docUdział bakteryjnych homologów dioksygenazy AlkB w naprawie
download 
Reklamacja Transkrypt
Udział bakteryjnych homologów dioksygenazy AlkB w naprawie
UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ WYDZIAŁ BIOLOGII I NAUK O ZIEMI Joanna Wrona Kierunek BIOLOGIA Specjalność Biochemia Udział bakteryjnych homologów dioksygenazy AlkB w naprawie egzocyklicznych uszkodzeń zasad DNA (The role bacterial homologues of AlkB dioxygenase in repair of exocyclic DNA bases damage) Promotor: prof. dr hab. Jarosław Kuśmierek Część doświadczalna pracy wykonana pod opieką dr Agnieszki Maciejewskiej w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN LUBLIN 2010 2 Streszczenie Gen alkB jest częścią systemu odpowiedzi adaptacyjnej na środki alkilujące bakterii Escherichia coli. Sam gen znany jest od wielu lat, jednak biochemiczna funkcja białka AlkB została odkryta dopiero w 2002 roku. Białko AlkB to zależna od 2-oksoglutaranu i jonów Fe(II) dioksygenaza, która usuwa grupy metylowe z 3-metylocytozyny i 1-metyloadeniny przez utlenienie ich do formaldehydu i tym samym odtwarza nieuszkodzoną cytozynę i adeninę w DNA. Homologi alkB znaleziono u wielu innych bakterii i organizmów wyższych, także u człowieka. Dodatkowo odkryto, że białka typu AlkB usuwają mostki etenowe z cytozyny i adeniny przez utlenienie ich do glioksalu. Addukty tego typu generowane są w DNA przez metabolity chlorku winylu, znanego kancerogenu przemysłowego, a także endogennie pod wpływem produktów peroksydacji lipidów (LPO). LPO jest procesem związanym ze stresem oksydacyjnym prowadzącym do powstania całej gamy wysoce reaktywnych związków (m. in.: akroleina, aldehyd krotonowy, dialdehyd malonowy, 4-hydroksynonenal) uszkadzających różne komponenty komórki, w tym DNA. Badano rekombinowane homologi białka AlkB z E. coli u następujących bakterii: Streptomyces coelicolor – białka SC-1A i SC-2B oraz Xanthomonas campestris – XC-1B i XC-2B. Białko SC-1A, w przeciwieństwie do SC-2B, XC-1B i XC-2B, wyraźnie naprawia uszkodzenia zasad DNA spowodowane związkami modyfikującymi, takimi jak aldehyd chlorooctowy (CAA) i akroleina (ACR). Przy pomocy opracowanej metody ustalone zostały optymalne warunki aktywności SC-1A w naprawie różnych adduktów w zależności od pH buforu, stężenia -ketoglutaranu i jonów żelaza. Optymalne warunki dla naprawy poszczególnych uszkodzeń przez białko SC-1A były zbliżone do wyników z udziałem EcAlkB, co świadczy o pokrewieństwie (homologii) tychże białek. Jak wynika z przeprowadzonych doświadczeń, białko AlkB jest w stanie naprawiać egzocykliczne addukty zasad, jak nienasycone etenoaddukty: etenoadeninę (εA) i etenocytozynę (εC), hydroksyetanocytozynę także ale (HEC) i nasycone hydroksyalkanopochodne: hydroksypropanocytozynę (HPC). Zatem specyficzność substratowa białek typu AlkB może być szeroka i białka te mogą odgrywać istotną rolę w naprawie różnego typu modyfikacji, również w komórkach ssaków. 3 Pragnę serdecznie podziękować prof. dr hab. Jarosławowi Kuśmierkowi za promotorską opiekę i cenne wskazówki udzielone w czasie pisania niniejszej pracy dr Agnieszce Maciejewskiej za opiekę naukową, teoretyczne i praktyczne zapoznanie mnie z tematem, życzliwość, cierpliwość, wyrozumiałość oraz wsparcie na jakie zawsze mogłam liczyć 4 Praca została zrealizowana w ramach polsko-norweskiego grantu nr PNRF-143-AI-1/07. The AlkB protein and its eukaryotic homologues – the role in DNA repair and the possible role in cancer etiology and target in cancer therapy (Białko AlkB i jego eukariotyczne homologi – rola w naprawie DNA i potencjalny udział w etiologii nowotworów oraz jako cel w terapii przeciwnowotworowej) 5 Spis treści I. Wstęp ........................................................................................................................ 9 I.1. Czynniki uszkadzające DNA ........................................................................... 10 I.1.1. Czynniki fizyczne ..................................................................................... 11 I.1.2. Czynniki biologiczne ................................................................................ 13 I.1.3. Czynniki chemiczne .................................................................................. 14 I.1.4. Chlorek winylu.......................................................................................... 18 I.1.5. Peroksydacja lipidów ................................................................................ 19 I.1.5.1. Egzocykliczne uszkodzenia DNA...................................................... 21 I.2. Sposoby naprawy DNA ................................................................................... 26 I.2.1. AlkB .......................................................................................................... 28 I.2.1.1. Mechanizm działania ......................................................................... 28 I.2.1.2. Struktura przestrzenna AlkB .............................................................. 30 I.2.1.3. Rodzina bakteryjnych białek AlkB .................................................... 31 I.2.1.4. Homologi AlkB .................................................................................. 33 I.2.1.5. Znaczenie badań nad białkami AlkB ................................................. 37 II. Cel pracy ................................................................................................................ 39 III. Materiały i metody ............................................................................................... 40 III.1. Materiały ....................................................................................................... 40 III.1.1. Odczynniki ............................................................................................. 40 III.1.2. Bufory..................................................................................................... 41 III.1.2.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka ...................................... 41 III.1.2.2. Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka ......................................................................... 42 III.1.3. Pentamery ............................................................................................... 42 III.1.4. Enzymy................................................................................................... 42 III.1.5. Antybiotyki............................................................................................. 42 III.1.6. Pożywki .................................................................................................. 43 III.1.7. Aparatura ................................................................................................ 43 III.1.7.1. Aparatura do oczyszczania białek ................................................... 43 III.1.7.2. Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka .................................................................................................. 43 III.1.8. Inne materiały ......................................................................................... 44 III.2. Metody .......................................................................................................... 44 III.2.1. Sporządzanie buforów ............................................................................ 44 III.2.2. Elektroforeza białkowa .......................................................................... 45 III.2.3. Przygotowanie komórek kompetentnych i transformacja bakterii ......... 45 III.2.3.1. Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem pET28a/alkB................................................................................................... 45 III.2.3.2. Ekspresja białka SC-1A w szczepie E. coli BL21 (DE3) ............... 46 III.2.3.3. Dysrupcja komórek ......................................................................... 46 III.2.2. Oczyszczanie białka SC-1A ................................................................... 47 III.2.3. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford ........................................ 47 III.2.4. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka ..... 47 III.2.4.1. Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksyetanocytozynę TT(HEC)TT i TT(εC)TT w reakcji pentameru TTCTT z aldehydem chlorooctowym (CAA) ................................................................................... 47 6 III.2.4.2. Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksypropanocytozynę TT(HPC)TT w reakcji pentameru TTCTT z akroleiną (ACR) ...................... 48 III.2.4.3. Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT w reakcji pentameru TTATT z aldehydem chlorooctowym (CAA) .................. 48 III.2.5. Badanie aktywności białek i wykonanie zależności .............................. 49 III.2.5.1. Zależność od pH .............................................................................. 50 III.2.5.2. Zależność od stężenia jonów Fe(II) ................................................ 51 III.2.5.3. Zależność od stężenia αKG ............................................................. 53 IV. Wyniki ................................................................................................................. 54 IV.1. Oczyszczanie białka SC-1A.......................................................................... 54 IV.2. Modyfikacja pentametrów zwierających cytozynę ....................................... 55 IV.2.1. Uzyskanie pentameru zawierającego hydroksypropanocytozynę ........ 55 IV.2.2. Uzyskanie pentamerów zawierających hydroksyetanocytozynę i etenocytozynę ..................................................................................................... 57 IV.3. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-1A ................ 59 IV.3.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od pH reakcji........................ 61 IV.3.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II) w reakcji ................................................................................................................. 63 IV.3.3. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia αKG w reakcji ... 67 IV.4. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-2B ................ 68 IV.4.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od pH reakcji........................ 69 IV.4.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II) w reakcji ................................................................................................................. 71 IV.5. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białka XC-1B i XC-2B . 71 V. Wnioski ................................................................................................................. 73 VI. Dyskusja............................................................................................................... 74 Literatura .................................................................................................................... 84 7 Spis używanych skrótów dR – deoksyryboza VC (ang. vinyl chloride) – chlorek winylu CEO (ang. chloroethylene oxide) – tlenek chloroetylenu CAA (ang. chloroacetaldehyde) – aldehyd chlorooctowy CRA (ang. crotonaldehyde) – aldehyd krotonowy ACR (ang. acrolein) – akroleina HNE (ang. trans-4-hydroxy-2-nonenal) – 4-hydroksynonenal MDA, MA (ang. malondialdehyde) – dialdehyd malonowy ROS (ang. reactive oxygen species) – reaktywne formy tlenu (RFT), wolne rodniki tlenowe (WRT) TT(HEC)TT, THEC – 3,N4-α-hydroksyetanocytozyna (HEC) TT(HPC)TT, THPC – 3,N4-α-hydroksypropanocytozyna (HPC) TT(εC)TT, TεC, εC – 3,N4-etenocytozyna (3,N4-εC) TT(εA)TT, TεA, εA – 1,N6-etenoadenina (1,N6-εA) EcAlkB – białko pochodzące od E. coli, podstawowe dla rodziny białek AlkB SC-1A – homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces coelicolor SC-2B – homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces coelicolor XC-1B – homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Xanthomonas campestris XC-2B – homolog biłka EcAlkB pochodzący od bakterii Xanthomonas campestris SA-1A – homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces avermitilis SA-2B – homolog białka EcAlkB pochodzący od bakterii Streptomyces avermitilis HPLC (ang. high performance / high pressure liquid chromatography) – wysokosprawna / wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa MeOH – metanol TEAA – trójetyloamina IPTG – izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd SDS – dodecylosiarczan sodu TEMED – N,N,N’,N’- tetrametylenodiamina DTT – ditiotreitol 8 I. Wstęp Kwas deoksyrybonukleinowy (deoxyribonucleic acid, DNA) jest podstawowym nośnikiem informacji genetycznej, która determinuje budowę, metabolizm, a także behawioral organizmów żywych. DNA narażone jest nieustannie na działanie czynników zaburzających, mających tym samym wpływ na jego strukturę. Jeżeli nastąpi zmiana w budowie chemicznej DNA wzrasta prawdopodobieństwo błędnego parowania się zasad lub braku zdolności do tworzenia par komplementarnych. Takie nieprawidłowości mogą uniemożliwić replikację i/lub transkrypcję powodując skutek mutagenny, a nawet letalny. Dlatego też tak ważnym jest aby wszystkie uszkodzenia DNA komórkowego zostały jak najszybciej usunięte w celu zapobieżenia utrwaleniu się danej mutacji w przyszłych pokoleniach. „DNA ani o niczym nie wie, ani o nic nie dba, DNA po prostu jest, a my tańczymy tak jak nam zagra." Richard Dawkins Budowa DNA DNA ma postać heliksu („podwójnej helisy”) i zbudowany jest z deoksyrybonukleotydów. Na deoksyrybonukleotyd składa się zasada azotowa: adenina lub guanina (dwupierścieniowa puryna), cytozyna lub tymina (jednopierścieniowa pirymidyna), 2-deoksyryboza (pentoza), a także reszta kwasu ortofosforowego. Zasada azotowa łączy się z pierścieniem pentozowym cukru wiązaniem N-glikozydowym, deoksyrybonukletydy zaś połączone są ze sobą wiązaniami fosfodiestrowymi, między pozycjami 3’ i 5’. Deoksyryboza jest pochodną rybozy, w której grupa hydroksylowa, połączona z węglem 2' zastąpiona jest grupą wodorową. Z atomem 5' reszty cukrowej związana jest grupa fosforanowa. Deoksyryboza dobrze rozpuszcza się w wodzie o pH obojętnym, w przeciwieństwie do zasad azotowych, które nie są rozpuszczalne. Z tego też powodu cząsteczki DNA tworzą taką strukturę, gdzie na zewnątrz obecne są elementy rozpuszczalne (cukier i reszta fosforanowa), natomiast wewnątrz nierozpuszczalne w wodzie. W warunkach fizjologicznych kwas deoksyrybonukleinowy ma postać regularnego 9 heliksu, który składa się z dwóch „antyparalelnie” ułożonych łańcuchów polinukleotydowych, zwiniętych wokół wspólnej osi. W obrębie heliksu dochodzi do oddziaływań hydrofobowych między zasadami, ponadto w każdej parze cytozyna guanina tworzą się trzy wiązania wodorowe, zasady w parze adenina - tymina są związane dwoma wiązaniami wodorowymi. W helisie B wyróżnia się rowek mniejszy i większy. Na dnie rowka białka wiążące DNA rozpoznają sekwencję nukleotydową, gdyż tam "wystają" grupy chemiczne zasad azotowych. Zatem zmiany konformacji w obrębie DNA mogą być mechanizmem regulującym ekspresję genów. I.1. Czynniki uszkadzające DNA Możliwe są przynajmniej dwa podziały czynników modyfikujących kwasy nukleinowe. Ze względu na pochodzenie wyodrębnić można czynniki egzogenne i endogenne. Czynniki egzogenne Do czynników egzogennych zaliczamy promieniowanie UV, promieniowanie jonizujące, substancje wywołane działalnością człowieka (chlorek winylu), związki alkilujące (np. etanosulfonian metylu – EMS, etylonitrozomocznik – ENU, metanosulfonian metylu – MMS) czy substancje naturalnie występujące w środowisku (np. aflatoksyna B1). Wiele związków ulega w organizmie przemianom prowadzącym do ich detoksykacji lub wręcz przeciwnie, do aktywacji. Np. przemiany, jakim przy udziale cytochromów P450 podlega aflatoksyna AFB1, prowadzą do jej detoksykacji, albo do powstania wysoce reaktywnej formy epoksydowej, która tworząc addukty w DNA zapoczątkowuje proces mutagenezy i kancerogenezy. Najczęściej występującymi zmianami w DNA są chemiczne modyfikacje zasad purynowych i pirymidynowych, w których wyróżnić można dwie podgrupy: cytotoksyczne i mutagenne. Uszkodzenia cytotoksyczne prowadzą do opóźnienia bądź zatrzymania widełek replikacyjnych blokując polimerazy DNA. Mutagenne uszkodzenia zaś są nieprawidłowo odczytywane w czasie replikacji, generując tym samym powstawanie mutacji w nowopowstałej nici DNA. 10 Czynniki endogenne Poza czynnikami środowiskowymi na zmianę struktury DNA wpływają procesy metaboliczne przebiegające we wszystkich żywych komórkach. Do czynników endogennych możemy zaliczyć naturalną reaktywność DNA (spontaniczna deaminacja hydrolityczna cytozyny prowadząca do powstania uracylu), jak również związki naturalnie powstające w komórkach (reaktywne formy tlenu). Przykładem innej spontanicznej reakcji hydrolitycznej, polegającej na zerwaniu wiązania N-glikozydowego między C-1’ deoksyrybozy a N-9 zasady purynowej, jest depurynacja, która prowadzi do utraty zasady purynowej z cząsteczki DNA. Do depirymidynacji może także dochodzić, lecz z mniejszą częstotliwością. Najczęściej obserwowanymi endogennymi modyfikacjami DNA są miejsca apurynowe, produkty dezaminacji, uszkodzenia oksydacyjne i alkilacja zasad, jak też różne aldehydopochodne addukty egzocykliczne (np. produkty peroksydacji lipidów). Addukty takie prowadzą do zniekształceń DNA, dających w rezultacie spowolnienie albo blokowanie replikacji. Wzrasta wówczas prawdopodobieństwo zatrzymania podziałów komórkowych lub pojawienia się aberracji chromosomowych. Bardziej precyzyjnym kryterium podziału jest rodzaj modyfikacji, który pozwala wyróżnić czynniki fizyczne, chemiczne i biologiczne. I.1.1. Czynniki fizyczne Spośród czynników fizycznych uszkadzających DNA znaczną rolę odgrywają promieniowania - jonizujące i ultrafioletowe. Promieniowanie jonizujące charakteryzuje się znaczną przenikliwością i jest powodem wybijania elektronów z zajmowanych przez nie orbitali. Działanie promieniowaniem o wysokiej energii prowadzi do jonizacji nie tylko kwasów nukleinowych, ale również innych składników komórki i może przyczyniać się do powstawania form wolnorodnikowych, które utleniają zasady azotowe kwasu deoksyrybonukleinowego oraz inicjują powstawanie wiązań krzyżowych pomiędzy dwoma nićmi DNA, jak też pomiędzy DNA a białkami. Wybicie elektronów zmniejsza także siłę wiązania między atomami i jest przyczyną pęknięć w cząsteczce DNA i jego fragmentacji (Schemat 1.). 11 PROMIENIOWANIE JONIZUJĄCE jonizacja składników komórki (DNA, RNA, białek) uszkodzenia oksydacyjne wiązania krzyżowe DNA-DNA i DNA-białko radioliza wody i powstawanie reaktywnych form tlenu (RFT) i azotu (RFA) pękanie nici DNA (niszczenie cukrów i wiązań fosfodiestrowych) Schemat 1. Wpływ promieniowania jonizującego na funkcjonowanie komórek Źródło: Kaczmarska Z, 2008, praca licencjacka Promieniowanie ultrafioletowe wykazuje mniejszą przenikliwość w porównaniu z promieniowaniem jonizującym ze względu na większą długość fali (200-300 nm) i mniejszą energię. Wprowadza w strukturę DNA dimery pirymidynowe z udziałem cytozyny i tyminy, głównie dimery tyminowe, pomiędzy C5 i C6. Tworzy się wtedy pierścień cyklobutanowy między pirymidynami, który powoduje odkształcenie cząsteczki i zbliżenie nukleotydów. Rysunek 1. Struktura dimeru tyminowego Źródło: Opracowanie własne na podstawie Kaczmarska Z, 2008, praca licencjacka 12 Pod wpływem promieniowania UV powstają także fotoprodukty pirymidyno (6-4) pirymidynowe. Rysunek 2. Struktura fotoproduktu pirymidyno (6-4) pirymidynowego Źródło: Opracowanie własne na podstawie Kaczmarska Z, 2008, praca licencjacka I.1.2. Czynniki biologiczne Do tej grupy czynników należą patogeny - wirusy i grzyby. Wirus HIV Jeden z retrowirusów, wirus HIV (ang. human immunodeficiency virus), będący przyczyną zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS) potrafi specyficznie wintegrowywać w genom komórki gospodarza przez pośrednią formę, jaką jest DNA. Aflatoksyna B1 Aflatoksyna B1 (AFB1) jest naturalnym produktem (mikotoksyną) wytwarzanym przez grzyby Aspergillus flavus i Aspergillus parasiticus. Mutagenność i kancerogenność AFB1 jest wynikiem powstawania AFB1-8,9epoksydu, reagującego bezpośrednio z DNA. Wiązanie z DNA zachodzi gwałtownie i powstaje trwały addukt 8,9-dihydro-8-(N7-guanyl)-9-hydroksy AFB1 (AFB1guanina) (Pierzynowska J, Grzesiuk E, 1999). 13 Rysunek 3. Struktura trwałego adduktu aflatoksyny B 1 Źródło: Opracowanie własne na podstawie Smart RC, Hodgson E, 2008 Enzymami odpowiedzialnymi za metabolizm fazy II AFB-8,9-epoksydu są: mikrosomalna hydrolaza epoksydowa (mEH) i S-transferaza glutationu (GST), prowadzące do detoksyfikacji (Plant N, 2003). I.1.3. Czynniki chemiczne Związki chemiczne stanowią niewątpliwie najobszerniejszą grupę czynników uszkadzających DNA. Zaliczamy tutaj nie tylko czynniki chemiczne prowadzące do oksydacji, alkilacji i hydrolizy zasad (deaminacja, depurynacja, depirymidynacja), ale także produkty peroksydacji lipidów oraz działanie chlorku winylu i jego pochodnych. Czynniki oksydacyjne Uszkodzenia oksydacyjne DNA odgrywają istotną rolę w mutagenezie, kancerogenezie i w procesie starzenia (Ames BN i in., 1995). Nadtlenek wodoru, tlen atomowy czy rodnik hydroksylowy są produktami ubocznymi wielu procesów metabolicznych, takich jak utlenianie w peroksyzomach, oddychanie tkankowe w mitochondriach czy metabolizm substancji egzo- i endogennych w retikulum endoplazmatycznym przy udziale cytochromu P450. Reaktywne formy tlenu są także bronią stosowaną przez makrofagi w obronie przed inwazją patogenów. W procesach zapalnych powstają również aktywne formy azotu. Tlenek azotu pełni w komórce 14 funkcję przekaźnika sygnałów, ale też może poprzez interakcję z lipidami uszkadzać DNA (Burcham PC, 1998). Najgroźniejsze implikacje dla organizmów niosą ze sobą reakcje wolnych rodników tlenowych z DNA. Interakcje takie mogą prowadzić do utworzenia pojedynczych i podwójnych pęknięć DNA, wiązań poprzecznych i modyfikacji zasad azotowych. Oksydacyjne modyfikacje zasad azotowych można podzielić na dwie grupy ze względu na ich biologiczne właściwości: a) potencjalnie mutagenne oraz b) blokujące proces replikacji DNA. Typowym przykładem oksydacyjnego uszkodzenia DNA prowadzącego do bloku replikacyjnego jest glikol tyminy. Prawdopodobnie również obecność w cząsteczce DNA produktów częściowego rozpadu pierścienia purynowego, to znaczy – FapyA i FapyG, może prowadzić do zahamowania procesu replikacji (Wallace SS, 1994). Pośród reaktywnych form tlenu zdolnych do uszkadzania DNA występują: anionorodnik ponadtlenkowy O2• ¯, nadtlenek wodoru H2O2, rodnik hydroksylowy OH• i tlen singletowy 1O2. Formy te łatwo utleniają zarówno cząsteczki zasad jak i cukrów budujących DNA (glikol tyminy, 8-oksyG, FapyG), a często prowadzą też do jednoniciowych i dwuniciowych pęknięć DNA. Modyfikacje w obrębie zasad obejmują wprowadzenie do cząsteczki grupy OH, co zmienia właściwości kodujące danego nukleotydu (np. 8-oksyG może tworzyć parę z A co wywołuje substytucję G do T, jak i z C co nie skutkuje mutacją), ułatwia pękanie pierścieni pirymidyn (mocznik) i puryn (Fapy), które są nie tylko mutagenne, lecz również blokują polimerazy DNA i RNA, prowadząc w efekcie do śmierci komórki. 15 O glikol tyminy blokuje replikację i transkrypcję HO NH2 NH H3C HO mocznik blokuje replikację i transkrypcję H O N O deoksyryboza H deoksyryboza O FapyG blokuje replikację O H N O H N NH 8-oksyG inicjuje błędy w kodowaniu GT NH O H HN N NH2 deoksyryboza N N NH2 deoksyryboza Rysunek 4. Wybrane uszkodzenia oksydacyjne Źródło: Kaczmarska Z, 2009, praca magisterska Jeżeli w procesie replikacji DNA naprzeciwko 8-oksyG włączona zostanie adenina, to po dwóch rundach replikacyjnych pojawi się transwersja G → T. Z wolnymi rodnikami reagują nie tylko zasady wchodzące w skład DNA, ale również obecne w trójfosfodeoksynukleotydach. 8-oksodGTP jest dobrym substratem dla polimeraz DNA, a możliwość błędnego parowania zmodyfikowanej oksydacyjnie guaniny może doprowadzić do jej inkorporacji naprzeciwko adeniny i do substytucji A → C po trzech rundach replikacyjnych (Oliński R, Jurgowiak M, 1999). Czynniki alkilacyjne Do czynników alkilujących zaliczamy mutageny i kancerogeny, które modyfikują DNA i RNA poprzez alkilację (van den Born E i in., 2009), potrafią wprowadzać różne szkodliwe uszkodzenia do kwasów nukleinowych, a także produkowane są endogennie, jako produkt uboczny metabolizmu komórkowego (Falnes PØ, Rognes T, 2003). Uszkodzenia alkilacyjne zasad mogą zatrzymywać replikację, przerywać transkrypcję czy sygnalizować aktywację apoptozy. W komórkach ssaków mogą być zaangażowane w kancerogenezę, schorzenia neurodegeneracyjne czy procesy starzenia (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Obecne w tych związkach reaktywne grupy metylowe i etylowe wywołują alkilację zasad azotowych i grup fosforanowych 16 nukleotydów. Rodzaj wywoływanych przez nie zmian zależy od ich właściwości chemicznych i struktury przestrzennej DNA (Sedgwick B, Lindahl T, 2002). Główne modyfikacje zasad wprowadzane do dwuniciowego DNA (dsDNA) przez czynniki alkilujące to: 7-metyloguanina (7-meG), 3-metyloadenina (3-meA) i O6-metyloguanina (O6-meG), natomiast w znacznie mniejszym stopniu: 1-metyloadenina (1-meA), 7-metyloadenina (7-meA), 3-metylocytozyna (3-meC), 3-metyloguanina (3-meG) i O4-metylotymina (O4-meT). Przy czym, w jednoniciowym DNA (ssDNA) 1-meA oraz 3-meC,występują częściej niż w dsDNA (Falnes PØ, Rognes T, 2003). O6-metyloguanina 7-metyloguanina 3-metyloadenina Rysunek 5. Przykłady uszkodzeń alkilacyjnych Źródło: Opracowanie własne Pozycja N7 guaniny jest najbardziej podatna na alkilację i stanowi od 65 do 80% wszystkich alkilowanych zasad. Modyfikacja ta nie blokuje replikacji, ani transkrypcji, nie wpływa również na parowanie zasad, wydaje się więc być nieszkodliwa. Jednak 7-meG może stanowić źródło wtórnych uszkodzeń DNA o silnych właściwościach toksycznych, takich jak: miejsca apurynowe czy puryny z otwartym pierścieniem imidazolowym, tzn. Fapy. Z kolei 3-meA blokuje większość polimeraz DNA, a ponadto jest źródłem miejsc apurynowych (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Donorem grup metylowych dla rozmaitych metylotransferaz jest S-adenozylometionina (SAM), która może nieenzymatycznie metylować DNA, ale w innych pozycjach niż w reakcjach enzymatycznych. Ponieważ metylacja odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych, takich jak ekspresja informacji genetycznej, 17 zmiana poziomu SAM w komórce może wpływać na jej funkcjonowanie, a nieprawidłowości związane z metabolizmem SAM mogą być przyczyną chorób wątroby, schorzeń neurologicznych czy kancerogenezy (Lutz WK, 1990). SAM może również uczestniczyć w spontanicznej metylacji DNA generując powstawanie głównie 7-meG i 3-meA, a w mniejszym stopniu także O6-meG. Metylosulfonian metylu (MMS) jest czynnikiem metylującym DNA, używanym w eksperymentach związanych z mutagenezą i rekombinacją (Beranek DT, 1990). MMS wywołuje zmiany w budowie zasad w postaci 1meA, 3meC i O6meG, które pojawiają się preferencyjnie w RNA i jednoniciowych cząsteczkach DNA, gdyż w przypadku dwuniciowego DNA metylowane atomy są zaangażowane w tworzenie wiązań pomiędzy zasadami, ich dostępność dla czynnika alkilującego jest zmniejszona. Zmiany takie mogą prowadzić do błędnego parowania zasad i zatrzymania replikacji (Duncan T i in., 2002). MMS czy jodek metylu (MeI) wprowadzają grupy alkilowe wyłącznie do atomów azotu oraz mają silne właściwości toksyczne (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Reaktywność SAM jest znacznie słabsza niż MMS (Rydberg B, Lindahl T, 1982). Do czynników metylujących należą również związki przyłączające grupy alkilowe zarówno do tlenu i azotu w cząsteczkach zasad oraz tlenu grupy fosforanowej (N-metylo-N-nitrozomocznik (MNU) i N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG). Wykazują one silne właściwości mutagenne. I.1.4. Chlorek winylu Chlorek winylu używany jest do produkcji polimerów (polichlorek winylu, PCW) i kopolimerów (z octanem winylu, chlorkiem winylidenu, estrami kwasu akrylowego i maleinowego) wykorzystywanych w przemyśle tworzyw sztucznych. Należy do rodziny halogenowych pochodnych etylenowych. Ten prosty gaz o zapachu chloroformu po dostaniu się do organizmu jest przetwarzany w wątrobie przez cytochrom P450 II E 1 (Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT, 1994). Pierwotnym produktem utleniania chlorku winylu (VC) jest tlenek chloroetylenu (Barbin A i in., 1975; Gothe R i in., 1974). Tlenek chloroetylenu (CEO) jest związkiem nietrwałym i w roztworach wodnych ulega przegrupowaniu do aldehydu chlorooctowego (CAA) oraz hydrolizie do aldehydu glikolowego. Zarówno aldehyd 18 chlorooctowy jak i aldehyd glikolowy są związkami względnie trwałymi (Barbin A i in., 1990). H H C C Cl H chlorek winylu (VC) [O] cytochrom P-450 2E1 O HOCH2 C hydroliza H H przegrupowanie O C C Cl H aldehyd glikolowy O ClCH2 C H tlenek chloroetylenu H aldehyd chlorooctowy ( CEO) ( CAA) Schemat 2. Aktywacja metaboliczna chlorku winylu Źródło: Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT, 1994 CEO i CAA oddziałują z białkami oraz z DNA (reakcje z adeniną i cytozyną) w jądrach komórek (Osterman - Golkar S i in., 1977). Obecność w tych metabolitach dwóch aktywnych grup funkcyjnych (w CEO chlor i grupa epoksydowa, w CAA chlor i grupa formylowa) umożliwia tworzenie cyklicznych adduktów zasad (etenopochodne) i wiązań krzyżowych. Wykazano także tworzenie wiązań międzyniciowych w reakcji CAA z DNA (Spengler SJ, Singer B, 1988). I.1.5. Peroksydacja lipidów Peroksydacja lipidów jest ciągiem reakcji, które mogą wzmagać stres oksydacyjny rozpoczęty przez wolne rodniki i reaktywne formy tlenu (Blair IA, 2001). Jest to proces fizjologiczny obejmujący utlenianie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), stanowiących podstawowy składnik błon biologicznych. Aktywne chemicznie elektrofilowe związki, zawierające przeważnie α,β-nienasycone aldehydy, powstałe w rezultacie tych procesów, mogą przemieszczać się do jądra 19 komórkowego i reagować z DNA, jak również powstawać in situ w wyniku peroksydacji lipidów chromatynowych, tj. fosfolipidów (Matulewicz Ł, Przybyszewski WM, 2004). Schemat 3. Powstawanie propano- i etenoadduktów pod wpływem produktów peroksydacji lipidów Źródło: Przybyszewski WM i in., 2005 (zmodyfikowano) Peroksydacja lipidów przebiega z utworzeniem wielu reaktywnych produktów, zarówno na drodze nieenzymatycznej jak i w wyniku reakcji enzymatycznych (Porter NA, 1986). Substancjami powstałymi w różnych ilościach w zależności od budowy kwasów oraz warunków utleniania są związki epoksydowe (np. 2,3epoksybutanal czy 2,3-epoksy-4-hydroksynonanal) oraz aldehydy nasycone (np. heksanal, pentanal) i α,β-nienasycone (np. akroleina, aldehyd krotonowy, 4hydroksynonenal, 2-heksenal, 2-heptenal, 2-oktenal, 2-nonenal, 2,4-nonadienal, 2,4dekadienal) (Dotan Y i in., 2004). Końcowymi produktami peroksydacji lipidów powstającymi w największych ilościach są α,β-nienasycone aldehydy o niskich masach cząsteczkowych, charakteryzujące się dłuższym czasem półtrwania niż reaktywne formy tlenu i zdolnością do dyfuzji do odległych nawet obszarów komórki względem miejsc ich powstawania. Przemieszczając się na swej drodze powodują uszkodzenie komórki, dzięki czemu można je traktować jako wtórne 20 przekaźniki peroksydacji lipidów (Dotan Y i in., 2004). Aldehydy te mogą reagować z grupami aminowymi i tiolowymi wielu innych związków ważnych biologicznie, takich jak białka i DNA. W reakcje z resztami aminokwasowymi białek łatwo wchodzi dialdehyd malonowy (MDA) oraz 4-hydroksy-2-nonenal (HNE), w wyniku czego wytwarzane są pochodne karbonylowe białek (Dotan Y i in., 2004). α,β-nienasycone aldehydy, jako związki karbonylowe dwufunkcyjne, są istotnymi czynnikami chemicznymi zanieczyszczającymi środowisko, jak również produktami metabolizmu człowieka. Należne ich dwufunkcyjnemu charakterowi (podwójne wiązanie skoniugowane z grupą formylową) zdolności chemiczne wykazują obfite modyfikacje DNA. Jedną z istotnych konsekwencji wysokiej reaktywność α,β-nienasyconych aldehydów w stosunku do zasad azotowych jest ich zdolność do tworzenia egzocyklicznych adduktów DNA (Pluskota-Karwatka D, 2008). W wyniku tych reakcji powstaje szereg połączeń prowadzących m.in. do hamowania replikacji i transkrypcji DNA (Dotan Y i in., 2004; Hemminki K i in., 1994). Należy też podkreślić, że aldehydy powstające w wyniku peroksydacji lipidów, wchodząc w reakcje z DNA i białkami, wykazują przy tym właściwości zarówno toksyczne jak i mutagenne (Dotan Y i in., 2004; Benamira M i in., 1995; Bartsch H i in., 2002). Stwierdzono, że najbardziej toksycznym produktem peroksydacji lipidów jest 4-hydroksy-2-nonenal (Esterbauer H i in., 1990). Właściwości mutagenne zarówno w stosunku do komórek bakteryjnych jak i zwierzęcych wykazuje akroleina (ACR), aldehyd krotonowy (CRA) jak też dialdehyd malonowy (MDA) (Eckl P, Esterbauer H, 1989), przy czym związkiem najbardziej mutagennym jest MDA (Esterbauer H i in., 1990). I.1.5.1. Egzocykliczne uszkodzenia DNA Akroleina (ACR), aldehyd krotonowy (CRA) i 4-hydroksynonenal (HNE) przekształcają się oksydacyjnie do epoksyaldehydów. Epoksyaldehydy mają zdolność modyfikacji zasad DNA dając w rezultacie etenoaddukty. Jak wykazały badania, w wyniku oddziaływania epoksyaldehydów na DNA powstaje etenoguanina, etenoadenina i etenocytozyna, a epoksyd akroleiny powoduje powstanie 1,N2-etenoguaniny (Golding BT i in., 1996). Aldehyd krotonowy przekształca się w 2,3-epoksybutanal, który powoduje powstawanie podstawionych grupami alkilowymi zasad: 1,N6-etenoadenozyny, 3,N4-etenocytydyny, 21 1,N2-etenoadenozyny (Nair V, Offerman RJ, 1985). Pochodna HNE - 2,3-epoksy-4hydroksynonenal (EH) powoduje podstawienie grup hydroksyheptanowych do guaniny i adeniny; powstają w ten sposób 1,N2- i N2,3-etenoguanina oraz 1,N6-etenoadenina (Sodum RS, Chung FL, 1989 i 1991). Addukty tego rodzaju przyczyniają się do niestabilności genetycznej, odgrywając tym samym znaczącą rolę w procesach mutagenezy i kancerogenezy (Kowalczyk P i in., 2004). Produkty peroksydacji lipidów tworzą w reakcji z kwasem dezoksyrybonukleinowym dwa rodzaje egzocyklicznych adduktów: epoksydy dają pięcioczłonowe etenoaddukty, natomiast nie-epoksydowane α,β-nienasycone aldehydy dają sześcioczłonowe propanoaddukty. Propanoaddukty zasad DNA Scharakteryzowano i opisano propanoaddukty powstałe m.in. w reakcji akroleiny z deoksycytozyną. Jednym z nich jest hydroksyalkanoaddukt 3,N4-αhydroksypropanocytozyna. Rysunek 6. Wzór hydroksypropanocytozyny Źródło: Opracowanie własne Addukt ten jest alkalilabilny co powoduje, że oligonukleotyd pęka w miejscu modyfikacji w środowisku zasadowym. HPC jest efektywnie usuwana przez Mug w zakresie pH 7.2-8.0. Uważa się, że słabe wycinanie HPC w warunkach niskiego pH związane jest z faktem, że HPC jest czwartorzędową zasadą i przy niskim pH przechodzi w formę uprotonowaną, co skutkuje zmniejszonym powinowactwem do enzymu (Borys-Brzywczy E i in., 2005). 22 Propanoaddukty powstają również pod wpływem aldehydu krotonowego i 4-hydroksynonenalu (HNE). Przeważającym ilościowo produktem bezpośredniej reakcji HNE z DNA jest propanowy addukt guaniny podstawiony łańcuchem alifatycznym (Douki T i in., 2004). Rysunek 7. Struktura adduktu HNE do guanozyny Źródło: Opracowanie własne Wyniki badań in vitro wykazały, że HNE oddziałuje z deoksynukleozydami, co prowadzi do powstania propano- i etenocyklicznych adduktów z bocznym łańcuchem hydroksyalkilowym, które powodują wzrost częstości mutacji oraz hamują syntezę DNA in vitro u E. coli (Kowalczyk P i in., 2004). Etenoaddukty zasad DNA Etenoaddukty są egzocyklicznymi związkami powstałymi poprzez uformowanie się dodatkowego pierścienia imidazolowego w cząsteczce zasady DNA. Możemy wyróżnić cztery etenoaddukty: 1,N6-etenoadenina (εA), 3,N4-etenocytozyna (εC), N2,3-etenoguanina (N2,3εG), 1,N2-etenoguanina (1,N2,εG) (Kochetkov NK i in., 1971). 23 HO N N N O N N 3,N4- (3,N4- C) cytozyna (HEC) N N N N N N N 1,N2-etenoguanina (1,N2- G) N N NN HN N O HO HO N N H hydroksy-etano O O + N N 3,N4-etenocytozyna CHO O O N O N N N N2,3-etenoguanina (N2,3- G) N N N N N 1,N6-etenoadenina (1,N6- A) Rysunek 8. Wzory chemiczne etenoadduktów zasad DNA powstających pod wpływem aldehydu chlorooctowego (CAA) Źródło: Kochetkov NK i in., 1971 Tymina nie tworzy cyklicznych adduktów, ponieważ jako jedyna z zasad azotowych nie posiada egzocyklicznej grupy aminowej w cząsteczce. Historia badań nad etenoadduktami sięga początków lat 70-tych ubiegłego stulecia, kiedy Kochetkov wraz ze współpracownikami po raz pierwszy otrzymali etenoadeninę i etenocytozynę w reakcji aldehydu chlorooctowego z adeniną i cytozyną. Badania mechanizmu reakcji CAA z resztami adeniny i cytozyny wykazały, iż we wstępnym etapie następuje wytworzenie zasady Schiffa w reakcji grupy aldehydowej CAA z egzocyklicznymi grupami aminowymi 6-NH2 adeniny lub 4-NH2 cytozyny. Następnie zachodzi cyklizacja w wyniku alkilowania przez ugrupowanie –CH2Cl endocyklicznego atomu azotu w najbliższym sąsiedztwie grupy –NH2. Aby powstała taka struktura związek chemiczny atakujący zasadę musi 24 N N N N posiadać dwie grupy funkcyjne zdolne do utworzenia nowego wiązania, jak również zasada powinna zawierać dwa reaktywne ugrupowania. Powstałe w ten sposób stosunkowo stabilne produkty przejściowe (hydraty) 1,N6εA · H2O i 3,N4εC · H2O w wyniku dehydratacji ulegają przekształceniu odpowiednio w 1,N6εA i 3,N4εC (Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT, 1994). Rysunek 9. Dehydratacja 3,N4-(N4–α-hydroksyetano)cytozyny (3,N4εC · H2O) Źródło: Opracowanie własne na podstawie Maciejewska AM i in., 2010 3,N4-etenodeoksycytozyna (3,N4-εC) jest jednym z egzocyklicznych etenowych uszkodzeń zasad DNA. Może powstawać zarówno w wyniku ekspozycji na niektóre kancerogeny środowiskowe, np. aldehyd chlorooctowy (CAA), jak i na skutek peroksydacji lipidów. W warunkach fizjologicznych połowiczny czas (t1/2) dehydratacji 3,N4-αhydroksyetanocytozyny (HEC) w polinukleotydzie wynosi około 1 dobę (Kuśmierek JT, Singer B, 1982), co sugeruje, że addukt ten może odgrywać niezależną od 3,N4-εC rolę w mutagenezie i naprawie. 1,N6-etenoadenina (1,N6-εA) powstaje w reakcji, w której azot N1 pierścienia adeniny oraz azot egzocykliczny tworzą pięcioczłonowy pierścień, dzięki nasyceniu wiązania podwójnego przy azocie N1 (Frick LE i in., 2007). Tak jak inne etenoaddukty, etenoadenina powstaje w wyniku działania m. in. aldehydu chlorooctowego (metabolitu chlorku winylu) oraz produktów peroksydacji ω-6-wielonienasyconych kwasów tłuszczowych na zasady DNA. Etenoadenina została wykryta w tkankach ludzi i gryzoni w bardzo zróżnicowanych ilościach, w przedziale od 0,043 do 31,2 cząsteczek etenoadeniny na 108 niezmodyfikowanych 25 adenin występujących w DNA. Traktowanie szczurów chlorkiem winylu powodowało wzrost ilości etenoadeniny w DNA ich wątroby, płuc, limfocytów i jąder (w wątrobie i płucach kilkukrotny). U bakterii polimeraza DNA rozpoznaje zwykle etenoadeninę jako niezmodyfikowaną adeninę, rzadko dając podstawienia AT→TA (Moriya M i in., 1994). W komórkach E.coli i Saccharomyces cerevisiae zaobserwowano aktywność enzymatyczną identyfikowaną jako alkilo-N-purynoDNA glikozylazy wycinające etenoadeninę, odpowiednio AlkA1 i MAG2 (Saparbaev M i in., 1995). Wykryto również aktywność enzymatyczną wycinającą etenoadeninę w ssaczym ekstrakcie komórkowym (Oesch F i in., 1986). Częściowo oczyszczono ludzkie białko ANPG3 wiążące się do, i usuwające etenoadeninę (Saparbaev M i in., 1995; Singer B i in., 1992). Zaobserwowano, że ANPG jest zdecydowanie bardziej efektywnym białkiem niż alkilo-N-puryno-DNA glikozydazy (Saparbaev M i in., 1995). I.2. Sposoby naprawy DNA Komórki wykształciły szereg systemów naprawczych mających na celu przeciwdziałanie efektom wpływu czynników mutagennych i cytotoksycznych. U Escherichia coli wyróżnia się cztery sposoby naprawy uszkodzeń kwasów nukleinowych spowodowanych przez związki alkilujące: 1) naprawa przez wycinanie zasad – ang. base excision repair (BER), 2) naprawa przez wycinanie nukleotydów – ang. nucleotide excision repair (NER), 3) naprawa błędnie sparowanych zasad – ang. mismatch repair (MMR), 4) naprawa bezpośrednia przez odwrócenie, np. metylotransferazy (alkilotransferazy) lub oksydacyjne demetylazy (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Procesy naprawcze zmodyfikowanej adduktami molekuły DNA zapobiegają gromadzeniu się tych modyfikacji i ich przekształcaniu w mutacje. Większość 1 Białko AlkA jest 3-metyloadeninową glikozylazą II DNA indukowaną w odpowiedzi na alkilację DNA. Chroni komórki przed negatywnymi działaniem alkilowanych zasad DNA poprzez katalizę ich wycinania, włączając w to N-3 i N-7 addukty adenozyny i guanozyny oraz O2 –addukty tymidyny i cytydyny. 2 MAG – białko drożdży Saccharomyces cerevisiae 3 ANPG – ludzka 3-metyloadeninowa glikozylaza DNA, in. ludzka N-glikozylaza DNA alkilowanych zasad 26 oksydacyjnych modyfikacji DNA, takich jak zmiany struktury chemicznej zasady, reszty cukrowej oraz obecność miejsc apurynowych i pirymidynowych, jest naprawiana z wykorzystaniem mechanizmu wycięcia zasady (BER). Wykazano, że według tego mechanizmu usuwane są etenoaddukty: 1,N6-etenoadenina, 3,N4-etenocytozyna, N2,3-etenoguanina i 1,N2-etenoguanina (Gros L i in., 2003). Najważniejszym elementem jest tu aktywność enzymatyczna glikozylaz DNA. Glikozylazy w procesie naprawy hydrolizują N-glikozydowe wiązanie pomiędzy zmienioną chemicznie zasadą a cukrem, a także eliminują zmodyfikowane zasady, np. alkilowane puryny czy glikol tyminowy oraz utlenioną 2’-deoksyrybozę. W zależności od rodzaju uszkodzenia obserwowano proces naprawczy z udziałem endonukleaz nacinających DNA w miejscu 5’ oksydacyjnie zmienionej zasady, pozostawiając wolne końce 3’-hydroksylowe i 5’-fosforanowe, co określono mianem: naprawa przez nacięcie nukleotydu (nucleotide incision repair – NIR) (Ishchenko AA, Saparbaev MK, 2002). Kolejnym mechanizmem naprawczym jest naprawa przez wycięcie nukleotydu (NER), który usuwa objętościowe addukty zmieniające konformację helisy DNA (Costa RMA i in., 2003). Częścią tego mechanizmu jest proces naprawczy połączony z transkrypcją (transcription coupled repair – TCR). Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) jest procesem, w efekcie którego usuwane są uszkodzone nukleotydy. U bakterii E. coli proces taki odbywa się przy udziale białek UvrA, UvrB, UvrC i UvrD. Naprawa błędnie sparowanych zasad (MMR) dotyczy źle sparowanych zasad na potomnej nici utworzonych w czasie procesu replikacji, a które uniknęły poprawy polimerazy DNA. Oprócz skomplikowanych kompleksów naprawczych, komórka może wykorzystywać także proste mechanizmy naprawy DNA, nie naruszające jego integralności. Przykładem jest bezpośrednia naprawa przez odwrócenie, w której bierze udział pojedyncze, wysoce specyficzne białko, nie nacinające wiązania pomiędzy reszta cukrową a fosforanową, ani nie wycinające zmodyfikowanej zasady. Wprowadzone dodatkowe grupy atomów są eliminowane bezpośrednio w miejscu ich przyłączenia. Jednym z takich mechanizmów jest działanie fotoliazy reaktywowanej pod wpływem światła ultrafioletowego. Fotoliazy przekształcają cyklobutanowe dimery pirymidynowe z powrotem do monomerów. Białka te zawierają grupę prostetyczną absorbującą światło niebieskie i transportują energię na 27 pierścień cyklobutanowy powodując tym samym jego rozszczepienie. Należy zaznaczyć, że fotoliza nie występuje w komórkach wyższych eukariotów. Do kolejnej grupy białek naprawczych możemy zaliczyć alkilotransferazy (np. metylotransferaza O6-metyloguaniny). Białka te transportują grupy metylowe ze zmodyfikowanych zasad DNA na grupę tiolową cysteiny własnej cząsteczki. W DNA zostaje więc naprawiona zasada, natomiast metylotransferaza ulega nieodwracalnej inaktywacji poprzez zablokowanie reszty cysteinowej (Falnes PØ i in., 2004). Dioksygenazy AlkB odgrywają kluczową rolę w mechanizmie bezpośredniej naprawy przez odwrócenie. Białka te katalizują reakcję całkowitej naprawy uszkodzenia bez naruszenia ciągłości nici DNA, a do reakcji wymagają obecności łatwo dostępnych w komórce α-ketoglutaranu i tlenu jako kosubstratów oraz Fe (II) jako kofaktora. Uczestniczą one w usuwaniu uszkodzeń alkilacyjnych, takich jak: 1-meA czy 3-meC oraz egzocyklicznych etenoadduktów DNA, które mogą być również usuwane przez system naprawy przez wycinanie zasad (BER) (Lau AY i in., 2000; Aas PA i in., 2003). I.2.1. AlkB Gen alkB został odkryty w 1983 roku podczas izolowania mutantów Escherichia coli ze zwiększoną wrażliwością na czynniki alkilujące. Obecnie produkt tego genu – białko AlkB u E. coli (EcAlkB) – uważane jest za białko uczestniczące w naprawie alkilacyjnych uszkodzeń DNA (Kataoka H i in., 1983). Jego homologi występują też u innych organizmów, gdzie uczestniczą w naprawie uszkodzeń w DNA lub/i RNA, a także mogą pełnić funkcje nie związane z naprawą DNA (van den Born E i in., 2009). W 2002 roku dwie niezależne grupy badawcze potwierdziły eksperymentalnie udział białek AlkB w naprawie DNA (Falnes PØ i in., 2002; Trewick SC i in., 2002). Analiza bioinformatyczna wykazała, iż białka te należą do rodziny dioksygenaz zależnych od Fe(II) i α-ketoglutaranu (Aravind L, Koonin EV, 2001). Enzym AlkB wymaga Fe(II) jako kofaktora oraz α-ketoglutaranu i tlenu jako kosubstratów. I.2.1.1. Mechanizm działania Białko AlkB usuwa zarówno alkilacyjne, jak i etenowe uszkodzenia zasad DNA. Mechanizm naprawy alkilowych modyfikacji można podzielić na dwa etapy. 28 W pierwszej kolejności następuje hydroksylacja wiązania C-H w dołączonej do zasady grupie alkilowej, co związane jest z oksydatywną dekarboksylacją α-ketoglutaranu, w wyniku której uwolnione zostają cząsteczki bursztynianu i dwutlenku węgla. Jeden z atomów cząsteczki tlenu wbudowany zostaje we fragment alkilowy jako grupa hydroksylowa, natomiast drugi stanowi część grupy karboksylowej bursztynianu (Prescott AG, Lloyd MD, 2000; Ryle MJ, Hausinger RP, 2002; Schofield CJ, Hang Z, 1999). Z wykorzystaniem tej drogi naprawy, białko AlkB bezpośrednio przekształca 1-metyloadeninę i 3-metylocytozynę odpowiednio w adeninę i cytozynę z jednoczesnym uwolnieniem utlenionej grupy metylowej w postaci formaldehydu (Trewick SC i in., 2002). Produktami przejściowymi są 1-hydroksymetyloadenina i 3-hydroksymetylocytozyna, które są niestabilne i spontanicznie rozkładają się regenerując nieuszkodzoną zasadę (Schemat 4). Schemat 4. Mechanizm naprawy uszkodzeń alkilacyjnych przez białko AlkB Źródło: Begley TJ, Samson LD, 2003 Mechanizm naprawy uszkodzeń adduktów etenowych opiera się na podobnej zasadzie jak usuwanie grup alkilowych (Sedgwick B, Lindahl T, 2002). Najpierw mostek etenowy utleniany jest do epoksydu, który w wyniku addycji cząsteczki wody tworzy glikol. W dalszej kolejności powstały alkohol uwalnia się spontanicznie w postaci glioksalu (Delaney JC i in., 2005) z odtworzeniem wyjściowej zasady. 29 Schemat 5. Mechanizm naprawy etenowych uszkodzeń przez białko AlkB Źródło: Delaney JC i in., 2005 W celu potwierdzenia hipotezy naprawy εA przez AlkB skonstruowano trimer DNA T(εA)T, który traktowano białkiem AlkB E. coli. Po reakcji analiza HPLC wykazała całkowity zanik piku dla T(εA)T i pojawienie się nowego piku reprezentującego TAT. Trimer TAT został dodany do tej samej mieszaniny, która była analizowana na HPLC. Zwiększenie gęstości w nowym piku potwierdza, że TAT zostało uzyskane jako produkt ostateczny. Eksperyment sprawdzający został przeprowadzony w dokładnie takich samych warunkach z T(εA)T, Fe(NH4)2(SO4)2, α-ketoglutaranem i askorbinianem w buforze MES albo HEPES z wyłączeniem AlkB. Analiza HPLC tego roztworu pokazała, że żadna reakcja naprawcza nie wystąpiła przy braku AlkB. Swoistości TAT i T(εA)T w roztworze zostały następnie potwierdzone przy użyciu spektrometrii masowej MALDI (Mishina Y i in., 2005). Po przeprowadzonej reakcji białka AlkB zachowują aktywność enzymatyczną (Trewick SC i in., 2002; Falnes PØ i in., 2002). I.2.1.2. Struktura przestrzenna AlkB Poznanie trójwymiarowej struktury białek AlkB w kompleksie z różnymi substratami pozwoliło na identyfikację kluczowych reszt aminokwasowych zaangażowanych w rozpoznanie substratu oraz ujawniło, że białko EcAlkB składające się z 216 aminokwasów zawiera trzy domeny. Są to: - N-terminalna domena (aa 1-45), - sekwencja NRL (ang. nucleotide-recognition lid) (aa 46-89), - C-terminalna domena dioksygenazowa, część katalityczna (aa 90-216) (Yang CG i in., 2008; Yu B i in., 2006). 30 Bakteryjne białka AlkB są zbudowane z 190-220 aminokwasów, zawierają silnie zakonserwowaną domenę dioksygenazową oraz słabiej zakonserwowany region N-terminalny. Przypuszczalnie domena N-terminalna zawiera reszty decydujące o specyficzności substratowej. Rysunek 10. Struktura krystaliczna kompleksu białka AlkB E. coli z Fe(II), 2OG i metylowanym trójnukleotydem. Kolorem pomarańczowym zaznaczono Fe, natomiast atomy w 2OG i dT-(1-me-dA)-dT są zaznaczone zgodnie z atomową identyfikacja (węgiel-biały; tlen-czerwony; azot-niebieski; fosfor-pomarańczowy). Niezmienne łańcuchy Fe-2OG dioksygenazy zaznaczono kolorem czerwonym lub magenta (czerwono-fioletowym) w zależności od interakcji odpowiednio z Fe lub 2OG (Yu B i in., 2006) Źródło: http://www.nature.com/nature/journal/v439/n7078/fig_tab/nature04561_F1.html I.2.1.3. Rodzina bakteryjnych białek AlkB Na podstawie analizy sekwencji bakteryjnych białek AlkB opracowano drzewo filogenetyczne z wyodrębnieniem czterech grup: 1A, 1B, 2A, 2B. Rozproszone występowanie białek w obrębie królestwa bakterii wskazuje na horyzontalny transfer kodujących je genów (van den Born E i in., 2009). W białkach należących do grupy 1B w domenie N-terminalnej występują takie same konserwowane sekwencje, jak w białkach należących do grupy 2B. Podobnie, w obrębie domeny NRL, występuje kilka konserwowanych ewolucyjnie aminokwasów wspólnych dla białek grupy 1B oraz 2B. Natomiast, w przypadku 31 grup 1A i 2A, takie same konserwowane sekwencje występują wyłącznie w białkach należących do tej samej grupy. Badania nie ujawniły podobieństwa sekwencji pomiędzy N-terminalną domeną białek z grup 1A i 1B, jednak przypuszcza się, iż zawierają one kilka kluczowych reszt w obrębie domeny NRL, łącznie z resztami Trp69 i Tyr76, co jest związane ze specyficznością substratową (Yu B i in., 2006). Sekwencje domeny NRL białek grupy 1B wykazują homologię do białek z grupy 1A i 2B, co sugeruje, że białka tych trzech grup mogą rozpoznawać podobne substraty (van den Born E i in., 2009). Białka należące do grupy 1A, 2B oraz 1B mają kilka takich samych konserwowanych ewolucyjnie aminokwasów w rejonie odpowiadającym domenie NRL EcAlkB co pozwala przypuszczać, że te trzy grupy białek mogą oddziaływać z takim samym substratem (kwasem nukleinowym). Białka z grup 1A, 1B oraz 2B uczestniczą głównie w naprawie DNA, podczas gdy funkcją białek z grupy 2A jest przede wszystkim modyfikacja tRNA (van den Born E i in., 2009). Tabela 1. Rozmiary homologów białka AlkB wybranych (badanych) gatunków bakterii Białko MT-2B SA-1A SA-2B SC-1A SC-2B XC-1B XC-2B EcAlkB Obecność/gatunek bakterii Mycobacterium tuberculosis Streptomyces avermitilis Streptomyces avermitilis Streptomyces coelicolor Streptomyces coelicolor Xanthomonas campestris Xanthomonas campestris Escherichia coli Wielkość (aa) 205 222 208 216 210 201 211 216 Źródło: Zmodyfikowano na podstawie van den Born E i in., 2009 Grupa 1A Białka należące do tej grupy są szeroko rozpowszechnione w królestwie bakterii, szczególnie u proteobacteria. Do grupy tej należy białko AlkB E. coli, także białka SA-1A i SC-1A; oba występują u bakterii z rodzaju Streptomyces, w 79% są identyczne na poziomie sekwencji aminokwasowej oraz mają podobne właściwości. Przypuszczalnie grupa 1A składa się z białek o funkcji podobnej do białka modelowego dla całej super rodziny AlkB – EcAlkB (van den Born E i in., 2009). 32 Grupa 1B Białka z grupy 1B występują u β- i γ-proteobacteria, a także u cyanobacteria. Wykazują podobieństwo do białek ALKBH2/ALKBH3 występujących u kręgowców. Do grupy tej należy białko XC-1B, charakteryzujące się wysoką aktywnością naprawczą. Analiza bioinformatyczna oraz liczne badania doświadczalne wykazały, iż białka z grupy 1B to białka naprawcze o funkcji zbliżonej do AlkB u E. coli (van den Born E i in., 2009). Grupa 2A Białka tej grupy występują u α-proteobacteria, u takich rodzajów jak Agrobacterium, Rickettsia czy Rhizobium. Niektóre z tych bakterii są patogenami roślin, a geny kodujące białka tej grupy u niektórych bakterii, np. Roseobacter denitrificans, Roseobacter etli, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium medicae występują częściej na plazmidach niż na chromosomach. Białka grupy 2A wykazują dużą homologię względem roślinnych oraz zwierzęcych białek ALKBH8 (Falnes PØ i in., 2009). Analizy bioinformatyczne sugerują, że białka tej grupy są zaangażowane raczej w modyfikację tRNA niż w naprawę DNA. Grupa 2B Białka tej grupy występują głównie u Actinobacteria, a także u niektórych patogenów roślinnych, np. Xanthomonas (γ-proteobacteria) i Burkholderia (β-proteobacteria), które mogły nabyć geny kodujące białka AlkB przez horyzontalny transfer genów z Actinobacteria, które większości są bakteriami glebowymi (Madigan MT i in., 2003). Analiza sekwencji wykazała, że białka z grupy 2B zawierają kilka takich samych konserwowanych reszt aminokwasowych w regionie NRL, co białka grupy 1B oraz uczestniczą w naprawie DNA. Białka należące do tej grupy: MT-2B, SA-2B, SC-2B oraz XC-2B ujawniają aktywność naprawczą, jednak specyficzność substratowa tych białek jest dość zróżnicowana, począwszy od białka MT-2B, z wysoką aktywnością w stosunku do uszkodzeń metylowych i niską w stosunku do etenoadduktów, co różni je od białka XC-2B (van den Born E i in., 2009). I.2.1.4. Homologi AlkB Sekwencja aminokwasowa białka AlkB wykazuje konserwatyzm od bakterii po człowieka (Mishina Y i in., 2005). Homologi tegoż białka znaleziono m.in. 33 u niektórych gatunków Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria i Proteobacteria. Natomiast u Arche i Firmicutes nie udało się ich odnaleźć, co może świadczyć o zbyt odmiennej sekwencji aminokwasowej lub o braku białka o funkcji podobnej do AlkB. Organizmy wielokomórkowe posiadają kilka homologów białka AlkB (ALKBH). U ssaków zidentyfikowano dziewięć takich białek: ALKBH1- ALKBH8 (Drablos F i in., 2004; Aravind L, Koonin EV, 2001; Kurowski MA i in., 2003) oraz związane z otyłością białko FTO, które jest funkcjonalnym białkiem ALKBH (Gerken T i in., 2007). Najlepiej poznane są: hABH2, hABH3 i FTO. hABH2, hABH3 oraz FTO wykazują podobną do AlkB E. coli reaktywność i specyficzność substratową. Ponadto, EcAlkB oraz ALKBH3 uczestniczą w naprawie uszkodzeń alkilacyjnych w RNA (Aas PA i in., 2003; Falnes PØ i in., 2004) oraz ujawniają preferencje w stosunku do ssDNA, a także dość efektywnie uczestniczą w demetylacji RNA, natomiast hABH2 oddziałuje z dsDNA i ma niskie powinowactwo do substratów RNA (Aas PA i in., 2003). Przypuszcza się, iż mogą one uczestniczyć w procesach innych niż naprawa DNA czy RNA (Falnes PØ i in., 2009; Sedgwick B i in., 2007). hABH2 i hABH3 mają różną lokalizację wewnątrzkomórkową. hABH2 występuje wyłącznie w jądrze komórkowym i odgrywa rolę w naprawie DNA w pobliżu widełek replikacyjnych. Z kolei hABH3 występuje zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie (Duncan T i in., 2002; Aas PA i in., 2003). Białko hABH2 ma ogromne znaczenie w obronie przeciwko toksycznym uszkodzeniom alkilacyjnym DNA (Ringvoll J i in., 2006). Rolą ssaczego białka hABH3, podobnie jak AlkB, może być naprawa RNA lub usuwanie pewnych naturalnych metylacji w różnego rodzaju RNA (Duncan T i in., 2002; Aas PA i in., 2003; Ougland R i in., 2004). Jądrowe białko FTO uczestniczy w naprawie 3-meT w ssDNA. Zróżnicowane właściwości ssaczych homologów AlkB sugerują, że mogą one pełnić różne funkcje, a naprawa DNA może być jednym z kilku procesów, takich jak: naprawa RNA, metylacja i demetylacja RNA oraz demetylacja białek (Sundheim O i in., 2008). Wszystkie zidentyfikowane homologi mają trzy motywy powtarzające się w sekwencjach aminokwasowych LHXD, X, RXXXXXR. Odpowiadają one za formowanie centrum aktywnego enzymu i miejsc, z którymi oddziałuje Fe2+ 34 i α-ketoglutaran (α-KG) (Mishina Y i in., 2005). Sekwencja AlkB ma postać H131XD133…H187, gdzie grupy His i Asp wiążą żelazo, a dodatkowo Asp oddziałuje z α-KG. Większość bakterii zawiera tylko jedno białko AlkB, ale niektóre gatunki, np. Streptomyces, posiadają więcej tego typu białek (Falnes PØ, Rognes T, 2003). Dlaczego Streptomyces coelicolor? W Zakładzie Biologii Molekularnej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie podjęto badania nad homologami AlkB ze szczepu Streptomyces coelicolor we współpracy z grupą badawczą kierowaną przez prof. P.Ø. Falnesa (University of Oslo) w ramach grantu „The AlkB protein and its eukaryotic homologues – the role in DNA repair and the possible role in cancer etiology and target in cancer therapy”. Szczep ten jest interesującym obiektem ze względu na obecność przynajmniej dwóch stwierdzonych homologów białka EcAlkB. Stereptomyces coelicolor reprezentuje grupę bakterii zwaną promieniowcami (Actinomycetales). Promieniowce nie wytwarzają jądra komórkowego. Wykazują podobieństwo do bakterii właściwych składem ściany komórkowej i błony cytoplazmatycznej, jak również budową organelli komórkowych (Różalski A, 1998). Naturalnym środowiskiem ich życia jest gleba, rozkładająca się masa roślinna, wilgotne stogi siana, torfowiska, sterty odpadów organicznych, rzadziej zbiorniki wodne. Są przeważnie tlenowcami i chemoorganotrofami i należą do drobnoustrojów Gram-dodatnich. Ich optymalna temperatura wzrostu mieści się w granicach 25-30ºC (zakres 15-37ºC), a optymalne pH jest bliskie 7 (zakres 5-9). Tworzą pseudogrzybnie - powietrzne, powierzchniowe (podstawowe) i wgłębne – obserwacja rozgałęziania których pozwala odróżnić bakterie od grzybów. Rozmnażają się przez podział, fragmentację pseudogrzybni oraz segmentację. U Streptomyces występują nitki konidioforowe, których podział prowadzi do powstania spor. Trzon kolonii właściwej tworzy pseudogrzybnia podstawowa, która składa się z silnie splecionych ze sobą strzępek. Pseudogrzybnię powietrzną stanowią strzępki uformowane w delikatną masę (zdjęcie). Na końcach tych nici powstają wyrostki sporonośne (mycelia), na których wytwarzane są spory (Różalski A, 1998). 35 Zdjęcie 1. Kolonie Stereptomyces coelicolor Źródło: www.jic.ac.uk/science/ molmicro/Strept.html Stereptomyces coelicolor jest pierwszym organizmem tej glebo-zależnej grupy bakterii, którego genom (jego sekwencja) został całkowicie poznany. Składa się on z 8 667 507 par zasad i najprawdopodobniej zawiera 7 825 genów, w skład których wchodzi ponad 20 klasterów kodujących metabolity wtórne (Bentley SD i in., 2002). Wśród nich znajdują się substancje o różnorodnej aktywności biologicznej, np. zaangażowane w reakcje na bodźce zewnętrzne. Większość poznanych genów tego drobnoustroju jest podobna do opisanych wcześniej genów innych bakterii oraz genów regulatorowych. Pośród organizmów bakteryjnych unikalne i niezwykłe są geny odpowiedzialne za różnicowanie faz rozwoju szczepu Streptomyces (Bentley SD i in., 2002). Mikroorganizmy te odpowiedzialne są za biosyntezę antybiotyków stosowanych w medycynie i weterynarii. Spośród idiolitów produkowanych przez Streptomyces coelicolor na szczególną uwagę zasługują: aktynorodyna, metylenomycyna, undecylodigiosyna, przeciwgrzybowy antybiotyk polienowy (pochodna amfoterycyny B) oraz CDA (calcium-dependent peptide antibiotic). Związki te mogą 36 być wytwarzane przez kolonie S. coelicolor w różnych ilościach w zależności od zmieniających się warunków otoczenia (źródło takie samo jak zdjęcie). Szczepy Streptomyces wydzielają do środowiska tzw. egzopigmenty zmieniające barwę otoczenia. Większość wytwarza również endopigmenty, zabarwiające komórkę i kolonie (Różalski A, 1998). I.2.1.5. Znaczenie badań nad białkami AlkB Bakteryjne białko AlkB posiada szerokie spektrum specyficzności substratowej i może brać udział w naprawie różnego typu adduktów zasad zarówno DNA, jak i RNA (Aas PA i in., 2003; Ougland R i in., 2004). Fakt ten sprawia, że białko to jest uniwersalnym komponentem systemów naprawy, które podczas stresu, zarówno alkilacyjnego, jak i oksydacyjnego, jest odpowiedzialne za utrzymanie wierności replikacji, transkrypcji i translacji w komórce. Tak ważna rola białka AlkB skłoniła wielu naukowców do wnikliwszych badań związanych z mechanizmem naprawy oraz warunkami, jakie muszą zaistnieć, by doszło do wydajnej rewersji uszkodzonej zasady. AlkB preferuje łączenie się z fragmentem cząsteczki DNA na odcinkach, gdzie tworzy ono formę jednoniciową. Wynika to faktu, że pojedyncza nić DNA jest znacznie bardziej elastyczna i dzięki temu dopasowuje się do narzuconej przez białko „formy”, czyli zagłębienia w strukturze proteiny, do której wsuwa się DNA. Problem z badaniami białek podobnych do AlkB polega na tym, że wiążą one docelową cząsteczkę bardzo słabo, przez co trudno jest obserwować ich strukturę w stanie odpowiadającym wykonywaniu swojego zadania. Z tego powodu przeprowadzono specjalny proces, w którym zmuszono DNA i AlkB do połączenia się ze sobą silnymi wiązaniami chemicznymi, przez co ustabilizowano ich wzajemne położenie. Połączone ze sobą cząsteczki poddano analizie krystalograficznej, tzn. określono dokładnie rozkład przestrzenny atomów wewnątrz cząsteczek. Udało się dzięki temu zdefiniować tzw. miejsca aktywne w strukturze AlkB, których zablokowanie powinno znacząco obniżyć aktywność proteiny. Białko AlkB uczestniczy w naprawie uszkodzeń, które są preferencyjnie generowane w ssDNA. Enzym ten kontroluje materiał genetyczny podczas replikacji i transkrypcji (Begley TJ, Samson LD, 2003). Naprawia również 1-meA i 3-meC w RNA (Aravind L, Koonin EV, 2001), które prowadzą do śmierci komórek, 37 zarówno bakteryjnych, jak i ludzkich (Kataoka H i in., 1983; Chen BJ i in., 1994). Usuwaniu uszkodzeń przez białka AlkB towarzyszy generowanie formaldehydu w mieszaninie reakcyjnej, który może dodatkowo uszkadzać DNA (Lutz WK, 1990), co sugeruje, że podczas naprawy z udziałem białek AlkB mogą powstawać wtórne uszkodzenia. Komórki jednak wykształciły mechanizmy zapobiegające ich powstawaniu lub usuwające takie modyfikacje. Zarówno AlkB, jak i hABH2, usuwają tzw. grupy alkilowe, powstające w wyniku reakcji z prostymi związkami organicznymi. Proces dołączania grup alkilowych jest niezwykle groźny dla stabilności genetycznej komórki. Stanowi zagrożenie nie tylko dla prawidłowo funkcjonujących komórek, ale także dla komórek nowotworu, które nie potrafią odtworzyć powstających uszkodzeń. Problem pojawia się gdy nowotwór jest wyposażony w skuteczny system naprawy DNA – może się on wówczas skutecznie bronić przed chemioterapią. Z tego powodu trwają poszukiwania nad sposobami ograniczenia aktywności systemów naprawczych wewnątrz guza. Mogłoby to znacznie zwiększyć skuteczność leczenia chorób nowotworowych. 38 II. Cel pracy Celem pracy było zbadanie specyficzności substratowej homologów AlkB w stosunku do adduktów egzocyklicznych. Wykorzystano tu modyfikujące własności aldehydu chlorooctowego i akroleiny. Naprawa powodowanych przez nie uszkodzeń przebiega w sposób bezpośredni - bez naruszania ciągłości nici DNA. Przedmiotem badań były wyizolowane i oczyszczone białka SC-1A i SC-2B ze szczepu Streptomyces coelicolor oraz XC-1B i XC-2B ze szczepu Xanthomonas campestris, stanowiące homologi EcAlkB. Dzięki przeprowadzonym doświadczeniom wyznaczono optymalne warunki naprawy egzocyklicznych uszkodzeń zasad DNA przez białko SC-1A. 39 III. Materiały i metody III.1. Materiały III.1.1. Odczynniki Kwas octowy (CH3COOH, AcOH) – POCh Octan sodu (NaCOOH) – Chempur Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazino-1-etanosulfonowy (HEPES) – Sigma Bis-Tris – Sigma Ditiotreitol (DTT) – Sigma Wodorotlenek sodu (NaOH) – Stanlab Kwas solny (HCl) – Chempur Trietyloamina (TEA, Et3N) – Merck Metanol (CH3OH, MeOH) – Lab-scan 2-oksoglutaran (α-ketoglutaran, αKG) – Fluka Sześciouwodniony siarczan amonowo-żelazawy (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O – Fluka Aldehyd chlorooctowy (CAA) – Fluka Akroleina (ACR) – Fluka Odczynniki do elektroforezy Żel rozdzielający (15%): 30% akrylamid - 2,5ml – Fluka 1,5M Tris (pH 8.8) – 1,3ml 10% SDS – 0,05ml miliQ H2O – 1,1ml 10% nadsiarczan amonu (APS) - 0,05ml – Bio-Rad N, N, N’ N’ - tetrametyletylenodiamina (TEMED) – 0,002ml - Fluka Żel zagęszczający (4,5%): 30% akrylamid – 0,17ml 1M Tris (pH 6,8) – 0,13ml 10% SDS – 0,01ml miliQ H2O – 0,68ml 10% nadsiarczan amonu (APS) – 0,01ml 40 N, N, N’ N’ - tetrametyletylenodiamina (TEMED) – 0,001ml Marker SigmaMarker™ Low Range (M.W. 6,500 - 66,000) – Sigma Barwnik Coomasie Brillant Blue G – 250 0,2 % Coomasie Brillant Blue G – 250 45 % metanol 10 % kwas octowy Odbarwiacz 25 % metanol 10 % kwas octowy III.1.2. Bufory III.1.2.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka Bufor sodowo-fosforanowy 160mM pH 7,4 Bufor do wiązania (BB) pH 7,4 Bufor do elucji (EB) pH 7,4 Bufor do przechowywania (ST) pH 7,4 Bufor do elektroforezy SDS-PAGE (pH 8,3) 0,125M Tris/HCl pH 8,3 0,96M glicyna 0,5% SDS Bufor Laemmli’ego (pH 6,8) 0,25M Tris/HCl pH 6,8 50% glicerol 25% β-merkaptoetanol 10% SDS 0,05% błękit bromofenolowy Bufor do dializy (pH 7,4) 40mM Tris/HCl pH 7,4 200mM NaCl 10% glicerol 5mM DTT 1mM PMSF 41 III.1.2.2. Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka 0,5M bufor octanowy w zakresie pH 4,2 – 5,6 0,5M HEPES w zakresie pH 6,8 – 7,8 0,5M Bis-Tris w zakresie pH 5,8 – 7,0 1,5M TEAB pH ok. 7-8 (węglan trietyloaminy) Bufor TE pH 7,8 (10mM Tris-HCl pH 7,8 + 1mM EDTA pH 8,0) Bufor kakodylanowy pH 6,5 – (CH3)2AsO2Na x 3H2O (BDH) Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej 1M TEAA (octan trietyloaminy) pH ok. 6,5 30% metanol w H2O III.1.3. Pentamery TTATT – Metabion, Martinsried, Germany TTCTT – Metabion, Martinsried, Germany III.1.4. Enzymy Preparaty oczyszczonych białek EcAlkB, SC-1A, SC-2B, XC-1B i XC-2B (His-tag) otrzymano w Zakładzie Biologii Molekularnej IBB PAN wykorzystując plazmid pET28a. Plazmid niosący sklonowany gen alkB z E. coli otrzymano z pracowni prof. Seeberga (Uniwersytet w Oslo), natomiast plazmidy pET28a niosące sklonowane geny białek SC-1A, SC-2B, XC-1B i XC-2B z pracowni prof. Falnesa (Uniwersytet w Oslo). Plazmidem transformowano szczep E. coli BL21 (DE3). Białko SC-1A zostało oczyszczane z ekstraktu komórkowego poprzez chromatografię powinowactwa (zob 3.9.). Białko SC-2B zostało oczyszczone w Zakładzie Biologii Molekularnej przez dr Jadwigę Nieminuszczy, a XC-1B i XC-2B przez mgr Annę Domańską. III.1.5. Antybiotyki Kanamycyna – Sigma 42 III.1.6. Pożywki Pożywka LB płynna 0,5 % NaCl 0,5 % ekstrakt drożdżowy 1 % trypton Pożywka LB stała Podłoże LB płynne z dodatkiem 1 % agaru III.1.7. Aparatura III.1.7.1. Aparatura do oczyszczania białek Zestaw do chromatografii niskociśnieniowej Äcta prime (Amersham) Kolumna niklowa HisTrap (Amersham) Spektrofotometr: Cary 3 UBV – Visible Spectrophotometer Varian Spektrofotometr ULTROSPEC PLUS 4054 UV/VISIBLE Spectrophotometer LKB BIOCHROM Wytrząsarka Elektroporator: TransPorator Plus - BTX Wirówka J2-21M/E – Beckman Wirówka miniSpin – Eppendorf Sonikator Branson Sonifier 250 pH-metr - inoLab III.1.7.2. Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez badane białka HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) firmy Knauer na bazie systemu podwójnego, zapewniającego gradient dwuskładnikowy, obsługiwany przez program EuroChrom Basic Edition (wersja 3.05) i wyposażony w detektor UV. Zarówno analityczny, jak i preparatywny rozdział próbek przeprowadzono na kolumnach: - Waters Nova-Pak® C18, 60Å, 4μm, 4,6mm x 250mm, z prędkością przepływu 1 ml/min. - HR C18, 60Å, 6μm, 3,9mm x 300mm, z prędkością przepływu 1,75 ml/min. z użyciem liniowego gradientu 20mM octanu trietyloaminy o pH 6,5 x 30% MeOH w wodzie przez 30 minut i detekcją UV przy długości fali 270nm 43 Spektrofotometr: Cary 3 UBV – Visible Spectrophotometer Varian Wirówka miniSpin – Eppendorf pH-metr – MeterLab® III.1.8. Inne materiały kuwety do elektroporacji – Bio-Rad kuwety do spektrofotometrii – Medlab szyby 14cm x 16cm z przekładkami i grzebieniem 0,4mm bibuła 3mm – Whatman folia spożywcza do przykrywania żeli papierki wskaźnikowe – MERCK III.2. Metody III.2.1. Sporządzanie buforów Wszystkie bufory zostały wykonane na bazie wody dejonizowanej mQ. • W celu sporządzenia 400ml buforu wiążącego (BB) zmieszano 50ml buforu sodowo-fosforanowego z 2ml 10mM imidazolu i uzupełniono wodą miliQ, stabilizując kwasem solnym pH do wartości 7,4. • Bufor do elucji (EB) wykonano mieszając 12,5ml tego samego buforu sodowofosforanowego z 25ml 500mM imidazolu i uzupełniając wodą do 100ml, pH ustabilizowano również do wartości 7,4. Tak przygotowane bufory BB i EB schłodzono. • Bufor do przechowywania (ST) uzyskano przez zmieszanie 40mM Tris/HCl, 200mM NaCl, 10% glicerolu i ustabilizowaniu pH do wartości 7,4. • Z przygotowanych wcześniej 0,5M buforów: octanowego, HEPES i Bis-Tris sporządzono 0,2M bufory. Do każdego z nich dodano 5mM DTT w objętości 5μl/ml. • Przygotowanie 1M octanu trójetyloaminy (TEAA) pH ~ 6,5 I° Destylacja TEA: Do kolby (o objętości 500ml) z TEA ~ 300ml wrzucono kilka sit molekularnych („porcelanek”) i ogrzano do wrzenia. Następnie obniżono temperaturę. Zebrano właściwy produkt TEA oraz przedgon (do ustabilizowania się temperatury niższej niż 90ºC) w objętości około 200ml. Wyłączono transformator i pozostawiono wszystko do wystygnięcia. 44 II° Schłodzono 1 mol (139,2 ml) destylowanej trójetyloaminy (Et3N, TEA), 1 mol (57,5 ml) 17,4M kwasu octowego (AcOH) i 700 ml H2O mQ. Zlewkę z wodą wstawiono w łaźni lodowej na mieszadło. Dodano TEA, który pływał po powierzchni jak olej. Kontrolowano pH powoli dodając AcOH aż do uzyskania wartości 6,5. Uzupełniono wodą do 1000 ml. Całość przesączono na sączku do HPLC. Do rozdziałów chromatograficznych używano 20mM TEAA. III.2.2. Elektroforeza białkowa Białka obecne we frakcjach zebranych podczas oczyszczania (osad bakterii nieidukowanych IPTG oraz supernatant przed nałożeniem na złoże, a także frakcje zebrane po dializie) zostały rozdzielone elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS-PAGE (warunki denaturujące). Zastosowano metodę według modyfikacji Laemmli’ego, czyli w tzw. systemie nieciągłym, gdzie żel składa się z dwóch części – górnej, o niższym stężeniu akrylamidu, 4,5% i pH 6,8, która służy do zagęszczenia białek oraz dolnej, zawierającej 15% akrylamid o pH 8,8, w której dochodzi do rozdziału białek w zależności od ich wielkości. Przed nałożeniem na żel do próbek o objętości 5µl dodano 5x stężony bufor Laemmli’ego (1,5µl). Elektroforezę prowadzono w buforze do elektroforezy SDSPAGE (1x) pod napięciem 200 V do momentu wyjścia barwnika z żelu. W celu oceny wielkości białka na żelu rozdziałowi poddano także marker wielkości białek SigmaMarker™ Low Range w zakresie 6,5 - 66 kDa. Po rozdziale białka barwiono Coomassie Brillant Blue G-250. Po 30 minutach barwnik zlewano, a żel umieszczano w odbarwiaczu, który zmieniano kilkakrotnie, aż do całkowitego odbarwienia się tła. III.2.3. Przygotowanie komórek kompetentnych i transformacja bakterii III.2.3.1. Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem pET28a/alkB Dwa eppendorfy zawierające po 100μl kompetentnych komórek bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) rozmrożono na lodzie. Jeden z nich stanowił kontrolę negatywną, do drugiego natomiast dodano 1μl plazmidu pET28a/pSC. Tak przygotowaną mieszaninę transformacyjną przenoszono do schłodzonej w lodzie kuwety, którą następnie wstawiano do elektroporatora i poddawano działaniu 45 impulsu elektrycznego o napięciu 2,5 kV/cm. Następnie do mieszaniny transformacyjnej dodawano 1ml LB i inkubowano przez 1 godz. w 37ºC w celu wyrażenia genu oporności na kanamycynę. Mieszaninę bakteryjną po transformacji wysiano na płytki ze stałym podłożem LB zawierającym kanamycynę o końcowym stężeniu 50 μg/ml, inkubowano przez noc w temperaturze 37ºC, a następnie sprawdzano na płytkach obecność transformantów jak również brak wzrostu na kontroli negatywnej. III.2.3.2. Ekspresja białka SC-1A w szczepie E. coli BL21 (DE3) W celu wyrażenia SC-1A pojedynczą kolonią szczepu E. coli BL21 (DE3) pET28aSC-1A, niosącego plazmid kodujący białko AlkB pET28a-SC-1A zaszczepiano 100ml płynnej pożywki LB z dodatkiem kanamycyny (50μg/ml). Bakterie hodowano w 37ºC z wytrząsaniem 200 rpm przez noc. Po tym czasie nastąpiło przeniesienie hodowli do świeżej pożywki (3 x 1 litr): do każdej kolby zawierającej 1 litr płynnej pożywki LB z kanamycyną dodano 20 ml hodowli nocnej, a zawartości kolb połączono. Całość wstawiono do 37ºC z wytrząsaniem na ok. 2,5 godziny do momentu osiągnięcia gęstości OD600=0,6. Z zawiesiny bakterii pobrano 1 ml co stanowiło kontrolę nieindukowaną. Pozostałą część chłodzono w 16ºC w chłodni, a następnie w celu zaindukowania ekspresji białka dodano izopropylo-βtiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 0,1mM. Po indukcji bakterie hodowano przez 16 godzin w 16ºC z wytrząsaniem 150 rpm. Po tym czasie hodowle wirowano (6000 rpm w 4ºC przez 15 min), supernatant odrzucono, a osady zamrożono w -20ºC. III.2.3.3. Dysrupcja komórek Do osadu komórek bakteryjnych, w którym uzyskano nadekspresję rekombinowanego białka SC-1A, dodano β-merkaptoetanol (70μl/100ml) i PMSF (1ml/100ml). Całość następnie zawieszono w 60 ml buforu wiążącego pH 7,4 (20mM bufor fosforanowy, 0,5M NaCl, 10mM imidazol). Tak przygotowaną zawiesinę przeniesiono do falkonów i umieszczono w ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia, a potem rozmrożono zimną, bieżącą wodą. W dalszej części (po przeniesieniu zawartości falkonów do dwóch zlewek i umieszczeniu w łaźni lodowej) komórki sonikowano 2 razy po 3 minuty za pomocą ultradźwięków o energii 250 W, przy użyciu sonikatora Branson Sonifier 250. Po sonikacji próbki 46 zwirowano z prędkością 12000 x g/10 min w 4ºC (ultrawirówka Beckman J2-21M/E), natomiast supernatant zebrano i przefiltrowano przez filtr celulozowonitrowy 0,2μm (Milipore), a osad odrzucono. III.2.2. Oczyszczanie białka SC-1A Plazmid bakteryjny pSC kodujący białko SC-1A (homolog AlkB) otrzymano od prof. Seeberga z Uniwersytetu w Oslo. Plazmid pET28a/SC zawierał wklonowaną sekwencję cDNA kodującą białko SC-1A. Wszystkie etapy oczyszczania białka przebiegały w temperaturze 4ºC. Supernatant nakładano na kolumny ze złożem niklowym HisTrap (Amersham) z wykorzystaniem urządzenia Äcta Prime. Następnie białko eluowano w buforze elucyjnym gradientem stężenia imidazolu od 10mM do 0,5M. Zebrane frakcje zachowano do dalszej analizy, zaś frakcje, zawierające SC-1A zostały poddane dializie do buforu do przechowywania 2xST (storage buffer) pH 7,4 (40mM TrisHCl, 200mM NaCl, 10% glicerol). Po dializie dodano glicerol do końcowego stężenia 50%. III.2.3. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford Wykonano trzy powtórzenia każdego pomiaru, a ostateczny wynik stanowił średnią arytmetyczną wszystkich wyników dla danej frakcji. Do pomiaru pobierano 5μl każdej z analizowanych frakcji, rozcieńczano w kuwetach zawierających po 795μl sterylnej wody miliQ, dodawano 200μl odczynnika Bradford, mieszano i odstawiano na 10 minut w ciemności. Po tym czasie mierzono absorbancję roztworów przy długości fali 595 nm względem kontroli, którą stanowiła mieszania 800μl wody i 200μl odczynnika Bradford. Stężenie białka w poszczególnych frakcjach określano na podstawie krzywej wzorcowej. Oczyszczone białka przechowywano w temperaturze -80ºC. III.2.4. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka III.2.4.1. Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksyetanocytozynę TT(HEC)TT i TT(εC)TT w reakcji pentameru TTCTT z aldehydem chlorooctowym (CAA) Do 1,5M buforu TEAB pH ok. 7-8 w objętości 276,5μl dodano 12,5μl pentameru TTCTT o stężeniu 2 OD/μl (555nmoli) oraz 29,75μl (180μmol) 45% roztworu aldehydu chlorooctowego (CAA). Całość wymieszano i inkubowano w 37°C przez 47 2,5 h. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną, zawierającą nieprzereagowany TTCTT oraz TT(HEC)TT i TT(εC)TT, oczyszczano za pomocą HPLC na kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą objętość reakcji. Zebrane frakcje zawierające TT(HEC)TT poddano pomiarowi absorbancji w celu określenia stężenia oligomeru, a następnie rozdziałowi za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej (nakładano 1nmol substancji). Do frakcji zawierającej czysty TT(HEC)TT dodano 1M bufor kakodylanowy pH 6,5, zliofilizowano, następnie rozpuszczono w buforze TE do stężenia 500pmoli/μl i przechowywano w temp. - 20ºC. Natomiast frakcje zawierające mieszaninę TT(HEC)TT i TT(εC)TT poddano procesowi dehydratacji przez ogrzewanie 72 godz. w 37ºC w pH 6,5. III.2.4.2. Otrzymywanie substratu zawierającego hydroksypropanocytozynę TT(HPC)TT w reakcji pentameru TTCTT z akroleiną (ACR) Do 1M buforu octanowego (pH 4,5) w objętości 214μl dodano 5μl pentameru TTCTT o stężeniu 2 OD/μl (222nmoli) oraz 39μl (1nmol) akroleiny (ACR). Całość inkubowano w 37°C przez 4 h. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną oczyszczano za pomocą HPLC na kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą objętość reakcji. Zebrane frakcje zawierające TT(HPC)TT poddano pomiarowi absorbancji w celu określenia stężenia oligomeru, a następnie rozdziałowi za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej (nakładano 1nmol substancji). Frakcje zawierające pożądany produkt połączono i zliofilizowano, a w dalszej kolejności rozpuszczono w buforze TE do stężenia 500pmoli/μl. III.2.4.3. Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT w reakcji pentameru TTATT z aldehydem chlorooctowym (CAA) Substrat został zrobiony przez dr Agnieszkę Maciejewską z Zakładu Biologii Molekularnej IBB PAN. Po każdej modyfikacji wykonywano pomiar spektrofotometryczny zebranych w czasie rozdziału frakcji (1min. = 1000μl, bo przepływ 1ml/min.). I tak np. dla modyfikacji TTCTT x CAA maksymalne długości fal sześciu zmierzonych frakcji mieściły się w spodziewanym zakresie od λ max = 258,5 nm do λ max = 270 nm. 48 Modyfikacja TTCTT x CAA Absorbancja 0,12 0,1 Frakcja 1 0,08 Frakcja 2 Frakcja 3 0,06 Frakcja 4 0,04 Frakcja 5 0,02 Frakcja 6 0 230 250 270 290 310 Długość fali Dla modyfikacji TTCTT x ACR maksymalne długości fal pięciu zebranych i zmierzonych frakcji zawierały się w zakresie od λ max = 267,0 do λ max = 267,5 nm. Modyfikacja TTCTT x ACR 0,6 Absorbancja 0,5 Frakcja 1 0,4 Frakcja 2 0,3 Frakcja 3 Frakcja 4 0,2 Frakcja 5 0,1 0 230 250 270 290 310 Długość fali III.2.5. Badanie aktywności białek i wykonanie zależności Analogiczne zależności przeprowadzono z udziałem wszystkich badanych homologów EcAlkB, a więc u występujących u Streptomyces coelicolor białek SC-1A i SC-2B oraz u występujących u Xanthomonas campestris białek XC-1B i XC-2B. W tym celu przygotowano 0,2M bufory: Bis-Tris, HEPES i octanowy w różnych zakresach pH wraz z dodatkiem 1M DTT (5μl/ml). Reakcje prowadzono w zależności od pH buforu, stężenia jonów żelaza i stężenia α-ketoglutaranu. Doświadczenie z udziałem białek XC-1B i XC-2B przeprowadzono w stosunku do każdego z czterech rodzajów uszkodzeń zasad DNA. Aby sprawdzić czy i jak ilość 49 białka wpływa na stopień naprawy w reakcjach wykorzystano po 20pm i po 50pm każdego z tych dwóch białek. Objętości wszystkich mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. III.2.5.1. Zależność od pH Reakcje startowano przyporządkowanym danemu substratowi buforem o odpowiednim pH. Reakcje z TT(HEC)TT przeprowadzone zostały w zakresie pH od 5,8 do 7,0; reakcje z TT(HPC)TT w pH od 6,8 do 7,8; natomiast z TT(εC)TT i TT(εA)TT w warunkach od 4,2 do 5,6. Skład i ilość pozostałych komponentów reakcji były identyczne. α-ketoglutaran i jony żelaza (II) w postaci (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O dodawano tuż przed reakcją ze względu na ich nietrwałość. Stężenia jonów Fe(II) i αKG wynosiły odpowiednio: dla TT(εA)TT i dla TT(εC)TT – 3mM i 0,5mM; dla TT(HEC)TT – 0,5mM i 0,5mM; dla TT(HPC)TT – 0,05mM i 0,1mM. TT(HEC)TT Reakcje prowadzono w buforze Bis-Tris o pięciu wartościach pH: 5,8; 6,0; 6,2; 6,6 i 7,0. We wszystkich mieszaninach końcowe stężenia α-ketoglutaranu i świeżo przygotowanego żelaza (II) wynosiły po 0,5mM. Pozostałe składniki stanowiła woda miliQ, substrat TT(HEC)TT (500pm) oraz białko SC-1A (20pm). Analogiczną zależność wykonano również z udziałem białka SC-2B. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. TT(HPC)TT Reakcje prowadzono w buforze HEPES o pięciu wartościach pH: 6,8; 7,2; 7,4; 7,6 i 7,8. We wszystkich mieszaninach końcowe stężenia α-ketoglutaranu wynosiły 0,1mM, natomiast stężenia świeżo przygotowanego Fe (II) 0,05mM. Pozostałe składniki stanowiła woda miliQ, substrat TT(HPC)TT (500pm) oraz białko SC-1A (50pm). Analogiczna zależność została przeprowadzona z udziałem białka SC-2B, 50 z tym że użyto go w ilości 20pm. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch różnych ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm na reakcję. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. TT(εC)TT i TT(εA)TT Reakcje prowadzono w buforze octanowym o pięciu wartościach pH: 4,2; 4,6; 5,0; 5,4 i 5,6. We wszystkich mieszaninach końcowe stężenia α-ketoglutaranu wynosiły 0,5mM, natomiast stężenia świeżo przygotowanego żelaza (II) 3mM. Pozostałe składniki stanowiła woda miliQ, substrat TT(εC)TT (500pm) oraz białko SC-1A (100pm). Białka SC-2B użyto w ilości 50pm. Dla substratu TT(εA)TT seria reakcji miała analogiczny skład i przebieg. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm na reakcję. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. III.2.5.2. Zależność od stężenia jonów Fe(II) Szereg rozcieńczeń jonów żelaza (II) w postaci (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O przygotowywano z wyjściowego 100mM roztworu w celu porównania uzyskanych wyników i zminimalizowania błędu pipetowania. Pozostałe składniki były identyczne z używanymi wcześniej. TT(HEC)TT Dla białka SC-1A reakcje przeprowadzono w dwóch buforach: octanowym (pH 5,4) i Bis-Tris (pH 5,8; 6,2). Stężenia żelaza w każdej reakcji wynosiły odpowiednio 0,1mM, 0,5mM, 1mM i 3mM, przy 20pm białka. Gdy rezultat okazał się niezadowalający wówczas zależność tę przeprowadzono w buforze Bis-Tris (pH 5,8), zwiększając ilość białka SC-1A do 50pm. Pozostałe składniki stanowiły: 51 α-ketoglutaran (50μM), woda miliQ i substrat TT(HEC)TT (500pm). W przypadku zaś białka SC-2B stężenia jonów żelaza (II) w poszczególnych reakcjach wynosiły: dla TT(HEC)TT 0,1; 0,25; 0,5; 1 i 2mM, stężenie α-ketoglutaranu we wszystkich reakcjach było równe 100μM, ilość użytego białka była także wynosiła 20pm. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. TT(HPC)TT Podczas badania naprawy THPC z użyciem białka SC-1A połączono dwie zależności: od pH i stężenia Fe. Zastosowano bufor HEPES w następujących zakresach pH: 6,8; 7,4 i 7,6. Stężenie αKG było równe 100μM w każdej reakcji, natomiast stężenia żelaza wynosiły odpowiednio 10μM, 50μM, 100μM, 250 μM, 500μM i 750μM. Pozostałe składniki stanowiła woda, substrat TT(HPC)TT (500pm) i enzym (100pm). Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody (schłodzonej w łaźni lodowej) i zamrożenie (w temp. - 20ºC). Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. TT(εA)TT Reakcje naprawy TεA przez białko SC-1A przeprowadzono w buforze octanowym o pH 5,0. Użyte stężenie αKG było równe 50μM, natomiast stężenia Fe (II) wynosiły 0,5mM, 1mM, 2mM, 3mM, 5mM i 7mM. Pozostałe składniki stanowiła woda, substrat TT(εA)TT (500pm) i enzym (100pm). Dodanie enzymu stanowiło moment rozpoczęcia reakcji. Zależność od żelaza w przypadku białka SC-1B wykonano stosując następujące stężenia Fe (II): 0,5; 1; 2; 3 i 5mM. Stężenie αKG było równe 100μM i użyto 50pm białka. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 52 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. TT(εC)TT Reakcje naprawy TT(εC)TT wykonane zostały dla białek: SC-1A, SC-2B, XC-1B i XC-2B. W przypadku SC-2B użyte stężenia jonów żelaza (II) w poszczególnych reakcjach wynosiły: 0,5; 1; 2; 3 i 5mM, stężenie αKG było równe 100μM, natomiast białka użyto 50pm. Zależność ta z zastosowaniem białek XC-1B i XC-2B została przeprowadzona przy dwóch ilościach każdego z nich: 20pm i 50pm. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. III.2.5.3. Zależność od stężenia αKG Dla trzech substratów (TT(HEC)TT, TT(HPC)TT i TT(εA)TT) przeprowadzona została niniejsza zależność w optymalnych pozostałych warunkach reakcji (oddzielnych dla każdego substratu), a więc dla THEC – bufor Bis-Tris pH5,8, Fe(II) 0,5mM; dla THPC – bufor HEPES pH 6,8 i 7,4 (celem ostatecznego rozstrzygnięcia optymalnego pH), Fe(II) 0,05mM oraz dla TεA – bufor octanowy pH 5,0, Fe(II) 3mM. Stężenia α-ketoglutaranu w szeregu reakcji dla każdego z uszkodzeń wynosiły 0μM, 10μM , 25μM, 50μM, 100μM i 250μM. Pozostałe składniki dla poszczególnych mieszanin reakcyjnych były takie same: woda, substrat i białko SC-1A. Każdego z substratów zastosowano w ilości 500 pm na reakcję, natomiast białka SC-1A odpowiednio dla TT(HEC)TT 50 pm oraz dla TT(HPC)TT i TT(εA)TT po 100 pm. Reakcji tych nie przeprowadzono z użyciem białek: SC-2B, XC-1B i XC-2B. Objętości mieszanin reakcyjnych były równe 20μl, a ich inkubacja (w temp. 37ºC) trwała 30 minut. Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano poprzez dodanie 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono na drodze rozdziału analitycznego na HPLC. 53 IV. Wyniki IV.1. Oczyszczanie białka SC-1A Plazmid pET28a/pSC wtransformowano do komórek elektrokompetentnych szczepu E. coli BL21 (DE3). Jedną z uzyskanych kolonii zaszczepiono w płynnej pożywce LB z dodatkiem kanamycyny (50μg/ml). Namnożono hodowlę bakteryjną szczepu Streptomyces coelicolor niosącego plazmid pET28a/pSC-1A, nadprodukujący białko SC-1A. Zebrany osad sonikowano 2 razy po 3 minuty za pomocą ultradźwięków o energii 250 W przy użyciu sonikatora Branson Sonifier 250. Nałożono na kolumnę niklową HisTrap (Amersham), którą umieszczono w zestawie do chromatografii niskociśnieniowej Äcta prime (Amersham). Analizę jakościową frakcji zebranych podczas oczyszczania białka SC-1A metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie niklowej HisTrap przeprowadzono poprzez poddanie otrzymanych próbek rozdziałowi elektroforetycznemu w buforze standardowym do SDS-PAGE: kDa M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 66 45 36 29 24 20,1 6,5 Zdjęcie 2. Żel przedstawiający rozdział frakcji zebranych podczas oczyszczania białka SC-1A barwionego Coomasie Brilliant Blue G-250 M - Marker masy cząsteczkowej M3913-1VL 2 – frakcja 13 SC-1A 3 – frakcja 14 SC-1A 54 4 – frakcja 15 SC-1A 5 – osad 6 – ekstrakt 7 – frakcja 3 – wyciek 8 – frakcja 8 – płukanie 9 – frakcja 13 10 – frakcja 17 Otrzymane w wyniku oczyszczania frakcje białka SC-1A charakteryzowały się różną czystością. Dlatego w doświadczeniach wykorzystano najbardziej czystą – frakcję 15 (pozycja nr 4 na zdjęciu żelu), posiadającą sekwencję aminokwasową pełnej długości. Białko w tej frakcji migruje na wysokość 25 kDa, czyli dokładnie tak, jak miało to miejsce w pracy van den Born E i in., 2009. W celu zmierzenia zawartości białka dokonano pomiaru absorbancji przy długości fali λ=595 nm z zastosowaniem odczynnika Bradford. Stężenie białka w poszczególnych frakcjach określono na podstawie krzywej wzorcowej. Uzyskano 2 ml białka SC-1A o gęstości 7 µg/µl (7000 ng/µl, 292,9 pm/µl). IV.2. Modyfikacja pentametrów zwierających cytozynę W pierwszej kolejności uzyskano dwie pochodne pentameru zawierającego cytozynę (TTCTT). Były to pochodne hydroksyetenocytozyny (HEC) i hydroksyporpanocytozyny (HPC), powstałe odpowiednio w reakcjach z aldehydem chlorooctowym (CAA) i akroleiną (ACR). Kolejny etap polegał na oczyszczeniu interesujących produktów za pomocą preparatywnego rozdziału na HPLC, w wyniku którego otrzymano czyste pochodne. Do pochodnej pentameru zawierającej cytozynę zaliczyć można również etenocytozynę (εC), która powstaje w wyniku dehydratacji HEC, a która używana była także jako substrat dla badanych białek. IV.2.1. Uzyskanie pentameru zawierającego hydroksypropanocytozynę TTCTT + ACR → TT(HPC)TT (hydroksypropanocytozyna) Po reakcji TTCTT z akroleiną w 1M buforze octanowym o pH 4,6 i 3,5 godz. inkubacji w temperaturze 37°C otrzymano całkowite przekształcenie cytozyny do hydroksypropanocytozyny (HPC). Wydajność reakcji wynosiła 100% (Rysunek 11). 55 Do monitorowania postępu reakcji oraz czystości otrzymanej pochodnej zastosowano technikę HPLC. Na kolumnę analityczną nałożono 1nmol mieszaniny reakcyjnej. [mAU] TC5 x ACR 1nmol 18.11.2009 25,78 2 50 13,35 Absorbance 1 40 30 3 20 27,45 10 0 0 5 10 15 20 25 30 [min.] Time Rysunek 11. Rozdział analityczny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT akroleiną. Pik 13,35 min – akroleina; 25,78 min – uzyskany produkt, pentamer TT(HPC)TT; 27,45- niezidentyfikowany, uboczny produkt reakcji W celu sprawdzenia uzyskanego produktu dodano 500 pm substratu TTCTT i poddano rozdziałowi na HPLC. [mAU] TCxACR reakcja +TC5 po 500pm18-lis-2009 50 5 25,18 24,47 4 60 3 30 14,58 Absorbance 40 8 9 30,03 7 26,95 28,22 6 26,13 7,77 4,10 10 2 1 20 0 0 5 10 15 20 25 Time Rysunek 12. Kontrola – mieszanina reakcyjna wraz z substratem TTCTT. Pik 14,58 min – akroleina; 24,47 min – substrat TTCTT (TC5); 25,18 min – TT(HPC)TT; pozostałe piki stanowią uboczne produkty reakcji 56 30 [min.] Następnie całość mieszaniny reakcyjnej nałożono na kolumnę preparatywną. [AU] 3 8 24,87 11,93 13,33 1 10 1,0 27,28 Absorbance 1,5 12,62 2 TC5 x ACR calosc 18.11.2009 11 28,37 23,17 9 22,35 26,38 6 7 5 20,63 16,68 4 0,5 0,0 0 5 10 15 20 25 30 [min.] Time Rysunek 13. Rozdział preparatywny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT akroleiną. Zebrano jedną frakcję 24-26 min zawierającą TT(HPC)TT. IV.2.2. Uzyskanie pentamerów zawierających hydroksyetanocytozynę i etenocytozynę TTCTT + CAA → TT(HEC)TT/TT(εC)TT (hydroksyetanocytozyna/etenocytozyna) Po potraktowaniu TTCTT aldehydem chlorooctowym w 1,5M buforze TEAB o pH ok. 7-8 przez 3,5 godz. w temperaturze 37°C uzyskano głównie hydroksyetenocytozynę (HEC), natomiast etenocytozyna (εC) jest produktem wtórnym powstającym wskutek spontanicznej dehydratacji HEC. Modyfikacja ta miała na celu wygenerowanie uszkodzeń: etenocytozyny i jej prekursora hydroksyetanocytozyny. Po 3,5 godz. inkubacji uzyskano modyfikację na poziomie 72,3%. 57 Przeprowadzono rozdział 1,5 nmola mieszaniny reakcyjnej na kolumnie półpreparatywnej HR. Chromatogram miał następujący obraz: [mAU] TCxCAA 1,5nmola 27-sty-2010 3 27,13 Absorbance 24,95 30 25,83 1 2 40 20 10 0 0 5 10 15 20 25 30 Time Rysunek 14. Rozdział reakcji modyfikacji pentameru TTCTT aldehydem chlorooctowym. Pik 24,95 min – niezmodyfikowana cytozyna w formie pentameru TTCTT; 25,83 min – zmodyfikowana TT(HEC)TT; 27,13 min – TT(εC)TT W wyniku reakcji substytucji nukleofilowej aldehydu chlorooctowego z cytozyną powstaje HEC. Półokres jej dehydratacji w temperaturze 37 C i w pH 6,5 wynosi 72 godz. Egzocykliczny mostek hydroksyetanowy po dehydratacji zmienia się w ugrupowanie etenowe. Obie dodatkowe grupy blokują tworzenie prawidłowych wiązań wodorowych, przez co mogą prowadzić do mutacji. 58 [min.] W tym wypadku również dokonano rozdziału preparatywnego całości próbki: 3 4 24,67 5 6 7 26,65 1,0 27,50 Absorbance 22,90 1 1,5 TCxCAA całość prep 27-sty-2010 23,53 2 25,53 [AU] 30,83 0,5 0,0 0 5 10 15 20 25 30 Time Rysunek 15. Rozdział preparatywny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT aldehydem chlorooctowym. Zebrano frakcje zawierające TT(HEC) i TT(εC)TT. IV.3. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-1A W celu zbadania aktywności naprawczej bakteryjnych homologów EcAlkB przeprowadzono szereg doświadczeń na substratach DNA zawierających cztery rodzaje uszkodzeń: 3,N4-α-HPC, 3,N4-α-HEC, 1,N6-εA oraz 3,N4-εC. Reakcje prowadzono przez 30 min. wykorzystując różne ilości białek, tzn. 20, 50 i 100 pm. Po inkubacji bakteryjnych homologów EcAlkB z substratami zawierającymi egzocykliczne addukty, konieczne było odróżnienie oligomerów naprawionych od uszkodzonych. W przeprowadzonych doświadczeniach wykorzystano technikę rozdziału substancji – wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Przed wykonaniem właściwych doświadczeń sprawdzono czy przechowywanie białka SC-1A ma wpływ na jego aktywność. W tym celu obydwu białek użyto w ilości 100 pm, a wszystkie reakcje prowadzono w 0,5mM stężeniu αKG. Stężenia jonów Fe(II) i pH dobrano odpowiednio do poszczególnych substratów: dla TT(HEC)TT – 0,5mM Fe(II), pH 6,0; dla TT(εC)TT – 3mM Fe(II), pH 4,6; dla TT(εA)TT – 3mM Fe(II), pH 4,6 oraz dla TT(HPC)TT – 100mM Fe(II), pH 7,5. 59 [min.] Aktywność SC-1A (próba pierwsza) 25 % naprawy 20 15 substrat 10 5 0 THEC TεC TεA THPC substrat (uszkodzenie) Wykres 1. Sprawdzenie aktywności białka SC-1A Po 3-miesięcznym przechowywaniu białka w -80ºC, a substratów w -20ºC reakcje powtórzono zachowując poprzednie warunki. Aktywność spadła tylko w przypadku TT(εC)TT, wzrosła zaś przy naprawie TT(HPC)TT, przy pozostałych substratach utrzymuje się na w miarę stałym poziomie. Aktywność SC-1A (próba druga) 25 % naprawy 20 15 substrat 10 5 0 THEC TεC TεA THPC substrat (uszkodzenie) Wykres 2. Sprawdzenie aktywności białka SC-1A trzy miesiące później 60 IV.3.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od pH reakcji TT(εA)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 4,2 do 5,6. W reakcjach użyto 3mM stężenia jonów Fe(II), 0,5mM stężenia αKG i 100 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano w pH 5,0. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 3. SC-1A - zależność naprawy TεA od pH 35 % naprawy 30 25 20 TεA 15 10 5 0 4,2 4,6 5 5,4 5,6 pH Wykres 3. Zależność naprawy TT(εA)TT od pH (białko SC-1A) [mAU] 24,38 Absorbance 4 25,03 5 2 1 SC1 O 5,0 eA Fe 3mM 10-gru-2009 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 [min.] Time Rysunek 16. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(εA)TT przez białko SC-1A. Pik 24,38 min reprezentuje produkt naprawy: TTATT, pik 25,03 min nienaprawiony TT(εA)TT. Wyjściowy substrat do reakcji zawierał 85,9% TT(εA)TT, po reakcji jest go 56,3% 61 TT(HEC)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 5,8 do 7,0. W reakcjach użyto 0,5mM stężenia jonów Fe(II), 0,5mM stężenia αKG i 20 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano w pH 5,8. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 4. SC-1A - zależność naprawy THEC od pH 16 14 % naprawy 12 10 8 THEC 6 4 2 0 5,8 6 6,2 6,6 6,8 7 pH Wykres 4. Zależność naprawy TT(HEC)TT od pH (białko SC-1A) [mAU] 20 Absorbance 24,40 1 15 25,37 2 SC1 BT 5,8 HEC Fe 0.5mM 09-gru-2009 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 Time Rysunek 17. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(HEC)TT przez białko SC-1A. Pik 24,40 min reprezentuje produkt naprawy: TTCTT, pik 25,37 min nienaprawiony TT(HEC)TT, a ostatni pik to TT(εC)TT. 62 [min.] TT(HPC)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 6,8 do 7,8. W reakcjach użyto 0,05mM steżęnia jonów Fe(II), 0,1mM stężenia αKG i 50 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano w pH 7,4. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 5. SC-1A - zależność naprawy THPC od pH 10 % naprawy 8 6 THPC 4 2 0 6,8 7,2 7,4 7,6 7,8 pH Wykres 5. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH (białko SC-1A) IV.3.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II) w reakcji TT(εA)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 0,5mM do 7mM. Reakcje przeprowadzono w pH 5,0, 50μM stężenia αKG, i 100 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano przy 3mM stężeniu jonów Fe(II). Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 6. 63 SC-1A - zależność naprawy TeA od stężenia Fe 100 % naprawy 80 60 TεA 40 20 0 0,5 1 2 3 5 7 stężenie Fe [mM] Wykres 6. Zależność naprawy TT(εA)TT od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A) Rysunek 18. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(εA)TT przez białko SC-1A. Pik 24,97 min reprezentuje produkt naprawy: TTATT, pik 25,62 min nienaprawiony TT(εA)TT. Wyjściowy substrat do reakcji zawierał 85,9% TT(εA)TT, po reakcji jest 64,9% TT(εA)TT TT(HEC)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 0,05mM do 3mM. Reakcje przeprowadzono w pH 5,8, przy 50μM stężeniu αKG i 50 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano przy 0,5mM stężeniu jonów Fe(II). Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 7. 64 SC-1A - zależność naprawy THEC od stężenia Fe 25 % naprawy 20 15 THEC 10 5 0 0,05 0,1 0,5 1 2 3 stężenie Fe [mM] Wykres 7. Zależność naprawy TT(HEC)TT od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A) Rysunek 19. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(HEC)TT przez białko SC-1A. Pik 23,93 min reprezentuje produkt naprawy: TTCTT, pik 24,92 min nienaprawiony TT(HEC)TT, a pik 26,32 min TT(εC)TT, powstały z dehydratacji TT(HEC)TT podczas trwania reakcji i rozdziału. Wyjściowy substrat do reakcji zawierał 72,3% TT(εC)TT, po reakcji jest 58,2% TT(εC)TT Wynik ten okazał się być adekwatny do przeprowadzonego wcześniej doświadczenia z użyciem 25pm EcAlkB (Wykres 8). 65 AlkB - naprawa THEC w zależności od stężenia Fe 80 70 % naprawy 60 THEC pH 5.8 50 THEC pH 6.0 40 THEC pH 6.2 30 THEC pH 6.6 20 10 0 0,05 0,075 0,1 0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 2,5 3 stęż. Fe [mM] Wykres 8. Zależność naprawy TT(HEC)TT od stężenia jonów Fe(II) (EcAlkB) TT(HPC)TT Postępując tym samym tropem z hydroksypropanocytozyny wykonano zastosowaniem najpierw białka zależność AlkB naprawy E.coli. Reakcje przeprowadzone zostały nie tylko w zależności od stężenia jonów Fe(II) lecz także w zależności od pH. W tym przypadku ilość EcAlkB wynosiła również 25pm. Wyniki doświadczenia przedstawiono na wykresie 9. AlkB - zależność naprawy THPC od pH i od stężenia Fe 80 % naprawy 70 60 6.8 50 7.2 40 7.4 30 7.6 20 7.8 10 0 10 25 50 100 250 500 stężenie Fe [uM] Wykres 9. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH i od stężenia jonów Fe(II) (EcAlkB) 66 Analogiczne wykonanie i przeprowadzenie reakcji naprawy THPC przez białko SC-1A pozwoliło uzyskać porównywalne wyniki (Wykres 10). Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 10μM do 750μM. Reakcje przeprowadzono w następujących zakresach pH: 6,8; 7,4 i 7,6, 100μM stężenia αKG, i 100 pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano przy 50μM stężeniu jonów Fe(II). Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 10. SC-1A - zależność naprawy THPC od pH i stężenia Fe 120 % naprawy 100 80 pH 6.8 60 pH 7.4 pH 7.6 40 20 0 10 50 100 250 500 750 stężenie Fe [uM] Wykres 10. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH i od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A) IV.3.3. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia αKG w reakcji TT(εA)TT, TT(HEC)TT, TT(HPC)TT W celu naprawy TεA, THEC, THPC reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń αKG od 0 μM do 250μM. Pozostałe warunki reakcji dla substratów: TT(εA)TT - pH 5,0, 3mM Fe(II) i 100pm SC-1A; TT(HEC)TT - pH5,8, 0,5mM Fe(II) i 50pm SC-1A; TT(HPC)TT - pH 6,8 i 7,4 (celem rozstrzygnięcia optymalnego pH), 0,05mM Fe (II) i 100pm SC-1A. Najlepszą naprawę uzyskano przy 10μM stężeniu αKG. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 11. 67 SC-1A - zależność naprawy THEC THPC TeA od stężenia aKG 80 70 % naprawy 60 THEC pH 5.8 50 THPC pH 6.8 40 THPC pH 7.4 30 TeA pH 5.0 20 10 0 0 10 25 50 100 250 stężenie aKG [uM] Wykres 11. Zależność naprawy TT(HEC)TT, TT(HPC)TT i TT(εA)TT od stężenia αketoglutaranu (białko SC-1A) Rysunek 20. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(HPC)TT przez białko SC-1A. Pik 24,28 min reprezentuje produkt naprawy: TTCTT, pik 26,00 min - nienaprawiony TT(HPC)TT. IV.4. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białko SC-2B Białko SC-2B jest drugim z homologów EcAlkB występującym u Streptomyces coelicolor. Przeprowadzono analizę aktywności TT(HEC)TT, TT(HPC)TT, TT(εC)TT i TT(εA)TT. 68 tego białka w naprawie IV.4.1. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od pH reakcji TT(εA)TT i TT(εC)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 4,2 do 5,6. W reakcjach użyto 3mM stężenia jonów Fe(II), 0,5mM stężenia αKG i 50 pm SC-2B. Najlepszą naprawę uzyskano w pH 5,0. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 12. % naprawy SC-2B - zależność naprawy TeA i TeC od pH 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 TεA TεC 4,2 4,6 5 5,4 5,6 pH Wykres 12. Zależność naprawy TT(εA)TT i TT(εC)TT od pH (białko SC-2B) TT(HEC)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 5,8 do 7,0. W reakcjach użyto 0,5 mM stężenia jonów Fe(II), 0,5mM stężenia αKG i 20 pm SC-2B. Najlepszą naprawę uzyskano w pH 6,2 i w pH 6,6. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 13. 69 SC-2B - zależność naprawy THEC od pH 10 % naprawy 8 6 THEC 4 2 0 5,8 6 6,2 6,6 6,8 7 pH Wykres 13. Zależność naprawy TT(HEC)TT od pH (białko SC-2B) TT(HPC)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie pH od 6,8 do 7,8. W reakcjach użyto 0,05 mM stężenia jonów Fe(II), 0,1mM stężenia αKG i 20 pm SC-2B. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 14. SC-2B - zależność naprawy THPC od pH 1,4 % naprawy 1,2 1 0,8 THPC 0,6 0,4 0,2 0 6,8 7 7,2 7,4 pH Wykres 14. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH (białko SC-2B) 70 7,6 7,8 IV.4.2. Zależność naprawy badanych uszkodzeń od stężenia jonów Fe(II) w reakcji TT(εA)TT Reakcje przeprowadzono w zakresie stężeń jonów Fe(II) od 0,5mM do 5mM. Reakcje przeprowadzono w pH 5,6, 100μM stężenia αKG i 50 pm SC-2B. Najlepszą naprawę uzyskano przy 3mM stężeniu jonów Fe(II). Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresie 15. SC-2B - zależność naprawy TεA w pH 5.6 od stężenia Fe 5 % naprawy 4 3 TεA pH 5.6 2 1 0 0,5 1 2 3 5 stężenie Fe [mM] Wykres 15. Zależność naprawy TT(εA)TT od stężenia jonów Fe(II) w pH 5,6 (białko SC-2B) Innych zależności z udziałem białka SC-2B nie wykonano. IV.5. Naprawa egzocyklicznych uszkodzeń DNA przez białka XC-1B i XC-2B Kolejno analizowanymi białkami były pochodzące od Xanthomonas campestris XC-1B i XC-2B. Reakcje naprawy substratów z ich udziałem, przy użyciu dwóch stężeń (20pm i 50pm), przeprowadzono w następujących warunkach. Dla naprawy TT(HPC)TT – w pH 7,4, 0,1mM stężeniu jonów Fe(II), 50μM stężeniu αKG; TT(εA)TT – w pH 5,0, 3mM stężeniu jonów Fe(II), 25μM stężeniu αKG; TT(εC)TT – w pH 5,0, 5mM stężeniu jonów Fe(II), 25μM stężeniu αKG. Uzyskane wyniki przedstawiono graficznie na wykresach 16 i 17. 71 Aktywność XC-1B (różne stęż.) 10 % naprawy 8 6 XC-1B 20pm XC-1B 50pm 4 2 0 THPC TεA TεC substrat Wykres 16. Aktywność białka XC-1B wobec TT(HPC)TT, TT(εA)TT i TT(εC)TT Aktywność XC-2B (różne stęż.) 10 % naprawy 8 6 XC-2B 20pm XC-2B 50pm 4 2 0 THPC TεA TεC substrat Wykres 17. Aktywność białka XC-2B wobec TT(HPC)TT, TT(εA)TT i TT(εC)TT Nie zaobserwowano naprawy 3,N4-α-hydroksyetanocytozyny (HEC) w tych warunkach reakcji. 72 V. Wnioski 1. Białko SC-1A jest homologiem AlkB naprawiającym takie uszkodzenia jak TT(HEC), TT(HPC)TT, TT(εA)TT. 2. Optymalne warunki naprawy: - dla TT(HEC)TT – pH 5,8, Fe 0,5mM, αKG 10μM; - dla TT(HPC)TT – pH 7,4, Fe 0,05mM (50μM), αKG 10μM; - dla TT(εA)TT – pH 5,0, Fe 3mM, αKG 10μM; - dla TT(εC)TT – brak naprawy. 3. Zarówno białko SC-2B, jak też białka XC-1A i XC-2B, w bardzo nieznacznym stopniu naprawiają egzocykliczne uszkodzenia zasad DNA w warunkach stosowanych w tej pracy. 73 VI. Dyskusja Naprawa DNA przez białko AlkB Escherichia coli zachodzi według bezprecedensowego mechanizmu, polegającego na usuwaniu uszkodzeń z zasady bez naruszania integralności nici DNA. Enzym ten utlenia grupy metylowe 1-metyloadeniny i 3-metylocytozyny w jednoniciowym DNA (ssDNA) (Trewick SC i in., 2002; Falnes PØ i Seeberg E, 2002), dwuniciowym DNA (dsDNA) oraz jednoniciowym RNA (ssRNA). AlkB usuwa także mostek etenowy z etenoadeniny bezpośrednio przekształcając ją w adeninę (Delaney JC i in., 2005; Mishina Y i in., 2005), oraz naprawia etenocytozynę i jej hydratowany prekursor hydroksyetanocytozynę, przywracając cytozynę (Maciejewska AM i in., 2010). Opublikowane dotychczas tylko w formie doniesienia konferencyjnego badania, prowadzone w Zakładzie Biologii Molekularnej IBB przez dr Agnieszkę Maciejewską, wykazały, że białko AlkB z E. coli oprócz znanych wcześniej substratów naprawia także z dużą wydajnością hydroksypropanocytozynę. Optimum pH dla naprawy substratów AlkB jest zależne od ich pKa. Do naprawy adduktów egzocyklicznych AlkB wymaga wyższego stężenia Fe(II) i niższego stężenia αKG, niż dla naprawy 3meC, co również jest zależne od pKa (Maciejewska AM i in., praca w przygotowaniu). pKa jest to taka wartość pH, przy której połowa cząsteczek danego związku jest w formie uprotonowanej, połowa w formie obojętnej. Obniżenie pH powoduje dalszą protonację. Przyjmuje się, że w pH niższym o 1 od pKa związku, wszystkie jego cząsteczki są uprotonowane. Wyniki uzyskane w omawianej pracy przedstawiono w tabeli 2. 74 Tabela 2. Zależność optymalnych warunków naprawy poszczególnych substratów od ich pKa Substrat AlkB pKa Optymalne pH Optymalne Optymalne stęż. Fe(II) stęż. αKG [µM] [µM] 3meC 9,0 8,0 50 500 HPC 8,6 7,5 100 50 HEC 6,9 5,8 1000 25 εA 3,9 4,6 3000 25 εC 3,7 4,6 5000 25 εG 2,2 – 2,5 - - - Źródło: Maciejewska AM i in., plakat Niniejsza praca stanowi kontynuację w/w badań i miała na celu określenie specyficzności substratowej homologicznych białek AlkB z innych bakterii, tj. Streptomyces coelicolor i Xanthomonas campestris oraz sprawdzenie, czy wydajność naprawy tych substratów jest również zależna od pKa. Powyższe dane stanowiły punkt odniesienia dla wykazania optymalnych warunków aktywności homologów białka AlkB Escherichia coli. Efektywność naprawy analizowano dla 3,N4-α-hydroksyetanocytozyny (HEC), 3,N4-α-hydroksypropanocytozyny (HPC), 1,N6-etenoadeniny oraz 4 3,N -etenocytozyny przy różnych stężeniach badanych białek pochodzących od różnych szczepów bakteryjnych. W tabeli 3 zebrano procentowe naprawy poszczególnych substratów przez białko SC-1A (pochodzące od Streptomyces coelicolor) przy różnych jego stężeniach (wartości w nawiasach obok napraw): 75 Tabela 3. Naprawa badanych uszkodzeń przez białko SC-1A Substrat białka % naprawy / stężenie białka SC-1A TT(HPC)TT pH Fe(II) αKG 6% (50pm) 57% (100pm) 68,3 (100pm) TT(HEC)TT 14,4% (20pm) 19,4% (50pm) 11% (50pm) TT(εA)TT 30,6% (100pm) 29% (100pm) 32,95% (100pm) TT(εC)TT - - - Źródło: Opracowanie własne Wyniki te wskazują wyraźnie, że stopień naprawy danych modyfikacji zależny jest od stężenia białka SC-1A - im wyższe stężenie tym lepsza naprawa – co jest oczywiste. Ze względu na wydajność napraw analizowane substraty można zatem uszeregować w następującej kolejności: THPC >>> TεA >> THEC > TεC (brak naprawy). Jednakże, aby mieć całkowitą pewność co do tego uszeregowania należałoby jeszcze powtórzyć reakcje naprawy wszystkich badanych substratów w optymalnych dla nich warunkach reakcji i przy tym samym stężeniu enzymu w reakcji. W tym miejscu chcę zaznaczyć, że przechowywanie białka SC-1A w -80ºC nie wpływa na pogorszenie aktywności (zobacz „Wyniki”, wykres 1 i 2). Wyniki moich badań dotyczące białka SC-1A i jego optymalnych warunków naprawy poszczególnych substratów zawiera tabela 4. Tabela 4. Optymalne warunki naprawy białka SC-1A Substrat dla białka Optymalne pH SC-1A Optymalne stęż. Fe(II) [μM] αKG [μM] TT(HPC)TT 7,4 50 10 TT(HEC)TT 5,8 500 10 TT(εA)TT 5,0 3000 10 TT(εC)TT - - - Źródło: Opracowanie własne 76 Optymalne stęż. Porównując uzyskane przeze mnie wyniki optymalnych warunków naprawy przez białko SC-1A (Tabela 4) z optymalnymi warunkami naprawy EcAlkB (Tabela 2) „na pierwszy rzut oka” widać że białko SC-1A wymaga do naprawy mniejszego stężenia α-ketoglutaranu przy wszystkich substratach. Jest ono od 2,5 (dla TT(HEC)TT i dla TT(εA)TT) do 5 razy (dla TT(HPC)TT) mniejsze niż w przypadku AlkB E. coli. Podobna sytuacja ma miejsce w przypadku optymalnych stężeń jonów Fe(II). O ile białko SC-1A do naprawy TT(εA)TT wymaga także 3 mM Fe(II) o tyle w aktywności względem TT(HPC)TT i TT(HEC)TT stężenia te pozostają 2 razy mniejsze niż dla naprawy przez AlkB. Jeśli chodzi o pH identyczne wartości przedstawiają się w przypadku TT(HEC)TT, bardzo zbliżone (różnica 0,1) są przy naprawie TT(HPC)TT, natomiast w przypadku naprawy TT(εA)TT optimum naprawy dla SC-1A jest 0,4 wyższe niż dla AlkB. Różnice te mogą wynikać z różnej wrażliwości porównywanych białek na niskie pH środowiska reakcji. Optymalne pH dla naprawy TT(HPC)TT wynosi 7,4, co stanowi potwierdzenie hipotezy, że optimum pH rewersji zmodyfikowanej zasady jest zależne i niższe od jej stałej kwasowej pKa (która w tym przypadku wynosi 8,6). Sugeruje to, że centrum aktywne białka AlkB wiąże tylko uprotonowane (dodatnio naładowane) formy substratów. Optymalnym pH w naprawie TT(HEC)TT jest 5,8, co potwierdza wcześniejsze spostrzeżenia dotyczące zależności optimum pH, w jakim zachodzi naprawa danego substratu od jego stałej kwasowej pKa. W tym przypadku pKa równa się 6,9, zatem w najkorzystniejszych warunkach naprawy pod względem pH substrat jest uprotonowany (pH jest niższe, niż jego stała kwasowa). pKa εA wynosi 3,9, toteż jest ona całkowicie uprotonowana w pH < 3. Maksymalną wydajność naprawy etenoadeniny przez białko AlkB obserwujemy w pH 5,0, ponieważ w niższym pH enzym najprawdopodobniej ulega dezaktywacji. Zebrane dane ujawniły również, że im wyższe pH, tym wymagane stężenie jonów żelaza (II) jest niższe. Może to wynikać z faktu, że w centrum aktywnym białek z rodziny AlkB kluczową rolę odgrywają reszty histydynowe. Uprotonowanie histydyn znacznie osłabia ich zdolność do koordynowania dwuwartościowych jonów żelaza sprawiając, że do prawidłowego funkcjonowania białka wymagane jest ich wyższe stężenie. Rozważane białka typu AlkB ze Streptomyces coelicolor (SC-1A) i z Escherichia coli (EcAlkB) należą do grupy 1A wyróżnionej przez van den Born’a. Stąd też 77 wynika niewątpliwa funkcja tych białek w naprawie uszkodzeń DNA. Inne z badanych przeze mnie homologów to białka z grup 1B i 2B o znacznie mniejszej aktywności naprawczej, bądź innej specyficzności substratowej. W moich badaniach białka XC-1B i XC-2B (ze szczepu Xanthomonas campestris) w bardzo nieznacznym stopniu naprawiają analizowane substraty. Białka z grupy 2B naprawiają etenoaddukty, ale bez znaczenia są dla nich metylowane uszkodzenia zasad (van den Born i in., 2009). W swych doświadczeniach wskazuje on jakoby większość białek z grupy 1B, jak również kilka z grupy 2B, wykazywały naprawy podobne do EcAlkB i tak np. białko XC-2B z wysoką wydajnością naprawia εA. Jednak zarówno XC-1B jak i XC-2B nie naprawiały badanych w tej pracy adduktów – być może przyczyną jest inna specyficzność substratowa? Niewykluczone jest jednak także, że preparaty białka używane w pracy nie miały wysokiej aktywności. Jednakże były to te same preparaty, których w swoich badaniach używała mgr Anna Domańska – były aktywne (zobacz dalej). Przeprowadzone doświadczenia, mające na celu zbadanie optymalnych warunków dla aktywności homologów białka AlkB (SC-1A, SC-2B, XC-1B, XC-2B) wobec TT(HPC)TT, TT(HEC)TT, TT(εA)TT i TT(εC)TT, polegały na prowadzeniu reakcji oczyszczonego białka z modyfikowanym substratem przy różnych stężeniach Fe(II) i α-ketoglutaranu oraz w różnych pH reakcji. Zespół Essigmanna wykazał, że reakcja ta polega na usunięciu mostka etenowego przez AlkB poprzez epoksydację wiązania podwójnego i ostateczne uwolnienie go w postaci glioksalu (Delaney JC i in., 2005). Ten sam mechanizm potwierdzono dla εA (Mishina Y i in., 2005). Wyniki mojej pracy wykazały, że do uzyskania pełnej aktywności enzymu przy naprawie TT(HPC)TT potrzeba 50 μM Fe(II) i 10 μM αKG, a reakcja powinna przebiegać w pH około 7,4. van den Born badał warunki reakcji białka AlkB względem 3-metylocytozyny. Wobec tego uszkodzenia białka SC-2B i XC-2B wykazywały słabą aktywność lub jej brak (van den Born i in., 2009). Z tego też powodu modyfikacja 3meC jak i εG (nie naprawiana przez AlkB E. coli) nie były przeze mnie badane. Z kolei białko hABH1, jak donoszą badania z ostatnich lat, jest dioksygenazą mitochondrialną mającą zdolność naprawy 3-metylocytozyny w ssDNA oraz RNA (Westbye MP i in., 2008). Natomiast od swojego bakteryjnego homologa białka hABH2, hABH3, hABH1 odróżnia jedynie słaba aktywność wobec εA (Duncan T i in., 2002). Jeśli chodzi o drugi z metylowanych uszkodzeń zasad DNA – 1meA – van den Born i wsp. wykryli aktywność naprawczą w przypadku 78 EcAlkB, MT-2B i XC-1B. Według Falnesa uszkodzenie to jest najwydajniej naprawiane w pH 8 przy 3 μM Fe(II) i 10 μM α-ketoglutaranu (Falnes PØ i in., 2002). Aminokwasem centrum aktywnego białka AlkB, który oddziałuje z uszkodzoną zasadą DNA jest naładowana ujemnie Arg161 (Yu B i in., 2006). Aby enzym mógł wydajnie naprawiać uszkodzenia, zmodyfikowana zasada musi być odpowiednio uprotonowana. Stała jonizacji pKa 3meC wynosi około 9, dlatego uzyskuje ona całkowity ładunek dodatni w pH 8 i może być wtedy wydajnie naprawiana przez białko AlkB. Chciałabym zatrzymać się przez chwilę nad czwartym z analizowanych substratów TT(εC)TT będącym produktem dehydratacji TT(HEC)TT. Otóż w przeprowadzonych doświadczeniach z udziałem białka SC-1A substrat ten nie był naprawiany. Nie chcę umniejszać roli TT(εC)TT jako substratu dla homologów EcAlkB, gdyż analizując naprawy uszkodzeń przez drugie z białek Streptomyces coelicolor, SC-2B, dało się zaobserwować prawie 9% naprawę tego uszkodzenia w pH 5,0 (Wykres 12). Enzym SC-2B, choć mało aktywny, może stanowić (wg mnie) pewnego rodzaju uzupełnienie w aktywności SC-1A. Podobna sytuacja przedstawia się w odniesieniu do białek wyizolowanych z Xanthomonas campestris, XC-1B i XC-2B. Obydwa enzymy zastosowane w ilości 50pm z taką samą wydajnością (5,6%) naprawiają TT(εC)TT (Wykres 16 i 17). Mgr A. Domańska wykazała wysokie aktywności naprawcze enzymów XC-1B i XC-2B, mniej aktywne wg niej były SA-1A, SC-1A, SC-2B. Dioksygenazy SC-1A, SA-2B i SC-2B najbardziej efektywnie naprawiały ε-guaninę (ok. 70% naprawionych oligodeoksynukleotydów w dsDNA, przy najwyższym stężeniu białka), w około 20% eliminowały z DNA ε-adeninę, natomiast najmniej wydajnie usuwały ε-cytozynę (około 10-15% naprawa). W swych badaniach wykazała również, że efektywność naprawy etenoadduktów przez białko SA-1A jest dużo niższa niż przez SC-1A, SC-2B i SA-2B. Białko SA-1A z podobnie niską wydajnością naprawiało εA i εG (około 35%), zaś jedynie minimalnie εC (około 7,5%). W moich doświadczeniach sytuacja przedstawiała się nieco inaczej. To białka XC-1B i XC-2B i SC-2B charakteryzowały się nieznaczną naprawą w warunkach optymalnych dla naprawy innych homologów, zaś białko SC-1A wykazywało jedne z najwyższych wartości napraw spośród analizowanych przeze mnie białek (około 70% naprawy THPC, zobacz wykres 11). Ustalone przeze mnie optymalne warunki 79 dla naprawy egzocyklicznych modyfikacji zasad przez białko SC-1A nie jest równoznaczne z wykazywaniem naprawy (w tych samych warunkach reakcji) przez białko SC-2B. Wynikać z tego może, że białko SC-2B pełni inną funkcję w komórce bakteryjnej. SC-1A widocznie jest na tyle szybko (poprzez obniżanie energii aktywacji) i skutecznie działającym enzymem, że bakteria Streptomyces coelicolor nie wymaga obecności drugiego białka pełniącego taką rolę w komórce. Jaka zatem jest funkcja białka SC-2B? Pytanie to pozostaje nadal otwarte. Porównując wyniki mgr Domańskiej z moimi, należy wziąć pod uwagę wszystkie aspekty. Trzeba więc m.in. zauważyć fakt stosowania przez nas odmiennych metod. Mgr Domańska po przeprowadzeniu reakcji badanego oligomeru z białkiem typu AlkB, używała kolejnego enzymu - glikozylazy ze szlaku BER, który usuwał nienaprawione wcześniej uszkodzenia pozostawiając miejsce apurunowe/apirymidynowe (AP). Używała MUG (dotyczy εC i εG), HAP-1, ANPG (dotyczy εA). O naprawie etenoadduktów wnioskowała na podstawie wystąpienia lub braku fragmentacji nici DNA, obserwowanych po rozdziale w żelu poliakrylamidowym. Fragmentacja wynikała z pęknięć nici w miejscu AP, a więc świadczyła o braku naprawy. Obserwowała działanie enzymów w dsDNA i ssDNA (w większości przypadków pożądane efekty osiągane były jedynie przy naprawie εG w dsDNA), ja natomiast stosując dużo krótsze odcinki DNA tj. pentametry, wykorzystałam technikę HPLC. Korzystałyśmy także z innych substratów (oprócz tych samych 1,N6-εA i 3,N4-εC) – Ona używała 1,N2-εG, a ja THEC i THPC. Jeśli chodzi o warunki to reakcje prowadziła w innym pH i w innej temperaturze, a także ilości używanych białek były u Niej znacznie większe; do tego stopnia, że nadmiar enzymu doprowadzał do zahamowania procesu naprawy. W moich badaniach enzym miał spełniać rolę katalizatora i wykazać naprawę egzocyklicznych uszkodzeń zasad DNA. Zarówno Streptomyces coelicolor jak i Mycobacterium tuberculosis należą do promieniowców, choć prowadzą odmienny tryb życia (Bentley SD i in., 2002). Badania nad białkami SA-1A (ze szczepu Streptomyces avermitilis) i MT-2B (ze szczepu Mycobacterium tuberculosis) przeprowadzone przez Beatę Krowisz, wykazały naprawę tylko w przypadku SA-1A (praca magisterska w przygotowaniu). Badane dioksygenazy naprawiają DNA z większą lub mniejszą wydajnością, a różnice w efektywności naprawy są czasami bardzo znaczne. Wskazuje to na różne 80 preferencje substratowe badanych białek. Enzymy wykazujące niską aktywność naprawczą być może pełnią w komórce inne funkcje, np. modyfikacji RNA. Niektóre organizmy bakteryjne posiadają tylko jedno białko typu AlkB (np. E. coli), zaś inne, jak Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor czy Xanthomonas campestris posiadają przynajmniej po dwa; odpowiednio: SA-1A i SA-2B, SC-1A i SC-2B oraz XC-1B i XC-2B. Nie jest więc wykluczone, że również u różnych gatunków bakterii nastąpiło częściowe rozdzielnie funkcji naprawy DNA i modyfikacji RNA przez białka z rodziny AlkB. Istnieją rozmaite koncepcje wyjaśniające ten problem. Aas i wsp., 2003 na przykład stwierdzili, iż EcAlkB preferencyjnie naprawia DNA, podczas gdy ludzki homolog AlkB hABH3 oddziałuje z taką samą wydajnością z DNA, jak i z RNA, co może wskazywać na większe znaczenie naprawy bardziej stabilnego eukariotycznego mRNA w porównaniu do naprawy prokariotycznego mRNA. Z drugiej jednak strony wiele tRNA i rRNA dla prawidłowego funkcjonowania wymaga obecności 1-meA oraz 3-meC. Pomimo różnic w specyficzności substratowej oraz wydajności naprawy in vitro, w komórkach bakterii wszystkie badane białka mogą pełnić funkcje naprawy DNA. 81 Aneks Wyniki uzyskane w tej pracy będą prezentowane w postaci plakatu na konferencji Europejskiego Towarzystwa Mutagenów Środowiskowych 40th annual meeting of The European Environmental Mutagen Society (EEMS), September 15-18 2010, Oslo NEW SUBSTRATES FOR ALKB DIOXYGENASE FROM ESCHERICHIA COLI AND OTHER BACTERIA Maciejewska1, Agnieszka M; Nieminuszczy1, Jadwiga; van den Born2, Edwin; Krowisz1, Beata; Wrona1, Joanna; Grzesiuk1, Elżbieta; Falnes2,3, Pål Ø and Kuśmierek1, Jarosław T 1 Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, 02-106 Warsaw, 5A Pawińskiego Str, Poland 2 Department of Molecular Biosciences, University of Oslo, PO Box 1041 Blindern, 0316 Oslo, Norway, 3 Centre for Molecular Biology and Neuroscience, Institute of Medical Microbiology, Oslo University Hospital and University of Oslo, N-0027 Oslo, Norway, Name and E-mail of presenting author: Agnieszka M. Maciejewska; [email protected] Keywords: DNA repair; AlkB dioxygenase homologues; exocyclic adducts to DNA bases; Conference: EEMS The AlkB-type proteins are repair enzymes which remove alkyl lesions from bases via an oxidative mechanism restoring native DNA structure. Recently, it was found that they also repair DNA etheno( )-adducts. Exocyclic adducts ( -adducts among them) can originate endogenously from reaction of lipid peroxidation products: α, βunsaturated- and epoxy- aldehydes with DNA bases. They are also formed upon exposure to various industrial carcinogens: e.g., vinyl chloride metabolites, chloroethylene epoxide and chloroacetaldehyde (CAA), or dietary and environmental toxin acrolein (ACR). We reacted 5-mer oligodeoxynucleotides, TTXTT, where X is C or A, with CAA, ACR, croton aldehyde or MMS, and we obtained 5-mers 82 containing modified cytosines: 3,N4-α-hydroxyethano- (HEC), 3,N4-etheno- (εC), 3,N4-α-hydroxypropano- (HPC), 3,N4-α-hydroxy-γ-methyl-propano- (mHPC) or 3-methyl- (3mC), respectively, or 1,N6-ethenoadenine (εA). The hydrolytic deamination of TT(3mC)TT at pH 9.2 gave TT(3mU)TT. All prepared modified 5-mers were studied as substrates for E. coli AlkB protein. Using HPLC technique, which allows to separate the modified from unmodified (repaired) oligomer, we have found that with exception of mHPC, all the modifications are repaired by E. coli AlkB dioxygenase. Appearance of repaired oligomer was also confirmed by mass spectrometry. We observed that the repair efficiency is pH dependent and correlated with pKa value of repaired adduct what suggests that enzyme recognizes protonated form of substrate. The efficiency of repair decreases in the following order 3mC>εA>HPC>HEC>εC>3mU. The repair of 3mU can be observed only at a high enzyme/substrate ratio. We have also checked the repair of HEC, εC, HPC and εA by following bacterial AlkB homologues: Streptomyces avermitilis SA-1A and SA-2A, Streptomyces coelicolor SC-1A and SC-2A, and Mycobacterium tuberculosis MT-2B. All of them were known to repair 3mC. The SA-1A and SC-1A proteins repair HEC and HPC efficiently, but εC weakly; εA is repaired by SC-1A but not by SA-1A protein. We did not observe any repair activity of SA-2B, SC-2B and MT-2B against the studied exocyclic adducts. 83 Literatura Aas PA, Otterlei M, Falnes PØ, Vagbo CB, Skorpen F, Akbari M, Sundheim O, Bjoras M, Slupphaug G, Seeberg E, Krokan HE. (2003) Human and bacterial oxidative demethylases repair alkylation damage in both RNA and DNA, Nature 421: 859-63. Alleviation of 1,N6-ethanoadenine genotoxicity by the Escherichia coli adaptive Ames BN, Gold LS, Willett WC. (1995) The causes and prevention of cancer, Proc Natl Acad Sci USA 92: 5258-65. Aravind L, Koonin EV. (2001) The DNA-repair protein AlkB, EGL-9, and leprecan define new families of 2-oxoglutarate- and iron-dependent dioxygenases, Genome Biology 2(3): 0007.1-0007.8. Barbin A, Bereziat J-C, Croisy A, O’Neil IK, Bartsch H. (1990) Chem-Biol Interact 73: 261-77. Barbin A, Bresil H, Crossy A, Jacquingnon P, Malaveille C, Montesano R, Bartsch H. (1975) Biochem Biophys Res Commun 67: 596-602. Bartsch H, Nair J, Owen RW. (2002) Exocyclic DNA adducts as oxidative stress markers in colon carcinogenesis: potential role of lipid peroxidation, dietary fat and antioxidants, Biol Chem 383: 915-21. Begley TJ, Samson LD. (2003) AlkB mystery solved: oxidative demethylation of N1-methyladenine and N3-methylcytosine adducts by a direct reversal mechanism, Trends Biochem Sci 28(1): 2-5. Benamira M, Johnson K, Chaudhary A, Bruner K, Tibbetts C, Marnett LJ. (1995) Induction of mutations by replication of malondialdehydemodified M13 DNA in Escherichia coli: determination of the extent of DNA modification, genetic requirements for mutagenesis, and types of mutations induced, Carcinogenesis 16: 93-9. Bentley SD, Chater KF, Cerdeño-Tárraga A-M, Challis GL, Thomson NR, James KD, Harris DE, Quail MA, Kieser H, Harper D, Bateman A, Brown S, Chandra G, Chen CW, Collins M, Cronin A, Fraser A, Goble A, Hidalgo J, Hornsby T, Howarth S, Huang C-H, Kieser T, Larke L, Murphy L, Oliver K, O'Neil S, Rabbinowitsch E, Rajandream M-A, Rutherford K, Rutter S, Seeger K, Saunders D, Sharp S, Squares R, Squares S, Taylor K, Warren T, Wietzorrek A, Woodward J, Barrell BG, Parkhill 84 J, Hopwood DA. (2002) Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2), Nature 417, 141-147. Beranek DT. (1990) Distribution of methyl and ethyl adducts following alkylation with monofunctional alkylating agents, Mutat Res 231: 11-30. Blair IA. (2001) Lipid hydroperoxide-mediated DNA damage, Exp Gerontol 36: 1473-81. Borys-Brzywczy E, Arczewska KD, Saparbaev M, Hardeland U, Schär P, Kuśmierek JT. (2005) Mismach dependent uracil/thymine-DNA glycosylases excise exocyclic hydroxyethano and hydroxypropano cytosine adducts, Acta Biochim Pol 52: 149-65. Burcham PC. (1998) Genotoxic lipid peroxidation products: their DNA damaging properties and role in formation of endogenous DNA adducts, Mutagenesis 13: 287305. Chen BJ, Carroll P, Samson L. (1994) The Escherichia coli AlkB protein protects human cells against alkylation-induced toxicity, J Bacteriol 176: 6255-61. Costa RMA, Chigancas V, daSilva-Galhardo R, Carvalho H, Menck FM. (2003) The eukaryotic nucleotide excision repair pathway, Biochimie 85: 1083-99. Delaney JC, Smeester L, Wong C, Frick LE, Taghizadeh K, Wishnok JS, Drennan CL, Samson LD, Essigmann JM. (2005) AlkB reverses etheno DNA lesions caused by lipid oxidation in vitro and in vivo, Nat Struct Mol Biol 12: 855-60. Dotan Y, Lichtenberg D, Pinchuk I. (2004) Lipid peroxidation cannot be used as a universal criterion of oxidative stress, Prog Lipid Res 43: 200-27. Douki T, Odin F, Caillat S, Favier A, Cader J. (2004) Predominance of the 1,N2propano-2’-deoksyguanosine adduct among 4-hydroxy-2-nonenal induced DNAlesions, Free Radic Biol Med 37: 62-70. Drablos F, Feyzi E, Aas PA, Vaagbo CB, Kavli B, Bratlie MS, Pena-Diaz J, Otterlei M, Slupphaug G, Krokan HE. (2004) Alkylation damage in DNA and RNA – repair mechanisms and medical significance, DNA Repair (Amst) 3: 1389-407. Duncan T, Trewick SC, Koivisto P, Bates PA, Lindahl T, Sedgwick B. (2002) Reversal of DNA alkylation damage by two human dioxygenases, Proc Natl Acad Sci USA 99: 16660-5. Eckl P, Esterbauer H. (1989) Genotoxic effects of 4-hydroxynonenals, Adv Biosci 76: 141-57. 85 Esterbauer H, Eckl P, Ortner A. (1990) Possible mutagens derived from lipids and lipid precursors, Mutat Res Rev Genet Toxicol 238: 223-33. Falnes PØ, Bjoras M, Aas PA, Sundheim O, Seeberg E. (2004) Substrate specificities of bacterial and human AlkB proteins, Nucleic Acids Res 32: 3456–61. Falnes PØ, Johansen RF, Seeberg E. (2002) AlkB-mediated oxidative demethylation reverses DNA damage in Escherichia coli, Nature 419: 178-82. Falnes PØ, Rognes T. (2003) DNA repair by bacterial AlkB proteins, Res Microbiol 154(8): 531-8. Falnes PØ, van den Born E, Meza TJ. (2009) Demethylation of DNA and RNA by AlkB Proteins. In Grosjean H (ed.), DNA and RNA Modification Enzymes: Structure, Mechanism, Function and Evolutio, Landes Bioscience, Austin, USA. Frick LE, Delaney JC, Wong C, Drennan CL and Essigmann JM. (2007) Alleviation of 1,N6-ethanoadenine genotoxicity by the Escherichia coli adaptive response protein AlkB, Proc Natl Acad Sci USA 104(3): 755-60. Gerken T, Girard CA, Tung YC, Webby CJ, Saudek V, Hewitson KS, Yeo GS, McDonough MA, Cunliffe S, McNeill LA, Galvanovskis J, Rorsman P, Robins P, Prieur X, Coll AP, Ma M, Jovanovic Z, Farooqi IS, Sedgwick B, Barroso I, Lindahl T, Ponting CP, Ashcroft FM, O’Rahilly S, Schofield CJ. (2007) The obesityassociated FTO gene encodes a 2-oxoglutarate-dependent nucleic acid demethylase, Science 318: 1469-72. Golding BT, Slaich PK, Kennedy G, Bleasdale C, Waston WP. (1996) Mechanisms of formation of adducts from reactions of glycidaldehyde with 2’-deoxyguanosise and/or guanosine, Chem Res Toxicol 9: 147-57. Gothe R, Callerman CJ, Ehrenberg L, Wachmeister CA. (1974) Ambio 3: 234-6. Gros L, Ishchenko AA, Saparbaev M. (2003) Enzymology of repair of ethenoadducts, Mutat Res 531: 219-29. Hemminki K, Dipple A, Shuker DEG, Kadlubar FF, Segerbäck D, Bartsch H. (1994) DNA adducts: identification and biological significance, IARC Sci Publ 125: 1-478. http://e-biotechnologia.pl/index.php?module=Strony&func=display&pageid=4 http://www.jic.ac.uk/science/molmicro/Strept.html http://www.nature.com/nature/journal/v439/n7078/fig_tab/nature04561_F1.html Ishchenko AA, Saparbaev MK. (2002) Alternative nucleotide incision repair pathway for oxidative DNA damage, Nature 415: 183-7. 86 Kaczmarska Z. (2008) Rola białka AlkB w naprawie etenoadduktów cytozyny, Praca licencjacka Kaczmarska Z. (2009) Nowe substraty dioksygenazy AlkB z Escherichia coli, Praca magisterska Kataoka H, Yamamoto Y, Sekiguchi M. (1983) A new gene (alkB) of Escherichia coli that controls sensitivity to methyl methane sulfonate, J Bacteriol 153: 1301-7. Kochetkov NK, Shibaev VN, Kost AA. (1971) New reaction of adenine and cytosine derivatives potentially useful for nucleic acid modification, Tetrahedron Lett 22: 1993-6. Konishi N, Nakamura M, Ishida E, Shimada K, Mitsui E, Yoshikawa R, Yamamoto H, Tsujikawa K. (2005) High expression of a new marker PCA-1 in human prostate carcinoma, Clin Cancer Res 11: 5090-7. Kowalczyk P, Cieśla JM, Komisarski M, Kuśmierek JT, Tudek B. (2004) Longchain adducts of trans-4-hydroxy-2-nonenal to DNA bases causa recombination, base substitutions and frameshift mutations in M13 phage, Mutation Research 550: 33-48. Kurowski MA, Bhagwat AS, Papaj G, Bujnicki JM. (2003) Phylogenomic identification of five new human homologs of the DNA repair enzyme AlkB, BMC Genomics 4, 48. Kuśmierek JT, Singer B. (1982) Chloroacetaldehyde-treated ribo- and deoxyribopolynucleotides. 1. Reaction products, Biochemistry 21: 5717-22. Lau AY, Wyatt MD, Glassner BJ, Samson LD, Ellenberger T. (2000) Molecular basis for discriminating between normal and damaged bases by the human alkyladenine glycosylase, AAG, Proc Natl Acad Sci USA 97(25):13573-8. Lutz WK. (1990) Endogenous genotoxic agents and processes as a basis of spontaneous carcinogenesis, Mutat Res 238: 287-95. Maciejewska AM, Ruszel KP, Nieminuszczy J, Lewicka J, Sokołowska B, Grzesiuk E, Kuśmierek JT. (2010) Chloroacetaldehyde-induced mutagenesis in Escherichia coli: The role of AlkB protein in repair of 3,N4-ethenocytosine and 3,N4-αhydroxyethanocytosine, Mutation Research 684: 24-34. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. (2003) Brock Biology of Microorganisms, Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ Matulewicz Ł, Przybyszewski WM. (2004) Wpływ lipidów na aktywność polimeraz DNA, Post Biol Kom 31: 277-84. 87 Mishina Y, He C. (2006) Oxidative dealkylation DNA repair mediated by the mononuclear non-heme iron AlkB proteins, J Inorg Biochem 100: 670-8. Mishina Y, Yang C-G, He C. (2005) Direct repair of the exocyclic DNA adduct 1,N6-ethenoadenine by the DNA repair AlkB proteins, J Am Chem Soc 127(42): 14594–5. Moriya M, Zhang W, Johnson F, Grollman AP. (1994) Mutagenic potency of exocyclic DNA adducts: marked differences between Escherichia coli and simian kidney cells, Proc Natl Acad Sci USA 91: 11899-903. Mroczkowska-Słupska MM, Kuśmierek JT. (1994) Molekularne podstawy mutagennego działania chlorku winylu, Post Bioch 40(1): 31-39. Nair V, Offerman RJ. (1985) Ring-extended products from the reaction of epoxy carbonyl compounds and nucleic acid bases, J Org Chem 50: 5627-31. Nieminuszczy J, Grzesiuk E. (2007) Bacterial DNA repair genes and their eukaryotic homologues: 3. AlkB dioxygenase and Ada methyltransferase in the direct repair of alkylated DNA Acta Biochim Pol 54(3): 459-68. Oesch F, Adler S, Rettelbach R, Doerjer G. (1986) Repair of etheno DNA adducts by N-glycosylases, IARC Sci Publ 373-9. Oliński R, Jurgowiak M. (1999) Oksydacyjne uszkodzenia DNA (8-oksodG) – biomarkerem niektórych chorób człowieka, Kosmos 48(3): 329-38. Osterman – Golkar S, Hultmark D, Segerback D, Calleman CJ, Gothe R, Ehrenberg L, Wachtemeister CA. (1977) Biochem Biophys Res Commun 76: 259-266. Ougland R, Zhahg CM, Liiv A, Johansen RF, Seeberg E, Hou YM, Remme J, Falnes PØ. (2004) AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation, Mol Cell 16: 107–16. Pierzynowska J, Grzesiuk E. (1999) Mutagenność i kancerogenność aflatoksyny AFB1, Post Bioch 45(4): 313-319. Plant N. (2003) Molecular Toxicology, BIOS Scientific, London; New York, 15-16. Pluskota-Karwatka D. (2008) Modifications of nucleosides by endogenous mutagens-DNA adducts arising from cellular processes, Bioorganic Chemistry 36: 198-213. Porter NA. (1986) Mechanisms for the autoxidation of polyunsaturated lipids, Acc Chem Res 19: 262-8. Prescott AG, Lloyd MD. (2000) The iron (II) and 2-oxoacid-dependent dioxygenases and their role in metabolism, Nat Prod Rep 17: 367-83. 88 Przybyszewski WM, Kasperczyk J, Stokłosa K, Bkhiyan A. (2005) Uszkodzenia DNA powodowane przez produkty peroksydacji lipidów, Post Higieny i Med Doświadczalnej 59: 75-81. Ringvoll J, Nordstrand LM, Vagbo CB, Talstad V, Reite K, Aas PA, Lauritzen KH, Liabakk NB, Bjork A, Doughty RW, Falnes PØ, Krokan HE, Klungland A. (2006) Repair deficient mice reveal mABH2 as the primary oxidative demethylase for repairing 1meA and 3meC lesions in DNA, EMBO J 25: 2189-98. Różalski A. (1998) Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Skrypt dla studentów biologii, część I – teoretyczna, Wyd. II, Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 135-39. Rydberg B, Lindahl T. (1982) Nonenzymatic methylation of DNA by the intracellular methyl group donor S-adenosyl-l-methionine is a potentially mutagenic reaction, EMBO J 1: 211-6. Ryle MJ, Hausinger RP. (2002) Non-heme iron oxygenases, Curr Opin Chem Biol 6: 193-201. Saparbaev M, Kleibl K, Laval J. (1995) Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, rat and human 3-methyladenine DNA glycosylases repair 1,N6-ethenoadenine when present in DNA, Nucl Acids Res 23: 3750-5. Schofield CJ, Zhang Z. (1999) Structural and mechanistic studies on 2-oxoglutaratedependent oxygenases and related enzymes, Curr Opin Struct Biol 9: 722-31. Sedgwick B, Bates PA, Paik J, Jacobs SC, Lindahl T. (2007) Repair of alkylated DNA: Recent advances, DNA Repair (Amst) 6: 429-42. Sedgwick B, Lindahl T. (2002) Recent progress on the Ada response for inducible repair of DNA alkylation damage, Oncogene 21: 8886-94 . Seńczuk W. (2002) Toksykologia. Podręcznik dla studentów, lekarzy i farmaceutów, Wyd. IV, PZWL, Warszawa, 671-2, 708-10. Singer B, Antoccia A, Basu AK, Dosanjh MK, Fraenkel-Conrat H, Gallagher PE, Kuśmierek JT, Qiu ZH, Rydberg B. (1992) Both purified human 1,N6-ethenoadenine-binding protein and purified human 3-methyladenine-DNA glycosylase act on 1,N6-ethenoadenine and 3-methyladenine, Proc Natl Acad Sci USA 89: 9386-90. Smart RC, Hodgson E. (2008) Molecular and Biochemical Toxicology, Fourth Edition, John Wiley & Sons, cop., Hoboken, 246, 466-467. 89 Sodum RS, Chung FL. (1989) Structural characterization of adducts formed in the reaction of 2,3-epoxy-4-hydroxynonanal with deoxyguanosine, Chem Res Toxicol 2: 23-8. Sodum RS, Chung FL. (1991) Stereoselective formation of in vitro nucleic acid adducts by 2,3-epoxy-4-hydroxynonanal, Cancer Res 51(1): 137-43. Spengler SJ, Singer B. (1988) Formation of interstrand cross-links in chloroacetaldehyde-treated DNA demonstrated by ethidium bromide fluorescence. Cancer Res 48(17): 4804-6. Sundheim O, Talstad VA, Vagbo CB, Slupphaug G, Krokan HE. (2008) AlkB demethylases flip out in different ways, DNA Repair 7(11): 1916-23. Śliwiński T, Błasiak J. (2005) Naprawa DNA przez wycinanie zasad, Post Bioch 51(2): 120-8. Trewick SC, Henshaw TF, Hausinger RP, Lindahl T, Sedgwick B. (2002) Oxidative demethylation by Escherichia coli AlkB directly reverts DNA base damage, Nature 419: 174-7. van den Born E, Bekkelund A, Moen MN, Omelchenko MV, Klungland A, Falnes PØ. (2009) Bioinformatics and functional analysis define four distinct groups of AlkB DNA-dioxygenases in bacteria, Nuc Acid Res 37: 7124-36. Wallace SS. (1994) DNA damages processed by base excision repair: biological consequences, Int J Radiat Biol 66: 579-89. Westbye MP, Feyzi E, Aas PA, Vågbø CB. (2008) Human AlkB homolog 1 is a mitochondrial protein that demethylates 3-methylcytosine in DNA and RNA, Department of Cancer Research and Molecular Medicine, Norwegian University of Science and Technology, N-7489 Trondheim, Norway Yang CG, Yi C, Duguid EM, Sullivan CT, Jian X, Rice PA, He C. (2008) Crystal structures of DNA/RNA repair enzymes AlkB and ABH2 bound to dsDNA, Nature 452: 961–65. Yu B, Edstrom WC, Benach J, Hamuro Y, Weber PC, Gibney BR, Hunt JF. (2006) Crystal structures of catalytic complexes of the oxidative DNA/RNA repair enzyme AlkB, Nature 439: 879-84. 90 Spis rysunków Rysunek 1. Struktura dimeru tyminowego Rysunek 2. Struktura fotoproduktu pirymidyno (6-4) pirymidynowego Rysunek 3. Struktura trwałego adduktu aflatoksyny B1 Rysunek 4. Wybrane uszkodzenia oksydacyjne Rysunek 5. Przykłady uszkodzeń alkilacyjnych Rysunek 6. Wzór hydroksypropanocytozyny Rysunek 7. Struktura adduktu HNE do guanozyny Rysunek 8. Wzory chemiczne etenoadduktów zasad DNA powstających pod wpływem aldehydu chlorooctowego (CAA) Rysunek 9. Dehydratacja 3,N4-(N4–α-hydroksyetano)cytozyny (3,N4εC · H2O) Rysunek 10. Struktura krystaliczna kompleksu białka AlkB E. coli z Fe(II), 2OG i metylowanym trójnukleotydem Rysunek 11. Rozdział analityczny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT akroleiną Rysunek 12. Kontrola – mieszanina reakcyjna wraz z substratem TTCTT Rysunek 13. Rozdział preparatywny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT akroleiną Rysunek 14. Rozdział reakcji modyfikacji pentameru TTCTT aldehydem chlorooctowym Rysunek 15. Rozdział preparatywny reakcji modyfikacji pentameru TTCTT aldehydem chlorooctowym Rysunek 16. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(εA)TT przez białko SC-1A Rysunek 17. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(HEC)TT przez białko SC-1A Rysunek 18. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(εA)TT przez białko SC-1A Rysunek 19. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(HEC)TT przez białko SC-1A Rysunek 20. Przykładowy chromatogram rozdziału produktów naprawy pentameru TT(HPC)TT przez białko SC-1A Spis schematów Schemat 1. Wpływ promieniowania jonizującego na funkcjonowanie komórek Schemat 2. Aktywacja metaboliczna chlorku winylu 91 Schemat 3. Powstawanie propano- i etenoadduktów pod wpływem produktów peroksydacji lipidów Schemat 4. Mechanizm naprawy uszkodzeń alkilacyjnych przez białko AlkB Schemat 5. Mechanizm naprawy etenowych uszkodzeń przez białko AlkB Spis tabel Tabela 1. Rozmiary homologów białka AlkB wybranych (badanych) gatunków bakterii Tabela 2. Zależność optymalnych warunków naprawy poszczególnych substratów od ich pKa Tabela 3. Naprawa badanych uszkodzeń przez białko SC-1A Tabela 4. Optymalne warunki naprawy białka SC-1A Spis wykresów Wykres 1. Sprawdzenie aktywności białka SC-1A Wykres 2. Sprawdzenie aktywności białka SC-1A trzy miesiące później Wykres 3. Zależność naprawy TT(εA)TT od pH (białko SC-1A) Wykres 4. Zależność naprawy TT(HEC)TT od pH (białko SC-1A) Wykres 5. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH (białko SC-1A) Wykres 6. Zależność naprawy TT(εA)TT od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A) Wykres 7. Zależność naprawy TT(HEC)TT od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A) Wykres 8. Zależność naprawy TT(HEC)TT od stężenia jonów Fe(II) (EcAlkB) Wykres 9. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH i od stężenia jonów Fe(II) (EcAlkB) Wykres 10. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH i od stężenia jonów Fe(II) (białko SC-1A) Wykres 11. Zależność naprawy TT(HEC)TT, TT(HPC)TT i TT(εA)TT od stężenia α-ketoglutaranu (białko SC-1A) Wykres 12. Zależność naprawy TT(εA)TT i TT(εC)TT od pH (białko SC-2B) Wykres 13. Zależność naprawy TT(HEC)TT od pH (białko SC-2B) 92 Wykres 14. Zależność naprawy TT(HPC)TT od pH (białko SC-2B) Wykres 15. Zależność naprawy TT(εA)TT od stężenia jonów Fe(II) w pH 5,6 (białko SC-2B) Wykres 16. Aktywność białka XC-1B wobec TT(HPC)TT, TT(εA)TT i TT(εC)TT Wykres 17. Aktywność białka XC-2B wobec TT(HPC)TT, TT(εA)TT i TT(εC)TT Spis zdjęć Zdjęcie 1. Kolonie Stereptomyces coelicolor Zdjęcie 2. Żel przedstawiający rozdział frakcji zebranych podczas oczyszczania białka SC-1A barwionego Coomasie Brilliant Blue G-250 93