Drobnoustroje do poprawy stanu zdrowia osobników z

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
23.12.2008 08865212.8
(19) PL
(11) PL/EP
(13)
(51)
2236598
T3
Int.Cl.
C12N 1/20 (2006.01)
A61K 35/74 (2006.01)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(54)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
26.12.2012 Europejski Biuletyn Patentowy 2012/52
EP 2236598 B1
A23L 1/30 (2006.01)
A61P 1/00 (2006.01)
A61P 1/12 (2006.01)
A61P 1/14 (2006.01)
Tytuł wynalazku:
Drobnoustroje do poprawy stanu zdrowia osobników z zaburzeniami związanymi ze spożyciem glutenu
(30)
(43)
Pierwszeństwo:
24.12.2007 ES 200703427
Zgłoszenie ogłoszono:
06.10.2010 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/40
(45)
O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
30.08.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08
(73)
Uprawniony z patentu:
Consejo Superior De Investigaciones Científicas, Madrid, ES
PL/EP 2236598 T3
(72)
Twórca(y) wynalazku:
YOLANDA SANZ HERRANZ, Burjassot, ES
ESTER SANCHEZ SANCHEZ, Burjassot, ES
MARCELA SUSANA MEDINA, Burjassot, ES
GIADA DE PALMA, Burjassot, ES
INMACULADA NADAL GIMENEZ, Burjassot, ES
(74)
Pełnomocnik:
rzecz. pat. Marta Kawczyńska
POLSERVICE
KANCELARIA RZECZNIKÓW
PATENTOWYCH SP. Z O.O.
ul. Bluszczańska 73
00-712 Warszawa
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący
udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za
sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
3
17/P32322PL00
EP 2 236 598 B1
Opis
Dziedzina techniki
[0001]
Niniejszy
spożywczego
i
wynalazek
sektora
dotyczy
przemysłu
farmaceutycznego.
Dokładniej,
wynalazek ten dotyczy dziedziny probiotyków i produktów
pochodnych w postaci żywności funkcjonalnej oraz nowych
produktów
spożywczych,
probiotyków,
synbiotyków,
nutraceutyków lub suplementów diety, a także kompozycji
farmaceutycznych o zastosowaniach klinicznych.
Stan techniki
[0002]
Choroba trzewna (celiaklia) jest enteropatią,
dotykającą
jelit,
pochodzenia
immunologicznego,
spowodowaną permanentną nietolerancją białek glutenu ze
zbóż,
na
osobnicy.
którą
Choroba
cierpią
ta
genetycznie
cechuje
się
predysponowani
szerokim
spektrum
klinicznym i obejmuje postacie typowe, atypowe, ciche i
potencjalne. Postacie typowe występują najczęściej w
pierwszych latach życia (6 - 24 miesięcy) i przejawiają
się
głównie
objawami
jelitowymi
oraz
pokrewnymi
zmianami (złe wchłanianie, przewlekła biegunka, spadek
masy
ciała,
uczucie
pełności
w
brzuchu,
opóźniony
wzrost, itp.). Jest ona obecnie najczęściej występującą
chorobą przewlekłą, której częstość występowania wynosi
0,7 do 2,0 % w populacji ogólnej, a 15 do 20% wśród
krewnych pierwszego stopnia. Ponadto, spożycie glutenu
i choroba trzewna związane są z innymi zaburzeniami,
takimi
jak
zespół
Downa,
cukrzyca
typu
1,
4
opryszczkowate
dermatitis
rozsiane,
zapalenie
skóry
herpetiformis),
zapalenie
stawów,
(choroba
Duhringa,
miopatia,
stwardnienie
autyzm,
schizofrenia,
depresja, chłoniaki, i ataksia. Uważa się, że związek
pomiędzy
spożyciem
glutenu
a
zaburzeniami
psychiatrycznymi, neurologicznymi i behawioralnymi jest
wynikiem powstawania bioaktywnych peptydów, takich jak
eksorfiny, posiadających aktywność opioidową.
[0003]
prolaminy
Białka
glutenu
i
gluteniny)
środowiskowy,
pokrewne
który
zaburzenia.
(gliadyny
oraz
stanowią
wyzwala
Białka
chorobę
te
analogiczne
główny
czynnik
trzewną
i
zawierają
inne
sekwencje
peptydowe bogate w prolinę i glutaminę, co sprawia że
są one bardziej oporne na enzymy trawienne niż inne
białka w diecie, i dlatego zdolne są do pozostawania w
świetle
przewodu
jelitowego.
U
genetycznie
predysponowanych osobników peptydy te są odpowiedzialne
za
nieprawidłową
nabyty
układ
reakcję,
która
odpornościowy
i
obejmuje
która,
wrodzony
i
całościowo,
prowadzi do przewlekłego stanu zapalnego błony śluzowej
jelit, zwiększonej ilości limfocytów śródnabłonkowych,
hiperplazji krypt oraz postępującego niszczenia kosmków
jelitowych, w tym do ich całkowitego zniknięcia. Te
toksyczne peptydy wytwarzane po spożyciu glutenu mogą
przechodzić przez nabłonek jelitowy i są rozpoznawane
zarówno przez cząsteczki HLA-DQ2, jak i HLA-DQ8 komórek
prezentujących antygen, korzystnie po deamidacji przez
działanie
tkankowej
transglutaminazy.
Zatem,
są
one
prezentowane receptorom komórek T, co prowadzi do ich
aktywacji. Wymaga to ekspresji antygenu CD4, znanego
również jako pomocniczy (Th), i jego różnicowania do
5
subpopulacji limfocytów, a zatem angażując odporność
nabytą.
Subpopulacja
Th2
oddziałuje
z
komórkami
B,
które różnicują się w komórki plazmatyczne i wytwarzają
przeciwciała przeciwko gliadynie, przeciwko endomysium
oraz
przeciwko
Subpopulacja
tkankowej
Th1
jest
transglutaminazie.
odpowiedzialna
za
wzrost
wydzielania cytokin prozapalnych (głównie IFN-γ) oraz
wzrost
stosunku
Recombinant
IFN-γ/IL-10
human
(Salvati
interleukin
10
i
wsp.
suppresses
2005.
gliadin
dependent T cell activation in ex vivo cultured coeliac
intestinal
mucosa.
Gut.
54:
46-53).
Peptydy
glutenu
mogą również wzbudzać odpowiedź w nabłonku jelitowym
zależną od cytokiny IL-15, angażującą wrodzony układ
odpornościowy (Green and Jabri 2006. Celiac disease.
Ann
Rev
Med.
57:207-21).
Spożyte
gliadyny
stymulują
wytwarzanie IL-15 w komórkach nabłonkowych, co sprzyja
ekspansji
klonalnej
śródnabłonkowych
cytotoksycznych
limfocytów T CD8 oraz ekspresji IFN-γ (Jabri i wsp.
2000.
Selective
lymphocytes
killer
expansion
expressing
receptor
the
of
intraepithelial
HLA-E-specific
CD94
in
celiac
natural
disease.
Gastroenterology. 118 :867-79; Mention i wsp., 2003.
Interleukin
15:
a
key
to
disrupted
intraepithelial
lymphocyte homeostasis and lymphomagenesis in celiac
disease. Gastroenterology. 125: 730-45; Forsberg i wsp.
2007.
Concomitant
inflammatory
increase
cytokines
in
of
IL-10
intraepithelial
and
pro-
lymphocyte
subsets in celiac disease. Int Immunol. 2007:19, 9931001). Skład mikrobioty jelitowej u pacjentów z chorobą
trzewną wykazuje również nierównowagę w porównaniu ze
zdrowymi
osobnikami,
cechującą
się
występowaniem
w
6
przeważającej
części
zmniejszoną
mlekowego
bakterii
proporcją
i
i
prozapalnych
składem
bifidobakterii.
(Sanz
oraz
bakterii
kwasu
i
2007.
wsp.,
Differences in faecal bacterial communities in coeliac
and healthy children as detected by PCR and denaturing
gradient
gel
electrophoresis.
FEMS
Immunol
Med
Microbiol. 51 (3):562-8. Nadal i wsp., 2007. Imbalance
in
the
composition
of
the
duodenal
microbiota
of
children with coeliac disease. J Med Microbiol. 2007
Dec; 56(Pt 12):1669-74; Collado i wsp. 2009. Specific
duodenal
and
faecal
bacterial
groups
are
associated
with paediatric celiac disease. J Clin Pathol. 62: 264269).
W
świetle
kombinacja
bakterii
i
glutenu
może
sprzyjający
nabłonku
ze
działać
przewodu
jelitowego
ilości
szkodliwych
wzrostem
jako
procesowi
czynnik
wywołujący
patologicznemu
i
lub
reakcjom
prozapalnym w przypadku aktywnej choroby trzewnej, jak
również innych pokrewnych zaburzeń. Podobnie do tego,
obecność lub nieobecność pewnych gatunków bakterii może
sprzyjać toksyczności glutenu lub chronić przed taką
toksycznością glutenu.
[0004]
Częstość
występowania
i
ciężkość
choroby
trzewnej jest bardzo wysoka, jednakże obecnie nie ma
żadnej terapii dla pacjentów cierpiących na tę chorobę.
Jedyną alternatywą jest przestrzeganie ścisłej diety
bezglutenowej
przez
całe
życie.
Przestrzeganie
tej
rekomendacji dietetycznej jest trudne i wielu pacjentów
wciąż cierpi na objawy żołądkowo-jelitowe, niedobory
pokarmowe
ryzyka
i
jest
zagrożonych
(zaburzeniami
niepłodnością,
powikłaniami
immunologicznymi,
nowotworami,
itp.)
a
wysokiego
osteoporozą,
równowaga
ich
7
ekosystemu
jelitowego
nigdy
nie
zostaje
w
pełni
przywrócona. Ponadto, osobnicy z chorobą trzewną oporną
na
leczenie
(5
-
10%)
nie
odpowiadają
na
tę
rekomendację dietetyczną.
[0005]
Opcje terapeutyczne lub ko-adiuwanty, które są
obecnie w trakcie badań do leczenia choroby trzewnej
obejmują
podawanie
otrzymanych
z
doustne
roślin
enzymów
albo
proteolitycznych
drobnoustrojów
w
celu
przyspieszenia trawienia żołądkowo-jelitowego peptydów
glutenu
(Shan
i
wsp.
2005.
Enzyme
treatment
of
foodstuffs for celiac sprue. 20050249719/A1; Marti i
wsp. 2006. Prolyl endopeptidase mediated destruction of
T
cell
epitopes
Stepniak
y
in
whole
Koning.
gluten.
2006.
20060286601/A1;
Enzymatic
gluten
detoxification: the proof of the pudding is in the
eating! Trends Biotechnol. 24:433-4; Gass i wsp. 2007.
Combination
dietary
enzyme
gluten
therapy
in
gastric
patients
Gastroenterology.
strategii
for
with
133:472-80).
wykazano
w
digestion
celiac
sprue.
Skuteczność
układach
of
tej
modelowych
z
zastosowaniem preparatów białkowych i peptydowych i ich
rekombinowanych odpowiedników, jednakże wciąż potrzebne
są
badania
wykazujące
osobników,
którzy
ich
skuteczność
spożywają
gluten
in
jako
vivo
u
taki
w
produktach spożywczych. Pomimo potencjalnych korzyści
tej
terapii
jako
środka
wspomagającego
przy
diecie
bezglutenowej, jej efekty będą w dużym stopniu zależały
od
czasu
przyjęcia
pozwalały
jedynie
zmniejszając
alternatywy
próg
preparatu
na
enzymatycznego
okazjonalne
toksyczności.
obejmują
spożycie
i
będą
glutenu
Inne
proponowane
opracowanie
związków
8
inhibitorowych
transglutaminazy
tkankowej
(Khosla
i
wsp., 2006. Transglutaminase inhibitors and methods of
use thereof W02007025247), przeciwciał wychwytujących
peptydy
gliadyn
treatment
(Fox,
of
intolerance.
2007.
diseases
Antibody
therapy
associated
20070184049/A1),
with
związków
for
gluten
blokujących
miejsca wiązania peptydów glutenu z cząsteczkami HLADQ2 lub HLA-DQ8 (Sollid i wsp. 2007. Drug therapy for
celiac sprue. 20070161572/A1); Peakman and Chicz. 2007.
Peptide epitopes recognized by disease promoting CD4+ T
lymphocytes.
20070142622/A1),
antagonistów
cytokin
prozapalnych takich jak IFN-γ (Maroun i wsp., 2007.
Interferon
antagonists
useful
for
the
treatment
of
interferon related diseases. 20070160609/A1), doustnego
podawania
rekombinowanych
cytokin
regulatorowych
(Salvati i wsp., 2005. Recombinant human interleukin 10
suppresses gliadin dependent T cell activation in ex
vivo
cultured
coeliac
intestinal
54:46-53),
inhibitorów
zaangażowanych
w
zonuliny
reakcje
odpowiedzialnej
międzykomórkowej
Formulations
US20070196501/A1).
a
Gut.
cząsteczek
zapalne
za
and
tight
Strategie
oraz
wzrost
(Paterson
for
mucosa.
te
2005;
adhezji
antagonistów
przepuszczalności
Ginski.
2007.
junction
effector
pociągają
za
sobą
modyfikację cząsteczek zaangażowanych w wiele procesów
biologicznych i ich zastosowanie mogłoby prowadzić do
niepożądanych skutków ubocznych. W przemyśle spożywczym
opracowuje
się
obecności
spożywczych,
strategie
toksycznych
które
mające
na
epitopów
spożywamy
celu
uniknięcie
w
produktach
poprzez
manipulację
genetyczną pewnych odmian pszenicy oraz zastosowanie
9
enzymów
proteolitycznych
i
pałeczek
kwasu
mlekowego
podczas procesów fermentacji produktów zbożowych, które
mogą degradować toksyczne epitopy. W ten sposób, celem
jest uzyskanie poprawy w diecie pacjentów z chorobą
trzewną
oraz
produktów,
choroby
dostarczenie
ale
jako
im
szerszego
bez
profilaktyki
takiej
(Rizzello
lub
i
zakresu
leczenia
wsp.
2007.
samej
Highly
efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal
proteases during food processing: new perspectives for
celiac disease. Appl Environ Microbiol.73:4499-507).
[0006]
Zastosowanie
szczepów
Bifidobacterium
jako
farmaceutycznych
do
trzewnej
i
należących
probiotyków
leczenia
związanych
z
nią
i
do
lub
preparatów
profilaktyki
zaburzeń
rodzaju
jest
choroby
podstawą
niniejszego wynalazku. Zalety bifidobakterii specjalnie
wyselekcjonowanych
Bifidobakterie
kolonizacji
do
posiadają
przewodu
przyczyniając
tego
się
szczególną
jelitowego
do
celu
rozwoju
są
zdolność
noworodków,
u
nich
liczne.
do
znacząco
mechanizmów
obronnych (immunologicznych i innych) oraz tolerancji
doustnej wobec antygenów pokarmowych. Ta grupa bakterii
jest jednym z głównych składników mikrobioty jelitowej
w pierwszych latach życia, w szczególności u dzieci
karmionych piersią.
Opis wynalazku
Krótki opis wynalazku
[0007]
Zgłoszenie to ujawnia sposób selekcjonowania
drobnoustrojów lub szczepów drobnoustrojów zdolnych do
10
modulowania
te,
odpowiedzi
korzystnie
immunologicznej.
należące
do
rodzaju
Drobnoustroje
Bifidobacterium,
zdolne są do tego by być zastosowanymi w leczeniu lub
profilaktyce chorób immunozależnych, takich jak choroba
trzewna,
ze
względu
na
ich
właściwości
immunomodulujące.
[0008]
Wynalazek według zastrzeżeń dostarcza nowego
szczepu z rodzaju Bifidobacterium (CECT 7347; w dalszej
części
określany
(IATA-ES1)
według
tu
lub
jako
"szczep
supernatantu
wynalazku
lub
według
hodowli
ekstraktu
wynalazku"
drobnoustrojów
otrzymanego
z
drobnoustrojów według wynalazku w postaci preparatów
zaprojektowanych do zmniejszania ryzyka i poprawy stanu
zdrowia oraz jakości życia osobników z chorobą trzewną
i innymi zaburzeniami związanymi ze spożyciem glutenu
(alergia,
astma
autyzm,
ataksja,
cukrzyca
i
stwardnienie rozsiane, itp.).
[0009]
kału
Szczep według wynalazku został wyizolowany z
zdrowych
dzieci
karmionych
piersią
i
zidentyfikowany poprzez sekwencjonowanie 16 S rRNA i
genów
tuf.
Szczep
immunomodulujące
zdolne
ten
posiada
właściwości
do
regulowania
odpowiedzi
prozapalnych typu Th1 charakterystycznych dla choroby
trzewnej
i
rozsiane,
związanej
cukrzyca,
odpowiedzi
nią
chorób
(stwardnienie
ataksja,
itp.),
jak
immunologicznych
charakterystycznych
pokarmowych
z
na
dla
białka,
zależnych
które
są
typu
od
IgE
skutkiem
również
Th2
alergii
spożycia
białek pszenicy i innych zbóż. Szczep według wynalazku
charakteryzuje się indukowaniem wytwarzania w niskim
stopniu cytokiny Th1 - IFN-γ oraz cytokiny prozapalnej
11
IL-1,
oraz
indukowaniem
wytwarzania
w
dużym
stopniu
cytokin regulatorowych IL-10 i TGF-β w jednojądrzastych
komórkach
krwi
obwodowej
indukowany
przez
ten
(PBMC).
szczep
nie
Profil
jest
cytokin
wspólną
cechą
charakterystyczną wszystkich bifidobakterii i bakterii
kwasu
mlekowego
z
ludzkiego
przewodu
jelitowego
i
sprawia, że szczep ten jest szczególnie dostosowany do
modulowania
nieprawidłowej
odpowiedzi
immunologicznej
wywoływanej przez białka glutenu u predysponowanych do
tego
osobników.
tego
takimi
na
drobnoustrojami,
Kombinacja
jak
szczepu
przykład
z
innymi
B.
longum
ATCC15707, może nasilać syntezę cytokiny regulatorowej
IL-10 korzystnej dla kontrolowania procesu zapalnego
charakterystycznego
Bakterie
różnych
dla
nieżywotne
procedur,
rozmrażanie,
tych
stanów
(inaktywowane
takich
jak
patologicznych.
z
zastosowaniem
ciepło,
napromieniowanie,
itp.)
zamrażanie
utrzymują
i
swoje
zdolności immunomodulujące.
[0010]
Szczep
pobierania
według
i
hydrolizowania
odpowiedzialnych
stężenie
Szczep
peptydazy
do
prolinę,
która
glutenu.
za
te
toksycznych
patogenny.
wynalazku
tego
ich
z
glutenu
potencjał
posiada
swoiste
zawierających
występuje
szczepu
do
zmniejszając
substratów
powszechnie
Kombinacje
i
wynalazku
hydrolizowania
jest
peptydów
zaburzenia,
epitopów
według
zdolny
w
białkach
innymi
szczepami
bifidobakterii, które mają różną swoistość pozwala na
komplementację
toksycznych
ich
działania,
epitopów.
co
Kombinacja
sprzyja
degradacji
bifidobakterii
z
innymi drobnoustrojami takimi jak Lactococcus lactis
NCD0712,
który
ma
proteinazę
zakotwiczoną
w
błonie,
12
także
nasila
efekty
hydrolityczne
wyłącznie
dzięki
działaniu bifidobakterii.
[0011]
Szczep
modulowania
przez
pomocą:
cytokin
IL-15
szlaku
i
prozapalnego
do
indukowania
(IL-10),
(ii)
prozapalnych
IFN-γ,
pochodzących
wrodzonej
jest
wywoływanej
(i)
regulatorowych
i
immunologicznej
hamowanie
za
wytwarzania
IL-8
zdolny
immunologicznej
glutenu
cytokin
zmniejszania
IL-1,
wynalazku
odpowiedzi
peptydy
syntezy
według
z
nabytej
odpowiedzi
oraz
zależnego
od
(iii)
czynnika
jądrowego κB (Przykład 3, Tabela 3).
[0012]
Szczep według wynalazku, jak również związki
pochodzące
z
niego
zgodnie
z
zastrzeżeniami
patentowymi, jest także zdolny do hamowania bakterii
patogennych
izolowanych
z
mikrobioty
jelitowej
pacjentów z chorobą trzewną, o potencjale prozapalnym i
z
czynnikami
wirulencji,
co
sprzyja
przywróceniu
równowagi jelitowej (Przykład 4, Tabele 4 i 5). Szczepy
te
są
również
zdolne
do
hamowania
odpowiedzi
prozapalnych na bakterie jelitowe pacjentów z aktywną
chorobą trzewną oraz u tych na diecie bezglutenowej, co
zmniejsza syntezę cytokin prozapalnych (TNF-α i IFN-γ)
i zwiększa syntezę cytokin regulatorowych (IL-10).
[0013]
Szczep
aktywności
esterazy,
według
wynalazku
metaboliczne
lipazy,
(na
przykład:
galaktozydazy,
acetylo-glukozaminidazy),
składników
odżywczych
wchłaniania
oraz
które
i
również
fosfatazy,
glukozydazy
sprzyjają
poprawiają
niedożywienie
pacjentów z celiaklią.
posiada
i
N-
trawieniu
zespół
złego
charakterystyczne
dla
13
[0014]
Szczep
przylegania
warunkach
do
według
mucyny
presji
wynalazku
(1
-
4%)
posiada
i
jest
żołądkowo-jelitowej
zdolność
stabilny
(kwaśne
pH
w
i
wysokie stężenie żółci; Przykład 5, Tabela 6 i Tabela
7)
oraz
procesów
wytwarzania
technologicznych
żywności
przechowywania
(chłodzenie,
i
liofilizacja,
fermentacja, itp.). In vivo zdolny jest do przeżycia
przejścia u ludzi po podaniu doustnym. Wszystkie te
właściwości
gwarantują
jego
długotrwałe
utrzymywanie
się i skuteczność w jelicie oraz jego zastosowanie jako
probiotyków
i
synbiotyków
(kombinacje
pro
i
prebiotyków). Gwarantują one również jego zastosowanie
w
postaci
żywności
funkcjonalnej,
spożywczych,
suplementów,
zmniejszania
ryzyka
i
nowych
nutraceutyków
poprawy
zdrowia
produktów
i
leków
oraz
do
jakości
życia podmiotów z chorobą trzewną, jak również innymi
zaburzeniami związanymi ze spożyciem glutenu.
[0015]
Zatem, pierwszy aspekt niniejszego ujawnienia
dotyczy
sposobu
szczepów
selekcjonowania
zdolnych
immunologicznej
obejmuje:
(a)
korzystnie
dzieci
w
do
modulowania
alergiach
izolowanie
kału,
karmionych
od
drobnoustrojów
piersią,
odpowiedzi
pokarmowych,
drobnoustrojów
zdrowych
osobników,
oraz
(b)
lub
z
który
próbek,
korzystnie
selekcjonowania
tych drobnoustrojów z etapu poprzedniego, które zdolne
są
do
modulowania
odpowiedzi
immunologicznej
i
hydrolizowania, inaktywowania lub zakłócania mechanizmu
działania co najmniej jednego czynnika, który wywołuje
alergie
pokarmowe,
korzystnie
chorobę
trzewną.
Korzystnie drobnoustroje wyselekcjonowane w etapie (a)
należą
do
potencjalnie
probiotycznych
rodzajów
lub
14
gatunków. W korzystnym przykładzie wykonania, odpowiedź
immunologiczna modulowana przez drobnoustrój otrzymany
w etapie (a) stanowią odpowiedzi prozapalne typu Th1
lub Th2. Ponadto, drobnoustroje otrzymane w etapie (a)
i (b), alternatywnie lub dodatkowo do ich właściwości
modulujących
odpowiedź
immunologiczną,
mogą
być
selekcjonowane pod kątem ich zdolności do zwiększania
żywotności
i/lub
integralności
komórek
nabłonkowych,
poprawiając działanie bariery jelitowej.
[0016]
Drobnoustroje wyselekcjonowane powyżej opisanym
sposobem albo zdolne do hydrolizowania, inaktywowania
lub
zakłócania
najmniej
działania
jednego
mechanizmów
czynnika
działania
wywołującego
co
alergie
pokarmowe i modulującego odpowiedź immunologiczną można
stosować
do
pokarmowych
leczenia
(w
lub
dalszej
profilaktyki
części
alergii
określane
tu
jako
"drobnoustroje według wynalazku"). Zatem, jeden aspekt
niniejszego
wynalazku
dotyczy
zastrzeganych
drobnoustrojów do zastosowania jako lek lub kompozycje
spożywcze,
korzystnie,
do
leczenia
lub
profilaktyki
alergii pokarmowych.
[0017]
Wynalazek
dotyczy
szczepu
bakteryjnego
zdeponowanego pod numerem dostępu CECT 7347.
[0018]
Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji (w dalszej
części
określana
wynalazku”),
która
tu
jako
zawiera
"kompozycja
szczep
według
według
wynalazku,
gdzie jest on obecny korzystnie w takiej kompozycji w
proporcji pomiędzy 0,1 a 99,9%, korzystnie pomiędzy 1%
a
99%
a
jeszcze
Kompozycja
drobnoustroje
ta
lub
korzystniej
może
pomiędzy
dodatkowo
pożywki,
które
10%
zawierać
nasilają,
a
90%.
inne
między
15
innymi, właściwość immunomodulującą drobnoustroju lub
szczepu
według
wynalazku
lub
jego
zdolność
do
hydrolizowania, inaktywowania lub zakłócania mechanizmu
działania środków wywołujących alergie pokarmowe.
[0019]
Wynalazek
dotyczy
ponadto
kompozycji,
którą
można otrzymać ze związków bioaktywnych pochodzących z
drobnoustrojów według wynalazku, którymi są supernatant
hodowli
dowolnego
wynalazku
(w
"supernatant
otrzymane
spośród
spośród
dalszej
według
z
czystej
drobnoustrojów
części
określany
wynalazku"),
lub
drobnoustrojów
mieszanej
według
według
tu
jako
lub
ekstrakty
hodowli
dowolnego
wynalazku
lub
szczepu
według wynalazku (w dalszej części określany tu jako
"ekstrakt
według
wynalazku").
Te
związki
bioaktywne
pochodzące z drobnoustroju według wynalazku, w dalszej
części określane tu jako "pochodne związki bioaktywne
według wynalazku", mogą być stosowane do wytwarzania
produktów
spożywczych,
suplementów,
nutraceutyków,
produktów opartych na probiotykach lub synbiotykach,
nowych produktów spożywczych i leków, i podobnie ich
różne zastosowania są również częścią wynalazku. Inny
aspekt ujawnienia dotyczy materiału podtrzymującego do
wytwarzania
kompozycję
produktów
według
drobnoustrój
spożywczych,
wynalazku
według
lub
wynalazku,
co
które
zawierają
najmniej
korzystnie,
jeden
szczep
według wynalazku. W korzystnym przykładzie wykonania,
drobnoustrój według wynalazku zawarty jest w materiale
podtrzymującym w ilości wynoszącej co najmniej około
105
cfu/g
materiału
podtrzymującego,
korzystnie
pomiędzy 106 cfu/g a 1012 cfu/g, korzystnie pomiędzy 106
cfu/g
a
1010
cfu/g.
Zgodnie
z
tym,
dowolny
produkt
16
spożywczy lub suplement zawierający kompozycję według
wynalazku również stanowi część wynalazku.
[0020]
Wynalazek
farmaceutycznej
zawiera
dotyczy
lub
dowolny
kompozycji
spośród
kompozycja
według
wynalazku,
ekstrakt
ponadto
kompozycji
spożywczej,
następujących
wynalazku,
według
związków:
supernatant
wynalazku,
która
według
drobnoustrój
według wynalazku, szczep według wynalazku i ewentualnie
farmakologicznie
dopuszczalne
pożywki
i/lub
zaróbki.
Ilość drobnoustrojów, którą kompozycja farmaceutyczna
lub kompozycja spożywcza musi zawierać będzie różnić
się w zależności od typu patologii, do leczenia której
jest
zaprojektowana.
stanowi
alergia
trzewna.
W
spożywczych,
najmniej
Korzystnie
pokarmowa,
przypadku
i
zgodnie
jeden
wspomnianą
a
korzystniej
wytwarzania
z
niniejszym
drobnoustrój
patologię
choroba
kompozycji
wynalazkiem,
co
wynalazku
lub
według
pochodny związek bioaktywny według wynalazku, zawarty
jest
w
materiale
pomiędzy
105
podtrzymującym
cfu/g
a
korzystnie
1014
cfu/g
w
ilości
materiału
podtrzymującego, korzystniej pomiędzy około 108 cfu/g a
1013 cfu/g, i jeszcze korzystniej pomiędzy około 107
cfu/g a 1012 cfu/g, w przypadku drobnoustroju według
wynalazku,
i
w
przypadku
pochodnego
związku
bioaktywnego według wynalazku w proporcji pomiędzy 0,1
a
99,9%,
korzystnie
pomiędzy
1%
a
99%
i
jeszcze
korzystniej pomiędzy około 10% a 90%. Te kompozycje
spożywcze
mogą
nutraceutyków,
być
żywności
stosowane
do
wytwarzania
funkcjonalnej,
probiotyków,
synbiotyków, suplementów odżywczych lub innych typów
produktów zaprojektowanych do leczenia lub profilaktyki
17
korzystnie alergii pokarmowych i korzystniej choroby
trzewnej.
[0021]
Kompozycja
farmaceutyczna
lub
kompozycja
spożywcza według wynalazku może występować korzystnie w
postaci
tabletek,
kapsułek,
mikrokapsułek,
proszków,
roztworów, past, itp.
[0022]
Inny
aspekt
kompozycji
według
wynalazku,
ekstraktu
farmaceutycznej
spożywczej
według
z
z
subkomórkowych.
do
lub
innym
dotyczy
supernatantu
według
wynalazku,
w
szczep
których
według
hodowli
Korzystnie,
i,
drobnoustrój
jest
supernatantem
jej
wspomniany
jeszcze
kompozycji
wynalazku
lub
Lactococcus,
kompozycji
lub
drobnoustrojem,
jego
lactis
wynalazku
wynalazku,
wynalazku,
rodzaju
Lactococcus
według
według
wynalazku
otrzymanym
należy
wynalazku,
według
skojarzony
niniejszego
frakcji
drobnoustrój
korzystnie
korzystniej,
gatunku
jest
to
szczep Lactococcus lactis NCDO712.
[0023]
Niniejszy
wynalazek
dotyczy
również
rożnych
postaci prezentacji kompozycji według wynalazku, które
można wytwarzać jako produkt spożywczy, nutraceutyk,
preparat
farmaceutyczny,
suplement,
probiotyki
lub
synbiotyki, albo nowe produkty spożywcze.
Definicje:
[0024]
Dzieci
karmione
piersią:
w
całym
opisie
określenie to będzie odnosić się korzystnie do zdrowych
osobników,
korzystniej
korzystnie
w
wieku
w
wieku
poniżej
poniżej
jednego
dwóch
roku
lat,
życia
i
korzystniej w wieku poniżej 6 miesiąca życia, którzy
byli w głównej mierze karmieni piersią.
18
[0025]
Zdrowy
korzystnie
do
osobnik:
kogoś,
określenie
kto
nie
to
cierpi
odnosi
się
żaden
typ
na
patologii przewlekłej czy ostrej zgodnie z kryteriami
specjalistów – lekarzy. Korzystnie wspomniana patologia
wywołuje stan zapalny nabłonka jelitowego, korzystniej
chorobę trzewną.
[0026]
Alergie pokarmowe: w całym opisie określenie to
będzie odnosić się korzystnie do alergii pokarmowych
wywołanych
korzystnie
przez
mleko,
jajka,
rośliny
strączkowe, orzechy, skorupiaki, ryby, mięczaki, sezam,
pestki
słonecznika,
nasiona
bawełny,
nasiona
maku,
fasole, groch, soczewicę i, korzystnie, gluten.
[0027]
bodziec,
Odpowiedź
który
prozapalna
wywołuje
typu
Th1:
wytwarzanie
w
odpowiedź
dużym
na
stopniu
cytokin typu Th1, i korzystnie cytokiny IFN-γ, które
jest korzystnie co najmniej 100 razy, korzystniej co
najmniej 15 razy, korzystniej co najmniej 10 razy i
jeszcze
korzystniej
co
najmniej
4
razy
wyższe
niż
odpowiedź
na
wytwarzanie przez kontrolę.
[0028]
bodziec,
Odpowiedź
który
prozapalna
wywołuje
typu
Th2:
wytwarzanie
w
dużym
stopniu
cytokin typu Th2, i korzystnie cytokiny IL-4, które
jest korzystnie co najmniej 100 razy, korzystniej co
najmniej 15 razy, korzystniej co najmniej 10 razy i
jeszcze
korzystniej
co
najmniej
4
razy
wyższe
niż
wytwarzanie przez kontrolę.
[0029]
Potencjalnie probiotyczne rodzaje lub gatunki:
Korzystnie w całym opisie określenie to będzie odnosić
się
do
gatunków
i
szczepów
następujących
rodzajów
filogenetycznych i rodzajów prokariotycznych: Archaea,
Firmicutes,
Bacteroidetes,
Proteobacteria,
19
Actinobacteria,
Verrucomicrobia,
Spirochaetes,
Fibrobacters,
Deinococcus,
Thermus,
Fusobacteria,
Deferribacteres,
Cianobacteria,
Methanobrevibacterium, Bifidobacterium, Lactobacillus,
Streptococcus,
Pediococcus,
Leuconostoc.
Lactococcus,
Peptostreptococcus,
Enterococcus,
Coprococcus,
Subdolingranulum,
Anaerofustis,
Gemella,
Ruminococcus,
Dorea,
Roseburia,
Bulleidia,
Catenibacterium,
Dialister, Anaerotruncus, Staphylococcus, Micrococcus,
Propionibacterium,
Enterobacteriaceae,
Faecalibacterium,
Prevotella,
Bacteroides,
Eubacterium,
Parabacteroides,
Akkermansia,
Bacillus,
Butyrivibrio, Clostridium, itp. Jak również gatunków i
szczepów
grzybów
Saccharomyces,
oraz
drożdży,
Candida,
między
Pichia,
innymi,
Debaryomyces,
Torulopsis, Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium.
[0030]
Pożywki:
określenie
odnosić
się
pożywek
do
to
będzie
korzystnie
hodowlanych,
substratów,
prebiotyków, włókien, związków bioaktywnych, zaróbek,
składników,
itp.,
charakterystyczną
które
właściwość
poprawiają
dowolną
drobnoustrojów
według
wynalazku do zastosowania, korzystnie, do wytwarzania
leków,
kompozycji
odżywczych,
kompozycji,
materiałów
podtrzymujących, supernatantów i produktów spożywczych
według wynalazku (na przykład, stabilności, właściwości
immunomodulujących,
fermentacyjnych,
właściwości
hydrolizacyjnych
adhezyjnych,
lub
inaktywacyjnych
środków wywołujących alergie, itp.)
[0031]
Materiał
podtrzymujący
spośród
mleka,
podtrzymujący:
stanowi
korzystnie,
kompozycja
jogurtu,
sera,
spożywcza
mleka
materiał
wybrana
fermentowanego,
20
produktów spożywczych na bazie mleka fermentowanego,
fermentowanych produktów zbożowych, mąki, soków, cukru,
ciastek, lodów, preparatów dla dzieci, itp.
[0032]
Lek: w całym opisie określenie to będzie się
korzystnie
odnosiło
farmaceutycznych
do
kompozycji
korzystnie
lub
preparatów
zaprojektowanych
do
leczenia lub profilaktyki alergii, alergii pokarmowych,
chorób
zapalnych
jelitowego
i
jelit,
zakażeń
translokacji
układu
drobnoustrojów
żołądkowopatogennych
lub ich toksyn, zmiany równowagi jelitowej (dysbioza),
przerostu
bakterii,
nietolerancji
zmiany
pokarmowej,
przepuszczalności
choroby
jelit,
trzewnej,
zespołu
złego wchłaniania, itp.
[0033]
to
Kompozycja spożywcza: w całym opisie określenie
będzie
odnosić
się
produktów
(funkcjonalnych,
konwencjonalnych
suplementów
preparatów
diety,
do
spożywczych
i
celów
nowych),
odżywczych
i
nutraceutyków zaprojektowanych korzystnie do leczenia
lub profilaktyki alergii, alergii pokarmowych, chorób
zapalnych jelit, zakażeń układu żołądkowo-jelitowego,
itp.
[0034]
dowolny
Związek bioaktywny pochodzący z drobnoustroju:
związek
drobnoustroju
lub
cząsteczka,
które
wynalazku
jako
według
tworzą
część
jego
część
strukturalną, składnik komórkowy, frakcja subkomórkowa,
metabolit
lub
wydzielana
cząsteczka,
możliwe
do
otrzymania z zastosowaniem technik fizyko-chemicznych
lub
biotechnologicznych,
wirowaniem,
sonikacją,
filtracją,
mechanicznym
włącznie
z,
między
liofilizacją,
lub
chemicznym
innymi,
precypitacją,
rozrywaniem
komórek, ekstrakcją związków z hodowli z zastosowaniem
21
enzymów
i/lub
środków
chemicznych,
rozdzielaniem
z
zastosowaniem technik chromatograficznych, klonowaniem,
i nadekspresją genów kodujących cząsteczki bioaktywne,
które zdolne są do przeprowadzania funkcji korzystnych
dla zdrowia.
Opis figur
[0035]
Figura
1.
Analiza
SDS-PAGE
profili
białkowych
różnych produktów trawienia gliadyn. Panel A: 1)
kontrola gliadyn po trawieniu pepsyną (G-P); 2)
kontrola gliadyn po trawieniu pepsyną i trypsyną
(G-P-T);
3)
G-P
inkubowane
ze
szczepem
według
wynalazku; 4) G-P-T inkubowane ze szczepem według
wynalazku (Bifidobacterium IATA-ES1). Panel B: 1)
kontrola G-P; 2) kontrola G-P-T; 3) G-P inkubowane
ze szczepem według wynalazku i Lactococcus lactis
NCD0712; 4) G-P-T inkubowane ze szczepem według
wynalazku i Lactococcus lactis NCDO712.
Figura 2. Chromatogram otrzymany z dializowalnej
frakcji trawienia gliadyn in vitro. Pik 2 jest
tym,
który
jest
korzystnie
hydrolizowany
przez
szczep według wynalazku.
Figura 3. Zmiana żywotności komórek (mierzona jako
aktywność
endolizosomalna)
wywołana
przez
rozpuszczalną i strawioną frakcją gliadyn (Gld), w
obecności
lub
nieobecności
bifidobakterii
in
vitro. Albumina bydlęca -BSA - (kontrola ujemna);
BifA2 (B. animalis); Bb (B. bifidum) i BL (szczep
według wynalazku - Bifidobacterium longum IATAES1-). Wyniki wyrażone są jako wartości średnie a
22
odchylenie standardowe określane jest w czterech
powtórzeniach.
Figura 4. Wytwarzanie cytokin prozapalnych (TNF-α)
oraz
ekspresja
czynnika
jądrowego
κB
(NF-κB)
w
hodowlach komórek Caco-2 poddanych ekspozycji na
rozpuszczalną i strawioną frakcję gliadyn (Gld), w
obecności
lub
nieobecności
bifidobakterii
in
vitro. Albumina bydlęca -BSA - (kontrola ujemna);
BifA2 (B. animalis); Bb (B. bifidum) i BL (szczep
według wynalazku - B. longum IATA-ES1-). Wyniki
wyrażone
są
jako
standardowe
wartości
średnie
określane
jest
a
odchylenie
w
czterech
powtórzeniach.
Szczegółowy opis wynalazku
[0036]
Niniejsze
ujawnienie
dotyczy
sposobu
selekcjonowania drobnoustrojów lub szczepów zdolnych do
modulowania
odpowiedzi
pokarmowych,
który
drobnoustrojów
korzystnie
zakłócania
środka
chorobę
tych
wywołującego
trzewną.
wyselekcjonowane
w
i
(b)
z
poprzedniego
modulowania
odpowiedzi
działania
alergie
inaktywowania
co
najmniej
pokarmowe,
Korzystnie,
etapie
osobników,
piersią,
hydrolizowania,
mechanizmu
alergiach
izolowanie
zdrowych
drobnoustrojów
do
i
od
w
(a)
karmionych
zdolnych
immunologicznej
obejmuje:
próbek
dzieci
selekcjonowania
etapu
z
immunologicznej
a)
należą
lub
jednego
korzystnie
drobnoustroje
do
silnie
probiotycznych rodzajów lub gatunków.
[0037]
Inny aspekt wynalazku dotyczy drobnoustrojów
zdolnych hydrolizowania, inaktywowania lub zakłócania
23
mechanizmu
działania
co
najmniej
jednego
środka
wywołującego alergie pokarmowe i modulowania odpowiedzi
immunologicznej. Drobnoustroje te mogą być stosowane
korzystnie
do
leczenia
pokarmowych,
chorób
ekosystemu
jelitowego
bakteryjnego,
przewodu
lub
profilaktyki
zapalnych
zespołu
alergii
jelit,
nierównowagi
(dysbiozy),
przerostu
złego
wchłaniania,
żołądkowo-jelitowego
i
zakażeń
translokacji
drobnoustrojów patogennych lub ich toksyn, oraz zmian
przepuszczalności jelit.
[0038]
Wynalazek ten dostarcza również drobnoustrojów
użytecznych
do
wytwarzania
preparatów,
które
zmniejszają ryzyko i poprawiają stan zdrowia osobników
cierpiących na zaburzenia związane ze spożyciem glutenu
lub
predysponowanych
do
takich
zaburzeń
za
pomocą
różnych mechanizmów działania, cechujących się tym, że
jest
to
drobnoustrój
zmodyfikowany
nie-genetycznie,
wyizolowany i wyselekcjonowany z mikrobioty jelitowej
zdrowych
osobników
dla
jego
właściwości
przeciwzapalnych i regulatorowych.
[0039]
Jego złożone mechanizmy działania obejmują, na
przykład,
i
bez
regulowanie
wrodzonej
immunologicznej
immunogenne
ograniczania
i
wywołanej
glutenu;
zakresu
nabytej
przez
(ii)
wynalazku:
(i)
odpowiedzi
peptydy
toksyczne
zmniejszanie
i
stężenia
toksycznych epitopów w świetle przewodu jelitowego za
pomocą transportu i hydrolizy peptydów glutenu; (iii)
wzmacnianie
funkcji
bakteriom
innym
czynników
i
bariery
środkom
wirulencji
żołądkowo-jelitowego
ochronnej
przeciwko
przeciwzapalnym
wyizolowanych
pacjentów
z
chorobą
z
i
innych
przewodu
trzewną,
i
24
(iv)
dostarczanie
aktywności
enzymatycznych,
dodatkowych do peptydaz, które sprzyjają trawieniu i
dostarczaniu
składników
odżywczych
do
łagodzenia
zespołów złego wchłaniania typowych dla tych pacjentów.
Drobnoustrój
ten
mógłby
wywoływać
korzystne
wpływy
oprócz tych wspomnianych, na zasadzie ilustracji i bez
ograniczania
zakresu
oksydacyjnego
związanego
regulowanie
zmniejszanie
ze
stanem
przepuszczalności
kolonizacji
funkcjach
wynalazku,
korzystnych
ochronnych,
prezentujących
toksycznych
peptydów
nabłonkowymi
komórkami
metaloproteazami,
apoptozę,
różnicowania
funkcji
hamowanie
z
gospodarza,
cyklu
wzrostu
oraz
o
komórek
interakcji
immunokompetentnymi
regulowanie
regulowanie
sprzyjanie
Gram-dodatnich
regulowanie
antygen,
zapalnym,
jelit,
bakterii
stresu
i
oddziaływanie
z
komórkowego
i
komórkowego
regulowanie
i
funkcji
neuroendokrynnych. (De Stefano i wsp., 2007. Lycopene,
quercetin
and
tyrosol
prevent
macrophage
activation
induced by gliadin and IFN-γ.Eur J Pharmacol. 2; 566
(1-3):192-9; Silano i wsp., 2007. A decapeptide from
durum
wheat
lymphocytes
prevents
from
celiac
activation
by
peripheral
gliadin
blood
peptides.
Pediatr Res. 61(1):67-71; Gross i wsp. 2007. Role of
neuropeptides in inflammatory bowel disease. Inflamm
Bowel Dis. 3(7):918-32).
[0040]
Drobnoustroje
według
wynalazku
należą,
korzystnie, do rodzaju Bifidobacterium. Drobnoustroje z
tego rodzaju zapewniają zalety w preparatach produktów
spożywczych,
probiotykach,
nowych
produktach
synbiotykach,
spożywczych,
suplementach,
25
nutraceutykach
i
preparatach
farmaceutycznych
do
leczenia lub profilaktyki choroby trzewnej i pokrewnych
zaburzeń.
Bifidobakterie
kolonizowania
mają
przewodu
specjalną
zdolność
jelitowego
do
noworodków,
przyczyniając się znacząco do rozwoju ich obrony.
[0041]
Drobnoustroje
według
wynalazku
należą
do
gatunku B. longum. Dla przykładu, i bez ograniczania
zakresu wynalazku, szczep według wynalazku należący do
tego gatunku został wyizolowany z kału zdrowych dzieci
karmionych
piersią
i
zidentyfikowany
przez
sekwencjonowanie genu 16S rRNA (Przykład 6) oraz genu
tuf.
Zsekwencjonowany
fragment
(1437
zasad)
amplifikowano przez PCR z zastosowaniem starterów 27f i
1401r a do sekwencjonowania zastosowano startery 530f i
U-968f
także
zgodnie
z
procedurami
opisanymi
przez
innych autorów (Satokari i wsp., 2001. Appl. Environ.
Microbiol.
67,
504-513;
Favier
i
wsp.
2002.
Appl.
Environ. Microbiol. 68, 219-226). Przez przyrównanie
sekwencji
bazach
otrzymanej
danych
podobieństwo
z
sekwencjami
(GenBank)
z
sekwencjami
występującymi
wykrywano
w
maksymalne
równoważnymi
14
różnym
szczepom z gatunku B. longum a wśród nich B. longum BG3
(numer dostępu AY735403.1). Część genu tuf (498 pz)
amplifikowano
starterów
i
sekwencjonowano
opisanych
przez
Ventura
characterization,
and
Lactobacillus
Bifidobacterium
direct
and
application
Environ
for
Microbiol.
loci
of
species
2003;
z
zastosowaniem
i
wsp.
the
tuf
species
(Analysis,
genes
and
their
identification.
69(11):6908-22).
in
W
Appl
tym
przypadku maksymalne podobieństwo wykrywano również z
gatunkami
B.
longum
a
specyficznie
z
sekwencją
26
odpowiadającą
dostępu
szczepowi
AY372042.1),
B.
longum
postępując
ATCC
15707
zgodnie
z
(numer
tą
samą
procedurą.
[0042]
Pokazuje
właściwości
do
to,
że
B.
longum
regulowania
układu
wykazuje
idealne
immunologicznego
według wynalazku w podobny sposób jak mogły wykazywać
inne wyselekcjonowane szczepy z tego rodzaju i gatunku,
zapewniając
te
same
korzystne
wpływy
u
osobników
z
zaburzeniami związanymi ze spożyciem glutenu.
[0043]
Wynalazek
ten
dotyczy
szczepu
bakteryjnego,
który należy do gatunku B. longum i który zdeponowano w
Hiszpańskiej
Kolekcji
Hodowli
Typowych
(Colección
Española de Cultivos Tipo - CECT), mającej siedzibę
główną w Burjassot (Valencia), w dniu 20 grudnia 2007,
odpowiadającego numerowi dostępu CECT 7347. Szczep ten
należy
do
gatunku
B.
longum
zgodnie
z
homologią
sekwencji genu 16S rRNA z innymi obecnie dostępnymi w
bazach danych (GenBank), jak opisano w Przykładzie 6;
jak również z homologią genu tuf z innymi szczepami
tego gatunku. Ten ostatni stanowi przykład szczepu z
rodzaju
które
Bifidobacterium
pozwalają
farmaceutycznych
(nowych
lub
na
lub
jego
posiadającego
zastosowanie
lekach,
funkcjonalnych)
właściwości,
w
preparatach
produktach
spożywczych
lub
odżywczych,
lub
suplementach diety.
[0044]
Szczep według wynalazku może być skojarzony z
innymi drobnoustrojami i związkami bioaktywnymi w celu
poprawy
ich
właściwości
ochronnych
i
metabolicznych
poprzez działania synergistyczne lub komplementujące,
takie
jak
wzrost
całkowitej
syntezy
cytokin
regulatorowych i ich typów, wzrost zdolności hamującej
27
wobec bakterii patogennych i funkcji bariery jelitowej
oraz wzrost ilości peptydaz i innych enzymów, które
sprzyjają trawieniu poprzez zwiększanie trawienia przez
wzrost
ich
całkowitego
stężenia
lub
zwiększanie
ich
typu lub swoistości.
[0045]
Zatem,
inny
aspekt
wynalazku
obejmuje
kombinację bifidobakterii z innymi drobnoustrojami lub
związkami bioaktywnymi, w sposób komplementujący i/lub
synergistyczny,
sprzyjający
immunoregulującym
immunogennych
oraz
wzmacniać
szczep
wpływ
wynalazku
ze
indukowania
degradacji
peptydów
drobnoustrojów,
odpowiedziom
toksycznych
glutenu.
B.
longum
Jako
ATCC
immunomodulujący
względu
syntezy
na
jego
IL-10
jak
przykład
15707
szczepu
wysoką
i
może
według
zdolność
wykazano
w
do
Tabeli
1
(Przykład 1). Działanie to byłoby również działaniem
komplementującym
indukcję
TGF-β
wytwarzanego
jedynie
przez ten drugi szczep (Tabela 1, Przykład 1). W tym
samym czasie, szczep Lactoccocus lactis NCD0712 może
komplementować
glutenu
i
dzięki
intensyfikować
bifidobakteriom
degradację
i
zmniejszać
peptydów
w
ten
sposób stężenie toksycznych epitopów glutenu oraz ich
uszkodzenia jelitowe i pozajelitowe ze względu na fakt,
że posiada on nie tylko wewnątrzkomórkowe peptydazy,
ale również zewnątrzkomórkową aktywność proteolityczną.
Intensyfikację
aktywności
Przykładzie
i
2
na
proteolitycznej
Figurze
1,
gdzie
wykazano
możliwe
w
jest
zobaczenie prawie całkowitego zniknięcia prążków białka
po inkubacji próbek strawionych gliadyn z zawiesinami
komórkowymi
szczepu
według
wynalazku
i
Lactoccocus
lactis NCD0712 (Figura 1, panel B, ścieżki 3 i 4).
28
Hydroliza
ta
była
wyższa
niż
hydroliza
uzyskana
z
zastosowaniem jedynie szczepu według wynalazku (Figura
1, panel A, ścieżki 3 i 4).
[0046]
Inny
aspekt
niniejszego
ujawnienia
dotyczy
zastosowania szczepu według wynalazku, jak również jego
nieżywotnych
równoważników
inaktywowanych
za
pomocą
różnych procedur (zamrażanie, ciepło, promieniowanie,
itp.) do celów immunomodulujących.
[0047]
Nieżywotne
inaktywowane
z
(zamrażanie,
użyteczne
stanowią
drobnoustroje
zastosowaniem
ciepło,
do
celów
także
wynalazku
różnych
procedur
promieniowanie,
terapeutycznych
część
immunomodulujące
według
niniejszego
bifidobakterii
itp.)
lub
wciąż
ochronnych
wynalazku.
są
są
i
Wpływy
otrzymywane,
co
najmniej w części, przez składniki strukturalne (DNA,
składniki
ściany
komórkowej,
itp.).
Umożliwia
to
zachowanie przez bifidobakterie części ich właściwości
immunomodulujących
bez
żywotności
i
effects
(Lammers
of
probiotic
konieczności
wsp.,
2003.
bacteria
DNA:
utrzymania
Immunomodulatory
IL-1
and
IL-10
response in human peripheral blood mononuclear cells.
FEMS
Immunol
Med
Microbiol.
38:
165-72).
Zatem,
Przykład 3 i Tabela 3 pokazują, że zawiesiny komórkowe
szczepu
według
wynalazku,
zamrażania
i
rozmrażania,
prozapalną
wywołaną
przez
inaktywowane
mogą
modulować
gliadyny,
kiedy
cyklami
odpowiedź
są
ko-
inkubowane z jednojądrzastymi komórkami krwi obwodowej,
zmniejszając w ten sposób syntezę cytokin prozapalnych
(na
przykład
IFN-γ)
i
zwiększając
regulatorowych (na przykład IL-10).
syntezę
cytokin
29
[0048]
Ponadto
drobnoustroju
związki
według
bioaktywne
wynalazku
pochodzące
takie
jak
z
związki
strukturalne, związki powstałe na drodze metabolicznej,
cząsteczki
wydzielane
drobnoustrojów
według
przez
dowolny
wynalazku
lub
spośród
szczep
według
wynalazku, otrzymane dobrze znanymi technikami, tworzą
część niniejszego wynalazku i mogą być stosowane do
modulowania odpowiedzi immunologicznych. Na przykład,
techniki
między
fizyko-chemiczne
innymi
precypitacja,
rozrywanie
i
wirowanie,
sonikacja,
komórek,
biotechnologiczne
filtracja,
tym
liofilizacja,
mechaniczne
ekstrakcja
w
i
chemiczne
związków
oparta
na
hodowli z enzymami i/lub środkami chemicznymi, rozdział
za pomocą technik chromatograficznych, klonowanie genów
kodujących wspomniane związki i ich nadekspresja.
[0049]
Przykład 1 i Tabela 1 pokazują, że składniki
strukturalne,
które
tworzą
część
otoczki
komórkowej
bifidobakterii, są odpowiedzialne co najmniej w części
za indukcję i wytwarzanie cytokin regulatorowych (IL-10
i TGF-β). W Przykładzie 3 i Tabeli 3, gdzie strawione
próbki gliadyn ko-inkubowano z zawiesinami nieżywotnych
komórek szczepu według wynalazku, pokazano także, że
składniki
strukturalne
tych
komórek
zdolne
są
do
zmniejszania odpowiedzi prozapalnych wywoływanych przez
gliadyny
oraz
regulatorowych
zwiększania
(IL-10).
syntezy
Podobnie,
cytokin
składniki
strukturalne, metabolity i substancje wydzielane przez
szczep
według
wynalazku
wywierają
wpływ
hamujący
na
wzrost potencjalnie patogennych bakterii wyizolowanych
od
pacjentów
z
chorobą
trzewną,
jak
wykazano
w
Przykładzie 4 i Tabeli 4. W tym Przykładzie, wpływ
30
hamujący
hodowli
komórek
tego
szczepu
oceniano
z
zastosowaniem techniki dwuwarstwowej, w której zarówno
komórki,
jak
i
metabolity
oraz
wydzielane
produkty
umieszcza się w kontakcie z organizmem patogennym, w
taki
sposób,
że
wpływy
hamujące
mogą
być
efektem
działania synergistycznego wszystkich tych składników.
Wpływ
hamujący
przez
bifidobakterie
także
z
metabolitów
do
związków
pożywki
zastosowaniem
supernatantów
i
hodowli
jako
wydzielanych
hodowlanej
oceniano
środka
hamującego
bezkomórkowych,
wcześniej
liofilizowanych. Zatem, wykazano, że związki uwalniane
do pożywki hodowlanej zapewniają wpływ hamujący wobec
wyizolowanych potencjalnych patogenów od pacjentów z
chorobą trzewną (Tabela 5).
[0050]
W szczególnym przykładzie wykonania niniejszego
wynalazku,
kompozycja
według
wynalazku,
supernatant
według wynalazku, ekstrakt według wynalazku, kompozycja
farmaceutyczna lub odżywcza według wynalazku, szczep
według wynalazku, cechują się tym, że są zdolne do
regulowania
lub
modulowania
wrodzonej
i
nabytej
odpowiedzi immunologicznej wywoływanej przez szkodliwe
peptydy glutenu lub inne alergie pokarmowe.
[0051]
Szczep według wynalazku został wyselekcjonowany
ze względu na jego właściwości immunomodulujące zdolne
do
regulowania
odpowiedzi
prozapalnych
typu
Th1
charakterystycznych dla choroby trzewnej i pokrewnych
chorób (zespół Downa, cukrzyca typu 1, opryszczkowate
zapalenie
skóry,
miopatia,
zapalenie
stawów,
autyzm,
stwardnienie
rozsiane,
schizofrenia,
depresja,
chłoniaki i ataksja), jak również reakcji alergicznych
typu Th2, które mogą być wywoływane w wyniku spożycia
31
białek pszenicy i innych zbóż. Szczepy te cechują się
zdolnością do indukowania wytwarzania w niskim stopniu
cytokiny
Th1
-
IFN-γ
(na
przykład
<100
pm/ml)
i
cytokiny prozapalnej - IL-1 (na przykład <150 pm/ml)
oraz indukowaniem wytwarzania w wysokim stopniu cytokin
regulatorowych IL-10 (na przykład > 800 pm/ml) i TGF-β
(na przykład >50 pmol/m) przez jednojądrzaste komórki
krwi obwodowej (PBMC; Przykład 1, Tabela 1). Profil
cytokin
indukowany
wspólną
cechą
bifidobakterii
przez
te
bifidobakterie
charakterystyczną
i
ludzkich
dla
jelitowych
nie
jest
wszystkich
bakterii
kwasu
mlekowego (Przykład 1, Tabela 1) i sprawia, że jest on
szczególnie
idealny
odpowiedzi
do
modulowania
immunologicznej,
którą
nieprawidłowej
wywołują
białka
pszenicy u predysponowanych osobników oraz u pacjentów
z
aktywną
chorobą
trzewną.
Wykrywanie
tych
wpływów
immunomodulujących z zastosowaniem zawiesin komórkowych
wyselekcjonowanego szczepu jako bodźców w tych testach
(Przykład 1 i Tabela 1) wskazuje na to, że składniki
strukturalne, które tworzą część otoczki komórki tej
bifidobakterii są odpowiedzialne, co najmniej w części,
za indukowanie wytwarzania cytokin regulatorowych (IL10 i TGF-β), które zmniejszają toksyczne i immunogenne
wpływy peptydów glutenu. Ponadto, w Przykładzie 3 i
Tabeli
3
nieżywotnych
pokazano,
komórek
że
zastosowanie
szczepu
według
zawiesin
wynalazku
(inaktywowanych cyklami zamrażania i rozmrażania) koinkubowanych z próbkami strawionych gliadyn zdolne jest
do
zmniejszania
syntezy
cytokin
prozapalnych
(na
przykład INF-γ i IL-15) wywoływanej przez gliadyny i
zwiększania syntezy cytokin regulatorowych (na przykład
32
INF,
IL-10).
strukturalne
Dlatego,
komórek
nieprawidłowe
wykazano,
bifidobakterii
odpowiedzi
że
składniki
mogą
regulować
immunologiczne
wywoływane
przez gluten, przy czym nie jest niezbędnie konieczne
utrzymanie żywotności bakterii.
[0052]
Szczep
według
wynalazku
i
pochodny
związek
bioaktywny według wynalazku, cechują się tym, że są
zdolne
do
wzmacniania
działania
bariery
ochronnej
przeciwko szkodliwym bakteriom, na przykład bakteriom
prozapalnym
i
bakteriom
z
czynnikami
wirulencji,
wyizolowanym z przewodu żołądkowo-jelitowego pacjentów
z choroba trzewną.
[0053]
Drobnoustroje
według
wynalazku
zdolne
są
do
hamowania bakterii o potencjale patogennym i potencjale
toksycznym wyizolowanych z jelit pacjentów z chorobą
trzewną
(Przykład
4,
Tabele
4
i
5).
Patogeny
te
obejmują, między innymi, szczepy z gatunku Escherichia
coli, które kodują czynniki patogenności (na przykład
fimbrie) i należą do wirulentnych grup filogenetycznych
(na
przykład,
innych
B2),
rodzajów,
przyczyniające
hemolityczne
się
szczepy
które
do
z
rodzaju
Bacteroides
wytwarzają
uszkodzenia
wyizolowane
z
metaloproteazy
tkanek,
biopsji
i
i
szczepy
dwunastnicy.
W
Przykładzie 4 i Tabeli 4 pokazano wpływ hamujący całych
hodowli komórkowych tego szczepu przeciwko wyizolowanym
patogenom
od
pacjentów
z
chorobą
trzewną,
z
zastosowaniem techniki dwuwarstwowej, w taki sposób, że
wpływy
te
mogą
być
rezultatem
składników
strukturalnych, metabolitów i substancji wydzielanych
przez
również
szczep
wpływ
według
wynalazku.
hamujący
Tabela
supernatantów
5
pokazuje
bezkomórkowych
33
hodowli tego szczepu, które zawierają tylko metabolity
i
związki
wydzielane
przez
bifidobakterie
do
tej
pożywki. W obu przypadkach wpływy hamujące uzyskane z
zastosowaniem wyselekcjonowanego szczepu są wyższe niż
wpływy
uzyskane
z
zastosowaniem
oznaczanych
w
drobnoustroje
według
wynalazku
celach
mogą
ekosystemu
sprzyjać
Zatem,
lub
się
i
pochodzenia
szczep
do
nabłonka.
jest
do
obciążenia
które
zapalnemu
i
Podobnie,
według
przywracania
zmniejszania
bateryjnego,
procesowi
zdolny
porównawczych.
przyczyniać
przepuszczalność
szczep
szczepów
wynalazku
jelitowego
antygenowego
innych
mogłyby
zwiększać
wyselekcjonowany
hamowania
syntezy
cytokin
prozapalnych (na przykład IFN-γ i TNF-α) stymulowanej
przez mikrobiotę jelitową pacjentów z chorobą trzewną w
jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej. Na przykład,
stężenia IFN-γ wynoszące 90,8 i TNF-α wynoszące 1966,3
pmol/ml wytwarzane przez PBMC w warunkach stymulacji
mikrobiotą jelitową pacjentów z chorobą trzewną można
zmniejszać
do
wartości
wynoszących
odpowiednio
8,2
pmol/ml i 295,2, w obecności szczepu według wynalazku
(Przykład
7).
Szczep
ten
zdolny
stymulowania
syntezy
cytokin
zmniejszanej
w
samym
tym
jelitową
pacjentów
z
przykład
wartości
IL-10
indukowane
przez
jest
również
regulatorowych
czasie
chorobą
przez
trzewną.
wynoszące
mikrobiotę
(IL-10),
mikrobiotę
Zatem,
49,3
jelitową
do
na
pmol/ml
pacjentów
z
chorobą trzewną można zwiększać do wartości wynoszących
107,5
pmol/ml
Bifidobacterium
immunomodulujący
poprzez
IATA-H1.
stymulację
Poprzez
wyselekcjonowany
ten
szczepu
mechanizm
szczep
może
34
przyczyniać się do przywracania równowagi jelitowej i
unikania nadmiernej stymulacji układu immunologicznego
wywołanej
przez
wywoływaną
szkodliwą
przez
mikrobiotę,
gluten
może
co
wraz
wywoływać
z
tą
powstanie
błędnego koła, które utrwala stan zapalny.
[0054]
się
Ponadto, drobnoustroje według wynalazku cechują
zdolnością
powstałych
na
zmniejszając
do
transportowania
skutek
w
trawienia
ten
sposób
peptydów
glutenu
żołądkowo-jelitowego,
stężenie
szkodliwych
epitopów.
[0055]
Dokładniej,
zdolność
do
szczep
według
pobierania
wynalazku
toksycznych
posiada
peptydów
pochodzących z trawienia żołądkowo-jelitowego gliadyn,
z produktów powstałych na skutek trawienia żołądkowego
za
pomocą
działania
pepsyny
(P),
jak
również
z
trawienia jelitowego za pomocą działania trypsyny (T) i
pankreatyny
(X)
gliadyn
w
(Przykład
2,
obecności
Figura
1).
Inkubacja
żywotnych
bakterii
wyselekcjonowanych szczepów zmniejsza ich stężenie i
obecność
toksycznych
zastosowaniem
epitopów
przeciwciała
R5
za
oznaczonych
pomocą
z
kanapkowego
testu ELISA i dlatego ich możliwe szkodliwe wpływy w
jelicie
i
na
stężenie
poziomie
ponadjelitowym.
toksycznych
strawionych
pepsyną,
epitopów
trypsyną
i
Na
przykład,
próbki
gliadyn
pankreatyną
(jak
wskazano w Przykładzie 2) wynosi 2349 ppm glutenu jak
oznaczono
za
zmniejszało
pomocą
się
do
kanapkowego
169
ppm
testu
glutenu
po
ELISA,
które
inkubacji
z
zawiesinami komórek szczepu według wynalazku. Podobnie,
inkubacja szczepu według wynalazku z gliadyną strawioną
w
warunkach
żołądkowo-jelitowych
i
dializowaną,
z
35
zastosowaniem
błony
o
wielkości
odcięcia
wynoszącej
poniżej 15 kDa, i następującą po tym jej analizą z
zastosowaniem HPLC w odwróconej fazie wykazała zdolność
tej bifidobakterii do zmniejszania o co najmniej 10%
stężenia
frakcji
strawionych
nr
2,
gliadyn
immunogenne
i
która
jest
jedyną
która
zidentyfikowane
z
główną
frakcją
zawiera
peptydy
zastosowaniem
spektrometrii masowej, właściwość, której nie posiadają
pozostałe
testowane
szczepy
(Przykład
8,
Figura
2).
Wpływy biologiczne na nabłonek jelitowy tej właściwości
szczepu B. longum IATA-ES1 wykazano po inkubacji próbek
strawionych
opisano
w
gliadyn
w
hodowlach
Przykładzie
8.
komórek
Przykład
ten
Caco-2,
jak
wykazuje,
że
szczep według wynalazku zwiększa w ten sposób żywotność
komórek nabłonkowych, w przeciwieństwie do pozostałych
testowanych szczepów (Przykład 8, Figura 3). Dodatkowo,
ko-inkubacja
szczepu
według
wynalazku
z
próbką
strawionej gliadyny zmniejszała ten ostatni wpływ na
syntezę
cytokin
prozapalnych,
takich
jak
TNF-alfa
i
ekspresję czynnika NκB odpowiedzialnego za ekspresję
genów prozapalnych (Przykład 8, Figura 4).
[0056]
Zdolność
szczepu
wychwytywania
oligopeptydów
gliadyn
odtworzona
jest
obecności
soli
w
żółciowych.
według
wynalazku
pochodzących
warunkach
Zdolność
z
trawienia
jelitowych
ta
do
nasila
i
w
się
poprzez ko-inkubcję z Lactococcus lactis NCD0712 który,
pomimo tego, że nie może skolonizować jelita grubego,
może
działać
jako
ko-adiuwant
w
pierwszych
etapach
hydrolizy spożytego glutenu za pomocą działania jego
zakotwiczonej
w
(Przykład
figura
2,
błonie
proteazy
1).
i
innych
Intensyfikację
peptydaz
aktywności
36
proteolitycznej za pomocą działania Lactoccocus lactis
NCD0712 wykazano na Figurze 1, gdzie można zauważyć
prawie całkowite zniknięcie prążków białka po inkubacji
próbek
strawionych
gliadyn
z
zawiesinami
komórek
szczepu według wynalazku i Lactoccocus lactis NCD0712
(Figura 1, panel B, ścieżki 3 i 4). Hydroliza ta była
większa niż hydroliza uzyskana z zastosowaniem jedynie
szczepu według wynalazku (Figura 1, panel A, ścieżki 3
i
4).
Aktywność
bifidobakterii
wobec
glutenu
można
również nasilać za pomocą jej ko-inkubacji z proteazami
i peptydazami z Lactococcus lactis NCD0712 w postaci
ekstraktów.
[0057]
Szczep
według
wynalazku
może
modulować
nieprawidłową odpowiedź immunologiczną wywoływaną przez
interakcję
toksycznych
immunokompetentnymi
peptydów
osobnika
glutenu
nie
tylko
z
komórkami
za
pomocą
metabolizowania peptydów, które działają jako szkodliwe
antygeny,
ale
również
za
pomocą
mechanizmów
immunoregulujących (Przykład 3, Tabela 3). Żywotne i
inaktywowane
szczepów
zawiesiny
ko-inkubowane
strawionych
bakteryjne
z
PBMC
żołądkowo-jelitowo
wyselekcjonowanych
w
obecności
gliadyn
zdolne
próbek
są
do
przeciwdziałania wpływowi prozapalnemu tych białek w
różnych
fazach
trawienia,
poprzez
działanie
pepsyny
żołądkowej (P) i jelitowej trypsyny (T) i pankreatyny
(X). Szczep ten zdolny jest do indukowania zmniejszenia
wytwarzania cytokin prozapalnych IFN-γ, IL-1, IL-8 i
IL-15
odpowiedzialnych
wrodzoną
i
nabytą,
jak
za
odpowiedź
również
immunologiczną
zwiększanie
syntezy
cytokiny regulatorowej - IL-10 (Przykład 3, Tabela 3).
Wpływy te są wynikiem co najmniej w części hamowania
37
różnych podjednostek czynnika jądrowego (NF) κB, p50,
p65 (RelA), c-Rel i Rel B jak oznaczono za pomocą testu
ELISA (Trans AM NFκB, Active Motive, Belgia). Hamowanie
tego
czynnika
transkrypcyjnego
pociąga
za
sobą
hamowanie ekspresji wielu genów prozapalnych co stanowi
punkt kontrolny procesów zapalnych a w szczególności
tego
występującego
wsp.,
2004.
w
Gliadin
chorobie
trzewnej
stimulates
(Jelínková
human
monocytes
i
to
production of IL-8 and TNF-alpha through a mechanism
involving NF-κB. FEBS Lett. 571(1-3):81-5).
[0058]
Drobnoustroje
związki
bioaktywne
według
według
wynalazku
wynalazku
i
pochodne
cechują
się
zdolnością do hydrolizowania peptydów glutenu za pomocą
ich
aktywności
toksycznych
peptydazowej,
epitopów.
wynalazku
posiada
swoistości
oraz
Jako
zmniejszając
przykład,
peptydazy
o
o
szczep
szerokim
swoistości
stężenie
dla
według
spektrum
substratów
zawierających prolinę, która występuje bardzo licznie w
gliadynach i ogranicza hydrolizę przez konwencjonalne
enzymy (Przykład 2, Tabela 2). Dokładniej, szczep ten
jest
jedynym
spośród
innych
o
najwyższej
aktywności
iminopeptydazowej (>300 U/mg białka); podobnie, posiada
on aktywność prolilo-endopeptydazową (>8 U/mg białka),
X-prolilo-dipeptydylo-peptydazową
(>15
U/mg
białka),
aktywność prolidazową i prolinazową (>15 U/mg białka).
Posiada on również aktywność tripeptydazową (>130 U/mg
białka
wobec
substratu
Gleu-Gly-Gly)
oraz
aktywność
leucylo-aminopeptydazową (>70 U/mg białka). Aktywność
tego szczepu wobec substratów zawierających prolinę,
takich
jak
Pro-pNA,
a
w
szczególności
stosunek
aktywności Pro-pNA/Leu-pNA, jest wyższa niż aktywność
38
wykrywana w innych bakteriach kwasu mlekowego (Di Cagno
i
wsp.
2004.
Sourdough
bread
made
from
wheat
and
nontoxic flours and started with selected lactobacilli
is tolerated in celiac sprue patients. Appl Environ
Microbiol. 70:1088-96; De Angelis i wsp. 2006. VSL#3
probiotic
preparation
gliadin
polypeptides
Biochim
Biophys
has
the
capacity
responsible
Acta.
2006
for
to
hydrolyze
celiac
sprue.
1762(1):80-93),
który
sprzyja swoistej hydrolizie peptydów glutenu o wysokiej
zawartości proliny.
[0059]
Zatem,
szczep
według
wynalazku
i
pochodne
związki bioaktywne według wynalazku posiadają aktywność
metaboliczną
dodatkową
w
stosunku
do
peptydaz
(na
przykład: fosfataza, esteraza, lipaza, galaktozydaza,
glukozydaza i N-acetylo-glukozaminidaza), co wspomaga
trawienie składników odżywczych spożytych wraz z dietą,
i poprawiają zespół złego wchłaniania i niedożywienie
charakterystyczne dla pacjentów z chorobą trzewną.
[0060]
Ostatecznie, inny szczególny przykład wykonania
stanowi zastosowanie drobnoustroju według wynalazku i
pochodnych
związków
kombinacji
z
preparatów
do
bioaktywnych
innymi
według
drobnoustrojami,
zmniejszania
ryzyka
wynalazku
do
i
w
wytwarzania
poprawy
stanu
zdrowia pacjentów z chorobami związanymi ze spożyciem
glutenu, lub innymi alergiami pokarmowymi.
[0061]
według
czemu
zakresu
Preparaty
wynalazku
powstają,
otrzymane
konwencjonalne,
opracować
między
innymi
różne
produkty
i
zastosowaniem
można
wynalazku,
konsumenta:
z
nowe),
przemysłowo
i
postaci
bez
szczepu
dzięki
ograniczania
prezentacji
spożywcze
suplementy,
dla
(funkcjonalne,
nutraceutyki,
39
kompozycje farmaceutyczne, probiotyki i/lub synbiotyki
albo nowe produkty spożywcze.
[0062]
Szczep
według
wynalazku
posiada
zdolność
do
przylegania do mucyny (1-4%) i jest oporny na kwaśne pH
żołądka (2,0; 2,5 i 3,0) oraz na wysokie stężenia soli
żółciowych
jelicie
(0,5;
cienkim,
ograniczające
one
1,0;
przez
2,0;
które
przeżycie
przewód
i
3,0%)
stanowią
probiotyków
jelitowy,
jak
występujące
główne
kiedy
w
bariery,
przechodzą
również
podczas
procesów fermentacji produktów spożywczych i w trakcie
ich okresu przechowywania (Przykład 5, Tabela 6). Na
przykład,
szczep
ten
utrzymuje
żywotność
i
zdolność
wzrostu wynoszącą 56-86% po 90 min inkubacji w pH 2,0 2,5. Z tego powodu, jak można zobaczyć w Tabeli 6,
szczep ten ma większe prawdopodobieństwo przeżycia i
pozostania funkcjonalnym niż inne wyizolowane szczepy i
pewne obecnie dostępne komercyjnie probiotyki. Szczep
ten przetrzymuje również przejście żołądkowo-jelitowe
in vivo. Po podawaniu w postaci mleka fermentowanego
przez
4
tygodnie
w
dawce
107-108
cfu/ml
dwa
razy
dziennie odzyskiwany jest on z kału i jego stężenie w
stosunku
do
stężenia
wyjściowego
(bez
spożycia
produktów probiotycznych) wzrasta o co najmniej 1 jedną
jednostkę
logarytmiczną.
bifidobakterie
namnażają
się
Wyselekcjonowane
i
pozostają
żywotne
w
rożnych produktach spożywczych i napojach, stanowiących
idealne nośniki do ich spożywania. Na przykład, zdolne
są one do fermentowania i koagulowania mleka, mogą być
one także stosowane do wytwarzania mleka fermentowanego
i innych pochodnych mleka (nabiałowych). Mogą one także
przetrwać
obróbki
technologiczne
przy
wytwarzaniu
i
40
konserwacji
produktów
preparatów
spożywczych,
farmaceutycznych,
takie
suplementów
jak
na
i
przykład
temperatury liofilizacji i zamrażania, gwarantujące ich
wykorzystanie przemysłowe.
[0063]
Szczególny
obejmuje
zastosowanie
pochodnych
aspekt
związków
szczepu
niniejszego
według
bioaktywnych
wynalazku
wynalazku
według
lub
niniejszego
wynalazku do wytwarzania preparatów w postaci produktów
spożywczych.
[0064]
W ten sposób, drobnoustroje według wynalazku
mogą tworzyć część produktu spożywczego preparowanego w
taki sposób aby, poza jego zwykłą wartością odżywczą,
wywierał on korzystny wpływ na zmniejszanie ryzyka i
poprawę stanu zdrowia pacjentów z chorobami związanymi
ze spożyciem glutenu.
[0065]
Inny szczególny aspekt niniejszego wynalazku
obejmuje
zastosowanie
pochodnych
związków
szczepu
według
wynalazku
bioaktywnych
w
lub
postaci
nutraceutyków, zdefiniowanych jako naturalne substancje
bioaktywne występujące w matrycy nie-spożywczej, które
w
tym
przypadku
będą
wywoływały
korzystne
wpływy
u
pacjentów z chorobami związanymi ze spożyciem glutenu,
zmniejszający
ich
ryzyko
i
poprawiając
ich
stan
zdrowia.
[0066]
W przypadku zastosowania drobnoustrojów, szczep
według wynalazku lub pochodne związki bioaktywne według
wynalazku
do
otrzymywania
suplementu
diety
lub
spożywczego, zawierałby on w swym składzie drobnoustrój
lub
jego
pochodne
związki
bioaktywne
ze
względu
na
uzupełnianie diety ze względów zdrowotnych, i w tym
specyficznym przypadku, w celu uzyskania korzystnych
41
wpływów u pacjentów z chorobami związanymi ze spożyciem
glutenu,
zmniejszając
ich
ryzyko
i
poprawiając
stan
zdrowia.
[0067]
Inny szczególny aspekt niniejszego wynalazku
obejmuje zastosowanie drobnoustrojów według wynalazku,
szczepu
według
według
wynalazku
wynalazku
do
lub
związków
bioaktywnych
wytwarzania
preparatów
farmaceutycznych. W ten sposób byłby on stosowany do
wytwarzania biologicznie aktywnych kompozycji, zdolnych
do
tego
by
być
stosowanymi
jako
leki
wywołujące
korzystny wpływ na zmniejszanie ryzyka i poprawę stanu
zdrowia pacjentów z chorobami związanymi ze spożyciem
glutenu.
[0068]
W
innym
niniejszego
szczególnym
wynalazku,
szczep
przykładzie
według
wykonania
wynalazku
lub
związki bioaktywne według wynalazku byłyby stosowane do
wytwarzania probiotyków i/lub synbiotyków (kombinacje
probiotyków
i
probiotyków),
gdzie
drobnoustroje
wprowadza się, na przykład żywe lub liofilizowane, w
odpowiednich ilościach i warunkach, które pozwalają na
wywieranie korzystnego lub terapeutycznego wpływu na
osobników
z
związanymi
alergiami
ze
pokarmowymi,
spożyciem
glutenu,
korzystnie
zmniejszając
tymi
w
ten
sposób ryzyko i poprawiając ich stan zdrowia.
[0069]
Ostateczny
wynalazku
obejmuje
szczególny
przedmiot
zastosowanie
niniejszego
szczepu
według
wynalazku lub związków bioaktywnych według niniejszego
wynalazku do wytwarzania nowych produktów spożywczych.
Przez
nowe
produkty
spożywcze
rozumie
się
dowolne
produkty lub składniki spożywcze, których nie stosowano
powszechnie w przeszłości do konsumpcji przez ludzi w
42
Unii Europejskiej od 15 maja 1997, które wywierałyby
korzystne
wpływy
u
pacjentów
cierpiących
na
choroby
związane ze spożyciem glutenu, zmniejszając ich ryzyko
i poprawiając ich stan zdrowia.
PRZYKŁADY WYKONANIA WYNALAZKU
PRZYKŁAD
RODZAJU
1.
PROCEDURA
BIFIDOBACTERIUM
MODULOWANIA
SELEKCJONOWANIA
ZGODNIE
WYTWARZANIA
Z
CYTOKIN
ICH
W
SZCZEPÓW
Z
ZDOLNOŚCIĄ
DO
JEDNOJĄDRZASTYCH
KOMÓRKACH KRWI OBWODOWEJ (PBMC)
1. Wytwarzanie hodowli i supernatantów bifidobakterii
i innych jelitowych bakterii kwasu mlekowego.
[0070]
MRS
Szczepy inokulowano do 10 ml pożywki wzrostowej
(Scharlau
Chemie
S.A.,
Barcelona,
Hiszpania)
zawierającej 0,05% cysteiny (MRS-C) w stężeniu 1% z
hodowlą 24 h i inkubowano przez 22 h w 37ºC w warunkach
anaerobowych
(anaerobioza).
Basingstoke,
UK).
Komórki
(AnaeroGen;
zebrano
przez
Oxoid,
wirowanie
(6000 g, 15 min), przepłukano dwukrotnie w PBS (10 mM
fosforan
sodu,
130
mM
chlorek
sodu,
pH
7,4),
i
zawieszono ponownie w PBS zawierającym 20% glicerol.
Porcje tych zawiesin zamrażano z zastosowaniem ciekłego
azotu
komórek
i
przechowywano
po
cyklu
w
-
zamrażania
80ºC.
–
Liczbę
żywotnych
rozmrażania
określano
poprzez zliczanie na płytkach MRSC po 48 h inkubacji.
Żywotność
ta
była
wyższa
niż
90%
we
wszystkich
przypadkach. Każdą porcję stosowano do jednego testu.
Przez
wzgląd
na
ocenę
wpływów
martwych
bakterii
niektóre porcje inaktywowano zimnem (3 cykle zamrażania
43
w -20ºC i rozmrażania) oraz inaktywowano ciepłem (30
min.
w
80ºC).
Wartości
pH
otrzymanych
supernatantów
dostosowano do 7,2 z zastosowaniem NaOH i estryfikowano
poprzez filtrację (wielkość porów 0,22 µm, Millipore,
Bedford, MA) w celu wyeliminowania możliwej obecności
żywotnych komórek. Porcje bezkomórkowych supernatantów
przechowywano w - 80ºC do dalszego zastosowania.
2. Izolacja i stymulacja PBMC
[0071]
PBMC
ochotników
izolowano
(średni
z
wiek
krwi
30
obwodowej
lat, zakres
4
24
zdrowych
–
40)
w
probówkach z heparyną. PBMC izolowano poprzez wirowanie
w gradiencie Ficolu (Amersham Biosciences, Piscataway,
NJ). Komórki płukano pożywką RPMI 1640 (Cambrex, New
York, USA) i doprowadzono do gęstości wynoszącej 1 x
106
komórek/ml
w
pożywce
dodatkowo
10%
Barcelona,
Hiszpania),
streptomycyny
płodowej
i
100
RPMI
1640
surowicy
2
mM
U/ml
zawierającej
bydlęcej
L-glutaminy,
penicyliny
(Gibco,
100
µg/ml
(Sigma).
PBMC
inkubowano w płaskodennych, 24-studzienkowych płytkach
polistyrenowych
(Corning,
Madryd,
Hiszpania)
obecności lub nieobecności środków stymulujących
w
w
37º C, przy 5% CO2, przez 24 h. Zawiesiny żywych i
martwych
bakterii
stosowano
jako
bodziec
w
stężeniu
wynoszącym 1 x 106 CFU/ml, i objętości supernatantu
wynoszącej
150
µl.
Jako
kontrolę
dodatnią
stosowano
oczyszczony lipopolisacharyd (LPS) z E. coli 0111 :B4
(Sigma, St. Louis, MO) w stężeniu wynoszącym 1 µg/ml.
Jako kontrolę ujemną testowano wytwarzanie cytokin w
niestymulowanych
dwóch
PBMC.
powtórzeniach
Każdy
w
typ
bodźca
każdym
testowano
w
doświadczeniu.
44
Supernatanty
hodowli
zebrano
przez
wirowanie,
frakcjonowano i przechowywano w porcjach w - 20ºC do
czasu wykrywania cytokin.
3. Oznaczanie cytokin
[0072]
w
Stężenia cytokin (IL-1, IFN-γ, IL-10, i TGF-β)
supernatantach
ELISA
mierzono
Bioscience
(BD
z
zastosowaniem
Biosciences,
San
zestawów
Diego,
CA)
postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
Tabela 1. Właściwości immunomodulujące bifidobakterii i
innych jelitowych bakterii kwasu mlekowego. Wpływ
żywotnych bakterii na wytwarzanie cytokin przez PBMC.
Bodziec
Wytwarzanie cytokin (pm/ml)
IL-1
IFN-γ
IL-10
TGF-β
RPMI
ND
9,0 ± 1,0
58,0 ± 3,0
ND
LPS
ND
12,0 ± 0,5
399,0 ± 8,0
ND
2459,0 ±
236,0 ±
28,0
119,0
103,0 ±
1
ES1
37,0
10,1 ± 1,0
255,0 ±
2
3
A2
ATCC15707
4
BIR-324
5
6
W11
BB536
1,0
ND
-
-
699,0 ±
13,0 ± 2,0
396,0
66,1 ±
4098,4 ±
23,9
1551,7
11,0 ± 5,0 469,0 ± 15,0
160,4 ±
486,0 ±
6,8
236,4
143,7 ±
1390,0 ±
18,3
268,8
ND
ND
-
-
45
Bodziec
7
Wytwarzanie cytokin (pm/ml)
LM1V
IL-1
IFN-γ
233,0 ±
27,0 ±
99,0
15,0
IL-10
TGF-β
166,0 ± 53,5
ND
ND, nie wykrywano
-, nie oznaczano
1
Szczep według wynalazku (IATA-ES1),
IATA-A2,
2
Bifidobacterium
3
Bifidobacterum longum ATCC15707,
4
Bifidobacterium BIR-324,
5
Bifidobacterum longum W11,
6
Bifidobacterum longum BB536,
7
Lactobacillus reuteri
LM1V.
PRZYKŁAD
2.
PROCEDURA
SELEKCJONOWANIA
BIFIDOBAKTERII
ZDOLNYCH DO HYDROLIZOWANIA i TRANSPORTOWANIA PEPTYDÓW
GLUTENU ZMNIEJSZAJĄCYCH PRZEZ TO ICH TOKSYCZNOŚĆ
[0073]
Zdolność szczepów do hydrolizowania białek i
peptydów pochodzących z glutenu mierzono poprzez ocenę
ilościową
aktywności
peptydaz
wewnątrzkomórkowych
szerokiego spectrum oraz swoistych do hydrolizowania
sekwencji peptydowych zawierających prolinę, obecnych w
peptydach odpowiedzialnych za odpowiedzi immunologiczne
i toksyczne na gluten. Komórki z 16 – 18 godzinnych
hodowli bakteryjnych hodowanych w MRSC zebrano przez
wirowanie (9000 x g przez 10 minut w 4º C), przepłukano
dwukrotnie
50
ponownie
w
mM
dziesięciokrotnie
buforem
takim
w
Tris
o
samym
stosunku
pH
7
i
buforze
do
wstępnej
zawieszono
zatężonym
objętości
hodowli. Komórki mechanicznie rozrywano z zastosowaniem
urządzenia Bead-Beater (Biospec Products, USA) dodając
46
2 objętości szklanych kulek na każdą objętość komórek i
stosując
2
otrzymany
pulsy
po
trwające
wirowaniu
1,5
minuty.
(8000
eliminacji
nierozpuszczalnych
stosowano
jako
ekstrakt
g,
10
Supernatant
min)
fragmentów
enzymatyczny
w
celu
i
komórek
do
testów
aktywności. Testowane substraty były następujące: Leuparanitroanilid (-pNA) do wykrywania aminopeptydaz o
szerokim spektrum swoistości, Leu-Leu-Gly do wykrywania
aminopeptydaz
swoistości,
i
tripeptydaz
o
Suc-Ala-Pro-pNA
do
szerokim
spektrum
wykrywania
prolilo-
endopeptydaz, Pro-AMC do wykrywania aminopeptydaz, GlyPro-AMC
do
Val-Pro
do
wykrywania
X-prolilo-dipeptydylopeptydaz;
wykrywania
wykrywania
prolidaz
prolinaz.
W
oraz
Pro-Gly
przypadku
do
substratów
pochodzących z paranitroanilidu, mieszanina reakcyjna
składała się z 200 µl 50 mM buforu fosforanowego, o pH
7,2, zawierającego 0,5 mM substratu i 50 µl ekstraktu
enzymatycznego. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 37ºC
przez maksimum 30 min. Hydrolizę substratu i uwalnianie
paranitroaniliny
monitorowano
spektrofotometrze
(550
Hercules,
pomocą
1978,
CA,
USA).
oznaczenia
Rapid
effluent
fractions
Analytical
Microplate
Hydrolizę
oksydazy
assay
Biochem
przy
to
90:
Reader,
peptydów
peptidases
L-amino
835-839).
nm
za
(Hejgaard,
in
acid
100
w
Bio-Rad,
oznaczano
L-aminokwasów
detect
using
419
column
oxidase.
µl
buforu
reakcyjnego zawierającego stężenie wynoszące 0,05 mM
inkubowano z 50 µl ekstraktu enzymatycznego przez 20
min. Po tym okresie czasu dodawano 100 µl odczynnika –
oksydazy
L-aminokwasów
mierzono
absorbancję
i,
przy
po
530
5
minutach
nm.
inkubacji,
Stężenie
białka
47
mierzono z zastosowaniem metody Bradforda i komercyjnie
dostępnego zestawu BioRad (Hercules, CA, USA). Jedną
jednostkę aktywności określono jako ilość enzymu zdolną
do hydrolizowania 1 µmol substratu w 37 ºC w czasie 1
minuty. Aktywności wyrażono w U/mg białka.
[0074]
Zdolność
hydrolizowania
szczepów
peptydów
do
transportowania
pochodzących
z
i
trawienia
gliadyn oznaczano przez elektroforezę. W tym przypadku,
zawiesiny komórkowe doprowadzano do gęstości optycznej
wynoszącej
cfu/ml,
4
i
przy
655
inkubowano
nm,
z
co
trzema
jest
109
równoważne
różnymi
hydrolizatami
gliadyn w końcowym stężeniu wynoszącym 300-600 µg/ml w
PBS do którego dodano 0,2 % glukozy. Hydrolizat gliadyn
(Sigma, St. Louis, MO) otrzymano poprzez stymulowanie
procesu
trawienia
żołądkowo-jelitowego
w
następujący
sposób: A). 100 g gliadyn trawiono w jednym litrze HCL
0,2
N
(pH:
pepsyny
w
1,8)
37º
z
zastosowaniem
przez
2
h
2
g
oczyszczonej
(hydrolizat
ten
będzie
określany jako G-P). B) Powstały tak produkt trawienia
trawiono
trypsyną
doprowadzeniu
(hydrolizat
Podwójnie
poprzez
pH
ten
do
będzie
trawioną
pankreatyny
i
(hydrolizat
ten
8
dodanie
z
g
trypsyny
zastosowaniem
określany
próbkę
2
jako
traktowano
mieszanie
przez
2
będzie
określany
2N
NaOH
G-P+T.
C).
następnie
godziny
jako
po
w
2
g
pH
8
G-P+T+X).
Po
każdym etapie trawienia wirowano go przy 10000 g przez
10 min, a supernatant przechowywano do dalszych testów
w
–
20
ºC.
Strawione
próbki
inaktywowano
poprzez
inkubację w 100 ºC przez 30 minut. Zawiesiny bakteryjne
inkubowano w obecności trzech hydrolizatów gliadyn (A,
B
i
C)
przez
6
godzin,
w
37
ºC,
w
warunkach
48
anaerobowych.
Zmiany
oznaczano
zastosowaniem
z
żywotności
podczas
komercyjnie
inkubacji
dostępnego
zestawu LIVE/DEAD BacLight (Molecular Probes, Leiden,
Holandia)
do
mikroskopii
instrukcjami
producenta.
(zielone)
martwych
i
postępując
Zliczanie
(czerwone)
zgodnie
bakterii
z
żywych
przeprowadzano
pod
mikroskopem epifluorescencyjnym BX 51 Olympus (Tokio,
Japonia).
We
wszystkich
przypadkach
po
inkubacji
wykrywano minimalne straty żywotności bakterii (0,0 11,5%).
Po
okresie
inkubacji
wirowano
je
w
celu
wyeliminowania nierozpuszczalnych komórek i białek a
supernatanty estryfikowano poprzez filtrację (wielkość
porów
0,22
µm,
wyeliminowania
Millipore,
możliwej
Bedford,
obecności
MA)
w
żywotnych
celu
komórek.
Zdolność szczepów do transportowania i wykorzystania
różnych hydrolizatów gliadyn oznaczano poprzez ocenę
znikania
prążków
w
konwencjonalnych
15%
żelach
poliakrylamidowych i w żelach Tris-Tricine (Gotowe żele
z
gradientem
Bio-Rad,
liniowym
Barcelona,
peptydów.
Białka
zastosowaniem
10-20%,
4%
Hiszpania)
wizualizowano
Coomassie
żel
w
wprowadzający,
celu
rozdzielenia
poprzez
Brilliant
barwienie
Blue
z
R-250.
Zmniejszenie toksycznych epitopów na skutek transportu
i
trawienia
wyselekcjonowanych
kanapkowego
gliadyn
bakterii
oznaczenia
Biotecnologia, Madryd).
ELISA
poprzez
oceniano
R5
z
(Centro
działanie
zastosowaniem
Nacional
de
49
Tabela 2. Aktywność peptydaz ze szczepów bifidobakterii
i pałeczek kwasu mlekowego pochodzenia jelitowego
względem substratów syntetycznych.
Szczepy
Aktywność swoista (U/mg białka)*
SucVal-
Pro-
Leu-
Pro-
Leu-
Ala-
Pro
Gly
Gly-Gly
pNA
pNA
PropNA
1
ES1
2
3
A2
15707
4
LmV1
GlyPropNA
18,1 ±
15,7
132,3 ±
480,2
80,0 ±
8,5 ±
17,1 ±
3,5
± 3,8
7,2
± 91,7
8,9
1,9
0,0
326,1
140,5
176,5
18,5 ±
60,43
± 15,9
± 6,4
± 3,5
4,8
± 11,0
-
-
5,1 ±
0,02 ±
0,2 ±
0,5
0,6
0,5
27,1 ±
14, 0
27,1
±
07,5
27,4 ±
37,9
2,0
± 0,8
9,34 ±
10,3
54,6 ±
7,8 ±
61,8 ±
8,0 ±
15,2 ±
0,7
± 0,6
2,7
3,7
3, 4
3,5
3,2
*Pożywki
±
SD.
-, nie oznaczano
1
Szczep według wynalazku (IATA-ES1),
2
Bifidobacterium
IATA-A2,
3
Bifidobacterum longum ATCC 15707,
reuteri LM1V.
4
Lactobacillus
50
PRZYKŁAD
3.
REGULACJA
WYWOŁANEJ
PRZEZ
IMMUNOKOMPETENTNYCH
ODPOWIEDZI
IMMUNOLOGICZNEJ
GLIADYNY
ZA
POMOCĄ
W
ICH
KOMÓRKACH
KO-INKUBACJI
ZE
SZCZEPAMI Z RODZAJU Bifidobacterium WYSELEKCJONOWANYMI
ZGODNIE Z ICH WŁAŚCIWOŚCIAMI IMMUNOMODULUJĄCYMI.
[0075]
Zawiesiny
CFU/ml),
jak
porównawczych,
wyselekcjonowanego
również
innych
inkubowano
z
(106-109
szczepu
zawartych
różnymi
dla
celów
hydrolizatami
gliadyn (P, P+T and P+T+P), otrzymanymi jak opisano w
Przykładzie 3, i PBMC w stężeniu wynoszącym 106 cfc/ml
przez 24 h. Jako kontrolę zastosowano bodźce w postaci
różnych hydrolizatów gliadyn bez bakterii i LPS z E.
coli
O111:B4.
cytokin
bez
izolowania
Wykrywano
także
dodawania
żadnego
PBMC,
stymulowania
wyjściowe
i
wytwarzanie
bodźca.
Procedurę
wykrywania
cytokin
opisano w Przykładzie 1.
Tabela 3. Wytwarzanie cytokin przez PBMC stymulowane
przez gliadyny trawione w warunkach żołądkowojelitowych oraz w obecności nieżywotnych hodowli
bifidobakterii i innych bakterii kwasu mlekowego
pochodzenia jelitowego.
Bodziec
Wytwarzanie cytokin (pm/ml)
IL-1
IL-8
IFN-γ
IL-10
IL-15
RPMI
ND
173 ± 17
9 ± 1
58 ± 3
ND
LPS
ND
399 ± 8
175 ±
2295 ± 83 12 ± 0,5
17
G-P
61 ± 2
4570 ± 484
42 ± 7
299 ± 149 34 ± 1
51
Bodziec
Wytwarzanie cytokin (pm/ml)
IL-1
G-P+T
IL-8
169 ± 22 5375 ± 13
IFN-γ
IL-10
IL-15
37 ± 3
136 ± 16
149 ±
83
G-P+T+X
1
ES1/G-P
75 ± 1
5264 ± 122
123 ± 8
4921
±
36 ± 9
272 ± 18
25 ± 7
11 ± 1
1192 ±
10 ± 7
129
ES1/G-P+T
48 ± 4
ES1/GP+T+X
ND
752
4928 ± 288 8,2 ± 5 935 ± 426 27 ± 10
5151 ± 146 2 ± 0,5
1054 ±
ND
477
109 ±
2
A2/G-P
215
A2/G-P+T
129 ± 4
4480 ± 23
6,9 ± 2 395 ± 216 29 ± 8
2848 ± 45
43 ± 22
1002 ±
46 ± 13
615
A2/G-P+T+X
3
129 ± 1
LM1V/G-P
5099 ± 30
29 ± 4
1314 ±
134 ±
724
57
33 ± 4
ND
5152 ± 119 62 ± 31
721 ± 16
LM1 V/G-P+T
ND
5015 ± 75
11 ± 5
458 ± 218 26 ± 4
LM1 V/G-
ND
5189 ± 98
- 82 ±
457 ± 257
P+T+X
ND, nie wykryto
1
Szczep według wynalazku (IATA-ES1)
2
Bifidobacterium IATA-A2
3
Lactobacillus reuteri LM1V
35
6 ± 1
52
PRZYKŁAD 4. ZDOLNOŚĆ WYSELEKCJONOWANYCH BIFIDOBAKTERII
DO
HAMOWANIA
WZROSTU
IZOLATÓW
MIRKOBIOTY
JELITOWEJ
PACJENTÓW Z CHOROBĄ TRZEWNĄ O POTENCJALNE PATOGENNYM.
[0076]
Aktywność
rodzaju
Bifidobacterium
zgodnie
z
ich
przeciwdrobnoustrojowa
wyselekcjonowanych
właściwościami
przeprowadzeniu
szczepów
procedury
uprzednio
immunomodulującymi
opisanej
w
z
Przykładzie
po
1
oznaczano z zastosowaniem dwóch sposobów: (i) techniki
dwuwarstwowej i (ii) techniki dyfuzji w agarze.
[0077]
Aktywność
oceniano
przeciwbakteryjną
globalnie
z
każdego
szczepu
zastosowaniem
techniki
dwuwarstwowej stosując jako drobnoustroje wskaźnikowe
bakterie wyizolowane z mikrobioty jelitowej pacjentów z
chorobą
trzewną
Bifidobakterie
i
o
hodowano
potencjale
na
płytkach
patogennym.
MRS-C
w
liniach
około 2 cm i inkubowano w optymalnych warunkach przez
16
h
a
ich
chloroformu.
stężeniu
dalszy
rozwój
Drobnoustrój
wynoszącym
hamowano
wskaźnikowy
104-105
z
użyciem
inokulowano
CFU/ml
do
10
w
ml
odpowiedniego agaru pół-stałego, wylewano na warstwę
agaru drobnoustroju ochronnego i inkubowano w 37 ºC w
warunkach
hamowania
anaerobowych.
(halo)
Po
24
wokół
h
mierzono
linii
strefy
hodowlanych
bifidobakterii.
[0078]
powodu
W celu oceny aktywności przeciwbakteryjnej z
wydzielania
związków
o
charakterze
białkowym
zastosowano technikę dyfuzji w agarze. 10 ml pożywki
wzrostowej
MRS-C
inokulowano
w
stężeniu
1%
z
24
h
hodowlą każdej bifidobakterii i inkubowano przez 16 h w
37ºC. Supernatanty otrzymano przez wirowanie (12000 g,
53
15
min,
4ºC)
i
zatężano
przez
liofilizację.
Liofilizowane próbki zawieszano ponownie w 1 ml 50 mM
buforu fosforanowego o pH 6,5, neutralizowano za pomocą
NaOH aż do osiągnięcia pH 6,5 w celu wyeliminowania
wpływów
kwasów
organicznych
wytwarzanych
przez
fermentację i sterylizowano przez filtrację. Próbki te
stanowiły nieoczyszczone ekstrakty, w których oznaczano
możliwą
aktywność
wytwarzanych
białek
przez
przeciwbakteryjnych
bifidobakterie.
Drobnoustrój
wskaźnikowy inokulowano w stężeniu wynoszącym 104-105
komórek/ml do 10 ml odpowiedniego agaru półstałego i
wylewano na warstwę stałego agaru z tą samą pożywką. Po
zestaleniu utworzono przez perforację 5 mm studzienki,
do
których
dodano
zneutralizowanego
40
ekstraktu
µl
z
bezkomórkowego
każdej
i
bifidobakterii.
Pozwolono na zachodzenie dyfuzji przez 4 h w 4ºC i
następnie
inkubowano
drobnoustroju
w
optymalnych
wskaźnikowego
lub
warunkach
dla
patogennego.
Po
inkubacji Po inkubacji mierzono strefy hamowania (halo)
wokół każdej studzienki.
Tabela 4. Hamowanie potencjalnie patogennych bakterii
wyizolowanych od pacjentów z chorobą trzewną przez
hodowle bifidobakterii.
Szczepy
Hamowanie (cm) przez szczepy
Bifidobacterium
IATA-A2
IATA-ES1
Bacteroides CAQ4
0,4
1,4
Bacteroides
0,5
1,3
54
Szczepy
Hamowanie (cm) przez szczepy
Bifidobacterium
IATA-A2
IATA-ES1
vulgatus
Clostridium
0,9
1,6
E. coli CBE9
1,1
1,9
BC-BP1
0,5
1,2
BC-B01
0,7
1,0
BC-BU1
2,3
2,0
BC-BU3
1,0
1,3
difficile
Tabela 5. Hamowanie potencjalnie patogennych bakterii
wyizolowanych od pacjentów z chorobą trzewną przez
supernatanty hodowli bifidobakterii.
Szczep wskaźnikowy Hamowanie (cm) przez Bifidobacterium spp.
IATA-A2
IATA-ES1
Bac CAQ4
0,40
0,45
Ent CBE9
0,95
1,15
PRZYKŁAD 5. OCENA ODPORNOŚCI BIFIDOBAKTERII NA WARUNKI
STRESU ŻOŁĄDKOWO-JELITOWEGO
[0079]
Odporność
warunki
kwasowe
pierwszą
soków
barierę
probiotyków
odzyskanych
po
wyizolowanych
żołądkowych,
biologiczną
spożyciu,
szczepów.
bifidobakterii
ograniczającą
potwierdzano
Aby
które
to
dla
zrobić
na
stanowią
żywotność
każdego
z
wytworzono
55
zawiesiny komórkowe każdego szczepu (108 komórek/ml) w
PBS, zawierające 3 g/l pepsyny (Sigma, St. Louis, MO) i
doprowadzono do pH 2 za pomocą HCl i inkubowano w 37 ºC
przez w sumie 120 min. W różnych punktach czasu (0, 90
i
120
min),
obejmujących
średni
czas
opróżniania
żołądka (90 min), pobierano porcje w celu określenia
żywotności poprzez zliczenia na płytkach agarowych MRSC. Następnie badano tolerancję szczepów odpornych na
kwaśne pH na inne warunki stresowe, takie jak żółć,
NaCl
i
wysokie
temperatury.
Aby
poznać
tolerancję
badanych szczepów wobec tolerancji na żółć oceniano ich
zdolność
do
wzrostu
w
MRS-C,
do
której
dodawano
w
różnych stężeniach (0,5 – 1,5 %) Ox-gall (Sigma, St.
Louis,
MO).
Porcje
po
200
µl
każdej
pożywki,
inokulowane w stężeniu wynoszącym 1% z 24 h hodowlami,
nakładano na płytki wielostudzienkowe i inkubowano w
37
ºC.
Wzrost
absorbancji
monitorowano
przy
655
nm
z
zastosowaniem
w
spektrofotometrze
Microplate Reader BioRad, Hercules, CA).
pomiarów
550
56
Tabela 6. Wpływ warunków żołądkowych na zdolność
wzrostu i żywotność szczepów Bifidobacterium
Żywotność*
Zdolność wzrostu †
(%)
pH
pH
Szczepy
3
IATA-
99,4
ES1
±4,2
2,5
3
2
86,2 57,9
±
±
13,0
2,3
89,4 73,1 61,6
BIR 324
±
±
±
2,3
1,0
1,7
98,4 78,4 11,6
Bion 3
NCIMB
8809
±
±
±
1,9
1,7
3,7
-
-
1,8
±
0,5
Kontrola
9,3 ±
0,0
9,1 ±
0,0
9,0 ±
0,0
8,1 ±
0,0
2,5
Log
cfu (%)
/ml
9,3
±
0,0
8,8
±
0,0
7,3
±
0,0
-
99,
7
96,
9
81,
Log
cfu/ml
2
(%)
8,1 ± 86,
0,0
7
Log
cfu/ml
5,2 ±
0,0
8,8 ± 96, 5,79 ±
0,2
8
4,8 ± 52,
2
0,1
8
-
-
-
0,1
(%)
56,1
63,6
-
-
-
-
*Żywotność wyrażona jako odsetek wykrywanej żywotności z użyciem
systemu LIVE/DEAD BacLight Kit (Molecular Probes) w zawiesinach
komórkowych w PBS w pH 7,2, którą uważano za 100 %.
†Zdolność wzrostu wyrażona w Log cfu/ml określonym przez
zliczanie na płytkach agarowych MRSC i wyrażonym jako odsetek
ponownego zliczania zawiesiny komórkowej w PBS, który uważano za
100 %.
*,†Odchylenia standardowe średniej wyników otrzymanych w trzech
niezależnych testach nd, nie określano
-, nie wykrywano
57
Tabela 7. Tolerancja szczepów Bifidobacterium na
obecność soli żółciowych
Szczepy
Względna zdolność wzrostu *(%)
Stężenie oxgall (%)
Kontrola
0,5
1,0
2,0
3,0
100
88,22 ±
82,65 ±
69,95 ±
67,28 ±
0,70
1,60
0,33
1,31
73,03 ±
64,12 ±
60,96 ±
38,21 ±
0,98
1,79
0,59
1,44
62,68 ±
43,99 ±
38,29 ±
37,06 ±
3,55
1,64
0,32
0,48
45,07 ±
23,88 ±
3,94 ±
0,70 ±
8,20
7,56
1,05
1,00
30,17 ±
23,30 ±
-
-
3,2
0,0
IATA-ES1
A2
100
BIR 324
100
NCIMB
100
8809
Bion 3
100
*Dane wyrażone jako odsetek szybkości wzrostu (h-1)
otrzymanej w nieobecności żółci, którą uważano za 100
%. Odchylenia standardowe średniej wyników otrzymanych
w trzech niezależnych doświadczeniach.
PRZYKŁAD 6. IZOLACJA i IDENTYFIKACJA WYSELEKCJONOWANYCH
BIFIDOBAKTERII
[0080]
kału
Szczepy z rodzaju Bifidobacterium wyizolowano z
zdrowych
spożywały
dzieci
karmionych
produktów
piersią,
spożywczych
które
nie
zawierających
bifidobakterie przez co najmniej jeden miesiąc przed
analizą
i
u
których
nie
stosowano
żadnego
leczenia
obejmującego antybiotyki. Próbki przechowywano w 4º C i
58
analizowano
momentu
w
czasie
ich
krótszym
zebrania.
niż
Dwa
dwie
gramy
godziny
każdej
od
próbki
rozcieńczano w 10 mM buforze fosforanowym zawierającym
130
mM
stężenie
NaCl
(PBS)
i
homogenizowano
w
homogenizatorze typu stomacher Lab-Blender 400 (Seward
Medical,
Londyn,
rozcieńczano
w
UK)
wodzie
przez
3
min,
peptonowej.
a
Porcje
następnie
po
0,1
ml
różnych rozcieńczeń dziesiętnych inokulowano do agaru
MRS
(z
Man
Rogosa
zawierającego
MRS-C),
i
and
0,05%
80
Sharpe;
cysteiny
µg/ml
Scharlau,
(Sigma,
mupirocyny.
St.
Po
Barcelona)
Louis,
MO;
48-godzinnej
inkubacji w 37 ºC w warunkach anaerobowych (AnaeroGen,
Oxoid,
UK)
potwierdzano
wyizolowane
ich
kolonie
tożsamość
za
selekcjonowano
pomocą
badania
i
ich
morfologii z zastosowaniem barwienia Grama. Tożsamość
izolatów potwierdzano z zastosowaniem PCR swoistej dla
rodzaju, zgodnie z metodologią opisaną przez Kaufman i
wsp.
(1997,
Identification
and
quantification
of
Bifidobacterium species isolated from food with genusspecific
16S
rRNA-targeted
probes
by
colony
hybridization and PCR. Appl. Environ. Microbiol. 63:
1268-1273), z zastosowaniem starterów (LM26 and LM3),
które amplifikują 1,35 kb fragment genu rybosomowego
16S
RNA.
Ponadto,
całkowitego
gen
DNA.
16S
rRNA
sekwencjonowano
Zsekwencjonowany
z
fragment
amplifikowano z zastosowaniem starterów 27f i 1401r i
oczyszczano
systemu
z
zastosowaniem
GFX™PCR
(Amershan,
komercyjnie
Bioscience,
dostępnego
UK).
Do
sekwencjonowania zastosowano również startery 530f i U968f
zgodnie
z
procedurami
opisanymi
przez
innych
autorów (Jonson, 1994. Similarity analysis of rRNAs. In
59
Methods
for
General
and
Molecular
Bacteriology;
Gerhard, P.; Murray, R. G.E.; Wood, W.A.; Krieg, N.R.,
Eds. American Society for Microbiology, Washington, DC.
Pp
683-700;
Satokari
i
wsp.,
2001.
Bifidobacterial
Diversity in Human Feces Detected by Genus-Specific PCR
and Denaturating Gradient Gel Electrophoresis. Appl.
Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier i wsp. 2002.
Molecular
Monitoring
Communities
in
of
Human
Succession
Neonates.
of
Bacterial
Appl.
Environ.
Microbiol. 68, 219-22). Sekwencjonowanie przeprowadzono
z zastosowaniem automatycznego sekwenatora DNA ABI 3700
(Applied
Biosystem,
najbliżej
Foster
spokrewnionych
City,
sekwencji
CA).
Poszukiwanie
przeprowadzono
w
bazie danych GenBank z zastosowaniem algorytmu BLAST
(Altschul i wsp., 1990. Basic local alignment search
tool. J. Mol Biol. 215, 403-410).
PRZYKŁAD
7.
OCENA
ZDOLNOŚCI
SZCZEPÓW
Z
RODZAJU
BIFIDOBACTERIUM DO REGULOWANIA ODPOWIEDZI PROZAPALNYCH
WYWOŁYWANYCH
PRZEZ
ZMIENIONĄ
MIKROBIOTĘ
JELITOWĄ
OSOBNIKÓW Z CHOROBĄ TRZEWNĄ Z AKTYWNĄ CHOROBĄ
i PO
LECZENIU DIETĄ BEZGLUTENOWĄ.
1.
Otrzymywanie
hodowli
bifidobakterii
jelitowych
i
próbek kału do oceny.
[0081]
Szczepy z rodzaju Bifidobacterium inokulowano
do 10 ml pożywki wzrostowej MRS (Scharlau Chemie S.A.,
Barcelona, Hiszpania) zawierającej około 0,05% cysteiny
(MRS-C) w stężeniu 1% z hodowlą 24 h i inkubowano przez
22 h w 37ºC w warunkach anaerobowych (AnaeroGen; Oxoid,
Basingstoke,
UK).
Komórki
zebrano
przez
wirowanie
60
(6000 g, 15 min), przepłukano dwukrotnie w PBS (10 mM
fosforan
sodu,
130
mM
chlorek
sodu,
pH
7,4),
i
zawieszano ponownie w PBS zawierającym 20% glicerol.
Porcje tych zawiesin zamrażano z zastosowaniem ciekłego
azotu
i
komórek
przechowywano
po
cyklu
w
–
80
zamrażania
ºC.
–
Liczbę
żywotnych
rozmrażania
oznaczano
poprzez ponowne zliczanie na płytkach MRSC po inkubacji
przez
48
h.
wszystkich
Żywotność
ta
przypadkach.
była
Każdą
wyższa
porcję
niż
90%
we
stosowano
do
jednego testu.
[0082]
Kał od pacjentów z chorobą trzewną w fazie
aktywnej
(w
momencie
rozpoznania)
i
leczonych
dietą
bezglutenową przez co najmniej 2 lata rozcieńczano 1/10
w
buforze
fosforanowym,
homogenizatorze
zamrażano
w
typu
-20ºC
jednojądrzastych
homogenizowano
stomacher
do
przez
zastosowania
komórkach
krwi
3-5
jako
w
minut
i
bodziec
w
obwodowej
(PBMC).
Pobrano także próbki kału od zdrowych osobników jako
kontrole.
2. Izolacja i stymulacja PBMC
[0083]
PBMC z krwi obwodowej 4 zdrowych ochotników
(średni wiek 30 lat, zakres 24 – 40 lat) izolowano w
probówkach
przez
z
heparyną.
wirowanie
Biosciences,
pożywce
w
Izolację
gradiencie
Piscataway,
RPMI
1640
PBMC
NJ).
Ficolu
Komórki
(Cambrex,
przeprowadzano
New
(Amersham
przepłukano
York,
USA)
w
i
doprowadzano do gęstości 1 x 106 komórek/ml w pożywce
RPMI
1640
bydlęcą
zawierającej
(Gibco,
glutaminy,
100
także
Barcelona,
µg/ml
10
%
płodową
Hiszpania),
streptomycyny
i
surowicę
2
100
mM
LU/ml
61
penicyliny (Sigma). PBMC inkubowano w płaskodennych 24studzienkowych
płytkach
polistyrenowych
(Corning,
Madryd, Hiszpania) w obecności lub nieobecności środków
stymulujących w 37º C, przy 5% CO2, przez 24 h. Jako
bodziec
zastosowano
osobników,
ekstrakty
pacjentów
z
aktywną
z
i
kału
zdrowych
nieaktywną
chorobą
trzewną, w obecności lub nieobecności 30 µl zawiesin
żywych komórek bakteryjnych przy 1 × 106 CFU/ml. Jako
kontrolę
dodatnią
stosowano
oczyszczony
lipopolisacharyd (LPS) z E. coli O111:B4 (Sigma, St.
Louis, MO) w stężeniu wynoszącym 1 µg/ml. Jako kontrolę
ujemną testowano wytwarzanie cytokin w niestymulowanych
PBMC. Każdy typ bodźca testowano w dwóch powtórzeniach
w każdym doświadczeniu. Supernatanty hodowli zebrano
przez
wirowanie,
frakcjonowano
i
przechowywano
w
porcjach w -20 ºC do czasu wykrywania cytokin.
3. Oznaczanie cytokin i markerów aktywacji komórkowej
[0084]
Stężenie
cytokin
(IFN-γ,
IL-10,
i
TGF-β)
w
supernatantach mierzono z zastosowaniem zestawów ELISA
z Bioscience (BD Biosciences, San Diego, CA) postępując
zgodnie
z
instrukcjami
populacji
limfocytów
zastosowaniem
znakowanych
producenta.
i
przeciwciał
FITC
Markery
aktywacji
przeciwko
(eBioscience,
wykrywano
CD4,
San
różnych
CD8
Diego,
i
z
CD86
CA)
i
cytometrii przepływowej (Flow cytometer EPICS® XL-MCL;
Beckman
Coulter,
Florida).
Oddziaływanie
szlaku
przekazywania sygnałów zależnego od czynnika jądrowego
(NF) κB na odpowiedź immunologiczną oznaczano poprzez
dodanie jego inhibitora (laktacystyna).
62
Wyniki
[0085]
Kał od pacjentów z chorobą trzewną, w którym
występowały
zmiany
składu
mikrobioty,
indukował
wytwarzanie cytokin prozapalnych (TNF-α i IFN-γ) wyższe
niż
u
zdrowych
osobników
oraz
wytwarzanie
cytokiny
przeciwzapalnej IL-10 niższe niż u zdrowych osobników w
PBMC.
Zwiększał
on
także
syntezę
cząsteczki
powierzchniowej CD86 niezbędnej do aktywacji komórek T
bardziej
niż
kontrolne
próbki
kału.
Ko-inkubacja
z
bifidobakteriami reguluje profil cytokin prozapalnych
indukowany przez mikrobiotę kałową pacjentów z chorobą
trzewną,
zmniejszając
syntezę
TNF-α
i
IFN-γ
a
zwiększając syntezę IL-10. Hamowanie syntezy cytokin w
obecności laktacystyny sugeruje, że NF κB zaangażowany
jest
we
wpływy
immunomodulujące
wykazywane
przez
bifidobakterie.
PRZYKŁAD
8:
WYTWARZANYCH
CHARAKTERYSTYKA
FRAKCJI
W
PROCESIE
TRAWIENIA
IN
CHARAKTERYSTYKA
PEPTYDÓW
POCHODZĄCYCH
GLIADYN
VITRO
Z
ORAZ
TRAWIENIA
ŻOŁĄDKOWO-JELITOWEGO GLIADYN PRZEZ BIFIDOBAKTERIE I ICH
WPŁYWY BIOLOGICZNE
1. Trawienie żołądkowo-jelitowe gliadyn
[0086]
Stosowano komercyjnie dostępny preparat gliadyn
(Sigma,
G3375),
białek,
α-/β-,
który
γ-
i
zawiera
ω-
cztery
gliadyny,
izoformy
których
tych
kompletna
sekwencja aminokwasowa jest dostępna.
[0087]
Roztwór
różnych
porcji
(150
mg)
komercyjnie
dostępnego ekstraktu gliadyn otrzymano w izotonicznym
roztworze soli fizjologicznej (140 mM NaCl, 5 mM KCI) o
63
pH 3, ogrzewając mieszaniny do 55 ºC przez 30 minut w
łaźni
z
mieszaniem.
stymulowanego
Próbki
trawienia
poddano
procesowi
żołądkowo-jelitowego
z
zastosowaniem pepsyny (Sigma, P7000) (800-2500 Ul/mg
białka)
i
świńskiej
pankreatyny
(P1750)
(aktywność,
4×USP) oraz ekstraktu żółciowego (B3883).
[0088]
3/1h,
Trawienie
żołądkowe
mieszanie)
wirowania
(50
(pepsyna
przeprowadzono
ml).
Następnie,
w
w
0,1M
HCl/pH
probówkach
przeprowadzono
do
etap
jelitowy (pankreatyna-żółć w 0,1 M NaHC03/pH 6,9-7/2 h,
mieszanie)
w
górnym
przedziale
(dawca)
(1,5
ml)
dwukamerowego systemu utworzonego z błoną dializacyjną
(Spectra/Por
2.1,
Spectrum
Medical,
Gardena,
CA)
o
wielkości porów wynoszącej 15 KDa. W dolnym przedziale
(biorca)
(1
umieszczono
ml).
Po
całkowitą
min/4
próbce
zakończeniu
ilość
ºC)
roztwór
białka
próbki
procesu
w
z
fizjologicznej
trawienia
supernatancie
trawionej
dializowanej
soli
oceniano
(4000
rpm/5
żółądkowo-jelitowo
zastosowaniem
i
w
komercyjnie
dostępnego zestawu (Sigma, TP0200) opartego na metodzie
Lowry’ego.
2.
Analiza
chromatograficzna
frakcji
gliadyn
po
gliadyn
zaadaptowano
procesie trawienia in vitro.
[0089]
W
celu
zanalizowania
metodę chromatografii z odwróconymi fazami. Rozdział
przeprowadzono na kolumnie BioBasic C18 (5 µm 4,6 x 250
mm) z zastosowaniem osprzętu Hewlett Packard 1050 HPLC.
Stosowane
fazy
acetonitrylu
(obj./obj.)
ruchome
(ACN,
z
składały
jakość
kwasem
do
się
HPLC)
z
w
trifluorooctowym
(A)
wodnego
stężeniu
(TFA)
0,1
15%
%
64
(obj./obj.),
i
(obj./obj.)
następujący
gradient
(B)
z
TFA
0,1%
gradient
aż
do
5%
wodnego
ACN
w
stężeniu
(obj./obj.).
elucyjny:
0
-
rozpuszczalnika
5
Zastosowano
min.,
B;
80%
5
-
liniowy
12 min.,
liniowy gradient aż do 20% rozpuszczalnika B. Kolumnę
przepłukiwano dwukrotnie 100% rozpuszczalnika B przez 5
minut, i równoważono ponownie z zastosowaniem warunków
wstępnych przez 3 minuty. Próbki filtrowano przez błonę
nylonową
(13
Analizowano
mm,
trzy
0,22
µm
Millex
niezależne
GN,
Millipore).
porcje
z
każdego
traktowania (100 µl). Absorpcję w zakresie ultrafioletu
monitorowano przy 210 nm.
3.
Identyfikacja
zastosowaniem
sekwencji
peptydowych
chromatografii
z
gliadyn
odwróconymi
z
fazami
sprzężonej z elektrosprejem-MsMs (RP-HPLC-ESI-MS/MS).
[0090]
kolumnie
Rozdział
chromatograficzny
BioBasic
C18
(5
µm
zastosowaniem
wyposażenia
sprzężonego
spektrometrem
pułapką
ze
jonową
przeprowadzono
4,6
x
systemu
mm)
Agilent
masowym
(Esquire-LC-Ms(n),
250
z
na
z
HPLC
kwadrupolową
Bruker
Daltonics,
Billerica, MA). Zastosowany gradient elucyjny był taki
jak
opisano
w
poprzedniej
sekcji.
W
analizie
tej
zastosowano azot jako gaz nebulizatorowy i suszący, a
hel jako gaz do kolizji cząsteczkowych przy ciśnieniu w
przybliżeniu
wynoszącym
5
x
10-3
bar.
Utrzymywano
napięcie kapilary kolizji wynoszące 4 kV. Widma masowe
monitorowano w zakresie masy/ładunku wynoszącym 500 5000. Metoda ta pokazuje analizę masy średniej z (Ms)
15 widm, i analizę sekwencyjną mas Ms(n) z 5 widm.
Limit prądu jonowego do przeprowadzania sekwencyjnej
65
analizy mas ustalono jako 5000, a jony prekursorowe
izolowano w zakresie m/z wynoszącym 4,0 fragmentowanym
z napięciem piłokształtnym wynoszącym 0,39 do 2,6 V.
Dane
widmowe
m/z
obrabiano
i
przekształcano
z
zastosowaniem oprogramowania do analizy dostarczonego
przez
wytwórcę
(Data
Analysis
wersja
3,
Bruker
Daltonics). Sekwencje peptydowe widm Ms(n) ustalono z
zastosowanie oprogramowania do analizy (BioTools wersja
2.1 (Bruker Daltonics).
4. Wpływy ko-inkubacji gliadyn trawionoch żołądkowojelitowo z bifidobakteriami.
[0091] Jako model nabłonka jelitowego stosowano próbki
trawionych
sekcji
1
żołądkowo-jelitowo
ko-inkubowane
bifidobakterii
w
jelitowych,
gliadyn
obecności
takich
otrzymane
i
jak
w
nieobecności
szczep
według
wynalazku, umieszczonych w części szczytowej (dawcy)
hodowli w komorze typu transwell komórek Caco-2. W celu
oznaczenia zmniejszania toksycznego wpływu gliadyn w
obecności szczepu według wynalazku (IATA-ES1) mierzono
syntezę
cytokiny
prozapalnej
TNF-α
i
NFκB
z
zastosowaniem metod ELISA w hodowli komórek Caco-2 w
dolnej
komorze
(biorcy)
w
obecności
i
nieobecności
bifidobakterii (Figury 3 i 4).
Wyniki
[0092]
Analiza RP-HPLC frakcji białek mniejszych niż
15 KDa pochodzącej z dializy próbek gliadyn trawionych
żołądkowo-jelitowo. Rozdział chromatograficzny (Figura
2) pokazuje obecność pięciu frakcji peptydów, przy czym
główną frakcją jest frakcja nr 2. Badania możliwości
66
dializowania
obecności
peptydów
różnych
pochodzących
szczepów
z
gliadyn
bakteryjnych
(to
w
znaczy
szczepu według wynalazku (IATA-ES1) i Bifidobacterium
A2,
wyizolowanych
w
naszym
laboratorium
wykazały
zdolność tych bakterii do proteolizy gliadyn i swoiście
frakcji
nr
2.
Szczepem,
który
wywoływał
największe
zmniejszenie frakcji nr 2 był szczep według wynalazku
(IATA-ES1),
który
zmniejszał
ponad
10%
frakcję
w
warunkach badania.
PRZYKŁAD
9.
OCENA
ZDOLNOŚCI
SZCZEPÓW
Z
RODZAJU
BIFIDOBACTERIUM DO REGULOWANIA INDUKOWANEGO GLIADYNAMI
DOJRZEWANIA
i
FENOTYPU
PRO-ZAPALNEGO
W
KOMÓRKACH
DENDRYTYCZNYCH ZAANGAŻOWANYCH W PREZENTACJĘ ANTYGENU.
1. Otrzymywanie próbek bifidobakterii jelitowych i kału
do oceny.
[0093]
Szczepy z rodzaju Bifidobacterium inokulowano
do 10 ml pożywki wzrostowej MRS (Scharlau Chemie S.A.,
Barcelona, Hiszpania) zawierającej 0,05% cysteiny (MRSC) w stężeniu 1% z hodowlą 24 h i inkubowano przez 22 h
w
37ºC
w
warunkach
anaerobowych
(AnaeroGen;
Oxoid,
Basingstoke, UK). Komórki zebrano przez wirowanie (6000
g,
15
min),
fosforanu
przepłukano
sodu,
130
mM
dwukrotnie
chlorku
w
sodu,
PBS
pH
(10
7,4),
mM
i
zawieszano ponownie w PBS zawierającym 20% glicerol.
Porcje tych zawiesin zamrażano z zastosowaniem ciekłego
azotu
i
komórek
przechowywano
po
cyklu
w
–
zamrażania
80
–
ºC.
Liczbę
żywotnych
rozmrażania
oznaczano
przez zliczanie na płytkach agarowych MRSC po inkubacji
przez
48
h.
Żywotność
była
większa
niż
90%
we
67
wszystkich
przypadkach.
Każdą
porcję
stosowano
do
jednego testu. Przed zastosowaniem komórek jako bodźca
przepłukano jest przez wirowanie i zawieszano ponownie
w PBS.
2. Izolacja i stymulacja komórek dendrytycznych (DC)
otrzymanych z krwi obwodowej.
[0094]
PBMC
ochotników
izolowano
(średni
z
wiek
krwi
30
obwodowej
lat,
zakres
4
24
zdrowych
-
40)
w
probówkach z heparyną. PBMC izolowano przez wirowanie w
gradiencie
Ficolu
(Amersham
Biosciences,
Piscataway,
NJ). Komórki przepłukano pożywką RPMI 1640 (Cambrex,
New York, USA) i doprowadzono do gęstości wynoszącej 1
x
10
6
również
komórek/ml
10
Barcelona,
%
w
pożywce
płodową
Hiszpania),
streptomycyny
i
100
RPMI
1640
surowicę
2
mM
U/ml
zawierającej
bydlęcą
L-glutaminy,
penicyliny
(Gibco,
100
µg/ml
(Sigma).
PBMC
inkubowano w płaskodennych, 24-studzienkowych płytkach
polistyrenowych
(Corning,
Madryd,
Hiszpania)
w
obecności lub nieobecności środków stymulujących w 37º
C, przy 5% CO2, przez 24 h. Jako bodziec zastosowano
gliadynę (0,1 mg/ml) i IFN-γ (150 UI) w obecności i
nieobecności
jelitowych.
oczyszczony
bifidobakterii
Jako
i
kontrolę
polisacharyd
innych
dodatnią
(LPS)
z
bakterii
zastosowano
E.
coli
O111:B4
(Sigma, St. Louis, MO) w stężeniu wynoszącym 1 µg/ml.
Jako kontrolę ujemną testowano wytwarzanie cytokin w
niestymulowanych
dwóch
PBMC.
powtórzeniach
Supernatanty
hodowli
Każdy
w
typ
bodźca
każdym
zebrano
testowano
w
doświadczeniu.
przez
wirowanie,
68
frakcjonowano i przechowywano w porcjach w – 20 ºC aż
do czasu wykrywania cytokin.
3. Oznaczanie cytokin i markerów aktywacji komórkowej
[0095]
Stężenia
cytokin
(IFN-γ,
IL-10
i
TGF-β)
w
supernatantach mierzono z zastosowaniem zestawów ELISA
z Bioscience (BD Biosciences, San Diego, CA) postępując
zgodnie z instrukcjami producenta. Markery aktywacji
komórkowej
cząsteczek
aktywacji
wykrywano
z
zastosowaniem przeciwciał przeciwko HLA-DR, CD86, CD40
i CD83 znakowanych FITC (eBioscience, San Diego, CA) i
oceniano
ilościowo
przepływowej
z
(Cytometr
zastosowaniem
przepływowy
cytometrii
EPICS®
XL-MCL;
Beckman Coulter, Floryda).
Wyniki
[0096]
co
Szczep według wynalazku (IATA-ES1) zmniejszał o
najmniej
zapalnej,
10%
wytwarzanie
która
wytwarzana
IFN-γ,
jest
głównej
w
cytokiny
odpowiedzi
na
gliadyny u pacjentów z chorobą trzewną, prowokowanych
stymulacją komórek dendrytycznych gliadynami i innymi
potencjalnie
prozapalnymi
bakteriami
jelitowymi
(np.
bakteroidy i bakterie jelitowe wyizolowane od pacjentów
z chorobą trzewną). Szczep ten wywoływał także wzrost
syntezy
cytokiny
anty-zapalnej
IL-10
przez
komórki
dendrytyczne o co najmniej 200% w porównaniu z wpływem
wywoływanym przez stymulację gliadynami. Szczep według
wynalazku
HLA-DR
i
(IATA-ES1)
CD86,
zmniejszał
indukowaną
po
ekspresję
cząsteczek
inkubacji
komórek
69
dendrytycznych w obecności gliadyny i IFN-γ, o pomiędzy
15 a 20%.
Consejo Superior De Investigaciones Científicas\
Pełnomocnik:
Zastrzeżenia patentowe
1. Szczep Bifidobacterium longum zdeponowany w
Hiszpańskiej
Kolekcji
Hodowli
Typowych
(Colección
Española de Cultivos Tipo, (CECT)) pod numerem dostępu
CECT 7347.
2. Szczep
według
zastrzeżenia
1,
w
postaci
zastrzeżenia
1,
w
postaci
żywotnych komórek.
3. Szczep
według
nieżywotnych komórek.
4. Kombinacja
szczep
według
drobnoustrojów,
dowolnego
z
która
zastrzeżeń
1
zawiera
do
3
i
co
najmniej jeden inny drobnoustrój.
5. Kombinacja drobnoustrojów według zastrzeżenia
4, w której innym drobnoustrojem jest B. longum ATCC
15707 i/lub L. lactis NCD0712.
6. Supernatant hodowli lub ekstrakt otrzymany z
drobnoustroju jak zastrzeżono w dowolnym z zastrzeżeń 1
do 3, albo z kombinacji drobnoustrojów jak zastrzeżono
w zastrzeżeniu 4 albo 5.
7. Zastosowanie szczepu B. longum jak zastrzeżono
w
dowolnym
zastrzeżeniu
1
do
3;
albo
kombinacji
70
drobnoustrojów jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 4 albo 5;
albo
supernatantów
zastrzeżeniu
lub
6,
ekstraktów
do
jak
zastrzeżono
wytwarzania
w
preparatów
zaprojektowanych do zmniejszania ryzyka i poprawy stanu
zdrowia pacjentów z chorobami związanymi ze spożyciem
glutenu.
8. Zastosowanie jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 7,
do
wytwarzania
preparatów
zaprojektowanych
do
profilaktyki i/lub leczenia choroby trzewnej.
9. Zastosowanie jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 7
albo 8, w których wytworzonym preparatem jest produkt
spożywczy,
nutraceutyk,
suplement,
kompozycja
farmaceutyczna, probiotyk i/lub synbiotyk.
10. Kompozycja
odżywcza
zawierająca
szczep
B.
longum jak zastrzeżono w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 3,
lub
kombinację
zastrzeżeniu
4
drobnoustrojów
albo
5,
jak
albo
zastrzeżono
supernatantów
w
lub
ekstraktów jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 6.
11. Kompozycja jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 10,
która dodatkowo zawiera nośnik.
12. Kompozycja jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 11,
w
której
fermentowane
zbożowe,
nośnikiem
mleko,
fermentowane
jest
mleko,
jogurt,
produkt
nabiałowy,
produkty
zbożowe,
ser,
produkty
soki,
lody
i/lub preparaty dla dzieci.
13. Kompozycja
zastrzeżeniu
10
do
jak
12,
zastrzeżono
w
której
w
szczep
dowolnym
B.
longum
występuje w ilości od około 106 cfu do około 109 cfu na
gram albo mililitr kompozycji.
14. Kompozycja
jak
zastrzeżono
w
dowolnym
zastrzeżeniu 10 do 13, w której wspomniana kompozycja
71
może
występować
w
postaci
tabletki,
kapsułki,
mikrokapsułki, proszku, roztworu lub pasty.
15. Kompozycja zawierająca szczep B. longum jak
zastrzeżono
kombinacja
w
dowolnym
z
drobnoustrojów
zastrzeżeń
jak
1
do
3;
zastrzeżono
albo
w
zastrzeżeniu 4 albo 5; albo supernatanty albo wyciągi
jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 6, razem z odpowiednimi
ilościami farmakologicznie dopuszczalnych zaróbek.
Consejo Superior De Investigaciones Científicas\
Pełnomocnik:
72
73