Oznaczanie substancji przy pomocy HPLC z detekcją fluorescencyjną

OZNACZANIE SUBSTANCJI PRZY POMOCY WYSOKOSPRAWNEJ
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ Z DETEKTOREM FLUORESCENCYJNYM
WPROWADZENIE
Jednym
z
najbardziej
selektywnych
detektorów
wykorzystywanych
w
chromatografii cieczowej jest detektor fluorescencyjny (Fluorescence Detector - FLD).
Detektor ten wykorzystywany jest do oznaczania substancji fluoryzujących naturalnie
lub odpowiednich pochodnych (np. WWA, katecholaminy, niektóre leki).Zjawisko
fluorescencji zachodzi wówczas, kiedy elektron znajdujący się na wyższym poziomie
energetycznym, na skutek wzbudzenia cząsteczki (np. przez absorpcję kwantu energii)
wraca
samorzutnie
promieniowanie.
na
Średni
poprzednio
czas
zajmowaną
pomiędzy
orbitę
wzbudzeniem
emitując
cząsteczki
przy
i
tym
emisją
promieniowania wynosi od 10-9 do 10-8 sekundy. Oznaczanie substancji z
wykorzystaniem FLD polega więc na pomiarze emitowanego przez nią światła o
określonej długości fali. Naturalną zdolność do fluorescencji wykazuje niewiele
związków, z tego też względu stosuje się wzbudzanie cząsteczek substancji światłem o
długości fali, która jest przez nie absorbowana. Dzięki temu, że związki chemiczne
pochłaniają i emitują światło o określonej, charakterystycznej dla nich długości fali, FLD
może wykazywać (szczególnie dla związków fluoryzujących)czułość nawet o trzy rzędy
wielkości większą.
1
Przy stosowaniu FLD do analizy składu próbki należy zwrócić uwagę na zdolności
fluorescencyjne rozpuszczalnika oraz towarzyszących domieszek, a także na wpływ pH
środowiska na fluorescencję oznaczanej substancji.
Celem ćwiczenia jest zapoznanie z pracą detektora FLD.
SPRZĘT I ODCZYNNIKI
1.
Chromatograf cieczowy Agilent 1200, składający się z następujących modułów:
a.
Kontroler układu chromatograficznego – umożliwia ustawienie żądanego składu
fazy ruchomej i prędkości przepływu, a także zaprogramowanie tabel odpowiedzialnych
za przebieg analizy (np. gradientu).
b.
Pompa chromatograficzna – odpowiada za automatyczne mieszanie składników fazy
ruchomej w określonych proporcjach i bez pulsacyjne tłoczenie mieszaniny elucyjnej do
dalszych modułów układu HPLC. Odpowiedzialna jest za monitorowanie ciśnienia w
układzie. Maksymalne ciśnienie pracy pompy wynosi 400 bar.
c.
Detektor DAD – pozwala na pracę w zakresie długości fal 190–950 nm. Wyposażony
jest w lampy deuterową (190–400 nm) i wolframową (400–950 nm), celkę pomiarową o
objętości 13μl i długości drogi optycznej równej 10 mm.
d.
Detektor FLD – pozwala na pracę w zakresie długości fal: dla wzbudzania 200–
700nm, dla emisji 280–900 nm. Wyposażony jest w lampę ksenonową i celkę
pomiarową 8 μl
e.
Komputer z zainstalowaną kartą komunikacyjną i oprogramowaniem ChemStation –
służy do zbierania i przetwarzania danych.
2.
Warunki chromatograficzne:
a.
kolumna chromatograficzna z wypełnieniem C18,
b.
pętla nastrzykowa o objętości 20 L,
c.
detekcja z zakresu światła UV i z zastosowaniem fluorescencji.
3.
Pipety automatyczne 20 - 200 μL, 100 - 1000 μL.
4.
Wialki chromatograficzne o pojemności 2 mL.
5.
Rozpuszczalniki o czystości do HPLC.
2
SPOSÓB WYKONANIA
Zgodnie z poleceniami prowadzącego:
1.
ustawić warunki chromatograficzne
2.
przygotować roztwory wzorcowe substancji badanej
3.
wyznaczyć analityczną długość fali wzbudzania substancji badanej przy pomocy
DAD
4.
wyznaczyć długości fali emisji
5.
wykonać pomiary właściwe.
Wykonać analizę przygotowanych roztworów wykorzystując FLD. Każdorazowo po
analizie zebrać wszystkie podstawowe parametry charakteryzujące piki uzyskane dla
badanej substancji – czasy retencji, wysokości pików, pola powierzchni pod pikami –
umieszczając zebrane wartości w tabeli.
Tabela 1. Tabela pomiarów
FLD
Numer wialki Stężenie roztworu [µg/mL]
1
2
3
4
5
tR
[min]
A
h
Wysokość
szumów
[mm]
100
10
1
0,1
0,01
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczyć LOD (Limit of detection) i LOQ (Limit of
quantification).
Opracowanie: B. Krawczyk, D. Szczukocki
3