CYTOGENETYKA – seminarium III rok WLI mgr inż. Łukasz Kuszel

CYTOGENETYKA – seminarium
III rok WLI
mgr inż. Łukasz Kuszel
CYTOGENETYKA:


Klasyczna – analiza kariotypu, techniki prążkowania chromosomów
Molekularna – stosowanie sond molekularnych, technika FISH
BUDOWA CHROMOSOMU - struktura znajdująca się w jądrze, zbudowana z liniowej cząsteczki DNA i
białek, wzdłuż której ułożone są geny, widoczna pod mikroskopem podczas podziałów komórkowych.
TYPY MORFOLOGICZNE CHROMOSOMÓW – klasyfikowane na podstawie współczynnika SDR
(stosunek długości ramion):



Metacentryczne
Submetacentryczne
Akrocentryczne
ABERRACJE CHROMOSOMOWE:


Aberracje:
o chromosomów autosomalnych
o chromosomów płci
Aberracje
o liczby chromosomów
o struktury chromosomów
ABERRACJE LICZBY CHROMOSOMÓW



Poliploidia
o Triploidia (69,XXX,XXY lub XYY) 1-3% wszystkich poczęć, w większości przypadków
poronienia samoistne
Aneuploidia (autosomy)
o Nullisomia (utrata pary chromosomów homologicznych) letalne przed implantacją
o Monosomia (utrata jednego chromosomu) letalne w stadium embrionalnym
o Trisomia (jeden chromosom dodatkowy) zwykle letalne, z wyjątkiem trisomii
chromosomów 13, 18, 21
Aneuploidia (chromosomy płci)
o Dodatkowy chromosom płci normalna długość życia
o Utrata chromosomu płci 99% przypadków-poronienia samoistne, normalna
inteligencja, bezpłodność
TRIPLOIDIA



Triploidia to obecność dodatkowego haploidalnego zestawu chromosomów w wyniku czego
w jądrze komórkowym zamiast 46 mamy 69 chromosomów.
Triploidia powstaje w wyniku:
o Zapłodnienia komórki jajowej przez dwa plemniki, czyli tak zwanej dispermii
o Połączenia się nieprawidłowej diploidalnej gamety żeńskiej z prawidłowym
plemnikiem, czyli tak zwanej dygynii
o Połączenia się nieprawidłowego diploidalnego plemnika z prawidłową gametą
żeńską, czyli tak zwanej diandrii
Skutki fenotypowe zależą od tego, czy dodatkowy materiał genetyczny pochodzi od ojca czy
matki:
o Typ I (ojcowski) - łożysko jest duże (często dochodzi do powstania częściowego
zaśniadu groniastego), a masa dziecka jest odpowiednia do wieku płodowego.
Noworodki z I typem triploidii umierają zwykle w pierwszej dobie życia.
o Typ II (matczyny) - łożysko jest małe i obserwuje się wewnątrzmaciczne ograniczenie
wzrastania płodu. U noworodków z typem II triploidii obserwowano nawet
kilkutygodniowe przeżycia.
o Najdłużej żyły noworodki, u których stwierdzono kariotyp mozaikowy z dwoma
liniami komórkowymi: diploidalnymi i triploidalnymi.
ABERRACJE STRUKTURALNE



Zmiany w strukturze (morfologii) chromosomów
Dzielimy je na zrównoważone i niezrównoważone
Zrównoważone, czyli takie, w wyniku których zmienia się struktura chromosomu, ale nie
zmienia się ogólna ilość DNA






Niezrównoważone są zawsze związane z nieprawidłową strukturą chromosomu oraz
nieprawidłową ilością DNA w jądrze komórkowym
Podział na aberracje zrównoważone i niezrównoważone odzwierciedla ich odmienną
manifestacją kliniczną
są wynikiem pęknięć i/lub przeniesienia fragmentów chromosomów oraz połączenia ich w
nowe konfiguracje
mogą powstawać de novo, jako błędy podziału mejotycznego (nieprawidłowy proces
crossing-over)
częściej są wynikiem błędów spermatogenezy niż oogenezy
mogą zostać odziedziczone od rodziców w takiej samej lub zmienionej formie
TRANSLOKACJE
Przemieszczenie się materiału genetycznego pomiędzy chromosomami
Translokacja wzajemna zrównoważona
Fragmenty chromosomów odrywają się i zamieniają miejscami. Nie dochodzi do utraty materiału
genetycznego.
Translokacja robertsonowska
 Dotyczy chromosomów akrocentrycznych
 Dwa chromosomy akrocentryczne tracą ramiona krótkie i łączą się ze sobą – powstaje jeden
chromosom dwuramienny
 Translokacja robertsonowska jest translokacją zrównoważoną, ponieważ utrata ramion
krótkich chromosomów akrocentrycznych nie powoduje utraty genów
INWERSJE
Chromosom ulega złamaniu w 2 miejscach, a fragment pomiędzy złamaniami ulega odwróceniu o 180
stopni. Inwersja jest aberracją zrównoważoną.
Powodują wysokie ryzyko poronień.
Im bliżej telomerów położone są punkty złamań chromosomu tym większe jest prawdopodobieństwo
przeżycia płodu do narodzin.
Inwersja paracentryczna – oba złamania są w obrębie jednego ramienia i odwrócony fragment nie
zawiera centromeru.
Inwersja pericentryczna – złamania nastąpiły w obydwu ramionach chromosomu i odwrócony
fragment zawiera centromer.
DELECJE I DUPLIKACJE
Delecja – utrata części chromosomu
Duplikacja – podwojenie części chromosomu
Delecje i duplikacje są aberracjami niezrównoważonymi – łączą się z utratą lub nadmiarem materiału
genetycznego. Skutki delecji są poważniejsze niż duplikacji. Najczęściej występują de novo. Zawsze
wiążą się z nieprawidłowym fenotypem pacjenta.
CHROMOSOMY PIERŚCIENIOWE
Chromosom pęka w obu ramionach, dystalne części chromosomów ulegają utracie, a pozostała część
chromosomu tworzy pierścień. Aberracja chromosomowa niezrównoważona.
IZOCHROMOSOM
Nieprawidłowy chromosom, który ma delecję jednego, a duplikację drugiego ramienia. Może
powstać wskutek poprzecznego podziału centromeru. Aberracja niezrównoważona.
ADDYCJA
Przyłączenie do chromosomu fragmentu zawierającego materiał niejasnego pochodzenia.
CHROMOSOMY MARKEROWE
 Małe dodatkowe chromosomy niejasnego pochodzenia, stwierdzane 1/2500 ciąż.
 W 90% przypadków pochodzą z krótkich ramion chromosomów akrocentrycznych (około
połowa pochodzi z chromosomu 15).
 Chromosomy markerowe wymagają identyfikacji metodami cytogenetyki molekularnej (FISH
– malowanie chromosomów).
KARIOTYP
Sklasyfikowany pod względem morfologicznym zestaw chromosomów danej komórki lub osoby.
WSKAZANIA DO SKIEROWANIA NA BADANIE KARIOTYPU
Zespół wad wrodzonych
Cechy dysmorfii
Opóźnienie rozwoju psychoruchowego lub umysłowego
Cechy kliniczne charakterystyczne dla danego zespołu chromosomowego
Zaburzenia dojrzewania płciowego
Nieprawidłowa budowa narządów płciowych, obojnactwo
Kliniczne zaburzenia wzrostu
Występowanie aberracji chromosomowej w rodzinie
Poronienia nawracające
Postępowanie przed zapłodnieniem in vitro (IVF)
Wiek matki powyżej 35 lat
MATERIAŁ BIOLOGICZNY DO BADANIA KARIOTYPU
Limfocyty krwi obwodowej
Szpik kostny
Fibroblasty skóry
Płyn owodniowy
Kosmówka
Limfocyty krwi obwodowej – najczęściej stosowana tkanka przy określaniu kariotypu
Do określenia kariotypu potrzeba 2-5 ml krwi u osoby dorosłej, 1 ml krwi u noworodka.
Krew pobierana jest do probówki z heparyną (nie z EDTA - trudności w hodowli).
Jeśli transport następuje dnia następnego, probówkę z krwią przechowujemy w lodówce w temp.
+4°C. Probówki z krwią nie zamrażamy. Probówkę z krwią można przesyłać szybką pocztą.
W przypadku pobierania krwi do badania cytogenetycznego (lub innej tkanki niż krew), pacjent nie
musi być specjalnie przygotowywany (np. na czczo, o określonej porze dnia). Istotny jest natomiast
sposób pobrania i przechowywania krwi lub innego materiału biologicznego. Jakość materiału
biologicznego (sterylne pobranie, odpowiednie przechowywanie, czas dostarczenia do laboratorium)
wpływa bezpośrednio na powodzenie hodowli.
METODY CYTOGENETYCZNE
Techniki klasyczne:
Techniki prążkowe
- Q (zastosowanie kwinakryny)
- metoda prążkowa C (barwienie centromerów)
- AgNOR (barwienie satelit)
- metoda prążkowa R (prążkowania odwrotnego, ang. reverse)
- GTG (trawienie trypsyną i barwienie odczynnikiem Giemsy)
Techniki cytogenetyki molekularnej:
FISH - (Fluorescent In Situ Hybridization) – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ
FISH – rodzaje sond:
 malujące (wcp. – ang. whole chromosome paint) pokrywające cały chromosom lub
poszczególne ramiona
 alfa-satelitarne (centromerowe, telomerowe)
 specyficzne (unikalne) dla poszczególnych sekwencji lub określonego locus
FISH – materiał do badań:
fibroblasty
limfocyty
komórki szpiku kostnego
komórki płynu owodniowego
komórki trofoblastu
komórki nabłonka jamy ustnej
skrawki parafinowe niektórych tkanek
ZASTOSOWANIE FISH:
 diagnostyka submikroskopowych i złożonych aberracji chromosomowych
 identyfikacja dodatkowego materiału chromosomowego
 identyfikacja chromosomów markerowych
 szybka diagnostyka aneuploidii chromosomowych
 mapowanie genów i sekwencji DNA
 identyfikacja komórek szpiku kostnego dawcy po przeszczepie
FISH – NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE FLOUROCHROMY:
FITC (fluoresceina)
TRITC (rhodamina)
Texas Red
Aqua
DAPI
PJ (jodek propidyny)
Cy3
Cy5
SKY-FISH:
 Umożliwia wybarwienie 24 chromosomów w jednej reakcji
 Diagnostyka złożonych aberracji strukturalnych – zwłaszcza jeżeli w translokacji bierze udział
kilka chromosomów
 Diagnostyka translokacji ukrytych
 Identyfikacja chromosomów markerowych
ARRAY-CGH
 Wysoka rozdzielczość badania
 Możliwość wykrywania małych delecji
 Brak możliwości wykrywania aberracji zrównoważonych
 Wysoki koszt badania
 Utrudniona diagnostyka mozaikowości