o d o b n ie
najw ażniejszym za d a n ie m kanałów jonow y ch w k o m ó r­
kach śródb ło nka [43],
NAPŁYW JONÓW WAPNIA Z PRZESTRZENI
POZAKOMÓRKOWEJ
Szlaki n a p ły w u jonów w a p n ia z p rzestrzen i pozakom órkow ej przez błonę p lazm aty czn ą kom ó rek śró d b ło n ­
ka są niezw ykle istotne, gdyż napływ ający Ca2+ stanow i
jeden z kluczow ych elem entów pośredniczących w długotrwającej o d p o w ied zi kom órkow ej. O pisano szereg
system ów regulujących procesy n a p ły w u C a2+ znacznie
różniących się od siebie m echan izm em regulacji, selek­
tyw nością i ilością p rz e p u sz c zan y c h jonów w ap n ia oraz
czasem trw an ia ich n ap ły w u i su b k o m ó rk o w ą lokaliza­
cją [44], Sprzężenie dużej różnicy stężeń C a2+ w p o p rzek
błony plazm atycznej w kom órkach sp oczynkow ych z hiperpolaryzacyjny m Vm stanow i o g ro m n ą elektrochem icz­
ną siłę faw oryzującą n a p ły w jonów w ap n ia do kom órki.
Jony w ap n ia m ogą napływ ać do k om órki przez błonę
plazm aty czną w w yn ik u otw arcia specyficznych dla C a2+
kanałów jonow ych. O grom na liczba k anałó w jonow ych o
p rzepu szczalności specyficznej dla C a2+ została o d k ry ta
w kom órkow ej błonie plazm atycznej [51]. B ram kow ane
potencjałem kanały C a2+ w ystępują w błonie pla z m a ty c z­
nej kom órek p o b u d liw y ch elektrycznie, takich jak k o m ó r­
ki m ięśniow e, serca i nerw ow e. Pom im o tego że kom órki
śródb łonka należą do g ru p y ko m órek n iep o b u d liw y c h
elektrycznie istnieją doniesienia św iadczące o obecności
kanałów zależnych od potencjału w szeregu ich typach
[52,53],
Kanały receptorow e o tw ierane p o d w p ły w e m w iąz a ­
nia agonisty (ROC, ang. receptor-operated channels), k a n a ­
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
ły w ap n io w e o tw ieran e p o d w p ły w e m o p ró żnien ia w e ­
w n ątrz k o m ó rk o w y c h m a g az y n ó w w ap n io w y c h (SOC,
ang. store-operated calcium channels) oraz kanały otw ierane
pod w pływ em prze k a źn ik a dru g ieg o rz ę d u (SMOC, ang.
smali messenger-operated channe 1) są szlakam i n a p ły w u
w apn ia w k o m órkach śró d b ło n k a o znacznie lepiej u d o ­
kum entow anej obecności [44,51,54].
Szczególną g ru p ę białek uczestniczących w tw o rzen iu
kanałów jonow ych stan o w ią białka TRP (ang. transient
receptor potential) o d k ry te u Drosophila melanogaster, ale
w ystępujące rów nież w kom órkach ssaków . Białka TRP
odkry te w o rg an izm ach ssaków pod zielon o na 6 g ru p
głównych: TRPC, TRPV, TRPM, TRPP, TRPML i TRP A
[55]. Liczna g ru p a białek TRP została zlokalizow ana ró w ­
nież w kom ó rkach śródbłonk a, gdzie, jak w ykazano, peł­
nią one rów nież w a żn ą funkcję w regulacji n a p ły w u C a2+
do kom órki [56], Dysfunkcja i brak odpow ied niej re g u ­
lacji śródb łon kow y ch białek TRP skutkuje u szk o d zen iem
(w skutek n a d m iern eg o w y tw a rz a n ia ROS), zm niejszoną
biologiczną aktyw nością NO, u szk o d zen iem bariery ko­
m órek śród błonka oraz rozw ojem chorób zw iązan y ch z
n iep raw id ło w ą ang iogenezą [56]. N a u w ag ę zasługuje
rów nież sprzężenie niektó rych białek TRP z kanałam i p o ­
tasow ym i, w tym z k anałem p o ta so w y m o d u ż y m p rz e ­
w odnictw ie BKCA (ang. big conductance potassium channel)
[57], Istnieją doniesienia św iadczące o z aa n g aż o w an iu
białek TRP w proces n a p ły w u C a2+, w ynikający z o p ró ż ­
nienia w e w n ą trz k o m ó rk o w y ch m a g a z y n ó w w a p n io w y c h
(SOCE, ang. storę operated calcium entry). W proces ten
zaan gażow ane są białka STIM1 (ang. stromal interacting
molecule) oraz ORAI (lub CRAM w organizm ie ludzkim ).
S tw ierdzono funkcjonalne o d d z ia ły w a n ie pom ięd zy
STIM1 a TRPC1 [58,59],
Odrębną grup ę stanow ią szlaki napływ u jonów w apnia
do komórek śródbłonka aktyw ow ane pod w pływ em stresu
mechanicznego i stresu sił ścinających (ang. shear stress) p o­
wstałych pod w pływ em zm ian szybkości przepływ u krwi
przez naczynia [60,61].
Początkow y w z ro st stężenia [Ca2+]., pow stały w w y n i­
ku stymulacji agonistą, w yn ika z opróżnien ia w e w n ą trz ­
kom órkow ych m ag a zy n ó w Ca2+, siateczki śró d p lazm atycznej (ER), następujące po p o czątk o w y m w zroście,
utrzym ujące się p o d w y ż sz o n e stałe stężenie (plateau)
jest p o d trz y m y w an e p rzez n ap ły w jonów w a p n ia z p rz e ­
strzeni pozakom órkow ej [44,62]. Podczas stym ulacji ko­
m órek śródb ło nka agonistą generującym p o w staw an ie
inozytolotrisfosforanu (IP3), który, oddziałując z recepto­
rem znajdującym się w ER, p o w o d u je w y p ły w C a2+ [63],
O próżnienie m ag azy n ó w w e w n ą trz k o m ó rk o w y c h u r u ­
cham ia szlak SOCE i n a p ły w jonów w a p n ia z p rzestrzeni
pozakom órkow ej. P o n o w n e n apełn ienie m a g a zy n ó w ER
pow oduje w yłączenie szlaku SOCE n a p ły w u jonów w a p ­
nia. O kazuje się, że ró w n ież kw as a rac h id o n o w y oraz
N O są w stanie u aktyw nić otw arcie innych kanałów jono­
w ych niż SOC w kom órkach śródbłonk a. A ktyw acja tych
kanałów m oże odbyw ać się w dosyć ograniczonej p rz e ­
strzeni kom órki uw zględniającej z g ru p o w a n ie k anałów
w apniow ych [64],
http://rcin.org.pl
203
MECHANIZMY USUWANIA JONOW WAPNIA
Z CYTOSOLU KOMÓREK ŚRÓDBŁONKA
W ykazano, że u su w a n ie [Ca2+], z kom órek śródbłonka
izolow any ch z aorty królika zach o d zi z w ykorzystaniem
głów nie trzech system ów : w y m ie n n ik a sodow o-w apniow ego (NCX) [65], Ca2+-A TPazy z siateczki śródplazm atycznej (SERCA), funkcjonujących w sekwencji w y n ik a­
jącej z ró żneg o p o w in o w a c tw a dla jonó w w apnia oraz
szybkości ich tra n sp o rtu dla poszczególnych system ów
i obniżających C a2+ o około 50%, o raz ATPazy z błony
plazm atycznej (PMCA) [66], która jest odpow iedzialn a
za u su w a n ie p ozostałych 50% jonów w ap n ia [67], W y­
kazano, że m echanizm y u su w a n ia C a2+ z cytosolu k om ó­
rek śró d b ło n k a różn ią się od tych w kom órkach naczy­
nio w y ch m ięśni gładkich [68]. O kazało się, że niezw ykle
istotna jest lokalizacja m ito c h o n d rió w w pobliżu błony
plazm atycznej oraz jej w p ły w na regulację napływ u Ca2+.
Z m iana przestrzennej lokalizacji m itocho ndriów w sto­
su n k u d o błony plazm atycznej p o w o d u je zaburzenie sy­
gnalizacji p o m ię d zy ER a m ito ch o n d riam i [69], O statnie
d an e lite ratu ro w e w skazują, że n a w e t podczas obniżo­
nego n a p ły w u C a2+ z p rzestrzen i zew nątrzkom órkow ej
u z u p ełn ie n ie siateczki śródplazm atyczn ej Ca2+ zostaje
zachow ane. N ależy zauw ażyć, że u zu p ełn ien ie m agazy­
nów ER p o w o d u je w yłączenie m ech an izm u SOCE [70],
N iezw ykle w a żn y m e n zy m em dla hom eostazy jonów
w a p n ia w kom órce jest N a +/ K +-A TPaza z błony p la ­
zm atycznej. E nzym ten ró w n ież w ystępuje w kom órkach
śró d b ło n k a [71,72], A ktyw no ść tego e n z y m u regu low a­
na jest p rz e z end ogenn e, jak rów nież p o d a n e egzogennie
glikozydy. Z w iązkiem b ędącym w po w szech n y m użyciu
w b a d an ia c h aktyw ności N a +/ K +-ATPazy jest, hamująca
jego aktyw ność, ouabaina, która w p ły w a w sposób z n a ­
czący na funkcję ko m órek śró d b ło n k a [73-75],
MITOCHONDRIA - AKTYWNY UCZESTNIK
HOMEOSTAZY Ca2+W KOMÓRKACH ŚRÓDBŁONKA
Pom im o znacznej dominacji ER w utrzym aniu homeosta­
zy jonów w apnia w śródbłonku, ok. 25% Ca2+ jest zgroma­
dzonych w m itochondriach tych kom órek [76], Jony wapnia
z kolei aktyw ują wiele białek poprzez ich zmiany konformacyjne [77], aktywują kinazy tyrozynowe, receptory IP, w
siateczce śródplazmatycznej, co pow oduje uwolnienie zm a­
gazynow anego Ca2+ i przew ażnie zapoczątkowuje SOCE.
W zrost stężenia [Ca2+]| aktywuje MLCK (kinazy lekkiego
łańcucha miozyny) [78].
O dkryto rów nież szereg enzym ów mitochondrialnych,
których aktyw ność regulow ana jest jonami wapnia, znajdu­
jącymi się w ich w nętrzu [Ca2+]m [79,80], Jak już w spom nia­
no, w zrost [Ca2+]m pow oduje przyspieszenie wytwarzania
ATP w różnych typach komórek, włączając w to komórki
śródbłonka. W zrost w ew nątrzkom órkow ego stężenia jo­
nów w apnia uw alnianych z ER pow oduje wzrost stężenia
Ca2+ w macierzy mitochondrialnej [81,82],
Szlakiem o d p o w ie d z ialn y m za akum ulację jonów
w a p n ia w m ito ch o n d riach jest u n ip o rte r w apniow y (CU).
N ap ły w jonów w a p n ia p rzez CU jest n ap ęd za n y przez
elektrochem iczny g rad ie n t potencjału m itochondrialne-
204
go (Aipm) w ystępujący na w ew nętrznej błonie m itochon­
drialnej. Zatem każda zm iana Aipm p ro w ad zi do zmian
tra n sp o rtu Ca2+ p rzez w e w n ę trzn ą błonę m itochondrialną, a to w konsekw encji zm ienia aktyw ność m etaboliczną
m itoch ondriów . Jed nym z czynników obniżających Aipm
jest, w y tw a rz a n y w kom órk ach śródbłonka, NO, którego
aktyw ność p ro w a d z i do zm niejszenia [Ca2+]m w h o d o w ­
li kom órek śródb łonk a izolow anych z cielęcych naczyń
płu cnych [83]. W św ietle istnienia izoform y m tNOS m i­
tochon dria m ogą scalać w e w n ątrz k o m ó rk o w ą regulacje
m ech anizm ów zależnych od Ca2+, N O i ROS, jak to z a ­
p ro p o n o w a n o dla kom órek m ięśni gładkich [84].
W ciąż nie znana jest o d p o w ie d ź na p ytan ie jakie jest
źró d ło Ca2+ dla m itochon drió w ? W ydaje się, biorąc pod
u w ag ę globalny w zro st stężenia [Ca2+]., że nie osiąga on
stężenia w ystarczającego dla tra n sp o rtu przez u n ip o rter
Ca2+. Jednak, jak w ykazan o, m itocho ndria znajdują się w
pobliżu ER i są e k sp o n o w a n e do m ikro obszarów o b a r­
dzo w ysokim lokalnym stężeniu jonów w ap n ia u w a ln ia ­
nego z ER [85]. Chociaż nie m usi to być p ra w d ą dla ko­
m órek śródbłonka, g dy ż w kom órk ach HUVEC tylko ok.
4% m itocho ndriów było zlok alizow any ch w pobliżu błon
ER [81], Jedną z p rzyczyn takiego w yn ik u b a d a ń m oże
być to, że unieśm iertelnione kom órki nie do końca o d ­
zw ierciedlają stru k tu rę ko m ó rk o w ą in vivo. Pom im o tego
TNO, TPGI21 TE ET, TCO/HO
Nasilenie tworzenia naczynioochronnych
przekaźników śródbłonka
\
i 0 2, iP G H 2, iizoprostany, 4ET-1,
4.Ang II, ATF,ivWF,4.PAI, TtPA,
TTM, TTFPI, 4.ICAM-1.ÍVCAM-1,
4.IL-6, 4.IL-8, AMCP-1 I inne
Wygaszenie mechanizmów zapalnych
i zakrzepowych śródbłonka
/
Rycina 4. Farm akologia dysfunkcji śródbłonka. Stan zapalny (dysfunkcja) ś ró d ­
błonka w yróżniają zw iększona synteza cytokin zapalnych, cząsteczek adhezyjnych i chem okin. Tem u to w arzyszy aktyw acja m echanizm ów zakrzepo rodn ych
śród błonk a (np. fPA I ftPA ) i upo śledzenie w y tw a rz an ia naczynioochronnych
przekaźn ik ów , takich jak N O i PGIr Stan zapaln y śródbłonka o dg ryw a kluczow ą
rolę w rozw oju m iażdżycy. Istnieją przekonujące d o w o d y na to, że leki, które
skutecznie ham ują patologiczną od p o w ie d ź zapaln ą śródbłonka i całej ściany
naczyniow ej (statyny, ACE-I, antagoniści A Tt), jednocześnie w yw ołują zah am o ­
w anie rozw oju zm ian patologicznych naczyń krw ionośnych i obniżenie śm iertel­
ności z p o w o d u m iażdżycy i innych chorób u k ła d u krążenia. Skuteczne leczenie
stan ó w zapaln ych śródbłonka w inn o przynieść: zaham ow anie aktywacji z ap a l­
nej śród błon ka i m echanizm ów z ak rzeporodny ch śródbłonka o raz w zm ocnienie
up ośledzonej czynności n aczynioochronnych p rzekaźników śródbłonka. Statyny
i ACE-I, antagoniści AT; i antagoniści aldosteronu, p op rz e z odm ienne m ech ani­
zm y, w yw ierają p o do bne szerokie sp ek tru m zm ian w śródb łonk u [3,93,94-97].
Rysująca się w ostatnich latach w iedza o roli m echanizm ów m itochondrialnych w
zapalen iu śródbłonka pow ala przypuszczać, że farm akologiczna korekcja funkcji
m ito ch ond rió w śródbłonka (np. m odulacja aktyw ności m itochondrialnych ka n a ­
łów potasow ych, m odulacja w ytw a rz an ia ROS) m oże przynieść now e sposoby
sk utecznego leczenia dysfunkcji śródbłonka.
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
istnieją d o w o d y na to, że m itoch ondria ko m ó rek śródbłonka o d p o w ia d a ją na w zro st cytosolow ego stężenia jo­
nów w apn ia, ale dotyczy to tylko w z ro stu C a2+ w pobliżu
błony plazm atycznej. W proces ten za a n g a ż o w an y jest
ró w n ie ż w y m ien n ik N a +/ C a 2+ [86],
W inn ym m o d elu zak ład a się, że podczas sty m u la ­
cji kom órek śró d b ło n k a następuje ciągły n a p ły w jonów
w a p n ia do m ito c h o n d rió w przez CU, które są n astępnie
u su w a n e p rze z m ito ch o n d rialn y w y m ie n n ik N a + / C a 2+
[82,87], Takie d ziałanie m ito ch o n d rió w p o w o d u je w y stę ­
p o w a n ie m ik rorejonów w cytosolu charakteryzujących
się niskim stężeniem jonów w apnia. Rejony te p rz y sp ie ­
szają pojem nościow y n a p ły w C a2+ (CCE ang. capacitative Ca2+ entry), który zacho dzi p rzez SOC. M odel ten nie
wyjaśnia, jak w a p ń dostaje się do m ito ch o n d rió w p o m i­
m o niskiego p o w in o w a c tw a CU do tego jonu. Z m iany
lokalne stężenia C a2+ w pobliżu błony plazm atycznej w
kom órkach śró d b ło n k a m ogą w p ły w ać na zm iany a k ty w ­
ności ich m itoch ondriów .
Agoniści recep to ró w w ystępujących na błonie k o m ó r­
kowej śró d b ło n k a i działającym i p o p rz ez generację IPy
stym ulują w y p ły w jonów w a p n ia z ER i to w p ły w a na
m odulację ich biologicznego działania. Zjaw isko w y p ły ­
w u C a2+ w procesie z w a n y m m ito c h o n d ria ln y m w y p ły ­
w em jonów w a p n ia sty m u lo w a n y m jonam i C a2+ (mCICR,
ang. mitochondria Ca2+-induce Ca2+ release), z ao b serw o w a ­
no dla kom ó rek śró d b ło n k a . Pom im o zbieżności n azw y
do procesu zach odzącego w m ięśniu sercow ym CICR
(Ca2+-induce C a2+ release), p o d o b ień stw o tych procesów
jest ograniczone. W p rz y p a d k u CICR zaa n g aż o w an y jest
kanał RyR (receptor ria nody now y). P ra w d o p o d o b n ie
mCICR w ystępuje, kiedy w ysoki poziom w ew n ątrzm itocho ndrialnego C a2+ in d u k u je otw arcie ko m pleksu biał­
kow ego o d p o w ie d z ia ln e g o za u p rze p u sz c zaln ien ie błony
m itochondrianej (PTP) [12,88],
W iększość opisanych dotychczas m echan izm ów re­
gulujących w e w n ą trz k o m ó rk o w e i w ew n ątrzm ito ch o n drialn e stężenie jonów w ap n ia w kom órkach śródb łon ka
dotyczy o d p o w ie d z i na agonistę lub zm iany tra n sp o rtu
w apnia. N iew iele jest w ciąż prac analizujących zm iany
hom eostazy jonów w a p n ia w stanie dysfunkcji śró d b ło n ­
ka. Potrzebne są więc dalsze bad an ia szlaków regulacji
hom eostazy w a p n ia w trakcie o d p o w ie d z i zapalnej śró d ­
błonka.
PODSUMOWANIE - PERSPEKTYWY
FARMAKOLOGII ŚRÓDBŁONKA
cz y n ioochronny ch p rz e k aź n ik ó w śródbłonka (PGR i NO;
Ryc. 4). Jak się w ydaje, w szystk ie w y m ienione składow e
o d p o w ie d z i zapalnej śró d b ło n k a są u ru ch a m ia n e w sp o ­
sób zależn y od zw ięk szonego w y tw a rz a n ia an ionorodnika p o n a d tlen k o w e g o w łańcuchu o d d e c h o w y m m ito­
c h o n d rió w śró d b ło n k a lub p rzez ok sydazy śródbłonkow e (oksydazę N A D PH , o k sydazę ksan tyno w ą, syntazę
NO). Z pew nością w zg lę d n y u d ział puli aniono rodn ika
p o n a d tle n k o w e g o w ytw orzo nej w m itochondriach, róż­
ni się w zależności do bodźca w yw ołującego zapalenie i
ty p u ko m ó rek śródbłonka. M im o istniejących niejasności,
w iększość b adaczy z g a d z a się, że w o d p o w ie d z i zapalnej
śró d b ło n k a w y tw arz a n ie a n io n o ro d n ik a p o n a d tlen k o w e ­
go i pow stających z niego p ro d u k tó w reakcji w e w n ą trz ­
k o m ó rk o w y c h (FRCR, O N O O ) z jednej strony (przez m e­
ch an izm y transkrypcyjne) w yw ołuje w zro st w ytw arz a n ia
cytokin z a p aln y c h i chem okin oraz syntezy cząstek a d h e ­
zyjnych, a z drugiej — p ro w a d z i do nie d o b o ru naczynioo c hronnych prz e k a ź n ik ó w śró d b ło n k o w y ch (NO i PGR)
[3, 89-91], O d p o w ie d z i zapalnej śró d b ło n k a i zwiększonej
p rod ukcji an io n o ro d n ik a p o n a d tle n k o w e g o tow arzyszą
ró w n ież zm iany m echanizm ów zależnej od m itocho n­
d rió w hom eo stazy w apnia. Istotnie, ROS pow stające w
m ito c h o n d ria ch kom órek śró d b ło n k a są przekaźn ikam i
o d p o w ie d z ia ln y m i za transm isję recep torow ego sy g n a ­
łu C a2+ i w y c h w y tu C a2+ do m itochondriów w y w o ła n e ­
go p rz ez tro m bin ę w o d p o w ie d z i na pro-zapalny sygnał
transkry pcyjn y. Ten ostatni u ru c h a m ia m echanizm y a d ­
hezji leu kocytó w do ko m ó rek śródbłonk a, które stanow ią
cen traln y elem ent o d p o w ie d z i zapalnej śró dbłonka [92],
O statnio zap ro p o n o w a n o , że za b u rzen ia funkcji m ito­
ch o n d rió w mają znaczący ud ział w dysfunkcji śró d b ło n ­
ka w yw ołanej przez an g io ten sy n ę II [26], M itochondria
k o m ó rek śró d b ło n k a m ogą więc stać sie now y m celem
farm ak o terap ii w chorobach u k ła d u krążenia. Istnieją już
leki sto so w an e w chorobach u k ła d u krążenia (statyny,
ACE-I, an tagoniści receptora AT^ antagoniści aldosteronu), które h am ują stany z ap aln e śród bło nka, jego goto ­
w ość p ro z ak rze p o w ą, przyw racają p raw id ło w ą naczynioo c hronną funkcję śródbłonka, a ich stosow anie przynosi
o bniżenie śm iertelności w yw ołanej przez choroby u k ła ­
du k rążenia [3,93,94-97], D alsze b ad a n ia p ro w a d z o n e w
celu pełniejszego zro zu m ien ie m itochon drialnych m e­
c h a n izm ó w scalających szlaki przek a zy w an ia sygnałów
z ależne od C a2+ i ROS w z ap alen iu śródbłonka, pozw olą
w yjaśnić sposoby d ziałania tych leków na m itochond ria i
z ap ro jek to w ać now e leki, których celem b ędą m itochon­
d ria śródbłonk a.
PIŚMIENNICTWO
M echanizm y o d p o w ie d z i zapalnej kom órek śró d b ło n ­
ka są b ard zo złożone. O d p o w ie d ź m oże w yw ołać wiele
czynników , np. an giotensyna II, końcow e p ro d u k ty glikacji (przez aktyw ację recep toró w RAGE), utlenione
cząstki LDL (oxLDL), TXA2, trom bina, IL-1 i TN F-a. W
k ażdym p rz y p a d k u o d p o w ie d ź zap aln a śró dbłon ka obej­
muje: 1) zw iększenie syntezy p ro z ap a ln y ch cytokin (np.
IF-6), chem o kin (np. MCP-1) i cząstek adh ezyjnych (np.
ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1), 2) zw iększenie gotow ości
pro zak rzep o w ej śródbłonka (np. zm niejszenie syntezy
tro m b o m o d u lin y ) oraz 3) u p o śled zen ie w y tw arz a n ia naPostępy Biochemii 54 (2) 2008
1. Bonetti PO, Lerm an LO, Lerm an A (2003) Endothelial dysfunction: a
m arker of atherosclerotic risk. Arterioscler T hrom b Vase Biol 23:168175
2. Chłopicki S (2006) Zapalenie śródbłonka i now e spojrzenie na atherothrom bosis. W: Januszewicz A, Januszewicz W, Rużyłło W (red)
Antagoniści receptora angiotensyny II w leczeniu chorób układu sercowo-naczyniowego,. M edycyna Praktyczna, Kraków, str. 91-113
3. Chłopicki S (2005) Farm akologia śródbłonka w atherothrombosis.
K ardiologia po Dyplom ie 4: 60-68
4. Chłopicki S, Gryglewski RJ (2004) Endothelial Secretory Function and
A therothrom bosis. W: Curtis-Prior P, (red) The eicosanoids. John Wi­
ley & Sons Ltd Cambridge, str. 267-276
http://rcin.org.pl
205
5. Gryglewski RJ (2005) Pharm acology of vascular endothelium . Delive­
red on 27 June 2004 at the 29th FEBS Congress in W arsaw. Febs J 272:
2956-2967
6. Kmita H, Stobienia O (2006) Kanał VDAC jako regulator funkcji mito­
chondriów . Postępy Biochem 52:129-136
7. W ięckowski MR (2008) M itochondrialny m egakanał w fizjologii i pa­
tologii kom órki — now e spojrzenie. Postępy Biochem 54: 71-81
8. Mitchell P (1961) Coupling of phosphorylation to electron and hydro­
gen transfer by a chemi-osmotic type of m echanism . N ature 191:144148
9. Q uintero M, Colombo SL, Godfrey A, M oncada S (2006) Mitochondria
as signaling organelles in the vascular endothelium . Proc Natl Acad
Sci USA 103: 5379-5384
10. Palacios-Callender M, Hollis V, Mitchison M, Frakich N, Unitt D,
M oncada S (2007) Cytochrom e c oxidase regulates endogenous nitric
oxide availability in respiring cells: a possible explanation for hypoxic
vasodilation. Proc Natl Acad Sci USA 104:18508-18513
11. W ard JP, Snetkov VA, A aronson PI (2004) Calcium, m itochondria and
oxygen sensing in the pulm onary circulation. Cell Calcium 36: 209-
220
12. D avidson SM, Duchen MR (2007) Endothelial m itochondria: contribu­
ting to vascular function and disease. Circ Res 100:1128-1141
13. Gulbins E, Dreschers S, Bock J (2003) Role of m itochondria in apoptosis. Exp Physiol 88: 85-90
14. R am achandran A, M oellering DR, Ceaser E, Shiva S, Xu J, DarleyUsm ar V (2002) Inhibition of m itochondrial protein synthesis results in
increased endothelial cell susceptibility to nitric oxide-induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 99: 6643-6648
15. K uw ana T, N ew m eyer DD (2003) Bcl-2-family proteins and the role of
m itochondria in apoptosis. C urr O pin Cell Biol 15: 691-699
16. He J, Xiao Y, Casiano CA, Zhang L (2000) Role of m itochondrial cyto­
chrom e c in cocaine-induced apoptosis in coronary artery endothelial
cells. J Pharm acol Exp Ther 295: 896-903
17. Mailloux A, Bruneel A, V aubourdolle M, Baudin B (2004) Cyclosporin
A but not estradiol can protect endothelial cells against etoposide-induced apoptosis. Endothelium 11:141-149
18. Mailloux A, G renet K, Bruneel A, Beneteau-Bum at B, Vaubourdolle
M, Baudin B (2001) Anticancer drugs induce necrosis of hum an endo­
thelial cells involving both oncosis and apoptosis. Eur J Cell Biol 80:
442-449
19. C zarna M, Jarm uszkiewicz W (2006) Rola m itochondriów w wytwa­
rzaniu i usuw aniu reaktyw nych form tlenu; zw iązek z przesyłaniem
sygnałów i program ow aną śmiercią komórki. Postępy Biochem 52:
145-156
20. Z hang H, Luo Y, Z hang W, He Y, Dai S, Z hang R, H uang Y, Bematchez P, G iordano FJ, Shadel G, Sessa WC, Min W (2007) Endothelialspecific expression of m itochondrial thioredoxin im proves endothelial
cell function and reduces atherosclerotic lesions. A m J Pathol 170:
1108-1120
21.Furchgott RF, Zaw adzki JV (1980) The obligatory role of endothelial
cells in the relaxation of arterial sm ooth muscle by acetylcholine. Na­
ture 288:373-376
22. Kato K, Giulivi C (2006) Critical overview of m itochondrial nitric-oxide synthase. Front Biosci 11: 2725-2738
23. Parihar MS, N azarew icz RR, Kincaid E, Bringold U, Ghafourifar P
(2008) Association of m itochondrial nitric oxide synthase activity with
respiratory chain complex I. Biochem Biophys Res C om m un 366: 2328
chondrial oxidative dam age and vascular endothelial dysfunction.
Circ Res 102: 488-496
27. Jezek P, H lavata L (2005) M itochondria in hom eostasis of reactive oxy­
gen species in cell, tissues, and organism. Int J Biochem Cell Biol 37:
2478-2503
28. M ukherjee TK, M ukhopadhyay S, Hoidal JR (2005) The role of reacti­
ve oxygen species in T N Fa-dependent expression of the receptor for
advanced glycation end products in hum an umbilical vein endothelial
cells. Biochim Biophys Acta 1744: 213-223
29. W atanabe N, Zmijewski JW, Takabe W, Um ezu-Goto M, Goffe CL,
Sekine A, Landar A, W atanabe A, Aoki J, Arai H, K odam a T, M urphy
MP, K alyanaram an R, Darley-Usmar VM, N oguchi N (2006) Activa­
tion of mitogen-activated protein kinases by lysophosphatidylcholineinduced m itochondrial reactive oxygen species generation in endothe­
lial cells. Am J Pathol 168:1737-1748
30. Liu Y, Zhao H, Li H, K alyanaram an B, Nicolosi AC, G utterm an DD
(2003) M itochondrial Sources of H 2O z generation play a key role in
flow-m ediated dilation in hum an coronary resistance arteries. Circ Res
93: 573-580
31. Hess DT, M atsum oto A, Kim SO, M arshall HE, Stamler JS (2005) Pro­
tein S-nitrosylation: purview and param eters. N at Rev Mol Cell Biol 6:
150-166
32. Turko IV, M urad F (2002) Protein nitration in cardiovascular diseases.
Pharm acol Rev 54: 619-634
33. Ballinger SW (2005) M itochondrial dysfunction in cardiovascular dise­
ase. Free Radie Biol Med 38:1278-1295
34. P uddu P, P uddu GM, Galletti L, Cravero E, Muscari A (2005) Mito­
chondrial dysfunction as an initiating event in atherogenesis: a plausi­
ble hypothesis. Cardiology 103:137-141
35. Traaseth N, Elfering S, Solien J, H aynes V, Giulivi C (2004) Role of cal­
cium signaling in the activation of m itochondrial nitric oxide synthase
and citric acid cycle. Biochim Biophys Acta 1658: 64-71
36. Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL (2003) Calcium signalling:
dynamics, hom eostasis and remodelling. N at Rev Mol Cell Biol 4: 517529
37. Berridge MJ, Lipp P, Bootman MD (2000) The versatility and universa­
lity of calcium signalling. N at Rev Mol Cell Biol 1:11-21
38. Berra-Romani R, Raqeeb A, A velino-Cruz JE, Moccia F, O ldani A, Speroni F, Taglietti V, Tanzi F (2008) Ca2+ signaling in injured in situ endo­
thelium of rat aorta. Cell Calcium, w d ruku
39. Nilius B, Viana F, Droogm ans G (1997) Ion channels in vascular endo­
thelium. A nnu Rev Physiol 59:145-170
40. Yamamoto Y, Chen G, Miwa K, Suzuki H (1992) Perm eability and
Mg2+ blockade of histam ine-operated cation channel in endothelial
cells of rat intrapulm onary artery. J Physiol 450: 395-408
41. Schm idt VJ, Wolfle SE, Boettcher M, de W it C (2008) G ap junctions
synchronize vascular tone w ithin the microcirculation. Pharm acol Rep
60: 68-74
42. Silva HS, Kapela A, Tsoukias NM (2007) A m athematical m odel of pla­
sm a m em brane electrophysiology and calcium dynam ics in vascular
endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol 293: C277-C293
43. A dam s DJ, Hill MA (2004) Potassium channels and m em brane poten­
tial in the m odulation of intracellular calcium in vascular endothelial
cells. J Cardiovasc Electrophysiol 15: 598-610
44. Nilius B, D roogm ans G (2001) Ion channels and their functional role in
vascular endothelium . Physiol Rev 81:1415-1459
45. Luckhoff A, Busse R (1990) Calcium influx into endothelial cells and
form ation of endothelium -derived relaxing factor is controlled by the
m em brane potential. Pflugers Arch 416: 305-311
24. Parihar MS, Parihar A, Villamena FA, Vaccaro PS, G hafourifar P (2008)
Inactivation of m itochondrial respiratory chain com plex I leads mito­
chondrial nitric oxide synthase to becom e pro-oxidative. Biochem Bio­
phys Res C om m un 367: 761-767
46. C ohen KD, Jackson WF (2005) M em brane hyperpolarization is not re­
quired for sustained m uscarinic agonist-induced increases in intracel­
lular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation 12:169-182
25. Z hang DX, G utterm an DD (2007) M itochondrial reactive oxygen spe­
cies-m ediated signaling in endothelial cells. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 292: H2023-H2031
47. McSherry IN, Spitaler MM, Takano H, Dora KA (2005) Endothelial cell
Ca2+ increases are independent of m em brane potential in pressurized
rat m esenteric arteries. Cell Calcium 38: 23-33
26. D oughan AK, H arrison DG, Dikalov SI (2008) M olecular mechanisms
of angiotensin II-m ediated m itochondrial dysfunction: linking mito­
206
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
48. Liu Y, Jones AW, Sturek M (1995) A ttenuated Ca2+ response to acetyl­
choline in endothelial cells from aorta of aldosterone-salt hypertensive
rats. A m J H ypertens 8: 404-408
70. Malli R, Frieden M, H unkova M, Trenker M, G raier WF (2007) Ca2+
refilling of the endoplasm ic reticulum is largely preserved albeit red u ­
ced Ca2+ entry in endothelial cells. Cell Calcium 41: 63-76
49. K um ar S, W est DC, Ager A (1987) Heterogeneity in endothelial cells
from large vessels and microvessels. Differentiation 36:57-70
71. H orisberger JD (2004) Recent insights into the structure and m echa­
nism of the sodium pum p. Physiology (Bethesda) 19:377-387
50. U m eda F, M asakado M, Takei A, Yam auchi T, Sekiguchi N, H ashi­
m oto T, N aw ata H (1997) Difference in serum -induced prostacyclin
production by cultured aortic and capillary endothelial cells. Prosta­
glandins Leukot Essent Fatty Acids 56: 51-55
72. B ondarenko A, Sagach V (2006) N a+-K+-ATPase is involved in the su­
stained ACh-induced hyperpolarization of endothelial cells from rat
aorta. Br J Pharm acol 149: 958-965
51.Parekh AB, Putney JW Jr. (2005) Store-operated calcium channels.
Physiol Rev 85: 757-810
73. Qiu J, Gao HQ, Li BY, Shen L (2008) Proteomics investigation of prote­
in expression changes in ouabain induced apoptosis in hum an um bili­
cal vein endothelial cells. J Cell Biochem, w druku
52. Figueroa XF, Chen CC, Campbell KP, D am on DN, Day KH, Ramos S,
D uling BR (2007) Are voltage-dependent ion channels involved in the
endothelial cell control of vasom otor tone? A m J Physiol H eart Circ
Physiol 293: H1371-H1383
74. Stahli BE, Breitenstein A, A khm edov A, Camici GG, Shojaati K, Bogda­
nov N, Steffel J, Ringli D, Luscher TF, T anner FC (2007) Cardiac glyco­
sides regulate endothelial tissue factor expression in culture. Arterioscler Throm b Vase Biol 27: 2769-2776
53. Zhou C, Chen H, Lu F, Sellak H, Daigle JA, Alexeyev MF, Xi Y, Ju J,
van M ourik JA, Wu S (2007) Cav3.1 (alG ) controls von W illebrand
factor secretion in rat pulm onary m icrovascular endothelial cells. Am
J Physiol L ung Cell Mol Physiol 292: L833-L844
75. Trevisi L, Pighin I, Luciani S (2006) Vascular endothelium as a target
for endogenous ouabain: studies on the effect of ouabain on hum an
endothelial cells. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand) 52: 64-70
54. Z hang J, Xia SL, Block ER, Patel JM (2002) N O upregulation of a cyclic
nucleotide-gated channel contributes to calcium elevation in endothe­
lial cells. A m J Physiol Cell Physiol 283: C1080-C1089
76. W ood PG, Gillespie JI (1998) Evidence for m itochondrial Ca2+-induced
Ca2+ release in perm eabilised endothelial cells. Biochem Biophys Res
C om m un 246: 543-548
77. Clapham DE (2007) Calcium signaling. Cell 131:1047-1058
55. Nilius B, O w sianik G, Voets T, Peters JA (2007) T ransient receptor po­
tential cation channels in disease. Physiol Rev 87:165-217
78. Tran QK, O hashi K, W atanabe H (2000) Calcium signalling in endothe­
lial cells. Cardiovasc Res 48:13-22
56. Kwan HY, H uang Y, Yao X (2007) TRP channels in endothelial func­
tion and dysfunction. Biochim Biophys Acta 1772: 907-914
79. D enton RM, McCormack JG (1990) Ca2+ as a second m essenger w ithin
m itochondria of the heart and other tissues. A nnu Rev Physiol 52:451466
57. Earley S, H eppner TJ, Nelson MT, Brayden JE (2005) TRPV4 form s a
novel Ca2+ signaling complex w ith ryanodine receptors and BKCj chan­
nels. Circ Res 97:1270-1279
58. H uang GN, Zeng W, Kim JY, Yuan JP, H an L, M uallem S, W orley PF
(2006) STIM1 carboxy 1-terminus activates native SOC, 1 ri and TRPC1
channels. N at Cell Biol 8:1003-1010
59. Lopez JJ, Salido GM, Pariente JA, Rosado JA (2006) Interaction of
STIM1 w ith endogenously expressed hum an canonical TRP1 upon
depletion of intracellular Ca2+stores. J Biol Chem 281: 28254-28264
60. Ali MH, Pearlstein DP, M athieu CE, Schum acker PT (2004) M itochon­
drial requirem ent for endothelial responses to cyclic strain: implica­
tions for m echanotransduction. A m J Physiol Lung Cell Mol Physiol
287: L486-L496
61. Kwan H-Y, Leung P-C, H uang Y, Yao X (2003) Depletion of Intracellu­
lar Ca2+Stores Sensitizes the Flow-Induced Ca2+ Influx in Rat Endothe­
lial Cells. Circ Res 92: 286-292
62. Jousset H, Malli R, G irardin N, G raier WF, D em aurex N, Frieden M
(2008) Evidence for a receptor-activated Ca2+ entry pathw ay indepen­
dent from Ca2+ store depletion in endothelial cells. Cell Calcium 43:
83-94
63. Foskett JK, W hite C, C heung KH, M ak DO (2007) Inositol trisphosphate receptor Ca2+ release channels. Physiol Rev 87: 593-658
64. Tom atis C, Fiorio Pla A, M unaron L (2007) Cytosolic calcium micro­
dom ains by arachidonic acid and nitric oxide in endothelial cells. Cell
Calcium 41: 261-269
65. DiPolo R, Beauge L (2006) Sodium /calcium exchanger: influence of
metabolic regulation on ion carrier interactions. Physiol Rev 86: 155203
80. M cCorm ack JG, D enton RM (1990) Intracellular calcium ions and intram itochondrial Ca2+ in the regulation of energy metabolism in m am ­
m alian tissues. Proc N u tr Soc 49: 57-75
81. Lawrie AM, Rizzuto R, Pozzan T, Sim pson AW (1996) A role for cal­
cium influx in the regulation of m itochondrial calcium in endothelial
cells. J Biol Chem 271:10753-10759
82. Malli R, Frieden M, Osibow K, Zoratti C, M ayer M, D em aurex N, Gra­
ier WF (2003) Sustained Ca2+ Transfer across M itochondria Is Essen­
tial for M itochondrial Ca2+ Buffering, Store-operated Ca2+ Entry, and
Ca2+ Store Refilling. J Biol Chem 278: 44769-44779
83. D edkova EN, Blatter LA (2005) M odulation of m itochondrial Ca2+ by
nitric oxide in cultured bovine vascular endothelial cells. Am J Physiol
Cell Physiol 289: C836-C845
84. Poburko D, Lee CH, van Breemen C (2004) Vascular sm ooth muscle
m itochondria at the cross roads of Ca2+ regulation. Cell Calcium 35:
509-521
85. Rizzuto R, Duchen MR, Pozzan T (2004) Flirting in little space: the ER/
m itochondria Ca2+ liaison. Sei STKE 2004: rel
86. Graier WF, Paltauf-Doburzyriska J, Hill BJ, Fleischhacker E, Hoebel
BG, Kostner GM, Sturek M (1998) Subm axim al stim ulation of porcine
endothelial cells causes focal Ca2+ elevation beneath the cell m em bra­
ne. J Physiol 506:109-125
87. Sedova M, Blatter LA (2000) Intracellular sodium m odulates m ito­
chondrial calcium signaling in vascular endothelial cells. J Biol Chem
275: 35402-35407
88. G raier WF, Frieden M, Malli R (2007) M itochondria and Ca2+signaling:
old guests, new functions. Pflugers Arch 455: 375-396
66. Di Leva F, Domi T, Fedrizzi L, Lim D, Carafoli E (2008) The plasm a
m em brane Ca2+ ATPase of anim al cells: Structure, function and regu­
lation. Arch Biochem Biophys, w d ruku
89. Frein D, Schildknecht S, Bachschmid M, Ullrich V (2005) Redox regu­
lation: a new challenge for pharm acology. Biochem Pharm acol 70:811823
67. W ang X, Reznick S, Li P, Liang W, van Breemen C (2002) Ca2+ rem oval
m echanism s in freshly isolated rabbit aortic endothelial cells. Cell Cal­
cium 31: 265-277
90. G riendling KK, Sorescu D, Ushio-Fukai M (2000) NAD(P)H oxidase:
role in cardiovascular biology and disease. Circ Res 86: 494-501
68.Szewczyk MM, Davis KA, Samson SE, Sim pson F, Rangachari PK,
Grover AK (2007) Ca2+-pum ps and N a2+-Ca2+-exchangers in coronary
artery endothelium versus sm ooth muscle. J Cell Mol Med 11: 129138
69. Frieden M, A rnaudeau S, Castelbou C, D em aurex N (2005) Subplasm alem m al m itochondria m odulate the activity of plasm a m em brane
Ca2+-ATPases. J Biol Chem 280:43198-43208
Postçpy Biochemii 54 (2) 2008
91. Loscalzo J (2003) O xidant stress: a key determ inant of atherothrom bosis. Biochem Soc Trans 31:1059-1061
92. H aw kins BJ, Solt LA, C how dhury I, Kazi AS, Abid MR, Aird WC, May
MJ, Foskett JK, M adesh M (2007) G protein-coupled receptor Ca2+-linked m itochondrial reactive oxygen species are essential for endothe­
lial/leukocyte adherence. Mol Cell Biol 27: 7582-7593
http://rcin.org.pl
207
93. Chłopicki S (2007) Endoteliocentryczne spojrzenie na m iażdżycę. W:
Więcek A, Kokot F (red) t. 4 M edycyna Praktyczna, Kraków, str. 1121
94. Chłopicki S (2007) Śródbłonek w patogenezie i farm akoterapii po­
wikłań m iażdżycow ych nadciśnienia tętniczego. W: Januszewicz A,
Januszewicz W, Szczepańska-Sadow ska E, Sznajderm an M (red) t. 2
Medycyna Praktyczna, Kraków, str. 263-274
95. Chłopicki S, Gryglewski RJ (2005) ACE and HMG-CoA reductase in­
hibitors in the forefront of pharm acology of endothelium . Pharmacol.
Rep.57 suppl: 86-96
96. Drelicharz Ł, Jakubowski A, Chłopicki A (2006) Zarys farmakologii
antagonistów receptora angiotenzyny II. Antagoniści receptorów angiotensyny II w leczeniu chorób u kładu sercowo-naczyniowego. Rużylło W, Januszewicz W, Januszewicz A (red) M edycyna Praktyczna,
Kraków, str. 149-170
97. Drelicharz L, Mikita J, Chabielska E, Chłopicki S (2005) Śródbłonkowe
działanie aldosteronu — Implikacje terapeutyczne płynące z badań
podstaw ow ych i klinicznych Kardiologia Polska 63,4, supl 2, str. 462471
Endothelial mitochondria — a novel target for
pharmacology of endothelial dysfunction
Antoni Wrzosek1, Agnieszka Lojek12, Iwona Stanislawska3, Antonina Chmura-Skirlinska1,
Krzysztof Dolowy2, Stefan Chlopicki3' , Adam Szewczyk1'
'L aboratory of Intracellular Ion C hannels, Nencki Institute of Experim ental Biology, 3 Pasteura St., PL 02-093 W arszaw a, Poland
d e p a r tm e n t of Biophysics, W arsaw U niversity Life of Sciences-SGGW, 159 N ow oursynow ska St., 02-776 W arszaw a, Poland
d e p a r tm e n t of Experim ental Pharm acology, C hair of Pharm acology, Jagiellonian U niversity M edical College, 16 G rzegorzecka St., 31-531 Kra­
kow, Poland
e-mail: a.szewczyk@ nencki.gov.pl, s.chlopicki@ jm rc.org.pl
Key words: endothelium , m itochondria, ion channels, apoptosis, inflam m ation, endothelial dysfunction, endothelial pharm acology
ABSTRACT
Vascular endothelium the inside layer of the cardiovascular system is presently looked upon as an important paracrine, autocrine and endo­
crine organ that determines the health of the cardiovascular system. In fact, healthy endothelium is essential for hom eostasis of cardiovascu­
lar system, w h ile endothelial dyfunction leads to cardiovascular diseases including atherosclerosis, diabetes and heart failure. Endothelial
dysfunction is tightly linked to the overproduction of reactive oxygen species, developm ent of oxidant stress and inflammatory response of
endothelium. Mitochondria of the vascular endothelium seem to be an important player in these processes. In contrast to numerous cell types,
synthesis of ATP in endothelium occurs in major part via a glycolytic pathway and endothelium seem to be relatively independent of the
mitochondrial pathway of energy supply. However, as evident from recent studies, mitochondrial pathways of free radicals production tighly
linked to mitochondrial and cytosol changes in the ion hom eostasis play an important role in the regulation of endothelial inflammatory re­
sponse, in the developm ent of oxidative stress and apoptosis of vascular endothelium . Therefore, endothelial mitochondria appears critical in
the regulation of endothelial functions and represent a novel target in pharmacology of endothelial dysfunction in cardiovascular diseases.
208
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
Kinazy białkowe w mitochondriach
STRESZCZENIE
itochondria, poza dostarczaniem energii komórce, pełnią istotną funkcję scalającą sy­
gnały prowadzące do przeżycia lub śmierci komórki. W ostatnich latach w iele badań
wskazuje, że pod w p ływ em różnorodnych bodźców, kinazy białkow e mogą bezpośrednio
oddziaływać z białkami mitochondrialnymi. Należą do nich: kinaza białkowa A, kinaza
białkow a B/Akt, kinaza białkowa C, kinazy Raf-1, p38 MAPK, JNK, ERK1/2, Src, Fyn, i Csk.
Badania koncentrują się na fosforylacji pro- i antyapopototycznych białek (Bad, Bax, Bcl-2,
Bcl-xL) oraz na fosforylacji lub innego typu oddziaływaniach z białkami łańcucha oddecho­
w ego (kompleks I i oksydaza cytochromowi COIV), białkami ANT (ang. adenine nucleotide
translocase) i VDAC (ang. voltage dependent anion chanel) tworzącymi MPTP (ang. m ito ­
chondrial pertneability transition pore), kom pleksem białek wchodzących w skład kanału
potasowego regulowanego przez ATP (mitoKATp) i skramblazą fosfolipidów 3 (PLSCR3). Po­
nadto, znalezienie w mitochondriach białek, przyłączających kinazy białkow e i tworzących
rusztowanie molekularne, które mogą ułatwiać pow stawanie w ielob iałk ow ych kom pleksów
w macierzy mitochondrialnej, wskazuje na istotną rolę, jaką w m etabolizm ie mitochondriów
odgrywa przekazywanie sygnału przez kinazy białkowe. Różne metody obrazowania w yka­
zały obecność kinaz białkowych związanych z zewnętrzną i wewnętrzną błoną oraz macie­
rzą mitochondrialną w warunkach stymulacji komórek in vitro, w chorobach neurozwyrodnieniow ych oraz w procesie ischem icznego hartowania serca in vivo . Wydaje się także, że
przemieszczanie kinaz białkowych do mitochondriów związane jest z tworzeniem reaktyw­
nych form tlenu w mitochondriach, szczególnie ze stanami ischem ii i reperfuzji w mózgu
i w sercu. Pełne wyjaśnienie m echanizm ów przemieszczania się kinaz białkow ych do m i­
tochondriów oraz funkcji, jakie m ogłyby pełnić w oddziaływ aniu z białkami docelowym i,
wymagają dalszych badań.
M
Joanna Ewa Kowalczyk
Barbara Zabłocka
Pracow nia Biologii M olekularnej, Instytut
M edycyny D ośw iadczalnej i Klinicznej im. M.
M ossakow skiego PA N, W arszaw a
^P raco w n ia Biologii M olekularnej, Instytut
M edycyny D ośw iadczalnej i Klinicznej im.
M. M ossakow skiego, Polska A kadem ia N auk,
Paw ińskiego 5, 02-106 W arszaw a; tel.: (022) 60
86 487, e-mail: jkow alczyk@ cm dik.pan.pl
A rtykuł otrzym ano 15 kw ietnia 2008 r.
A rtykuł zaakceptow ano 21 kw ietnia 2008 r.
Słow a kluczowe: m itochondria, kinazy biał­
kow e, przekazyw anie sygnału, hartow anie
ischem iczne, apoptoza
Podziękowania: Praca pow stała w trakcie re­
alizacji projektu badaw czego finansow anego
p rz ez Polską Sieć M itochondrialną M itoN et.pl
WSTĘP
Ż adna kom órka eukariotyczna nie może praw idłow o funkcjonować bez
sprawnej i szeroko rozwiniętej sieci przekazyw ania informacji. G dyby szczegó­
łow o opisać wszystkie szlaki sygnałow e w komórce, to średnio w każdy z nich
zaangażow anych jest kilkadziesiąt białek [1-5]. Kinazy białkowe to najliczniejsza
grupa w śród białek enzym atycznych biorących udział w kaskadow ym przeka­
zyw aniu informacji docierających do komórki z otoczenia, jak i do poszczegól­
nych organelli/przedziałów w każdej z nich (ang. cross-talk). Kinazy białkowe
regulują aktywność w ew nątrzkom órkow ych białek poprzez ich fosforylację —
najczęstszy rodzaj odwracalnej modyfikacji kowalencyjnej mogącej zmieniać
konformację, a tym sam ym funkcję określonego substratu.
Kinazy białkowe biorą udział w niemal wszystkich procesach kom órkow ych,
m.in. w proliferacji, różnicow aniu czy aktywacji reakcji obronnych organizm u.
O dpow iadają za praw idłow e funkcjonowanie komórki, jej przeżycie, kontrolują
apoptozę, w pływają na aktywność kanałów jonowych, m odulując ich aktyw ­
ność i funkcję, regulują uw alnianie przkaźników sygnału oraz odziałują z recep­
toram i zlokalizowanymi w błonie plazmatycznej [6].
Niewiele w iadom o na tem at kinaz białkowych zlokalizowanych w m itochon­
driach. Dane literaturow e w yraźnie w skazują na ich obecność, natom iast funkcja
i oddziałujące z nimi białka wciąż nie są dobrze poznane [7], W niniejszej pracy
zebrano dane literaturowe opisujące najlepiej poznane kinazy białkowe bezpo­
średnio zw iązane z m itochondriami. Ponadto, przedstaw iono potencjalne białka
docelowe tych kinaz oraz przypuszczalną rolę, jaką mogłyby odgryw ać procesy
fosforylacji i oddziaływ ania typu białko-białko na terenie m itochondriów i w
efekcie w całej komórce (Ryc. 1).
KINAZA BIAŁKOWA A
Kinaza białkowa A (PKA), należąca do grupy kinaz serynowo-treoninowych,
jest istotnym m ediatorem większości szlaków sygnałow ych zależnych od cy­
klicznego AMP (cAMP), co umiejscawia ją w grupie białek odgrywających ważPostępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
209
Białka mitochondrialne
Asocjacja do zewnętrznej błony?
Białko integralne kompleksów?
Aktywny transport do macierzy?
Kinazy
białkowe
Fosforylacja substratów?
Zmiany konformacji białek docelowych?
Białka oddziałujące
z mitochondriami
R ycina 1. P rop o n o w an e kinazy białkow e oddziałujące z m ito ch ond riam i i ich m itochondrialne substraty lub białka, z k tórym i oddziałują. K inazy białkow e zlok alizow ane są w cytosolu kom órki, a po
aktyw acji kom órki m ogą przem ieszczać się do m itochondriów , gdzie łączą się z licznym i białkam i,
które fosforylują lub po połączeniu zm ieniają ich konform ację, w pływ ając na ich aktyw ność, a tym
sam ym na losy kom órki. Zjaw iska te obejm ują i) h a m ow an ie tw orzenia MPTP, ii) aktyw ację kanału
potasow ego m itoK ATp, iii) w z ro st produkcji ATP po przez regulację aktyw ności COIV, iv) p rzeb u d o ­
w ę architektury błon m itochondrialnych p rzez w z ro st aktyw ności PLCSR3, v) obniżenie aktyw ności
antyap optoty cznych białek Bcl-2 i Bcl-xL, vi) obniżenie aktyw ności proapoptotycznej białka Bad.
ną rolę w p raw idłow ym funkcjonow aniu wielu procesów
kom órkowych. A ktyw ow ana przez cAMP, PKA uwalnia
dwie katalityczne podjednostki, które następnie fosforylują
docelowe białka. W ykazano jej rolę, między innymi, w regu­
lacji hormonalnej, gdzie pośredniczy w kontroli wieloetapo­
wej odpow iedzi specyficznych kom órek i tkanek na stym u­
lację horm onam i, np. progesteronem; od niej także zależy
regulacja aktywności kanałów jonowych, fosforylacja białek
chrom osom ow ych (m.in. histonu H I) oraz jądrow ych czyn­
ników transkrypcyjnych, takich jak CREB i NF- kB [8].
W ystępowanie i aktywność PKA zaobserw ow ano rów ­
nież w m itochondriach. M etodą immunodetekcji wykryto
zarów no podjednostki katalityczne, jak i regulatorow e w
wewnętrznej błonie oraz macierzy m itochodriów otrzym a­
nych z serca krow y [9], W ykazano, że w kom órkach mioblastów i w yizolow anych z nich mitoplastach, zależna od
cAMP, fosforylacja 18 kDa podjednostki kom pleksu I łańcu­
cha oddechowego, zwiększa jego wydajność i jest niezbęd­
na do zachow ania praw idłow ych funkcji oddechow ych m i­
tochondriów [10].
Trwają badania nad sposobem przem ieszczania się kinaz
do różnych organelli w obrębie komórki. Rolę w transporcie
PKA do m itochondriów coraz częściej przypisuje się białku
kotwiczącemu PKA — AKAP (ang. A-kinase anchor protein)
[11], W ykazano, że AKAP121 pośredniczy w przyłączaniu
aktywnej kinazy PKA oraz cAMP do zewnętrznej błony m i­
tochondrialnej [11,12]. Badania na em brionalnych kom ór­
kach ludzkich HEK 293 pokazały, że połączenie to prow adzi
do fosforylacji proapototycznego białka Bad, uniem ożliw ia­
210
jąc m u zablokowanie białka antyapoptotycznego Bcl-2 [13]. W konsekwencji nie dochodzi
do uw alniania cytochrom u c do cytosolu i do
apoptozy. Ponadto, są doniesienia o udziale
AKAP121 w fosforylacji/aktywacji przez PKA
białka StAR (ang. steroidogenic acute regulatory
protein) — m itochondrialnego czynnika pro­
mującego steroidogenezę, zlokalizowanego w
mitochondriach kom órek Leydiega w jądrach
myszy, co w skazuje na udział PKA w biosynte­
zie horm onów [14-16]. Ostatnie badania na linii
MA-10, transform ow anych komórek Leydiega,
wskazują, że w zrost aktywności PKA p ro w a­
dzi do fosforylacji mitochondrialnej puli kina­
zy E R K I/2 [17], a m aksym alna steroidogeneza
zachodzi w obecności cholesterolu i oddziały­
w aniu pom iędzy StAR, ERK1/2 i PKA [18].
U waża się, że PKA potrzebna jest do p ra­
w idłow ego funkcjonowania mitochondriów,
regulacji ekspresji białek m itochondrialnych
oraz aktywacji m echanizm ów ochronnych ko­
mórki [19],
KINAZA BIAŁKOWA B/Akl/PI3K
Serynowo-treoninow a kinaza białkowa B
(PKB/Akt), aktyw ow ana przez kinazę-3 fosfatydyloinozytoli (PI3K), odgryw a głów ną rolę
w proliferacji oraz w ochronie różnych typów
kom órek przed apoptozą [17].
Stymulacja IGF-1 lub insuliną kom órek neuroblastom a i
komórek nerki w yizolow anych z ludzkich em brionów po­
woduje bardzo szybkie przeniesienie ufosforylow anej/ak­
tywnej kinazy Akt do m itochondriów [20], Kinazę tę zloka­
lizowano w błonie zewnętrznej, jak i w ew nętrznej oraz w
macierzy mitochondriów . D odatkow o w ykazano, że z abu­
rzenie potencjału m itochondrialnego uniemożliwia w nika­
nie Akt do m itochondriów naw et w w arunkach stymulacji
przez IGF-1, co m oże świadczyć o tym, że transport tej kina­
zy do m itochondriów zależy od potencjału ich w ew nętrznej
błony [20,21],
Przemieszczanie i akumulacja aktywnej kinazy Akt w
m itochondriach nasunęła pytania o białka, z którym i może
ona oddziaływ ać w mitochodriach. M etodą im m unoprecypitacji i analizy spektormetrii mas w ykazano, że zarów no
w błonie zewnętrznej, jak i w ewnętrznej Akt w ystępuje w
kompleksie z kinazą syntazy glikogenu 3p (GSK3(3), kon­
stytutyw nie aktyw nym białkiem, regulow anym przez fos­
fory lację, w ystępującym głównie w cytosolu [22]. GSK3(3,
podobnie jak Akt, bierze udział w regulacji metabolizmu,
różnicow aniu i przeżyciu komórek. Interesujący jest fakt,
że fosforylacja reszty seryny w pozycji 9 GSK3|3 przez
PK B /A kt pow oduje obniżenie jej aktywności [20], Jednak
mimo obecności GSK3[3 w m itochondriach, w tym rów nież
w kontekście w spółw ystępow ania z Akt, funkcja GSK3[3 w
tym przedziale kom órkow ym pozostaje niew yjaśniona [23].
Istnieją doniesienia mówiące o udziale cytoplazmatycznej
GSK3P w przekazyw aniu sygnału podczas apoptozy in d u ­
kowanej staurosporyną oraz szokiem cieplnym w k om ór­
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
kach neuroblastom a [24], Jednoczesne podanie litu, który
jest inhibitorem GSK3(3, ham ow ało proapoptotyczne dzia­
łanie tej kinazy [25,26]. Być m oże m itochondrialna forma
GSK3[3 pełni podobną funkcję, a jej zaham ow anie w w yniku
fosforylacji przez Akt mogłoby przyczyniać się do ograni­
czenia apoptozy.
Stymulacja receptora erytropoetyny (Epo) w k om ór­
kach m ięśniow ych serca w ydaje się aktyw ow ać wiele prożyciow ych kinaz, takich jak PI3K, AKT, kinazę białkow ą C
(PKC) i E R K I /2 [27,28], Badania z ostatnich miesięcy p o ­
tw ierdziły doniesienia o w ystęp o w an iu Akt w m itochon­
driach izolow anych z serca królika oraz w ykazły o d d z ia ­
ływ anie z białkiem ANT, które w chodzi w skład MPTP
(ang. mitochondrial permeability transition pore) [29], Serca
p o d d a n e 30 m inutow ej ischemii i dw ugodzinnej reperfuzji, wcześniej traktow ane Epo, w y kazyw ały w ielokrotnie
m niejszy obszar uszkodzenia niż serca nie chronione Epo.
P odanie LY294002, specyficznego inhibitora kinazy PI3K,
ham ow ało kardioprotekcję. A utorzy sugerują, że Epo
zw iększa ilość/stężenie ufosforylowanej kinazy A kt w
m itochondriach i że poprzed zenie ep izo du ischem icznego
aktyw acją szlaku P I3K /A kt i dalej tw orzenie kom pleksu
z k o m pon entam i m egakanału, m oże być kluczow ym p ro ­
cesem pro w ad zący m do ochrony serca p rzed skutkam i
jego niedokrw ienia [29].
KINAZA BIAŁKOWA C
Kinazy białkowe C (PKC), to liczna rodzina kinaz serynow o-treoninow ych. Aktywność izoform: a) klasycznych (a,
[31, [311 i y) — zależy od stężenia jonów Ca2+ w cytosolu, od
obecności w tórnego przekaźnika sygnału 1,2-diacyloglicerolu (DAG) oraz od fosfatydyloseryny (PS), b) now ych (8,
e, 0 i r)) — nie jest wrażliw a na zm iany stężeń Ca2+, c) aty ­
pow ych (ę, p i \/X) — nie jest regulow ana ani przez Ca2+ ani
DAG [30]. W ystępowanie PKC obserwuje się powszechnie
u ssaków we wszystkich typach tkanek i komórek; jest ona
obecna zarów no w cytosolu w formie rozpuszczalnej (nie­
aktywna), jak i zw iązana z błonami (forma aktywna). Do
podstaw ow ych i najistotniejszych funkcji PKC należy p o ­
średniczenie w odpow iedziach kom órek eukariotycznych
na różne sygnały docierające z otoczenia, zaangażow anie w
regulację w zrostu, różnicowanie, apoptozę oraz aktywację
czynników transkrypcyjnych [31-33]. Kinazy białkowe C
w iązane są rów nież z procesem uczenia się i zapam iętyw a­
nia (LTP) [34], W ostatnich latach coraz częściej określa się
niektóre z izoform PKC kluczowymi m ediatoram i sygnału
ischemicznego w m ózgu i sercu, tym sam ym przypisując
im bezpośredni udział w procesach związanych ze śmiercią
kom órki lub jej przeżyciem [35].
W połowie lat 90. XX-tego w ieku PKC a i [3 zostały w y ­
kryte w m itochondriach kom órek Mullera siatkówki oka
karpia. M etodą mikroskopii elektronowej uw idoczniono ich
obecność w grzebieniach m itochondrialnych [36]. O d tego
m om entu wzrosło zainteresowanie funkcją, jaką m ogły­
by pełnić poszczególne izoformy PKC w mitochondriach.
Najwięcej danych sugeruje udział dw óch izoform PKC: 8 i e
w dw óch procesach kom órkow ych nierozerw alnie zw iąza­
nych z mitochondriami: w apoptozie i w hartow aniu ischem icznym serca.
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
PKC 8
Udział w procesie apoptozy najczęściej przypisyw any
jest PKC 8, której aktywność nie jest bezpośrednio regulo­
w ana przez Ca2+. O bserw ow ane przeniesienie tej izoformy
do m itochondriów kom órek now otw orow ych, tj. keratynocytów, U-937 i MCF-7 [33], traktow anych estrami forbolu
lub w odą utlenioną prow adziła do uw alniania cytochrom u
c z m itochondriów do cytosolu, co w konsekwencji p ro w a­
dziło do indukcji apoptozy [37,38]. Podobne zjawisko obser­
w ow ano, gdy traktow ano keratynocyty prom ieniow aniem
UV. N astępstw em translokacji PKC 8 do m itochondriów
było kolejno: zaburzenie potencjału błonowego tych orga­
nelli, aktywacja kaskady kaspaz i śmierć komórki [39], Cie­
kaw y w ydaje się rów nież fakt, że nadekspresja PKC 8 p ro ­
w adzi do apoptozy zarów no keranocytów zdrow ych, jak i
now otw orow ych [40],
W iększość doniesień podkreśla uw alnianie cytochro­
m u c z przestrzeni m iędzybłonow ej m itochondriów do
cytosolu, jako następstw o licznych szlaków sygnałow ych
przebiegających w m itochondriach. N ie jest n atom iast ja­
sne, jakie białka m ogą pośrednio lub bezpośrednio uczest­
niczyć w tym procesie. M etodą im m unoprecypitacji m ito­
chondrió w w yizolow anych z kom órek HeLa, w ykazano,
że PKC 8 w spółw ystępuje z izoform ą 3 skram blazy fos­
folipidów (PLSCR3) [41], enzym em od pow ied zialn y m za
praw id ło w e rozm ieszczenie fosfolipidów (w tym ch arak ­
terystycznej dla m itochondriów kardiolipiny (CL)) w bło­
nie m itochondrialnej [42], PLSCR3 jest enzym em n ie zb ę d ­
n y m do nadan ia praw idłow ej struk tury lipidowej błon
m itochondrialnych. Badania in vitro w ykazały, że PLSCR3
jest fosforyzow ana p rzez PKC 8, konsekw encją czego jest
zm iana aktyw ności skram blazy, transport CL do ze w n ę trz ­
nej błony m itochondrialnej, gdzie w ydaje się oddziaływ ać
z białkiem proap optotyczny m tBid. N astępstw em tej ka­
skady sygnałowej, prow adzącej do uprzepuszczelnienia
błony m itochondrialnej, jest uw olnienie cytochrom u c z
m itochondriów [43,44]. Jednocześnie, w ykazano znaczny
przyrost CL w zew nętrznej błonie m itochondrialnej w cza­
sie apoptozy, podczas gdy w fizjologicznych w aru n k ac h
fosfolipid ten w ystępuje głównie po w ew nętrznej stronie
w ew nętrznej błony m itochondrialnej [44]. Badania te p o ­
tw ierdzają hipotezę przem ieszczenia kardiolipiny w bło­
nach m itochondrialnych przy udziale ufosforylowanej
przez PKC 8, aktyw nej PLSCR3 [45].
Choć uw aża się, że PKC 8 jest głównie związana z apoptozą, istnieją doniesienia mówiące o jej udziale w kardioproitekcji. W kardiom iocytach szczurów poddanych k rót­
kotrwałej, nieuszkadzającej ischemii i reperfuzji w ykazano
przem ieszczanie PKC 8 do m itochondriów, gdzie w w e ­
w nętrznej błonie oddziaływ ała z kanałem potasow ym za­
leżnym od ATP (mitoKATp), efektem czego była jego akty­
wacja prow adząca do kardioprotekcji [46],
PKC e
W iele b a d a ń w skazuje na to, że przeniesienie n ie z a ­
leżnej od C a2+ PKC £ do m ito ch o n d rió w m a b e z p o śred n i
z w iązek ze zjaw iskiem h a rto w a n ia m ięśnia sercow ego
[47]. K rótkotrw ały, nie u szkadzający kom órki, e p iz o d
http://rcin.org.pl
211
n ie d o k rw ie n n y serca inicjuje w e w n ą trz k o m ó rk o w ą ka­
sk adę sygnałów , które zw iększają o d p o rn o ść kom órek
na d łu g o trw a łe niedotlenienie, w konsekw encji czego nie
dochod zi do aż tak dużej u tra ty kard io m iocy tó w , jak w
kom órkach serca nie p o d d a n y c h w cześniejszem u prekondy cjono w aniu [48]. Liczne prace z zasto sow aniem
z aró w n o m odeli in vivo, ex vitro oraz in vitro pokazują,
że selektyw na aktyw acja PKC e p ro w a d z i do k ardioprotekcji [49], D ane te po tw ierd zają d o św iad czen ia z za­
stosow aniem chlorku cheleritryny — in hibitora izoform
PKC, w których nie obserw uje się zjaw iska ochrony in­
d u k o w a n e g o przez k ró tk o trw ały ep izo d n iedokrw ienny.
S u gero w anych jest kilka białek m itochon drialnych, które
m ogą być s u b s tra ta m i/ białkam i o dd ziałującym i z PKC e.
N ależą do nich białka łańcucha o d d e c h o w eg o oraz białka
kan ałów jon ow ych [50]. W bad a n iac h in vitro w ykazano,
że aktyw acja kardiom iocytó w izolow any ch z zarodkó w
szczuró w a k ty w ato re m PKC, PMA, p ro w a d z i do fosfo­
rylacji po djedn ostk i IV o ksydazy cytochrom ow ej (COIV),
n ato m iast po d an ie selektyw nego inhibitora PKC e, eVl-2,
ham uje tę fosforylację [51]. Dalsze b ad an ia d o w odzą, że
p o d d a n ie h a rto w a n iu p ło d o w y ch k ardiom io cytów m y­
szy w w y n ik u hipoksji p o w o d u je o d d z ia ły w a n ie PKC £
i COIV. R ezultatem tych o d d z ia ły w a ń jest fosforylacja
COIV i o b serw o w an y aż czterokro tn y w z ro st a k ty w n o ­
ści o k sy d azy cytochrom ow ej, w z m o żo n a synteza ATP,
tym sam y m u sp ra w n ie n ie funkcji bioenergetycznej m ito­
c h ond riów , co tłum aczyć m oże zw iększoną odporn ość na
u szk o d zen ie ischem iczne serca [52].
Innym su b stratem PKC 8 w ydają się być białka tw o ­
rzące MPTP: VDAC (ang. voltage-dependent anion channel)
w zew nętrznej oraz ANT (ang. adenine nucleotide translocator) w w ew nętrznej błonie m itochondrialnej. Z w yko ­
rzy stan iem m eto d y im m unop recyp itacji u do w o d n io n o ,
że PKC 8 fizycznie łączy się z białkiem A N T i VDAC,
które d o d a tk o w o jest fosforylow ane [53]. W ydaje się,
że w p raw id ło w o funkcjonującej kom órce, nie p o d d a ­
nej ż a d n e m u stresow i, m egakanał jest p ra w d o p o d o b n ie
zam knięty lub m inim alnie otw arty. C ałkow ite otwarcie
MPTP p od czas reperfuzji p o niedo krw ienn ej p ro w ad zi do
śmierci kom órki [54], Z ao bserw ow ano, że inkubacja m i­
to ch o n d rió w w yizolow any ch z serca m yszy z nadekspresją PKC e obniżała otw arcie m egakanału, a jego całkowite
ham o w a n ie m iało miejsce w m itochodriach serca m yszy z
ko n sty tu ty w n ie ak ty w n ą PKC 8 [53], B adania te sugerują
ud z ia ł PKC e w regulacji aktyw ności m eg ak an ału i jego
otw arcia.
Innym kanałem zlokalizow anym w w ew nętrznej błonie
mitochondrialnej, który praw dopodobnie oddziałuje z PKC
8, jest kanał potasowy, którego otwarcie regulow ane jest
przez ATP (mitoKATp). W niepobudzonej komórce, kiedy
utrzym any jest stały poziom ATP, kanał ten jest zamknięty
[55], Jego otwarcie poprzedzone jest spadkiem ilości ATP,
obserw ow anym np. podczas niedokrwienia. Liczne do­
św iadczenia wskazują, że krótkotrw ałe otwarcie kanału mitoKATp w pływ a na regulację objętości macierzy, poziom Ca2+
w m itochondriach i produkcję w olnych rodników [56,57],
Zaobserw ow ano, że kanał mitoKATp otw iera się po podaniu
agonisty PKC e — vj/eRACK, a zam yka po podaniu antago­
nisty, eVl-2 [58].
212
KINAZA C-Raf (Raf-1)
Kinaza Raf-1, należąca do kinaz serynowo-treoninowych, ma kluczowe znaczenie w przekazyw aniu sygnałów
zew natrzkom órkow ych zarów no w praw idłow ych, jak i no­
w otw orow ych komórkach. Rezultatem kaskady fosforylacji
zależnych od Raf-1 jest aktywacja licznych kinaz białko­
wych, co prow adzi do aktywacji czynników transkrypcyjnych i proliferacji kom órek [59-61]. Po raz pierw szy pow ią­
zano kinazę Raf-1 z mitochondriami, prow adząc badania
na ludzkich kom órkach nerkow ych 293 oraz na kom órkach
32D.3, w których w ykazano, że nadprodukcja białka antyapototycznego Bcl-2 pow oduje przeniesienie kinazy Raf-1
do m itochondriów [62]. Dalsze dośw iadczenia pokazały,
że Raf-1 fosforyluje, a tym sam ym inaktyw uje proapoptotyczne białko Bad w zewnętrznej błonie mitochondrialnej,
pow odując zaham ow anie apoptozy [63]. W m itochondriach
izolowanych z m ózgu chomika mongolskiego w ykryto ki­
nazę Raf-1, której poziom zmniejszał się w czasie reperfuzji
po krótkotrw ałym niedokrw ieniu. Jednocześnie zw iększa­
ła się ilość kinazy JNK. Kinazy te fosforylują odpow iednio
białka Bad i Bcl-2, zmieniając ich wzajem ne pow inow actw o
i połączenie z błoną mitochondrialną. Badania te w skazały
na udział kinazy Raf-1 i JNK w poischemicznej p rzeb u d o ­
wie zewnętrznej błony m itochondriów, co p row adzi do
uszkodzeniach neuronów po niedokrw ieniu m ózgu [64],
Ciekawe wydają się obserwacje, że Raf-1 działa ochronnie
rów nież w komórkach, które nie ekspresjonują białka Bad i
są ubogie w Bcl-2 [65]. Sugeruje to w ystępow anie innych
białek, z którymi oddziałuje Raf-1 w błonach m itochon­
drialnych. Badania m etodą immunoprecypitacji pokazały,
że w mysich kom órkach now otw orow ych 32Dcl.3 aktyw na
kinaza Raf-1 fizycznie odziałuje z białkiem VDAC [66]. Ckońcowy fragm ent kinazy Raf-1 łączy sie z białkiem VDAC.
To połączenie nie zmienia jednak aktywności MPTP w spó ł­
tworzonego przez VDAC. Sugerow any jest zatem udział
jeszcze innych białek; w tym Bcl-2. Wydaje się, że bezpo­
średnie oddziaływ anie Raf-1 i Bcl-2 z VDAC m oże zmienić
jego konformację, w rezultacie zmniejszając liczbę tw orzo­
nych przez VDAC porów w zewnętrznej błonie m itochon­
drialnej, obniżać depolaryzację błony i zmniejszać w ypływ
cytochrom u c z m itochondriów [66].
INNE KINAZY BIAŁKOWE
RODZINA KINAZ TYROZYNOWYCH Src
Obecność kinaz fosforylujących białka w m itochondriach
wskazuje, że są one istotne dla funkcjonowania tych orga­
nelli. Oprócz kinaz serynow o-treoninow ych znaleziono w
m itochondriach kinazy tyrozynow e z rodziny Src. Trak­
towanie oczyszczonych m itochondriów w yizolow anych
z m ózgu szczura specyficznym inhibitorem kinaz Src (PP2)
ham ow ało fosforylację reszt tyrozynow ych wielu białek
mitochondrialnych, co sugeruje obecność tych kinaz i ich
substratów w badanej frakcji [67], Badania z użyciem spe­
cyficznych przeciwciał potw ierdziły obecność czterech z 11
kinaz z rodziny Src: c-Src, Fyn, Lyn oraz Csk. O prócz kina­
zy Lyn, która wydaje się być zlokalizow ana w grzebieniach,
pozostałe kinazy występują w przestrzni miedzybłonowej
m itochondriów [68]. Do dziasiaj tylko dla kinazy c-Src zn a­
leziono substrat, którym jest oksydaza cytochrom ow a [69],
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
W ykazano też, że c-Src oddziałuje z kom pleksem II łańcu­
cha oddechowego. Jego fosforylacja wydaje się być niezbęd­
na do praw idow ego przepływ u elektronów przez łańcuch
oddechow y w kom órkach o d użym zapotrzebow aniu na
ATP, takich jak, bogate w mitochondria, osteoklasty [70].
Najnow sze badania sugerują również, że obecność kinazy
c-Src w m itochondriach jest bezpośrednio zw iązana z biał­
kiem kotwiczącymi AKAP121 oraz białkiem PTPD1 (ang.
protein tyrosine phosphatase), które biorą rów nież udział w
kotwiczeniu kinazy PKA w zewnętrznej błonie m itochon­
drialnej [13].
RODZINA MAPK KINAZ
Kinazy MAPK (ang. mitogen-activated protein kinases) to
grupa kinaz serynow o-treoninow ych aktyw ow anych mitogenami, która reguluje od pow iedź na sygnały docierające
do komórki z zewnątrz. W pływają one m.in na ekspresję
genów, różnicowanie kom órkow e, proliferację i apoptozę.
Rodzinę kinaz MAP dzielimy na trzy grupy: kinazy p38,
JNK (ang. c-Jun terminal kinase)/SAPK (ang. stress-activated
protein kinase) oraz E R K I/2. Generalnie aktywacja szlaków
JNK i p38 zw iązana jest z reakcją kom órek na stres i może
prow adzić do ich śmierci. Szlak kinaz E R K I /2, zaangażo­
w any głównie w procesy podziału i w zrostu komórki, jest
aktyw ow any przez czynniki w zrostow e [71]. Nie ma zbyt
wielu doniesień dotyczących kinazy p38 w mitochondriach;
wiadom o, że jest ona zw iązana z procesami apoptozy, w
tym z przeniesieniem białka Bax z cytosolu do m itochon­
driów, niezależnym od kaspaz w ypływ em potasu oraz
z transkrypcyjną regulacją TR3, białka, które transporto­
w ane jest z jądra do m itochodriów inicjując szlak apoptotyczny [72-74], Epperly i w spółpracow nicy (2002) wykazali
transport kinazy p38 jak i JNK do m itochondriów hematopoetycznych kom órek 32D cl 3 po naśw ietleniu promienimi
X [75], Głów nym skutkiem działania kinazy JNK na m ito­
chondria jest stymulacja apoptozy. Traktow anie aktyw ną
kinazą JNK m itochondriów w yizolow anych z m ózgu szczu­
ra pow oduje ham ow anie anty-apoptotycznych białek Bcl-2 i
Bcl-Xj, prow adząc do uwalniania cytochrom u c [76-78]. Ba­
dania m etodą d w u h y bryd ow ą wykazały, że w komórkach
drożdży kinaza JNK łączy sie z białkiem Sab (SH3BP5), a
badania imm unocytochem iczne wskazują, że JNK w ystępu­
ję w m itochondriach w kom órkach ludzkich (A431, HFF),
mysich (KIM-2) i kurzych (CEF) [78]. Sugeruje się, że białko
Sab oddziałuje z JNK w m itochondriach, gdzie może pełnić
funkcję podobną do białek kotwiczących z rodziny AKAP.
Nie wykluczone jest, że może pośredniczyć w szlaku prze­
kazyw ania sygnałów przez JNK w m itochondriach [77], Jak
w spom niano wcześniej, ilość aktywnej, ufosforylowanej
JNK związanej z m itochondriam i w neuronach zwiększa
się w przebiegu poniedokrw iennej, opóźnionej neurodegeneracji, co wskazuje na udział JNK w procesie apoptozy, jak
w ykazano w m odelu przejściowego niedokrw ienia m ózgu
chomika mongolskiego [64],
Pierwsze doniesienia, które w skazują na mitochondrialną lokalizację ufosforylow anej/aktyw nej kinazy E R K I/2,
pochodzą z badań m etodą western biot poszczególnych
frakcji kom órkow ych [79], W ykazano, że uszkodzenie
kom órek nerki (ang. renal proximal tubular cells- RPTC)
cytostatykiem, cisplatyną, prow adzi do w zrostu ilości ak­
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
tywnej kinazy E R K I/2 oraz PKC a w m itochondriach, co
wydaje się w pływ ać na zwiększenie potencjału błony mito­
chondrialnej, spadek aktywności oksydacyjnej fosforylacji,
w zrost aktywności kaspazy 3 oraz apoptozę [79]. Podobnie,
udział E R K I/2 w fosforylacji białek Bcl-2 i Bad wykazano
z zastosow aniem m etody ko-immunoprecypitacji aktyw ­
nej kinazy E R K I/2 z białkami z rodziny Bcl-2 [80], Bada­
nia im m unohistochem iczne w mikroskopie elektronow ym
potw ierdziły obecność ufosforylowanej formy E R K I/2 w
m itochondriach [81]. Kolejne badania pozwoliły dokładniej
określić ich lokalizację w przestrzni międzybłonowej oraz w
macierzy mitochondrialnej [81]. Ich w ystępow anie zaobser­
w ow ano m.in. w m itochondriach uszkodzonych kom órek
nerw ow ych pacjentów z chorobą Parkinsona [82].
PODSUMOWANIE
W yniki badań prow adzonych w ostatnich latach po raz
kolejny potwierdzają, jak istotną rolę odgrywają w komórce
mitochondria. W chwili obecnej wydaje się, że bez fosfory­
lacji i defosforylacji białek związanych z m itochondriam i
przez kinazy serynow e-treoninow e czy tyrozynow e nie
byłoby możliwe przekazyw anie sygnałów z cytoplazmy
do m itochondriów. Czyni to kinazy białkowe kluczowymi
białkami niezbędnym i do utrzym ania rów now agi pom ię­
dzy wielom a procesami w komórce, w tym pom iędzy pro­
cesami prożyciow ym i a apoptozą. Liczne kinazy białkowe
zostały zlokalizowane zarów no w błonach m itochondrial­
nych, w przestrzeni pom iędzy nimi, a także w macierzy mi­
tochondrialnej.
Aby kinazy białkowe mogły wejść na „m itochondrialny
szlak sygnałowy" i fosforylować bądź oddziaływ ać z biał­
kami, tworząc z nimi kompleksy, a tym sam ym zmieniać
ich konformację i m odulow ać funkcje, enzym y te m uszą się
przemieścić z cytoplazm y do błon lub w nętrza m itochon­
driów. W niektórych przypadkach połączenie kinazy z bło­
ną um ożliw ia jej aktywację. N adal nie jest jednak znany m e­
chanizm transportu kinaz białkowych PKA, Akt, PKC i JNK
do m itochondriów . Nie są też w pełni opisane białka, które
biorą udział w transporcie aktyw nych dom en kinaz białko­
wych. W stępne badania sugerują udział białek transp ortu­
jących TOM (ang. tranlsocase of outer membrane) oraz TIM
(ang. translocase of inner membrane) [83], białek zdających się
być kotwicą dla kinaz, np. białek receptorowch RICK (ang.
receptors for inactive C kinase) i RACK (ang. receptors for acti­
vated C kinase) dla izoform PKC [84,85], czy białek kotwiczą­
cych z rodziny AKAP dla PKA [19]. Dodatkow o, p rzy pusz­
cza się, że białko PICK1 (ang. protein that interact with protein
C kinase) przenosi PKC a z cytosolu do m itochondriów [86],
natom iast białko /TCOP (ang. [3' coatamer protein) wydaje się
być specyficznym białkiem RACK dla izoformy PKC e [87],
Nie jest znany m echanizm transportu kinazy PK B /A kt do
m itochondriów . Sugerow any jest udział translokazy białka
szoku cieplnego w pow iązaniu z białkiem TOM20 [29].
D otatkow o istnieje szereg kinaz białkowych tow arzy­
szących kinazom białkowym docelowo przenoszonym do
błon oraz w nętrza m itochondriów , które pośrednio w pły­
wają na aktywację szlaków sygnałow ych prow adzących
do przeżycia lub śmierci kom órek [88-90], Do takich kinaz
należy m.in. cytoplazm atyczna kinaza białkowa G (PKG),
http://rcin.org.pl
213
która w w yniku krótkotrwałego, hartującego niedokrwienia
serca jest aktyw ow ana przez cykliczne GMP (cGMP). PKG
praw dopodobnie fosforyluje nieznane białko w zew nętrz­
nej błonie mitochondrialnej, które w w yniku niezbadanego
m echanizm u przenosi dalej sygnał do znajdującej się w w e­
wnętrznej błonie mitochondrialnej PKC e. Wiele dośw iad­
czeń wskazuje, że aktyw na PKC £ oddziałuje następnie z
kanałem potasow ym mitoKATp. Fosforylacja bądź inne mo­
dulacje kanału dają komórce w yraźny efekt ochronny [90].
PIŚMIENNICTWO
1. H ouslay MD (1991) 'Crosstalk': a pivotal role for protein kinase C in
m odulating relationships betw een signal transduction pathw ays. Eur
J Biochem 195:9-27
2. Geiger B, Bershadsky A, Pankov R, Yam ada KM (2001) Transm em ­
brane crosstalk betw een the extracellular m atrix—cytoskeleton cross­
talk. N at Rev Mol Cell Biol 2: 793-805
3. Im pey S, O brietan K, W ong ST, Poser S, Yano S, W aym an G, Deloulme
JC, Chan G, Storm DR (1998) Cross talk betw een ERK and PKA is re­
quired for Ca2+ stim ulation of CREB-dependent transcription and ERK
nuclear translocation. N euron 21: 869-883
4. Shen YH, G odlew ski J, Z hu J, Sathyanarayana P, Leaner V, Birrer MJ,
Rana A, Tzivion G (2003) Cross-talk betw een JN K /SA PK and ERK/
MAPK pathw ays: sustained activation of JNK blocks ERK activation
by m itogenic factors. J Biol Chem 278: 26715-26721
16. M anna PR, Jo Y, Stocco DM (2007) Regulation of Leydig cell steroido­
genesis by extracellular signal-regulated kinase 1 /2: role of protein
kinase A and protein kinase C signaling. J Endocrinol 193: 53-63
17. D ow nw ard J (2004) PI 3-kinase, Akt and cell survival. Semin Cell Dev
Biol 15:177-182
18. Poderoso C, Converso DP, M aloberti P, Duarte A, N eum an I, Galli S,
Maciel FC, Paz C, Carreras MC, Poderoso JJ, Podesta EJ (2008) A m i­
tochondrial kinase complex is essential to m ediate an ERK 1/2-depen­
dent phosphorylation of a key regulatory protein in steroid biosynthe­
sis. PLoS ONE 3: el443
19. Perkins GA, W ang L, H uang LJ, H um phries K, Yao VJ, M artone M,
Deerinck TJ, Barraclough DM, Violin JD, Smith D, N ew ton A, Scott JD,
Taylor SS, Ellisman M H (2001) PKA, PKC, and AKAP localization in
and around the neurom uscular junction. BMC N eurosci 2:17
20. Bijur GN, Jope RS (2003) Rapid accum ulation of A kt in m itochondria
following phosphatidylinositol 3-kinase activation. J N eurochem 87:
1427-1435
21. Kang BP, Urbonas A, Baddoo A, Baskin S, M alhotra A, Meggs LG
(2003) IGF-1 inhibits the m itochondrial apoptosis program in m esangial cells exposed to high glucose. A m J Physiol Renal Physiol 285:
F1013-F1024
22. Grim es CA, Jope RS (2001) The m ultifaceted roles of glycogen syn­
thase kinase 3beta in cellular signaling. Prog N eurobiol 65: 391-426
23. Parcellier A, Tintignac LA, Z huravleva E, H em m ings BA (2008) PKB
and the m itochondria: AKTing on apoptosis. Cell Signal 20:21-30
5. D ow nw ard J (2001) The ins and outs of signalling. N ature 411: 759762
24. Bijur GN, Jope RS (2001) Proapoptotic stimuli induce nuclear accu­
m ulation of glycogen synthase kinase-3 beta. J Biol C hem 276: 3743637442
6. N ow ak JZ, Zaw ilska JB (2004) Receptory i m echanizm y przekazyw a­
nia sygnału, W ydanie drugie rozszerzone. W ydaw nictw o Naukow e
PWN, W arszawa
25. Bijur GN, De Sam o P, Jope RS (2000) Glycogen synthase kinase-3beta
facilitates staurosporine- and heat shock-induced apoptosis. Protec­
tion by lithium. J Biol Chem 275: 7583-7590
7. Thom son M (2002) Evidence of undiscovered cell regulatory mecha­
nisms: phosphoproteins and protein kinases in m itochondria. Cell Mol
Life Sci 59: 213-219
26. H etm an M, Cavanaugh JE, Kim elm an D, Xia Z (2000) Role of glycogen
synthase kinase-3beta in neuronal apoptosis induced by trophic w ith­
drawal. J Neurosci 20: 2567-2574
8. Horbinski C, Chu CT (2005) Kinase signaling cascades in the mito­
chondrion: a m atter of life or death. Free Radie Biol M ed 38: 2-11
27. Bullard A], Govewalla P, Yellon DM (2005) Erythropoietin protects the
m yocardium against reperfusion injury in vitro and in vivo. Basic Res
Cardiol 100: 397-403
9. Technikova-Dobrova Z, Sardanelli AM, Stanca MR, Papa S (1994)
cA M P-dependent protein phosphorylation in m itochondria of bovine
heart. FEBS Lett 350:187-191
10. Technikova-Dobrova Z, Sardanelli AM, Speranza F, Scacco S, Signorile
A, Lorusso V, Papa S (2001) Cyclic adenosine m onophosphate-depen­
dent phosphorylation of m am m alian m itochondrial proteins: enzyme
and substrate characterization and functional role. Biochemistry 40:
13941-13947
11. Affaitati A, C ardone L, de Cristofaro T, Carlucci A, G insberg MD, Varrone S, G ottesm an ME, A vvedim ento EV, Feliciello A (2003) Essential
role of A-kinase anchor protein 121 for cAMP signaling to m itochon­
dria. J Biol Chem 278: 4286-1294
12. Cardone L, Carlucci A, Affaitati A, Livigni A, DeCristofaro T, Garbi
C, Varrone S, Ullrich A, G ottesm an ME, A vvedim ento EV, Feliciello
A (2004) M itochondrial AKAP121 binds and targets protein tyrosine
phosphatase D l, a novel positive regulator of sre signaling. Mol Cell
Biol 24: 4613-4626
13. Livigni A, Scorziello A, Agnese S, A dom etto A, Carlucci A, Garbi C,
Castaldo I, A nnunziato L, A vvedim ento EV, Feliciello A (2006) Mito­
chondrial AKAP121 links cAMP and sre signaling to oxidative m eta­
bolism. Mol Biol Cell 17:263-271
14. Dyson MT, Jones JK, Kowalewski MP, M anna PR, Alonso M, Gotte­
sm an ME, Stocco DM (2008) M itochondrial A-kinase anchoring pro­
tein 121 binds type II protein kinase A and enhances steroidogenic
acute regulatory protein-m ediated steroidogenesis in MA-10 mouse
Leydig tum or cells. Biol Reprod 78: 267-277
15. Stocco DM, W ang X, Jo Y, M anna PR (2005) M ultiple signaling path­
w ays regulating steroidogenesis and steroidogenic acute regulatory
protein expression: m ore com plicated than w e thought. Mol Endocri­
nol 19: 2647-2659
28. Hanlon PR, Fu P, W right GL, Steenbergen C, Arcasoy MO, M urphy E
(2005) M echanisms of erythropoietin-m ediated cardioprotection d u r­
ing ischem ia-reperfusion injury: role of protein kinase C and phospha­
tidylinositol 3-kinase signaling. FASEB J 19:1323-1325
29. Kobayashi H, Miura T, Ishida H, Miki T, Tanno M, Yano T, Sato T,
H otta H, Shim am oto K (2008) Lim itation of infract size by erythropoi­
etin is associated w ith translocation of Akt to the m itochondria after
reperfusion. Clin Exp Pharm acol Physiol, w druku
30. Parker PJ, M urray-Rust J (2004) PKC at a glance. J Cell Sci 117: 131132
31. Corbalan-Garcia S, G om ez-Fem andez JC (2006) Protein kinase C regu­
latory dom ains: the art of decoding m any different signals in m em ­
branes. Biochim Biophys Acta 1761: 633-654
32. M etzger F, Kapfham m er JP (2003) Protein kinase C: its role in activitydependent Purkinje cell dendritic developm ent an d plasticity. Cere­
bellum 2: 206-214
33. Steinberg SF (2004) Distinctive activation m echanism s and functions
for protein kinase C6. Biochem j 384:449-459
34. Ramakers GM, Pasinelli P, H ens JJ, Gispen WH, De G raan PN (1997)
Protein kinase C in synaptic plasticity: changes in the in situ phospho­
rylation state of identified pre- and postsynaptic substrates. Prog Neuropsychopharm acol Biol Psychiatry 21: 455-486
35. Nakajima T (2006) Signaling cascades in radiation-induced apoptosis:
roles of protein kinase C in the apoptosis regulation. M ed Sci M onit 12:
RA220-RA224
36. Fernandez E, Cuenca N, Garcia M, De Juan J (1995) Two types of m i­
tochondria are evidenced by protein kinase C im m unoreactivity in the
M uller cells of the carp retina. Neurosci Lett 183: 202-205
37. M ajum der PK, Pandey P, Sun X, Cheng K, Datta R, Saxena S, Kharbanda S, Kufe D (2000) M itochondrial translocation of protein kinase
214
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
Cô in phorbol ester-induced cytochrom e c release and apoptosis. J Biol
Chem 275: 21793-21796
38. M ajum der PK, Mishra NC, Sun X, Bharti A, K harbanda S, Saxena S,
Kufe D (2001) Targeting of protein kinase C delta to m itochondria in
the oxidative stress response. Cell G row th Differ 12:465-470
39. D enning MF, W ang Y, Tibudan S, Alkan S, Nickoloff BJ, Qin JZ (2002)
Caspase activation and disruption of m itochondrial m em brane poten­
tial during UV radiation-induced apoptosis of hum an kératinocytes
requires activation of protein kinase C. Cell Death Differ 9: 40-52
40. Li L, Lorenzo PS, Bogi K, Blumberg PM, Yuspa SH (1999) Protein kina­
se C6 targets m itochondria, alters m itochondrial m em brane potential,
and induces apoptosis in norm al and neoplastic kératinocytes w hen
overexpressed by an adenoviral vector. Mol Cell Biol 19: 8547-8558
41. Ffe Y, Liu J, G rossm an D, D urrant D, Sw eatm an T, Lothstein L, Epand
RF, Epand RM, Lee RM (2007) Phosphorylation of m itochondrial pho­
spholipid scramblase 3 by protein kinase C5 induces its activation and
facilitates m itochondrial targeting of tBid. J Cell Biochem 101: 12101221
42. Van Q, Liu J, Lu B, Feingold KR, Shi Y, Lee RM, Flatch GM (2007) Pho­
spholipid scramblase-3 regulates cardiolipin de novo biosynthesis and
its resynthesis in grow ing HeLa cells. Biochem J 401:103-109
43. Liu J, Chen J, Dai Q, Lee RM (2003) Phospholipid scramblase 3 is the
m itochondrial target of protein kinase C delta-induced apoptosis.
Cancer Res 63:1153-1156
44. Liu J, Dai Q, Chen J, D urrant D, Freem an A, Liu T, G rossm an D, Lee
RM (2003) Phospholipid scramblase 3 controls m itochondrial structu­
re, function, and apoptotic response. Mol Cancer Res 1: 892-902
45. Liu J, Weiss A, D urrant D, Chi NW, Lee RM (2004) The cardiolipinbinding dom ain of Bid affects m itochondrial respiration and enhances
cytochrom e c release. A poptosis 9: 533-541.
46. Uecker M, Da Silva R, G ram pp T, Pasch T, Schaub MC, Z augg M
(2003) Translocation of protein kinase C isoforms to subcellular targets
in ischemic and anesthetic preconditioning. Anesthesiology 99: 138147
47. Inagaki K, H ahn HS, D om GW, Mochly-Rosen D (2003) A dditive p ro­
tection of the ischemic heart ex vivo by combined treatm ent w ith delta-protein kinase C inhibitor and epsilon-protein kinase C activator.
Circulation 108: 869-875
48. H aiestrap AP, Clarke SJ, Khaliulin I (2007) The role of m itochondria
in protection of the heart by preconditioning. Biochim Biophys Acta
1767:1007-1031
49. Budas GR, Churchill EN, Mochly-Rosen D (2007) Cardioprotective
m echanism s of PKC isozyme-selective activators and inhibitors in the
treatm ent of ischem ia-reperfusion injury. Pharm acol Res 55:523-536
50. Budas GR, Mochly-Rosen D (2007) M itochondrial protein kinase Cepsilon (PKCepsilon): em erging role in cardiac protection from ischaemic
damage. Biochem Soc Trans 35:1052-1054
51,Ogbi M, Chew CS, Pohl J, Stuchlik O, Ogbi S, Johnson JA (2004) Cy­
tochrom e c oxidase subunit IV as a m arker of protein kinase Cepsilon
function in neonatal cardiac myocytes: implications for cytochrom e c
oxidase activity. Biochem J 382: 923-932.
52. Ogbi M, Johnson JA (2006) Protein kinase Ce interacts w ith cytochro­
me c oxidase subunit IV and enhances cytochrom e c oxidase activity in
neonatal cardiac myocyte preconditioning. Biochem J 393:191-199
53. Baines CP, Song CX, Z heng YT, W ang GW, Zhang J, W ang OL, G uo Y,
Bolli R, Cardwell EM, Ping P (2003) Protein kinase Cepsilon interacts
w ith and inhibits the perm eability transition pore in cardiac m itochon­
dria. Circ Res 92: 873-880
57. Otani H (2004) Reactive oxygen species as m ediators of signal trans­
duction in ischemic preconditioning. Antioxid Redox Signal 6: 449469
58.Jaburek M, Costa AD, Burton JR, Costa CL, Garlid KD (2006) Mito­
chondrial PKCe and m itochondrial ATP-sensitive K+channel copurify
and coreconstitute to form a functioning signaling m odule in proteoliposomes. Circ Res 99: 878-883
59. K arandikar M, Xu S, Cobb M H (2000) MEKK1 binds raf-1 and the
ERK2 cascade com ponents. J Biol Chem 275: 40120-40127
60. M atheny SA, Chen C, Kortum RL, Razidlo GL, Lewis RE, W hite MA
(2004) Ras regulates assem bly of mitogenic signalling complexes thro­
ugh the effector protein IMP. N ature 427: 256-260
61. von Kriegsheim A, Pitt A, G rindlay GJ, Kolch W, Dhillon AS (2006)
Regulation of the Raf-MEK-ERK pathw ay by protein phosphatase 5.
N at Cell Biol 8:1011-1016
62. W ang HG, Rapp UR, Reed JC (1996) Bcl-2 targets the protein kinase
Raf-1 to m itochondria. Cell 87: 629-638
63. W ang HG, Reed JC (1998) Bcl-2, Raf-1 and mitochondrial regulation of
apoptosis. Biofactors 8:13-16
64. Dluzniewska J, Beresewicz M, W ojewodzka U, Gajkowska B, Zablocka B.(2005) Transient cerebral ischemia induces delayed proapoptotic
bad translocation to m itochondria in CA1 sector of hippocam pus. Bra­
in Res Mol Brain Res 133: 274-280
65. Z hong J, Troppm air J, Rapp UR (2001) Independent control of cell
survival by Raf-1 and Bcl-2 at the m itochondria. Oncogene 20: 48074816
66. Le Mellay V, Troppm air J, Benz R, Rapp UR (2002) Negative regula­
tion of m itochondrial VDAC channels by C-Raf kinase. BMC Cell Biol
3:14
67. Salvi M, Brunati AM, Bordin L, La Rocca N, Clari G, Toninello A (2002)
Characterization and location of Src-dependent tyrosine phosphoryla­
tion in rat brain m itochondria. Biochim Biophys Acta 1589:181-195
68. Garcia FM, Troiano L, M oretti L, Pedrazzi J, Salvioli S, Castilla-Cortazar I, Cossarizza A (2000) Changes in intram itochondrial cardiolipin
distribution in apoptosis-resistant HCW -2 cells, derived from the h u ­
m an prom yelocytic leukem ia HL-60. FEBS Lett 478: 290-294
69. M iyazaki T, Neff L, Tanaka S, H om e WC, Baron R (2003) Regulation
of cytochrom e c oxidase activity by c-Src in osteoclasts. J Cell Biol 160:
709-718
70. Miyazaki T, Tanaka S, Sanjay A, Baron R (2006) The role of c-Src kinase
in the regulation of osteoclast function. M od Rheumatol 16: 68-74
71. Chang L, Karin M (2001) M am m alian MAP kinase signalling cascades.
N ature 410: 37-40
72. H olm es WF, Soprano DR, Soprano KJ (2003) Early events in the induc­
tion of apoptosis in ovarian carcinom a cells by CD437: activation of the
p38 MAP kinase signal pathw ay. Oncogene 22: 6377-6386
73. Bossy-Wetzel E, Schw arzenbacher R, Lipton SA (2004) Molecular pa­
thw ays to neurodegeneration. N atM ed lO(Suppl): S2-S9
74. Bossy-Wetzel E, Talantova MV, Lee WD, Scholzke MN, H arrop A,
M athew s E, Gotz T, H an J, Ellisman MH, Perkins GA, Lipton SA
(2004) Crosstalk betw een nitric oxide and zinc pathw ays to neuronal
cell death involving m itochondrial dysfunction and p38-activated K+
channels. N euron 41: 351-365
75. Epperly MW, Sikora CA, DeFilippi SJ, G retton JA, Zhan Q, Kufe DW,
G reenberger JS (2002) M anganese superoxide dism utase (SOD2) inhi­
bits radiation-induced apoptosis by stabilization of the m itochondrial
m em brane. Radiat Res 157: 568-577
55. Szewczyk A, Wojtczak L (2002) M itochondria as a pharm acological
target. Pharmacol Rev 54:101-127
76. Schroeter H, Boyd CS, A hm ed R, Spencer JP, Duncan RF, Rice-Evans
C, Cadenas E (2003) c-Jun N -term inal kinase (JNK)-mediated m odu­
lation of brain m itochondria function: new target proteins for JNK
signalling in m itochondrion-dependent apoptosis. Biochem J 372:359369
56. Bednarczyk P, Dołowy K, Szewczyk A (2005) Matrix Mg2+ regulates
m itochondrial A TP-dependent potassium channel from heart. FEBS
Lett 579:1625-1632
77. W iltshire C, Gillespie DA, May G H (2004) Sab (SH3BP5), a novel mitochondria-localized JNK-interacting protein. Biochem Soc Trans 32:
1075-1077
54. H aiestrap AP, McStay GP, Clarke SJ (2002) The perm eability transition
pore complex: another view. Biochimie 84:153-166
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
215
78. W iltshire C, M atsushita M, T sukada S, Gillespie DA, May GH (2002) A
new c-Jun N -term inal kinase (JNK)-interacting protein, Sab (SH3BP5),
associates w ith m itochondria. Biochem J 367:577-585
79. N ow ak G (2002) Protein kinase C-alpha and ERK 1/2 m ediate mito­
chondrial dysfunction, decreases in active N a+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J Biol Chem 277:43377-43388
80. Deng X, Ruvolo P, Carr B, May WS Jr (2000) Survival function of
ERK1/2 as IL-3-activated, staurosporine-resistant Bcl2 kinases. Proc
Natl Acad Sci USA 97:1578-1583
81. Alonso M, Melani M, Converso D, Jaitovich A, Paz C, Carreras MC,
M edina JH, Poderoso JJ (2004) M itochondrial extracellular signal-re­
gulated kinases 1 /2 (ERK1/2) are m odulated d uring brain develop­
ment. J N eurochem 89: 248-256
82. Z hu JH, G uo F, Shelburne J, W atkins S, Chu CT (2003) Localization of
phosphorylated ER K /M A P kinases to m itochondria and autophago­
som es in Lewy body diseases. Brain Pathol 13:473-481
83. Bolender N, Sickmann A, W agner R, Meisinger C, Pfänner N (2008)
M ultiple pathw ays for sorting m itochondrial precursor proteins.
EMBO Rep 9: 42-49
84. Frazier AE, Chacinska A, Truscott KN, Guiard B, Pfänner N, Rehling P
(2003) M itochondria use different m echanisms for transport of multi-
spanning m em brane proteins through the interm em brane space. Mol
Cell Biol 23: 7818-7828
85. Truscott KN, B randner K, Pfänner N (2003) M echanism s of protein im ­
port into mitochondria. Curr Biol 13: R326-R337
86. W ang WL, Yeh SF, Chang YI, Hsiao SF, Lian WN, Lin CH, H uang
CY, Lin WJ (2003) PICK1, an anchoring protein that specifically targets
protein kinase C alpha to m itochondria selectively upon serum stim u­
lation in NIH 3T3 cells. J Biol C hem 278: 37705-37712
87. Csukai M, Chen CH, De M atteis MA, Mochly-Rosen D (1997) The
coatom er protein beta'-COP, a selective binding protein (RACK) for
protein kinase Ce. J Biol Chem 272: 29200-29206
88. W ang QJ (2006) PKD at the crossroads of DAG and PKC s:gnaling.
Trends Pharm acol Sci 27: 317-323
89. Lasfer M, Davenne L, Vadrot N, Alexia C, Sadji-Ouatas Z, Eringuier
AF, Feldm ann G, Pessayre D, Reyl-Desmars F (2006) Protein kinase
PKC delta and c-Abl are required for m itochondrial apoptosis induc­
tion by genotoxic stress in the absence of p53, p73 and Fas receptor.
FEBS Lett 580: 2547-2552
90. Costa AD, Pierre SV, Cohen MV, D ow ney JM, Garlid KD (2003) cGMP
signalling in pre- and post-conditioning: the role of mitochondria. Cardiovasc Res 77: 344-352
Protein kinases in mitochondria
Joanna Ewa Kowalczyk , Barbara Zablocka
M olecular Biology Unit, M ossakow ski M edical Research Centre, Polish A cadem y of Science, 5 Paw inskiego St., 02-106 W arsaw , Poland
:e-mail: jkow alczyk@ cm dik.pan.pl
Key words: m itochondria, protein kinase, signal transduction, ischaem ia preconditioning, apoptosis
ABSTRACT
Mitochondria, besides playing a central role in energy metabolism w ithin the cell, are involved in a cohort of other processes like cellular
differentiation and apoptosis. Investigations during recent few years have show n that protein kinases, including PKA, PKB/Akt, PKC, Raf-1,
p38 MAPK, JNK, ERK1/2, Src, Fyn and Csk, may directly interact with mitochondrial proteins. Their role mainly concentrates at phosphory­
lation of pro- and anti-apoptotic proteins (Bad, Bax, Bcl-2, Bcl-xL), phosphorylation/modification of electron transport chain proteins (complex
I, COIV), MPTP form ing proteins VD AC and ANT, proteins of mitochondrial ATP-sensitive potassium channel (mitoKATp) and phospholipid
scramblase 3 (PLSCR3). Many experimental data show ed the presence of protein kinases in the outer and inner mitochondrial membranes as
w ell as in the mitochondrial matrix during in v itro cell stimulations, in neurodegenerative diseases and in in v iv o ischaemia heart preconditio­
ning. These data show that translocation of protein kinases to mitochondria plays an important role especially during ischaemia/reperfusion
in brain and heart.
216
http://rcin.org.pl
w w w .p o step yb o chem ii.pi
Zastosowanie elektroforezy „Blue Native"
w badaniach mitochondrialnego łańcucha
oddechowego w normie i patologii
STRESZCZENIE
pracowana pod koniec XX w ieku, elektroforeza „Blue Native" wykorzystywana jest do
badania składu kom pleksów białkow ych oraz w diagnostyce chorób mitochondrial­
nych, związanych z uszkodzeniam i łańcucha oddechow ego. Białka i kom pleksy białkow e
rozdzielone w żelu za pomocą tej techniki zachowują swoją aktywność enzymatyczną. W
artykule opisano kluczow e etapy elektroforezy „Blue Native" determinujące jakość rozdzia­
łu oraz użyteczność tej techniki w badaniach m itochondrialnego łańcucha oddechow ego w
komórkach zdrowych i dotkniętych patologią.
O
WPROWADZENIE
Wiele białek oddziałuje ze sobą, tw orząc kom pleksy i dzięki tem u m ogą speł­
niać w kom órce wyspecjalizowane funkcje. W ostatnim czasie nastąpił dyna­
miczny rozwój takich kierunków biologii molekularnej, jak badania kom plek­
sów białkow ych (ang. complexomics) oraz oddziaływ ania białko-białko (ang.
interactomics). Sprawiło to, że niezbędne stało się opracow anie m etod p ozw a­
lających na dokładniejsze poznanie i identyfikacje obecnych w komórce kom ­
pleksów białkowych. Do metod, które to um ożliwiają należy elektroforeza „Blue
N ative" (BN-PAGE), im m unoprecypitacja, d w ustopniow e oczyszczanie m etodą
pow inow actw a (ang. two step affinity purification) oraz drożd żow y system dw uhybry dow y (ang. two hybride system).
Elektroforeza „Blue Native" jest jedną z najpopularniejszych m etod badania
białek w ich natywnej formie. Technika ta rozwija się intensyw nie od początku
lat 90. ubiegłego w ieku i jest ciągle udoskonalana [1], Jej tw órcam i są niemiec­
cy badacze Schägger i Von Jagow [2], Początkow o służyła głów nie do badania
kom pleksów łańcucha oddechow ego izolowanych z błon m itochondriów [2]. W
ostatnich latach technika ta znalazła rów nież szereg innych zastosow ań, np. w
diagnostyce chorób m itochondrialnych (zw iązanych z uszkodzeniam i łańcucha
oddechow ego) [3], czy jako m etoda kom plem entarna do im m unoprecypitacji w
badaniach oddziaływ ań białek [4]. O grom ną zaletą BN-PAGE jest to, że w trak­
cie rozdziału elektroforetycznego zachow yw ana jest oryginalna aktyw ność en­
zym atyczna oraz oddziaływ ania białek w chodzących w skład kom pleksów [2].
Jest to możliw e dzięki zastosow aniu optym alnych w arun ków zarów no podczas
izolacji, jak i rozdziału.
ELEKTROFOREZA „BLUE NATIVE" I
SDS-PAGE - RÓŻNICE I PODOBIEŃSTWA
Magdalena Lebiedzińska
Jerzy Duszyński
Mariusz R. Więckowski
P racow nia Bioenergetyki i Błon Biologicznych,
Insty tu t Biologii D ośw iadczalnej PA N im.
M arcelego Nenckiego, W arszaw a
^P rac o w n ia
B ioenergetyki
i
Błon
Biologicznych,
In sty tu t
Biologii
D ośw iadczalnej
PA N ,
im.
M arcelego
N enckiego, ul. P asteura 3, 02-093 W arszaw a;
e-m ail: m .w ieckow ski@ nencki.gov.pl
A rtykuł otrzym ano 14 kw ietnia 2008 r.
A rtykuł zaakceptow ano 22 kw ietnia 2008 r.
Słow a kluczowe: elektroforeza „Blue N ative",
m itochondria, m itochondrialny łańcuch od­
dechow y, diagnostyka chorób m itochondrial­
nych, o ddziaływ ania białek
W ykaz skrótów: BN-PAGE — elektroforeza
„Blue N ative" w żelu poliakryloam idow ym ;
CN-PAGE — elektroforeza „Clear N ative" w
żelu poliakryloam idow ym ; DTT - ditiotreitol;
OXPHOS — fosforylacja oksydacyjna; SDS
— dodecylosiarczan sodu; SDS-PAGE — elek­
troforeza poliakryloam idow a białek w w a ru n ­
kach denaturujących
Podziękowania: Praca dośw iadczalna autorów
oraz w yniki przedstaw ione na rycinach niniej­
szego opracow ania zostały częściowo sfinanso­
w ane z funduszy przyznanych przez M inister­
stw o N auki i Szkolnictwa W yższego na realiza­
cję projektu badaw czego N301 092 32/3407 oraz
przez Polską Sieć M itochondrialną
SDS-PAGE
Do rozdziału elektroforetycznego typu SDS-PAGE białka należy zdenaturow ać i „opłaszczyć" jonow ym detergentem dodecylosiarczanem sodu (SDS).
Z asada rozdziału białek z zastosow aniem SDS-PAGE jest stosunkow o prosta.
SDS w trakcie przygotow ania próbki w iąże się z białkami w stosunku m aso­
w y m 4,1:1, nadając im ujemny ładunek elektryczny o stałej gęstości, bez w zglę­
du na wielkość białka. W tego typu elektroforezie szybkość migracji białek w
żelu nie jest determ inow ana przez wielkość ładu nku elektrycznego, lecz zależy
wyłącznie od m asy białka. Białka rozdzielane są w żelu poliakryloam idow ym na
podstaw ie zróżnicowanej ruchliwości elektroforetycznej w polu elektrycznym.
Ruchliwość ta jest odw rotnie proporcjonalna do logarytm u m asy cząsteczkowej
białka. W rzeczywistości białka rozdzielane są w SDS-PAGE na zasadzie filtra­
cji, analogicznie do m etody chromatograficznej (sączenie molekularne). Ten typ
elektroforezy pozw ala na rozdział białek o m asach cząsteczkowych w zakresie
ok. 10-400 kDa [5],
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
217
„BLUE NATIVE"-PAGE
W odróżnieniu od elektroforezy denaturującej, na każ­
d ym etapie elektroforezy „Blue N ative", czyli podczas
przygotow ania próbki oraz jej rozdziału w żelu, białka za­
chowują swoją strukturę drugo-, trzecio- i czwartorzędow ą.
Elektroforeza „Blue Native" pozw ala na rozdział białek/
kom pleksów białkowych o znacznie większej masie w po­
rów naniu z elektroforezą SDS-PAGE. Przy zastosow aniu
standardow ego poliakryloam idow ego żelu gradientow ego
(4-16% poliakryloamid) m ożna rozdzielić białka o masie
od 100 kDa do 1,5-2 MDa. D odatkow e obniżenie stężenia
akryloam idu pozw ala na rozszerzenie tego zakresu naw et
do 4 MDa. Zastąpienie żelu poliakryloam idow ego agarozow ym przesuw a tę granice jeszcze dalej — naw et do 10
~ 15 MDa. Daje to możliwość badania dużych kom plek­
sów białkowych, np. takich jak kom pleks dehydrogenazy
pirogronianowej, który m a masę około 8 MDa [6]. W yko­
rzystyw any w elektroforezie BN-PAGE barw nik Coomassie
Brillant Blue G-250 zm ienia ładunek białek na ujem ny oraz
zmniejsza tendencję białek o dużych pow ierzchniach hy­
drofobow ych do agregacji umożliwiając ich rozdział elektroforetyczny. Przykładow y obraz rozdziału kom pleksów
łańcucha oddechow ego w yizolow anych z m itochondriów
serca szczura przedstaw iono na Ryc. 1.
CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA ROZDZIAŁ
KOMPLEKSÓW BIAŁKOWYCH W
ELEKTROFOREZIE „BLUE NATIVE"
Uzyskanie rozdziału porów nyw alnego z przedstaw io­
nym na Ryc. 1 jest możliwe przy przestrzeganiu kilku zasad
w ym ienionych poniżej.
w zg lęd u na p otrzeb ę zachow ania białek w form ie niez d en atu ro w an ej oraz o d d z ia ły w a ń pom ięd zy białkam i,
nie jest m ożliw e zastosow anie tak silnego d ete rg e n tu jo­
now ego jakim jest SDS i dlatego w ykorzystu je się d e te r­
genty niejonow e. Błony organelli kom órek euk ario tycz­
nych charakteryzują się ró ż n y m składem lip id o w y m oraz
zaw artością białek. W z w iąz k u z tym , w zależności od
b adanego m ateriału, n ie z b ę d n e jest d o branie o d p o w ie d ­
niego d e te rg e n tu oraz jego stężenia do solubilizacji błon.
U żyty d ete rg en t nie m oże d o p ro w a d z ić do ro z p a d u kom ­
pleksów białkow ych, a jednocześnie p o w in ien być na tyle
efektyw ny żeby „rozerw ać" w iązania p o m ięd z y białkam i
i lipidam i. Do najczęściej sto sow any ch d e te rg e n tó w n ie­
jonow ych należą n-dodecylo-|3-D -m altozyd [2], digitonina [7], T riton X-100 [7], sap o n in a [8] oraz Brij 96 [8]. W
niektórych p rz y p a d k a c h stosuje się Big, CHAPS, NP-40
oraz n -d ekanoilosach arozę [9], W Tabeli 1 p rz e d sta w io n o
zestaw ienie najbardziej p o p u larn y c h d e te rg e n tó w i ich
zastosow anie.
SIŁA JONOWA
Czynnikiem w pływ ającym na wydajność ekstrakcji kom ­
pleksów z błon jest odpow iedni skład roztw oru, w którym
przeprow adza się solubilizację błon. Najczęściej do tego celu
wykorzystuje się roztw ory o niskiej sile jonowej. W arunki
takie zapew nić może roztw ór kw asu am inokapronow ego,
bądź octanu potasu. Rozpuszczalne kom pleksy białkowe są
szczególnie wrażliw e na w arunki panujące w trakcie przy­
gotow yw ania próbki, poniew aż oddziaływ ania pom iędzy
białkami mogą ulegać osłabieniu naw et przy bardzo niskiej
sile jonowej.'
COOMASSIE BRILLIANT BLUE G-250
PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU DO ROZDZIAŁU
ELEKTROFORETYCZNEGO - WYBÓR
ODPOWIEDNIEGO DETERGENTU
Jednym z w ażniejszych etapów , zasługujących na
szczególną uw agę, jest etap p rz y g o to w a n ia próbki, która
m a być p o d d a w a n a rozdziałow i elektroforetycznem u. W
p rz y p a d k u białek błonow ych polega on na „w y dobyciu"
k om plek sów b iałkow ych z ich n atu ra ln e g o środo w iska
lipidow ego, w taki sposób, aby nie n a ru sz y ć stru k tu ry
sam ego k om pleksu. W elektroforezie „Blue N ative", ze
W n iektórych p rz y p a d k a c h stabilność k om pleksów
m oże być zw iększon a p o p rz e z obniżenie stężenia C o­
om assie Brillant Blue w próbce przy gotow anej do elek­
troforezy. W tym p rz y p a d k u ilość barw nika, który sta n ­
d a rd o w o jest obecny w buforze kato d o w y m , w y starcza
do p raw id ło w e g o p rzebieg u elektroforezy i po zw ala na
rozdział k om pleksów białkow ych. Kiedy bufor k ato d o w y
oraz p rób ka p rz y g o to w a n a do elektroforezy nie za w ie ra ­
ją C oom assie Brillant Blue m am y do czynienia z elektro­
forezą „Clear N ative"-PA G E (CN-PAGE) [10]. W ykonuje
się ją w tedy, gdy istnieje podejrzenie, że stabilność k o m ­
pleksów , b ą d ź su p e rk o m p le k só w białkow ych m oże być
obn iżan a przez obecny barw n ik . Ten typ elektroforezy
Tabela 1. D etergenty w ykorzystyw ane do ekstrakcji białek w elektroforezie „Blue
N ative".
M ateriał
Stężenie
D igitonina
m itochondria ssaków
m itochondria roślin
1-2%
1-2%
n-dodecyloP-D -m altozyd
m itochondria ssaków
m itochondria roślin
4 m g / m g białka
5 m g / m g białka
T riton X-100
m itochondria ssaków
m itochondria roślin
totalny ekstrakt kom órkow y
1-3%
0,5%
0,1%
Saponina
totalny ekstrakt kom órkow y
1%
Brij 96
totalny ekstrakt kom órkow y
0,5%
I D etergent
Rycina 1. Elektroforetyczny ro zd ział kom pleksów łańcuch a o ddecho w eg o w y ­
izo low anych z m itochon driów serca szczura p rz y u ży ciu elektroforezy „Blue
N ative". Żel poliakry lo am idow y (gradient 5-13%), n-dodecylo-p-D -m altozyd
-
1 %.
218
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
80(.ig
300|ig
150ąg
800|ig
500ng
300|ig
500|ig
80ąg
150(ig
40ąg
R ycina 2. W pływ ilości białka na rozdział kom pleksów łańcucha odd echow ego
w y izo lo w an y ch z m ito ch ond rió w w ą troby szczura przy użyciu elektroforezy
„Blue N ative". Żel poliakry lo am idow y (g radient 6-13%), n-dodecylo-P-D -m altozyd - 1% (w g [16], zm odyfikow ane, za zgodą).
jest ró w n ie ż z p o w o d z e n ie m w y k o rzy sty w a n y w d ia g n o ­
styce chorób m ito ch o n d rialn y ch [11].
Rycina 3. T ypow y o braz położenia kom pleksów łańcucha m itochondrialnego w
żelu „Blue N ative" m ito ch ond rió w serca w ołu (H) i fibroblastów (F). Żel polia­
kry loam idow y (gradient 5-12%), n-dodecylo-P-D -m altozyd - 1%, (w g [16], zm o ­
dyfikow ane, za zgodą).
ROZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY ZAWARTOŚĆ AKRYLOAMIDU W ŻELU ORAZ
ILOŚĆ ROZDZIELANEGO MATERIAŁU
RODZAJ ROZDZIELANYCH
KOMPLEKSÓW BIAŁKOWYCH
Najwięcej problem ów przysparza badaczom w ykonanie
elektroforezy „Blue Native" z lizatu kom órkow ego zaw ie­
rającego w szystkie białka komórki, zarów no błonowe, jak
i rozpuszczalne (cytosolowe). Camacho-Carvajal i wsp.
stwierdzili, że w cytosolu znajduje się niskocząsteczkowy
(mniejszy niż 3,5 kDa) czynnik, który zaburza rozdział elektroforetyczny [8]. Jakość rozdziału kom pleksów białkowych
m etodą BN-PAGE m ożna popraw ić pozbywając się tego
czynnika, np. m etodą dializy.
Kolejnymi param etram i w elektroforezie „Blue Native",
determinującymi jakość rozdziału kom pleksów łańcucha
oddechowego, są stężenie akryloam idu w żelu oraz ilość
m ateriału biologicznego nałożonego na żel [1]. N a przykła­
dzie preparatu przygotow anego z m itochondriów w ątro ­
by szczura widać, że zwiększanie ilości białka nałożonego
na ścieżkę w celu podniesienia widoczności kom pleksów
w żelu ma swoje ograniczenia, a przeładow anie przynosi
wręcz odw rotny rezultat (Ryc. 2). Zastosowanie poliakryloam idow ego żelu gradientow ego (6-12%)
pokazuje, że najlepszy rozdział kom plek­
sów łańcucha oddechow ego obserwujemy
w przedziale 500-100 kDa, czyli dla kom ­
pleksów III, IV i II. Zm iana gradientu na 512% skutkuje lepszym rozdziałem w zakre­
sie 800-350 kDa, co um ożliw ia popraw ienie
rozdziału kom pleksów I, V, III i IV (Ryc. 3).
Z kolei zastosow anie żelu o gradiencie 412% popraw ia rozdział znacznie większych
kom pleksów z zakresu 2 MDa — 600 kDa,
np. dim eru ATPazy o masie 1,2 MDa (Ryc.
4). Praw idłow o p rzeprow adzona elektrofo­
reza „Blue Native" pozwala na porów nanie
profili rozdzielonych kom pleksów łańcucha
oddechow ego m itochondriów w yizolow a­
nych z różnych tkanek lub narządów . Na
przykładzie elektroforetycznego rozdziału
kom pleksów białkowych z m itochondriów
w ątroby i serca szczura m ożna stwierdzić,
że w m itochondriach serca jest więcej kom ­
pleksu I niż w m itochondriach w ątroby. Jest
to zgodne z p rzeprow adzonym i spektrofotom etrycznym i pom iaram i w badanych
Rycina 4. Poró w nanie ro zd ziału kom pleksów łańcucha o d dechow ego z m ito c h o n d rió w w ątrob y i serca
m itochondriach aktywności kom pleksu I.
szczura przy użyciu elektroforezy „Blue N ative". Żel po liakryloam idow y (g rad ien t 4-12% ), n-dodecyloAby zaobserw ow ać porów nyw alną aktyw ­
P-D -m altozyd - 1%. T ypow y obraz położenia kom plek só w OXPHOS w żelu o ra z spektrofotom etry czny
p o m ia r aktyw ności ko m pleksu I — (A) w m itocho ndriach w ątro by szczura i (B) serca szczura (w g [16],
ność kom pleksu I, należy użyć do pom iaru
zm odyfikow ane, za zgodą).
dw ukrotnie więcej m itochondriów w ątroby
P ostępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
219
profil białkowy w żelu. W p rz y p a d k u zastosow ania n-dodecylo-(3-D-maltozydu (lub T ritonu X-100) kom pleksy łań­
cucha oddechow ego w ystępują w postaci m onom erycznej
(Ryc. 1-4), z w yjątkiem ATPazy, która m oże w ystępow ać
także jako dim er o masie 1,2 MDa. G dy do ekstrakcji k om ­
pleksów użyje się digitoninę, w żelu m ożna obserw ow ać
także „superkom pleksy" tw orzone przez kom pleksy łań­
cucha oddechow ego. Więcej na tem at superkopleksów ,
tw orzonych przez kom pleksy łańcucha oddechow ego
m ożna znaleźć w literaturze [7,12-15], Różnice w profilu
białkow ym dla n-dodecy lm altozy du i digitoniny p rz e d sta ­
w iono na Ryc. 5.
INNE PARAMETRY
Rycina 5. W pływ d eterg en tu na rodzaj izolow anych k om pleksó w łańcucha od­
dechow ego. Elektroforeza „Blue N ative" m ito ch ond rió w w ą tro b y m yszy. Żel
po liakryloam idow y (gradient 5-12%), n-dodecylo-p-D -m altozyd — 1%, digiton ina — 2%. D igitonina um ożliw ia w y izolow anie i ro zd ział "su perko m pleksów "
łańcucha oddechow ego.
(Ryc. 4). Obserwacja ta czyni z elektroforezy „Blue Native"
metodę, którą m ożna z pow odzeniem stosować do określa­
nia poziom u poszczególnych kom pleksów łańcucha odde­
chowego w bad any m materiale.
SOLUBILIZACJA
Jak już wcześniej w spom niano, niezw ykle w ażny jest
staranny dobór detergentu i jego stężenia w zależności
od m ateriału w y korzystyw anego do badań. Ponadto, de­
tergent m oże mieć w pływ na obraz ro zd z ia łu elektroforetycznego, bow iem w zależności od tego, który detergent
w yk orzystany zostanie do „ekstrakcji" kom pleksów łań­
cucha o ddechow ego z m itochondriów , otrzym am y różny
Elektroforeza przebiega bez zakłóceń i jest po w tarzalna
w tedy, gdy utrzym uje się stałą, niską te m p eratu rę (4°C)
podczas przygotow y w ania próbki oraz w trakcie ro z d z ia ­
łu. W ażne jest także unikanie jonów soli oraz stosow anie
się do reżim u zm ian napięcia w trakcie elektroforezy.
Przestrzeganie tych zasad spraw ia, że elektroforeza „Blue
Native" daje w iarygod ne i pow tarzalne wyniki. N a Ryc. 6
przedstaw iono przykład nieudanego rozdziału elektro­
foretycznego „Blue N ative" w żelu akryloam idow ym i
agarozow ym . W obu p rzy p ad k ach m o żna w żelu zaob­
serw ow ać miejsce (charakterystyczna linia), gdzie ulegają
rozpad ow i kom pleksy białkowe. P rzyczyną takiego stanu
rzeczy m oże być w ysoka zaw artość jonów w próbce lub
przegrzew anie się żelu w trakcie elektroforezy.
AKTYWNOŚĆ W ŻELU (ANG. IN GEL ACTIVITY ASSAY)
Jedną z zalet elektroforezy „Blue N ative" jest to, że
białka oraz kom pleksy białkow e zachow ują swoją a k ty w ­
ność enzym aty czną w trakcie ro zd z ia łu elektro foretycz­
nego. D otyczy to rów nież tak złożonych k o m p lek só w
b iałkow ych jakim i są kom pleksy łańcu cha
odd echow ego. Ich ak tyw ność m ożna m ie­
rzyć inkubując frag m enty żelu w o d p o w ie d ­
nich m ieszaninach reakcyjnych [3,16]. Skład
ro ztw o ró w do p o m ia ru aktyw ności w żelu
p rz ed staw io n o w Tabeli 2. N a g ro m a d z a n ie
się barw n ych p ro d u k tó w reakcji w m iejscu
lokalizacji k om p lek su w żelu p o zw ala na
o szacow anie aktyw ności enzym atycznej p o ­
szczególnych k om p leksów łańcucha o d d e ­
chow ego (Ryc. 7). W p rz y p a d k u , kied y ilość
m ateriału nałożonego na żel jest m ała, b ą d ź
z aw artość kom p lek só w łańcucha o d d e c h o ­
w ego w badanej próbce jest na tyle niska, że
nie m ożn a ich zaob serw o w ać w żelu (Ryc.
3, F- fibroblasty), p o m iar aktyw ności m o że
być je d n y m ze sposobó w na u w id o cz n ie n ie
ich obecności w żelu.
POŁĄCZENIE ELEKTROFOREZY
„BLUE NATIVE" Z SDS-PAGE
Rycina 6. Przykład y n ie udaneg o ro zd ziału elektroforetycznego „Blue N ative" w żelu akryloam idow y m (A) i w żelu agaro zow y m (B).
220
http://rcin.org.pl
Połączenie elektroforezy „Blue N ativ e" z
innym i technikam i stoso w an y m i w biologii
m olekularnej m oże pozw olić na d o k ła d n ie j­
sze sch arak tery zo w an ie słabo jeszcze pow w w .postepybiochem ii.pl
znan ych k o m pleksów białkow ych. Elektrofore­
za Blue N ative w y k o n y w an a jest dla rozdziału
kom pleksó w białkow ych. Elektroforeza SDSPAGE jest zazw yczaj n a stę p n y m krokiem (drugi
kieru nek rozd ziału) w b a dan iach składu k o m ­
pleksów ro zdzielony ch podczas elektroforezy
„Blue N ative" [14]. Paski żelu z ro zd zie lo n y ­
mi kom plek sam i in k u b o w a n e są w w a ru n k ac h
d en atu ru jący ch i redu kujących (w obecności
SDS i 2-m erk ap to etan o lu lub DTT), aby d o p ro ­
w adzić do ro z p a d u k om pleksó w białkow ych.
Tak p rzy g o to w a n y m ateriał jest rozd zielan y w
żelu poliak ry lo am id o w y m , ale ju ż tym razem
w obecności SDS. N astępnie, techniką W estern
Biot, za pom ocą przeciw ciał, m oże być b ad an y
ich skład. N a Ryc. 8 p rz e d sta w io n o p rz y k ła d o ­
w y ro zdział elektroforetyczny BN -PA GE/SD SPAGE k om pleksów łańcucha o ddecho w ego w y ­
izolow anych z m ito ch o n d rió w serca szczura.
R ycina 7. Test a k ty w n o śc i w żelu k o m p le k só w ła ń c u ch a o d d e c h o w e g o m ito c h o n d rió w w ą ­
tro b y s z c z u ra w y k o n a n y p o p rz e p ro w a d z e n iu e le k tro fo rez y „B lue N a tiv e ". Żel p o lia k ry lo a m id o w y (g ra d ie n t 5-12% ), n-d odecylo-(3-D -m altozyd — 1% (w g [16], z m o d y fik o w a n e ,
za z g o d ą).
Rycina 8. Elektroforeza d w u k ie ru n k o w a „Blue N ative"/SD S-P A G E m itochon driów serca szczu­
ra. Pierw szy kierunek — elektroforeza „Blue N ative", żel poliak ryloam idow y (g rad ien t 5-12%)
w yb arw io n y C oom assie B rillant Blue G250, n-dodecylo-P-D -m altozyd — 1%. D rug i kierunek
— SDS-PAGE. Żel poliak ryloam idow y 10%. W estern Biot — przeciw ciała m on oklon aln e 1:5000
(Total O xphos M itoSciences).
Tabela 2. Skład ro ztw o rów do p om iaru aktyw ności w żelu na p odstaw ie [3].
DIAGNOSTYKA CHOROB
MITOCHONDRIALNYCH
Elektroforeza „Blue N ative" w p ow iązaniu z
techniką p om iaru aktyw ności w żelu i elektrofo­
rezą SDS-PAGE z p ow o dzeniem m oże być w yk o­
rzystyw ana w badaniach defektów oksydacyjnej
fosforylacji w tkankach pacjentów, u których p o ­
dejrzew a się chorobę m itochondrialną [3,11,16].
Próbki badane z zastosow aniem elektroforezy
„Blue N ative" m ogą pochodzić z różnych tka­
nek, bądź z hodow li kom órkow ych, np fibroblastów pacjentów. Po k ażd y m z etapów procedury
diagnostycznej otrzym ujem y cząstkow e wyniki,
które zebrane pozw alają stw ierdzić z jakiego ro­
dzaju defektem łańcucha oddechow ego m am y do
czynienia. Jedną z zalet elektroforezy „Blue N ati­
ve" (oraz testu aktyw ności w żelu) jest niew ielka
ilość m ateriału potrzebna do przeprow adzenia
procedury diagnostycznej. Przykładow y obraz
testu aktyw ności w żelu w y konany dla kom plek­
su IV w yizolow anego z mięśni szkieletow ych
pacjenta z podejrzeniem deficytu oksydazy cytochrom ow ej przed staw io no na Ryc. 9. W ystarczy
bow iem około 30 m g m ięśnia sercowego, 50 mg
m ięśnia szkieletowego, bądź 30 m in fibroblastów
pacjentów do w yizolow ania m itochondriów
oraz w ykonania elektroforezy „Blue Native" i
testu aktyw ności w żelu dla kom pleksów I, II, IV
i V [3,11,16], Procedurę diagnostyczną z w yko_____________________
rzystaniem elektroforezy
„Blue N ative" m ożem y
podzielić na następujące
trzy etapy.
K om pleksy łańcucha
oddechow ego
M iesznina reakcyjna
K om pleks I
3 m M T ris-H C l (pH 7.4), 1 m g N A D H , 5 m g nitrotetrazolium blue
K om pleks II
1.5 m M bufor fosforanow y (pH 7.4), 5 m M EDTA, 10 m M KCN, 0.2 m M
phenazine m ethasulfate, 50 m M b u rszty n ian sodu, 5 m g n itrotetrazolium blue
K om pleks IV
50 m M bufor fosforanow y (pH 7.4), 5 m g 3,3'-diam idobenzidine
tetrahydrochloride, 200 gg k atalazy, 10 m g cytochrom u c, 750 m g sacharozy
K om pleks V
35 m M Tris-HCl, 270 mM glicyna, 14 m M M gSO, (pH 7.8),
0.2% Pb (NO.,),, 8 m M ATP
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
ETAP I
Obraz otrzym any po
elektroforezie „Blue N a­
tive" odpow iada na py­
tanie czy w badanych m i­
tochondriach obecne są
221
heteroplazm ią. W tym p rz y p a d k u nie w szystkie kom órki
mają u szk o d zo n y m ito ch o n d rialn y łańcuch oddechow y.
UWAGI KOŃCOWE
Rycina 9. W y korzystanie testu aktyw ności w żelu w celach diagnostycznych. Re­
akcja w żelu w celu identyfikacji ko m pleksu IV. HBM - m ito chon dria serca w ołu.
Żel poliak ryloam id ow y (gradient 5-12%), n-dodecylo-P-D -m altozyd — 1% (wg
[16], zm odyfikow ane, za zgodą).
w szystkie kom pleksy łańcucha oddechowego. Porównanie
ich lokalizacji w żelu ze standardem w ykonanym z mito­
chondriów od osoby zdrowej, w ykaże czy posiadają one w
przybliżeniu odpow iednią masę (zawierają wszystkie p o d ­
jednostki) oraz czy nie m am y do czynienia z obniżoną ilo­
ścią któregoś z kompleksów.
ETAP II
Pom iar aktywności w żelu pozw ala na stw ierdzenie czy
kom pleksy łańcucha oddechow ego w badanej próbce po­
siadają aktywność enzym atyczną, taką jak materiał kon­
trolny. Może się bow iem zdarzyć, że profil rozdzielonych
białek nie będzie odbiegał od kontroli (brak istotnych zm ian
w wielkości ani w ilości kom pleksu) lecz będzie on mniej,
bądź wcale nieaktywny.
ETAP III
Elektroforeza SDS-PAGE w ykonana jako „drugi kie­
runek" rozdziału m oże w skazać przyczynę braku ak ty w ­
ności kom pleksów łańcucha oddechow ego. Brak którejś z
podjednostek o małej masie, np. determinującej aktyw ność
centrum katalitycznego kom pleksu, m oże być n iezau w ażo ­
ny w obrazie „Blue N ative". Jednakże m oże to być stw ier­
dzone z w ykorzystaniem techniki W estern Biot. W p rzy ­
padku, kiedy potw ierdzi się obecność w szystkich pod jed ­
nostek w chodzących w skład kom pleksów OXPHOS, brak
aktyw ności, któregoś z nich m oże być w ynikiem mutacji.
Dlatego aby się o tym przekonać m ożna przeprow adzić
badania genetyczne.
W celu po zn an ia przy czy n y obserw o w an eg o defektu
m itoch ondrialneg o łańcucha o d d ech o w eg o pro c ed u rę
d iagn ostyczn ą w zbogaca się, w ykonując d o d a tk o w e testy. N ależą do nich np. im m un ocyto chem ia oraz im m unohistochem ia w y k o n an a na m ateriale biopsyjnym , a także
p o m iary o d d y c h an ia oraz m itochon drialnego potencjału
w h o d o w lach kom órkow ych pochod zących od pacjentów .
Im m un ocy tochem ia i im m u n o h isto ch em ia p o zw alają na
określenie czy zab u rz en ia aktyw ności, b ą d ź ilości k o m ­
pleksów łańcucha o d d ech o w eg o dotyczą w szy stkich ko­
m órek czy też m am y do czynienia ze zjaw iskiem z w an y m
222
Szerokie spek trum m etod p ozw ala na badanie aktyw ­
ności kom pleksów łańcucha oddechow ego w tkankach,
liniach kom órkow ych oraz izolow anych m itochondriach,
co m oże mieć duże znaczenie w pozn aniu etologii cho­
roby mitochondrialnej. Elektroforeza „Blue N ative" jest
obecnie w ykorzystyw ana jako jedna z m etod diagnostycz­
nych w p rz y p ad k u podejrzenia choroby mitochondrialnej
związanej z uszkodzeniem m itochondrialnego łańcucha
oddechow ego. Pozw ala ona na jakościowe i ilościowe p o ­
m iary zarów no poziom u, jak i aktyw ności poszczególnych
kom pleksów łańcucha oddechow ego. Ponadto, m oże ona
stanow ić pierw szy etap szeregu dalszych, bardziej skom ­
plikow anych badań (np. elektroforeza dw ukierunkow a,
preparaty w na, W estern biot), prow adzących do poznania
b u d o w y i składu kom pleksów białkow ych znajdujących
się w różnych przedziałach kom órkow ych. Porów nanie
różnych m etod izolacji i rozdziału kom pleksów łańcucha
oddechow ego pokazało, że jakość i rozdzielczość elektro­
forezy „Blue N ative" jest w iększa niż np. filtracji w żelu
lub ultraw irow anie w gradiencie sacharozy. W szystkie
w ym ienione zalety oraz łatwość jej w ykonania [17] czyni z
elektroforezy „Blue Native" niezw ykle p rz y d atn ą techni­
kę, która może być w yk orzystyw ana w wielu aplikacjach
biologii m olekularnej oraz diagnostyce chorób m itochon­
drialnych zw iązanych z uszkodzeniam i łańcucha o d d e ­
chowego.
PIŚMIENNICTWO
1. W ittig I, Schagger H (2007) Electrophoretic m ethods to isolate protein
complexes from m itochondria. M ethods Cell Biol 80: 723-741
Schagger H, Von Jagow G (1991) Blue native electrophoresis for iso­
lation of m em brane protein complexes in enzym atically active form.
Anal Biochem 199:223-231
Van Coster R, Smet J, George E, De M eirleir L, Seneca S, Van Hove
J, Sebire G, Verhelst H, De Bleecker J, Van Vlem B, Verloo P, Leroy J
(2001) Blue native polyacrylam ide gel electrophoresis: a pow erful tool
in diagnosis of oxidative phosphorylation defects. Pediatr Res 50: 65865
Sun H, Pan YC (1999) Using native gel in tw o-dim ensional PAGE for
the detection of protein interactions in protein extract. J Biochem Bio­
phys M ethods 39:143-151
5. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assem ­
bly of the head of bacteriophage T4. N ature 194: 680-685
6. Suh MH, Ye P, Datta AB, Zhang M, Fu J (2005) An agarose-acrylam ide
com posite native gel system suitable for separating ultra-large protein
complexes. Anal Biochem 343:166-75
7' Schagger H, Pfeiffer K (2001) The ratio of oxidative phosphorylation
complexes I-V in bovine heart m itochondria and the com position of
respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem 276: 37861-37867
Camacho-Carvajal MM, W ollscheid B, A ebersold R, Steimle V, Schamel WW (2004) Two-dim ensional Blue native/S D S gel electrophoresis
of m ulti-protein complexes from w hole cellular lysates: a proteom ics
approach. Mol Cell Proteomics 3:176-182
9 . Rivas S, Romeis T, Jones JD (2002) The Cf-9 disease resistance protein
is present in an approxim ately 420-kilodalton heterom ultim eric m em ­
brane-associated complex at one m olecule per complex. Plant Cell 14:
689-702
10. W ittig I, Schagger H (2005) A dvantages and lim itations of clear-native
PAGE. Proteomics 5:4338-4346
http://rcin.org.pl
w w w .postepybiochem ii.pl
11.W ittig I, C arrozzo R, Santorelli FM, Schägger FI (2007) Functional
assays in high-resolution clear native gels to quantify m itochondrial
complexes in h u m an biopsies and cell lines. Electrophoresis 28: 38113820
12. Schägger H (2002) Respiratory chain supercom plexes of m itochondria
and bacteria. Biochim Biophys Acta 1555:154-159
13. Schägger H (2001) Respiratory chain supercomplexes. IUBMB Life 52:
119-128
14. Sunderhaus S, Eubel H, Braun H P (2007) Two-dim ensional blue na­
tiv e /b lu e native polyacrylam ide gel electrophoresis for the charac­
terization of m itochondrial protein complexes and supercomplexes.
M ethods Mol Biol 372:315-324
15. W ittig I, Carrozzo R, Santorelli FM, Schägger H (2006) Supercom ple­
xes and subcom plexes of m itochondrial oxidative phosphorylation.
Biochim Biophys Acta 1757:1066-1072
16. Karkucińska-W ięckowska A, Czajka K, W asilewski M, Sykut-Cegielska J, Pronicki M, Pronicka E, Zabłocki K, Duszyński J, W ięckowski
MR (2006) Blue N ative Electrophoresis: an additional useful tool to
study deficiencies of m itochondrial respiratory chain complexes. Ann
Diagnostic Pediatric Pathology 11: 75-78
17. W ittig I, Braun HP, Schägger H (2006) Blue native PAGE. N ature Pro­
tocols 1: 418-428
Application of „Blue Native" Electrophoresis in the studies of
mitochondrial respiratory chain complexes in physiology and pathology
Magdalena Lebiedzińska, Jerzy Duszyński, Mariusz R. Więckowski
L aboratory of Bioenergetic and Biom em branes, D epartm ent of Biochem istry, N encki Institute of E xperim ental Biology, 3 Pasteur St., 02-093 W ar­
saw , Poland
'e-mail: m .w ieckow ski@ nencki.gov.pl
Key words: "Blue N ative" E lectrophoresis, m itochondria, m itochondrial respiratory chain com plexes, diagnosis of m itochondrial disorders,
protein interactions
"Blue Native" polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE), originally described by Schägger and von Jagow in 1991, is an elegant method
to study protein com plexes from mitochondrial membranes. BN-PAGE, com m only used in molecular biology to study com position of pro­
tein com plexes and protein-protein interactions, enables separation of respiratory chain complexes keeping their properties and enzymatic
activities unchanged. BN-PAGE, supplem ented by other methods, e.g. in gel activity assay, SDS-PAGE (as a first or second dimension) can
be successfully adapted for diagnosis of mitochondrial diseases connected w ith abnormalities of the respiratory chain. Therefore, to make a
correct diagnosis of the deficiency of respiratory chain com plexes, other methods, as histochemical colorimetric reactions allow ing evaluation
of the OXPHOS catalytic activity in individual cells and spectrophotometric technique should be used sim ultaneously w ith BN-PAGE.
Postępy Biochemii 54 (2) 2008
http://rcin.org.pl
223
Kilkuletnie starania o pozyskanie środków finansowych z funduszy strukturalnych UE w okre­
sie 2004-2006 zakończyły się wielkim sukcesem Centrum Zaawansowanych Technologii
„Biotechnologii, Informatyki Stosowanej i Medycyny - Kampus Ochota". W ramach pro­
jektu Wyposażenie Laboratorium Obrazowania Biologicznego i Medycznego, koordynow­
anego przez Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego, a realizowanego wspól­
nie z Akademią Medyczną i Uniwersytetem Warszawskim, zrealizowane zostaną inwestycje
aparaturowe o wartości ponad 15 m ilionów złotych. Jest to największy tego typu projekt reali­
zowany w ramach SPO WKP 1.4 w Polsce.
konwencjonalny mikroskop
konfokalny
•n
\
v
■-'V '
? \ Al ■ -i{• ,
fj
S■
, 4:
mikroskop konfokalny
z systemem STED
•\
> N L l ’\ f
c
:f *•Ci
* tu
j "ś
0.6 pm
■■H I
mikrotubule w komórce nabłonkowej wyznakowane przeciwciałami
skoniugowanymi z barwnikiem Atto 647
W ramach projektu zostanie m.in. zakupi­
ony nowoczesny mikroskop konfokalny
wyposażony w unikatową technikę STED
(ang.
stimulated emission-depletion)
(Leica), pozwalającą na obserwacje z
rozdzielczością 90 nm, tzn. 2.5 raza lepszą
niż tzw. lim it Abbego - wartość od ponad
100 lat uznawana za nieprzekraczalną.
Ten przełomowy wynalazek jest dziełem
niemieckiego naukowca, Prof. Stefana
Helia, pioniera mikroskopii „superrozdzielczej". Urządzenie, które zosta­
nie zakupione przez Instytut Biologii
Doświadczalnej PAN, jest jednym z
pierwszych na świecie. Mikroskop będzie
przystosowany do prowadzenia badań
przyżyciowych, obrazowania grubych
preparatów (> 200 pm) oraz badań z zas­
tosowaniem technik FRET i FRAP.
W ramach projektu zostaną również zakupione:
zestaw do badań metodą Tomografii Rezonansu Magnetycznego: pierwszy w Polsce system MRI
wykorzystujący 32-kanałową technologię RF
mikroskop elektronowy transmisyjny z systemem umożliwiającym obrazowanie rozkładu pier­
wiastków w preparacie biologicznym
stanowisko umożliwiające archiwizację danych obrazowych w formie cyfrowej oraz zaawansowane
przetwarzanie informacji wizualnej w rozproszonym systemie gridowym
UNIA DLA PRZEDSIĘBIORCZYCH
P R O G R A M
K O N K U R E N C Y J N O Ś Ć
P ro je k t w s p ó łfin a n s o w a n y p rzez
UNIĘ EUROPEJSKĄ
ze ś r o d k ó w
E u ro p e jsk ie g o F unduszu
http://rcin.org.pl
R ozw oju R e g io n a ln e g o
bon
C Z T
KAMPUS
-
OCHOTA
www.roche-applied-science.com
LightCycler® 480
Real-Time PCR System
Poluj na nowe cele:
Topnienie wysokiej rozdzielczości
i wysokiej wydajności PCR w jednym
0.138
0.118
S 0.098
i 0.078
£at 0.058
System LightCycler® 480 oferuje nowe narzędzie do analizy mutacji oparte na
pomiarze topnienia wysokiej rozdzielczości (HRM). To wysoce czuła metoda po
PCR umożliwia badania SNP (polimorfizm pojedynczego nukleotydu) w szerokim
formacie po znacznie mniejszym koszcie.
Ę 0.038
■? 0.018
I
$ -0.022
S
■ Odkrywaj zm ienność genetyczną - szybko: wybierz pierwsze w pełni
zintegrowane rozwiązanie PCR/HRM dla płytek 96- i 384-dołowych.
S -0.042
-0.062
-0.082
■ Poszerzaj zakres swoich badań: korzystaj z innowacyjnego oprogramo­
wania oraz nowej mieszaniny reakcyjnej HRM o niezrównanej uniwersalności.
Oprogramowanie LightCycler® 480 Gene Scanning
Software pozwala na wykrycie różnic pomiędzy
próbkami prezentującymi typ dziki i warianty, poprzez
grupowanie krzywych HRM. Fragment ludzkiego genu
LPLH3 z krwi został poddany amplifikacji z zastosowaniem
LightCycler® 480 High Resolution Melting Master.
Analiza różnic krzywych umożliwia rozróżnienie pomiędzy
próbkami prezentującymi typ dziki [zielony], homozygot
mutantów G do T [czerwony] i heterozygot [niebieski].
■ Unikaj niepotrzebnego sekw encjonow ania: zwiększ efektywność swo­
ich badań dzięki nowej, wysokowydajnej i wygodnej metodzie badania mutacji.
Przenieś poziom swojego PCR na now e szczyty.
Dowiedz się więcej na stronie www.lightcycler480.com
Tylko do użytku lab o rato ryjn eg o . P rodukt nie je s t p rzezn aczo n y do d iagnostyki.
Purchase of this product is accompanied by a limited license to use it in the PCR process, including homogeneous PCR
methods described in U.S. Patents Nos. 5,994,056,6,171,785,6,569,627 and corresponding patents outside the United States,
for life science research in conjunction with a thermal cycler whose use in the automated performance of the PCR process
is covered by the up-front license fee, i.e., an authorized thermal cycler. No real-time apparatus or system patent rights or
any other patent rights owned by Applera Corporation are conveyed expressly, by implication or by estoppel. No rights for
any other application, including any in vitro diagnostic application, are conveyed expressly, by implication or by estoppel
under U.S. Patents Nos. 6,174,670 and 6,245,514 and corresponding patent claims outside the United States, or any other
patents owned by Roche Molecular Systems, Inc. and F. Hoffmann-La Roche Ltd. claiming real-time amplification and
detection methods. The product is covered in-part by US 5,871,908, co-exclusively licensed from Evotec OAI AG. Parts of the
Software used for the LightCycler* 480 System are licensed from Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA
LIGHTCYCLER is a trademark of Roche. Other brands or product names are trademarks of their respective holders.
© 2007 Roche Diagnostics GmbH. All rights reserved.
http://rcin.org.pl
Roche Diagnostics Polska Sp. z o.o.
ul. Wybrzeże Gdyńskie 6B
01-531 Warszawa
www.roche-applied-science.com
tel. 022 481 55 70
fax 022 481 55 92
<(Roche)