Pobierz opis

Streszczenie pracy doktorskiej pt. „Charakterystyka i znaczenie biologiczne
dysmutazy ponadtlenkowej z jaj kurzych”, autor Jacek Wawrzykowski.
Dysmutazy ponadtlenkowe (superoxide dismutase, SOD, EC 1.15.1.1) to rodzina enzymów
usuwających z komórek żywego organizmu anion ponadtlenkowy (O2-). Są to metaloproteidy.
Obecnie znane są izoenzymy zawierające w centrum aktywnym:
cynk i miedź (CuZn-SOD), występujące głównie w cytozolu komórek eukariotycznych,
żelazo (Fe-SOD), zidentyfikowane w komórkach bakteryjnych i w plastydach roślinnych,
mangan (Mn-SOD), o strukturze przestrzennej bardzo zbliżonej do Fe-SOD, występujące w
komórkach bakteryjnych oraz w mitochondriach komórek eukariotycznych,
nikiel (Ni-SOD), występujące w prokariotta.
Organizmy wyższe zawierają rożne izoformy SOD w rożnych kompartmentach komórek a także
izoenzym zlokalizowany pozakomórkowo (EC-SOD). SOD (CuZn-SOD) z erytrocytów bydlęcych została
wyizolowana już w 1939 i była pierwszym białkiem którego strukturę przestrzenną udało się ustalić.
Mechanizmy reakcji katalizownej przez dysmutazy ponadtlenkowe, a prowadzącej do syntezy
nadtlenku wodoru, mogą być zapisane w następujących pół reakcjach:
M(n +1)+-SOD + O2- → Mn+-SOD + O2
Mn+-SOD + O2- + 2H+ → M(n +1)+-SOD + H 2O2 .
gdzie M = Cu (n = 1); Mn (n = 2), Fe (n = 2), Ni (n = 2).
Na przestrzeni lat potwierdzono udział enzymów rodziny SOD w usuwaniu reaktywnych form
tlenu powstających w komórkach w wyniku stresu oksydacyjnego wywołanego różnymi czynnikami
oraz wpływem środowiska na organizm. Obecnie prowadzone są badania nad wykorzystaniem
enzymu pochodzącego z komórek bakteryjnych w leczeniu zaburzeń wywołanych nadmiernym
gromadzeniem się wolnych rodników w organizmie np. po radioterapii czy u palaczy. Równolegle
SOD znalazła też zastosowanie w kosmetologii.
W dostępnej literaturze brakuje wyczerpującej charakterystyki biochemicznej SOD występującej
w jajach kurzych (Gallus galusdomesticus). Nieliczne prace potwierdzają występowanie aktywnej
izoformy CuZn-SOD zbliżonej do występującej w erytrocytach oraz w wątrobie kurzej.
W maju 2011 FAO ogłosiła raport o stratach w produkcji i obrocie żywnością. Wskazuje on że
ponad 1/3 produktów żywnościowych marnuje się bezpowrotnie. Jako główne przyczyny
marnotrawstwa żywności wskazano niewłaściwe przechowywanie i nieznajomość środków
konserwujących na etapie produkcji co generuje ponad 40% start. Od lat prowadzi się badania
mające na celu ochronę żywności przed psuciem się na etapie od producenta do konsumenta.
Początkowo ogromną popularnością cieszyły się syntetyczne konserwanty cechujące się dużą
skutecznością, jednak wraz z rozwojem badań naukowych wiele z nich zostało powiązanych z
zaburzeniami pracy organizmu konsumenta. Obecnie poszukuje się naturalnych środków
konserwujących, olbrzymia ich ilość pochodzi w formie ekstraktów, wyciągów i destylatów z
surowców roślinnych. Ze względu na ich charakter (są to zazwyczaj mieszaniny substancji o
specyficznych właściwościach organoleptycznych - smak, zapach) nie jest możliwe ich zastosowanie
we wszystkich produktach. Prowadzi się więc badania mające na celu wykorzystanie substancji
pochodzenia zwierzęcego w konserwowaniu żywności. Olbrzymie znaczenia mają tu między innymi
hydrolizaty białek soi, jaj kurzych itp.
str. 1
U podstaw psucia się produktów żywnościowych leżą skomplikowane procesy chemiczne jednak
większość zmian sprowadza się do reakcji wywołanych obecnością reaktywnych form tlenu. To
właśnie procesy wolno rodnikowe odpowiadają za psucie się tłuszczy.
Do produktów zawierających tłuszcz najczęściej jako dodatki antyoksydacyjne stosowane są
polifenole (flawonoidy, itp.), kwas askorbinowy (witamina C) i tokoferole (witamina E) oraz butylo
hydroksytoluen (BHT).
Mając powyższe na względzie podjęto badania, których celem jest:
1. Charakterystyka biochemicznych właściwości SOD z jaj i erytrocytów kurzych – wpływ pH,
temp na aktywność SOD, obecność Cu i Zn, ciężar cząsteczkowy (elektroforeza)
2. Ocena dynamiki zmian aktywności SOD w zależności od:
a. Sezonowości niesienia jaj (wiosna/jesień)
b. Czasu przechowywania jaj
3. Ocena możliwości wykorzystania SOD z jaj kurzych jako naturalnego antyoksydantu żywności
Wykorzystane w doświadczeniu kury domowe i ich jaja pochodziły z hodowli ekologicznej (zgoda
II Lokalnej Komisji ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Lublinie nr 1/2012 z dnia 17.01.2012).
Doświadczenie wykonano na grupie badanej 10 osobników w dwu powtórzeniach (po 5 sztuk w
każdym, przez 2 kolejne lata). Pomiar aktywności SOD odbywał się w dwu terminach, jesiennym –
pierwszy okres znoszenia jaj u młodych kur, i wiosennym – drugi okres znoszenia jaj u tych samych
osobników.
W trakcie doświadczenia pobierano krew z żyły łokciowej od kur biorących udział w
doświadczeniu (co 7 dni, czterokrotnie od każdego osobnika, w każdym z badanych okresów) oraz
zbierano znoszone jaja.
Jaja zostały podzielone na dwie grupy: grupa z dni parzystych (16 dni w każdym z badanych
terminów) przeznaczona do analizowania natychmiast po pozyskaniu, grupa jaj z dni nieparzystych
przed pomiarem aktywności SOD była przechowywana przez 30 dni w warunkach chłodniczych.
W jajach oraz krwi kur oznaczono aktywność SOD metodą spektrofotometryczną wykorzystującą
hamowanie przez enzym autooksydacji adrenaliny w środowisku alkalicznym. Oznaczenie aktywności
SOD w jajach kurzych przeprowadzono w oparciu o autorską modyfikację metody opisaną w
European Food Research and Technology, 2011, 232, 479-484, Changes in activity during storage and
characteristics of superoxide dismutase from hen eggs (Gallus gallus domesticus).
Otrzymane wyniki aktywności SOD odniesiono do zawartości hemoglobiny (w próbach krwi) oraz
zawartości białka (w próbach z jaj).
Równolegle opracowana została metoda ekstrakcji mieszaniną chloroform-etanol SOD z żółtek
jaj kurzych. Otrzymane w ten sposób białko enzymatyczne zostało wykorzystane jako naturalny
antyoksydant w próbach tłuszczy roślinnych.
Przygotowano dwa zestawy prób tłuszczy roślinnych:
- oliwa z oliwek - tłuszcz naturalny o niewielkiej zawartości nienasyconych (w tym
wielokrotnie nienasyconych) kwasów tłuszczowych, jako próba kontrolna
- olej ze słonecznika - tłuszcz o dużej zawartości wielokrotnie nienasyconych kwasów
tłuszczowych, podatny na szybkie utlenianie.
Do każdego z przygotowanych zestawów dodano:
str. 2
- BHT (jako przykład syntetycznego antyoksydantu, dobrze rozpuszczalnego w tłuszczach) w
stężeniach 0,02, 0,04, 0,06 mg/ml tłuszczu.
- SOD wyizolowane z żółtek, w stężeniach 0,02, 0,04 i 0,06 mg białka enzymatycznego na ml
badanego tłuszczu
- równolegle wykonano próby kontrolne bez dodatku żadnych substancji.
W celu zobrazowania zmiennych warunków przechowywania próby oleju podzielono na trzy
zestawy:
- pierwszy zestaw kontrolny przechowano w warunkach chłodniczych bez dostępu światła.
- drugi zestaw przechowywano w temperaturze 22°C
- trzeci zestaw przechowywano w temperaturze 37°C.
Analizę składu kwasów tłuszczowych przeprowadzono techniką chromatograficzną (w oparciu o
PN-EN ISO 5509:2001, „Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce. Przygotowanie estrów metylowych
kwasów tłuszczowych” oraz PN-EN ISO 5508:1996 „Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce. Analiza
estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej”) w próbach
przechowywanych odpowiednio w czasie 0, 30, 60 i 120 dni.
Charakterystyka SOD wyizolowanej z krwi oraz jaj kurzych oparta jest na rozdziale
elektroforetycznym na żelach poliakrylamidowych i identyfikacji wyizolowanego białka techniką
MALDI TOF/TOF.
Zawartość metali w centrum aktywnym enzymu wykonuje się w oparciu o pomiar zawartości
metalu w hydrolizacie otrzymanym z enzymu techniką ICP-MS w Centralnym Laboratorium
Agroekologicznym Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie.
Scharakteryzowano SOD otrzymaną na drodze ekstrakcji z jaj kurzych jako metaloproteinę o
masie monomeru około 14kDa zawierającą w centrum aktywnym jon metalu.
Aktualnie trwają prace nad potwierdzeniem charakterystyki enzymu niezależnymi metodami (w
oparciu o elektroforezę 2-D, analizę proteomiczną MALDI i identyfikację otrzymanych
białek/peptydów w dostępnych bazach (Swissprot i innych).
Wstępna analiza wyników pomiaru aktywności SOD w żółtkach i białkach jaj kurzych z dni
nieparzystych oraz z dni parzystych po 30 dniowym okresie przechowywania wskazuje na
stosunkowo stałą aktywność enzymu w trakcie przechowywania i niewielką zmienność pomiędzy
kolejnymi monitorowanymi dniami. Znaczne są natomiast różnice pomiędzy terminami wiosennym i
jesiennym.
Wyniki analizy profilu kwasów tłuszczowych (zwłaszcza nienasyconych) w badanych próbach
oleju pozwalają wysnuć stwierdzenie iż otrzymana z jaj SOD jest równie dobrym antyoksydantem jak
zastosowany kontrolnie BHT, trend ten jest wyraźnie widoczny w próbach oleju słonecznikowego
zawierającego znaczną ilość wielokrotnie nienasyconych kwasów tłuszczowych.
str. 3