M. Czyżniejewski - Recenzja 2

Poznań, 07.08.2016
Prof. dr hab. Henryk Jeleń
Wydział Nauk o Żywności i Żywieniu
Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
RECENZJA
rozprawy doktorskiej Pana mgr Mariusza Czyżniejewskiego
pt. „Zmiany profili metabolitów wybranych traw z kompleksu Lolium-Festuca w
odpowiedzi na stresy abiotyczne”
wykonanej pod kierunkiem prof. dr hab. Piotra Kachlickiego w Instytucie Genetyki
Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu.
Recenzja składa się z oceny następujących elementów:
1. Dobór i znaczenie tematu
2. Układ pracy, bibliografia, wymogi formalne
3. Koncepcja rozwiązania problemu naukowego
4. Zastosowane metody badań
5. Przedstawione wyniki i prawidłowość wnioskowania
6. Ocena końcowa
Ad.1) Dobór i znaczenie tematu
Trawy (Wiechlinowate) obejmują ponad 600 rodzajów w obrębie rodziny. Wśród
udomowionych są zboża. Trawy pastewne, istotne z punktu widzenia użytkowego, obejmują
między innymi życice (rodzaj Lolium), kostrzewy (Festuca), a także odmiany mieszańcowe
(Festulolium).
Zmiany klimatu, które występują w ostatnich latach charakteryzuje między innymi
podwyższenie średnich temperatur i wzrost częstości występowania susz. Jednocześnie
malejąca pokrywa śnieżna zimą powoduje większe prawdopodobieństwo przemarzania
roślin. Dlatego też prowadzone są badania mające na celu uzyskanie roślin o pożądanych
cechach użytkowych, takich jak odporność na stresy abiotyczne - głównie niską temperaturę,
suszę i zasolenie gleby. Badania nad mieszańcami traw prowadzone są także w Instytucie
Genetyki Roślin. W wyniku prowadzonych badań zarejestrowano szereg odmian traw
mieszańcowych z rodzaju Festulolium.
Biorąc pod uwagę istotność problemu zmian klimatycznych dla rolnictwa, produkcji
roślinnej, specyfikę naszego klimatu, a także duże doświadczenie jednostki w badaniach nad
pozyskiwaniem nowych odmian wybrana tematyka doktoratu jest jak najbardziej
uzasadniona, interesująca z naukowego punktu widzenia, mająca także potencjalnie duże
1
znaczenie dla praktyki. Praca ta była realizowana w ramach dwóch projektów,
finansowanych przez Narodowe Centrum Nauki.
Ad. 2) Układ pracy, bibliografia, wymogi formalne
Przedstawiona do oceny praca napisana jest w tradycyjnym układzie. Część
literaturowa, w pracy cała pod nazwą „Wstęp” obejmuje 5 podrozdziałów poświęconych
kolejno trawom, reakcjom roślin na stresy abiotyczne, metabolomowi i metodom jego analizy
za pomocą technik separacyjnych i spektroskopowych, a także rozdział poświęcony
wieloskalowym analizom metabolomicznym. Część ta liczy 44 strony. Po części literaturowej
określono cel pracy (2 strony) i opisano materiały i metody wykorzystywane w pracy (20
stron). Obszerna część wynikowa pracy obejmuje ogółem 86 stron z czego 66 strony to opis
wyników, a 20 stron to ich dyskusja. Pracę kończy 8 wniosków. Część literaturowa zawiera
143 pozycje, przy czym tylko 38 to prace starsze niż 10 lat, co po części jest wynikiem
nowości metabolomiki jako obszaru badań. W celu zwiększenia przejrzystości pracy autor
zdecydował się na umieszczenie części wyników w załącznikach. 7 załączników w formie
wykresów obrazuje zmiany metabolitów pierwotnych w eksperymentach prowadzonych w
latach 2013-14 (załączniki 1-4) oraz metabolitów fenolowych w tych badaniach (załączniki 57). Ostatnim załącznikiem jest tabela, w której scharakteryzowano zidentyfikowane
metabolity fenolowe podając parametry retencji, dokładną masę, skład elementarny oraz
dane dotyczące fragmentacji (MS).
W rozdziale poświęconym reakcji roślin na stresy abiotyczne opisano mechanizmy
tworzenia reaktywnych form tlenu (ROS), mechanizmów obrony przed działaniem ROS,
mechanizm stresu chłodu, zasolenia i suszy. Kolejny rozdział poświęcony jest
metabolomowi. Omówiono w nim podział metabolitów na pierwotne i wtórne, poświęcając
dużo miejsca na omówienie metabolicznej odpowiedzi na stres chłodu, zasolenia i suszy. Z
uwagi na charakter pracy omówiono także w skrócie metody analizy metabolomu oparte na
technikach separacyjnych/łączonych wraz z obróbką danych.
Specyfika pracy - duża liczba monitorowanych związków, a co za tym idzie duża
liczba często złożonych rycin powoduje, że opisanie szczególnie wyników poszczególnych
eksperymentów jest trudne tak, by zachować przejrzystość prezentowanych danych.
Śledzenie wyników poszczególnych eksperymentów wymaga uwagi. Pomimo bardzo dużej
liczby wyników (szczególnie jeśli chodzi o monitorowanie metabolitów) praca pod względem
edytorskim jest opracowana dobrze, choć niektóre ze stwierdzeń wymagałyby w mojej opinii
korekty. Główne uwagi zamieszczono poniżej:

Definicja chromatografii gazowej (str. 47) podana przez autora w której pisze, że
związki rozdzielane są w kolumnie o wypełnieniu stałym, którym najczęściej jest żel
krzemionkowy (nb. pokryty fazą), pochodzi z czasów, gdy do rozdziałów
wykorzystywano kolumny pakowane i w dzisiejszych warunkach jest nieaktualna.
2

Określenie „zbyt mała dynamika pracy detektora” (str. 54) powinno być zastąpione
zbyt małym zakresem dynamicznym detektora

Opis „wypełnienie silica gel-DB-5 o uziarnieniu 0.25µm” (str. 67) jest błędne w
odniesieniu do kolumny do GC

„przepływ przedmuchu przegrody” powinno być zastąpione przemywaniem
membrany gazem nośnym

„Rozwiązano częściowo struktury związków obecnych w 62 wierzchołkach
chromatograficznych” (str 103) nie jest zdaniem dobrze napisanym

Autor w niektórych miejscach nie uniknął pojęć żargonowych/anglicyzmów np.: –
binowanie danych (str 72) (ang. data binning/bucketing), jony z tabeli po alignmencie
(str. 74).
W całej pracy opisy tabel znajdują się pod tabelami, a powinny być umieszczone nad nimi.
Powyższe uwagi mają charakter edytorski i nie wpływają na meritum pracy.
Ad 3) Koncepcja rozwiązania problemu naukowego
W literaturze opisano zmiany zawartości różnorodnych związków
niskocząsteczkowych w tkankach roślin w odpowiedzi na stresy abiotyczne. Najczęściej
wymienianymi są niektóre cukry, aminokwasy, aminy czy związki fenolowe. Ponieważ w
dostępnych publikacjach ilość informacji poświęconych zmianom zawartości metabolitów
pierwotnych oraz związków fenolowych w liściach traw w reakcji na stres jest ograniczona,
podjęto opisane w pracy badania. Dodatkową zaletą planu badań było kompleksowe
podejście, w którym na tych samych genotypach badano wpływ różnych czynników
stresowych, stawiając hipotezę, że odpowiedź rośliny na różne abiotyczne czynniki stresowe
jest zróżnicowana. W celu weryfikacji tej hipotezy zbadano odpowiedź metaboliczną
wybranych genotypów traw z kompleksu Lolium-Festuca na stres chłodu, suszy i zasolenia.
Badania prowadzono na dobrze dobranych trawach, o różnej tolerancji na czynniki
stresowe, którymi były: kostrzewa trzcinowa (Festuca arundinacea) odmiana Kord, życica
trwała (Lolium perenne) odmiana Solen oraz mieszaniec międzyrodzajowy (F. pratensis i L.
Multiflorum) Festulolium odm. Felopa. Eksperymenty prowadzono w latach 2013 i 2014, przy
czym nie wszystkie rodzaje stresów były przedmiotem badań w obu latach.
Monitorowano zmiany metabolitów pierwotnych i wtórnych, przy czym szczególny
nacisk położono na glikozydowe pochodne związków fenolowych i identyfikację
charakterystycznych metabolitów drugorzędowych. Praca jest przykładem kompleksowego
podejścia do analizy metabolomu za pomocą wysublimowanych, choć w tym obszarze
badań standardowych, metod analitycznych. Dobór materiału roślinnego pozwala na
obserwację metabolitów charakterystycznych dla badanych stresów.
3
Ad 4) Zastosowane metody badań
Do izolacji metabolitów z materiału roślinnego wykorzystano ekstrakcję 80%
metanolem, gdzie próbki liści homogenizowano za pomocą kulek stalowych, a następnie
poddano procesowi sonikacji. Choć ekstrakcja metanolem jest jedną z najczęściej
stosowanych metod izolacji metabolitów w opisie nie podano źródła literaturowego metodyki
ekstrakcji lub odniesienia do wcześniejszych eksperymentów dotyczących optymalizacji tego
procesu. Przygotowanie próbek do analiz techniką GC-MS obejmowało etap derywatyzacji
stosowanej w celu zmniejszenia polarności/zwiększenia lotności analizowanych związków.
Wykorzystanie do detekcji spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości umożliwiało oprócz
uzyskania typowych widm EI dla identyfikowanych związków także dokładne oznaczenia
mas monoizotopowych badanych związków. Do analiz próbek analizowanych w roku 2014
wykorzystywano także zestaw do kompletnej dwuwymiarowej chromatografii gazową ze
spektrometrią mas (GCxGC-ToFMS), choć z opisu metody wynika, że aparat działał w trybie
chromatografii jednowymiarowej (opis tylko jednej kolumny). W analizach metabolitów
techniką LC-MS do identyfikacji metabolitów wykorzystywano spektrometr z analizatorem
typu pułapki jonowej (do wielokrotnej spektrometrii mas przy ustalaniu struktur związków w
oparciu o widma fragmentacyjne) oraz wysokorozdzielczy spektrometr mas Q-Exactive.
Wyniki uzyskane za pomocą obu spektrometrów były wobec siebie komplementarne. Oprócz
spektrometrów mas różnego typu do monitorowania zmian profilu metabolitów fenolowych
wykorzystywano detektor z listwą diodową, rejestrując pasma absorpcji charakterystyczne
dla związków fenolowych i flawonoidów/kwasów hydroksycynamonowych). W badaniach
wykorzystano także chromatografię kolumnową (preparatywną) na kolumnie wypełnionej
poliamidem do uzyskania większej ilości materiału do identyfikacji metabolitów.
Z uwagi na specyfikę badań metabolomicznych dużą rolę odgrywa w nich
przetwarzanie danych. Wykorzystano do tego celu zarówno programy producentów/źródeł
zewnętrznych (Target Search, Golm Metabolome Database), jak i dostarczone ze sprzętem
(ChromaTOF). Dane uzyskane z detektora fotodiodowego (UV-VIS) poddano analizie
umożliwiającej porównanie dużej liczby danych (profili) chromatograficznych w oparciu o
procedury opracowane w IGR (głównie odnoszące się do wyrównania/ujednolicenia
chromatogramów (COW) i detekcji sygnałów. Warsztat analityczny wykorzystywany do
realizacji pracy obejmował najnowocześniejsze urządzenia, oraz techniki i metody
stosowane w badaniach nad metabolomem w najlepszych laboratoriach.
Ad 5) Przedstawione wyniki i prawidłowość wnioskowania
Część wynikową pracy ujęto w 4 podrozdziałach, w których omówiono kolejno i) parametry fizjologiczne, ii) – zmiany profili metabolitów pierwotnych, iii) – identyfikację
struktur metabolitów wtórnych oraz iv) – analizy zmian profili metabolitów wtórnych.
Zaobserwowano statystycznie istotne różnice w poziomie ocen odrostu pomiędzy
kostrzewą trzcinową, życicą trwałą i mieszańcem międzyrodzajowym po stresie chłodu. Dla
4
próbek kostrzewy trzcinowej po stresie solnym nie zaobserwowano statystycznie istotnych
różnic w poziomie względnej zawartości wody (RWC), wykazano statystycznie istotne
różnice między traktowanymi i kontrolnymi próbkami życicy trwałej. Statystycznie istotne
różnice w poziomie względnej zawartości wody zaobserwowano pomiędzy roślinami
traktowanymi a kontrolnymi dla roślin poddanych stresowi suszy.
Monitorując zmiany metabolitów pierwotnych (GC-MS) identyfikowano związki w
oparciu o indeksy retencji, porównanie widm masowych i charakterystycznych jonów,
następnie do porównań statystycznych wykorzystywano tylko zidentyfikowane związki.
Monitorując zmiany będące wynikiem stresu chłodu (2013) dla 54 sygnałów (związków?) dla
próbek nierozcieńczonych (spośród 89) i dla 40 dla próbek rozcieńczonych (spośród 59)
zaobserwowano statystycznie istotny efekt traktowania. Rozcieńczenia próbek (1:4)
prowadzono w celu wyeliminowania wysycenia detektora. Z uwagi na dużą liczbę wyników
identyfikowane związki starano się pogrupować, by uprościć interpretację wyników, choć np.
rozróżnienie związków grupy I (25 związków) i II (9 związków) nie jest dla mnie jasne(str. 856). Najliczniejszą grupą związków były metabolity, których poziom wzrastał w trakcie
aklimatyzacji w stosunku do kontroli. W roku 2014 monitorowano metabolity pierwotne tylko
dla stresu solnego i stresu suszy. Liczba związków identyfikowanych w stresie solnym była
znacznie większa niż w stresie chłodu z 2013 (163). Mogło to mieć związek także (oprócz
oczywiście odmiennego rodzaju stresu) z korzystaniem w roku 2014 z aparatu o innej
specyfice działania (bardzo szybki ToF wyposażony w bardzo dobry program do
dekonwolucji widm). Autor pisze, że stres chłodu badano w roku 2013 oraz 2014, natomiast
w części wynikowej dotyczącej monitorowania metabolitów pierwotnych nie przedstawiono
wyników z roku 2014.
Identyfikacja struktur metabolitów wtórnych (za pomocą LC-MS) to trzecia część
materiału wynikowego, opisująca głównie procedury związane z identyfikacją związków na
podstawie widm po jonizacji ESI z wykorzystaniem pułapki jonowej i aparatu o wysokiej
rozdzielczości (Orbitrap). Zidentyfikowano 62 metabolity dla kostrzewy trzcinowej i życicy
trwałej, przy czym 16 zostało zidentyfikowanych wyłącznie u kostrzewy, a 15 wyłącznie u
życicy.
Część pracy poświęcona identyfikacji metabolitów jest bez wątpienia jej
najmocniejszą stroną. Identyfikację kwasów hydroksycynamonowych oparto na analizie
widm UV, a w przypadku kwasu chlorogenowego poszczególne izomery, różniące się
miejscami estryfikacji rozróżniano w oparciu o różnice w parametrach retencji, przydatnej
m.in. do rozróżniania izomerów cis/trans i sposobie fragmentacji. Nie podano, czy
tożsamość związków została potwierdzono analizą standardów, ale z części pracy opisującej
wykorzystane odczynniki można domniemać, że nie. Analiza widm masowych po
fragmentacji w pułapce jonowej, rzetelnie przeprowadzona, jednoznacznie wskazuje na
obecność izomerów 3,4, i 5 kwasu kawochinowego. Dla pochodnych ferulochinowych
5
zidentyfikowano izomery 3,4,5 u obu badanych gatunków traw, a dla pochodnych parakumarochinowych izomery 3 i 5.
Kolejną grupą, będącą przedmiotem zainteresowania doktoranta były flawonoidy.
Identyfikowane związki z tej grupy były podstawione cząsteczkami cukrów (heksozy,
pentozy), a także kwas glukuronowy lub acylowane kwasem malonowym lub kawowym.
Badając aglikony flawonoidów za pomocą GC/MS z uwagi na ograniczenia metodyczne nie
uściślono tożsamości podstawników cukrowych. Identyfikację aglikonów przeprowadzono w
oparciu o widma UV, a także (głównie, podobnie jak w przypadku związków fenolowych)
widma fragmentacjyjne (MS). Pozwoliły one na identyfikację połączeń C-glikozydowych i Oglikozydowych. W oparciu o widma zidentyfikowano mono-, dwu- i trójglikozylacje cukrami.
Identyfikacja tych metabolitów jest bardzo dobrze udokumentowana. W próbkach
zidentyfikowano także acylowane (kwasem malonowym i kawowym) pochodne flawonoidów,
a także lignany (w liściach kostrzewy trzcinowej). Identyfikacje prowadzone za pomocą
spektrometru typu pułapki jonowej zostały uzupełnione i potwierdzone za pomocą
wysokorozdzielczej spektrometrii mas (dokładny pomiar masy – w rezultacie określenia
wzoru sumarycznego związków).
Ostatnią częścią rozdziału poświęconego analizie wyników jest monitorowanie zmian
profili metabolitów wtórnych. Podobnie jak w przypadku metabolitów pierwszorzędowych
przyjęty sposób prezentacji wyników (skala logarytmiczna) pozwolił na łatwą identyfikację
zachodzących zmian. Zmiany profili metabolitów wtórnych prowadzono dla stresu chłodu w
latach 2013 i 2014. Wykazano istotne zmiany w 10 związkach identyfikowanych w próbkach
kostrzewy trzcinowej, a także 22 dla życicy trwałej. Wyniki dla tego testu umieszczone w
pracy w Załączniku 5 mogły być umieszczone w rozdziale temu poświęconym. Obserwując
dane z testu chłodu pochodzące z roku 2014 dla liści kostrzewy statystycznie istotne zmiany
występowały w 9 związkach, aczkolwiek większość z nich nie pokrywała się ze związkami
identyfikowanymi w roku 2013, co po części jest wynikiem zmiany sposobu zbierania próbek.
Analogiczną sytuację obserwowano dla próbek życicy.
Dla wybranych metabolitów wtórnych monitorowanie ich zmian w eksperymentach
zasolenia i suszy jest opracowane bardzo rzetelnie. Zidentyfikowano większość związków
zmieniających się w zależności od czasu zbioru próbek i traktowania. Wyniki te dały dużo
informacji odnośnie zmian profili metabolitów wtórnych - związków fenolowych.
Na etapie opracowywania wyników, można było wziąć pod uwagę czy wykorzystanie
statystycznej analizy wielowymiarowej (MVA) nie ułatwiłoby porównania analizowanych
próbek i wyselekcjonowanie najbardziej istotnych markerów dla badanych stresów.
Dyskusja otrzymanych wyników jest mocną stroną pracy, stanowi odrębną od
wyników doświadczeń część, i została napisana w sposób przejrzysty i jasny. W wyniku
analiz metabolitów pierwotnych i wtórnych w tego typu badaniach sama rejestracja zmian
zawartości związków ma ograniczoną wartość, gdy nie zostanie powiązana z wpływem na
szlaki metaboliczne zachodzące w roślinie. Uzyskane wyniki wskazują na wpływ stresów na
6
szereg szlaków metabolicznych, a zmiany w zawartości metabolitów pierwszo i
drugorzędowych są bardzo dokładnie porównane z doniesieniami literaturowymi.
Ad 6) Ocena końcowa
Praca doktorska pana mgr Mariusza Czyżniejewskiego została przygotowana w
sposób rzetelny. Zawiera bardzo dużo wyników, efektem jej jest poznanie szeregu
metabolitów pierwotnych i (szczególnie) wtórnych, charakterystycznych dla stresów chłodu,
zasolenia i suszy, co niewątpliwie przyczyni się do lepszego poznania metabolizmu traw w
reakcji na stresy abiotyczne.
Stwierdzam, że oceniana przez mnie rozprawa spełnia wszystkie wymagania
stawiane pracom doktorskim. W związku z powyższym zwracam się do Rady Instytutu
Genetyki Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu o dopuszczenie pana mgr Mariusza
Czyżniejewskiego do dalszych etapów postępowania o ubieganie się o nadanie stopnia
naukowego doktora.
Prof. dr hab. Henryk Jeleń
7