Wykorzystanie metody Griessa do oznaczania azotanów/azotynów

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2010 • Volume 46 • Number 3 • 307-312
Praca oryginalna • Original Article
Wykorzystanie metody Griessa do oznaczania
azotanów/azotynów w supernatantach komórek
śródbłonka stymulowanych agonistami
Usefulness of the Griess method for determination of nitrates/
nitrites in supernatants of agonist-stimulated endothelial cells
Magdalena Boncler, Dominika Dudzińska, Joanna Rywaniak, Cezary Watała
Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi Katedry Diagnostyki Laboratoryjnej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Streszczenie
Tlenek azotu (NO) generowany przez komórki śródbłonka naczyniowego jest ważnym markerem funkcji śródbłonka. Istnieje
wiele metod oznaczania NO w układach biologicznych wykorzystujących odrębne techniki pomiarowe. Ich rozmaitość jest
zapewne konsekwencją braku jednej, idealnej metody oznaczania NO, która powinna być dostatecznie specyficzna, ale także
wystarczająco czuła z uwagi na relatywnie niskie stężenie NO in vivo, jak i na jego nietrwałość. Nawet nowsze metody pomiaru NO, charakteryzujące się większą czułością, mają poważne ograniczenia i dostarczają wielu problemów natury metodologicznej. Niniejsza praca służyła weryfikacji standardowej, często rekomendowanej kolorymetrycznej metody Griessa do
analizy wytwarzania NO przez komórki śródbłonka inkubowane z bradykininą, acetylocholiną lub PMA przez 24 lub 48 godzin.
Wykorzystując komercyjny test do oznaczania metabolitów NO, oznaczano stężenie NO3-/ NO2- w supernatantach niefiltrowanych, jak i po ich filtracji, pochodzących z hodowli komórek śródbłonka o różnym mianie. Pobudzanie komórek agonistami
nie wpływała istotnie na zmiany stężenia NO w próbach, chociaż obserwowano tendencję do wzrostu stężenia metabolitów
NO w obecności agonistów. Zwiększenie gęstości komórek w hodowli ewidentnie sprzyjało wzrostowi wykrywanego stężenia
NO3-/NO2- w badanych próbach, chociaż z drugiej strony, niezależnie od miana komórek, filtracja prób - zgodnie z rekomendacją producenta komercyjnego testu, prowadziła do znacznego obniżenia wartości stężenia metabolitów NO. Na podstawie
naszych obserwacji wydaje się, że oznaczanie NO w supernatantach komórek śródbłonka metodą Griessa jest dalece dyskusyjne, gdyż może prowadzić do zbierania artefaktów, głównie ze względu na względnie niską czułość metody oraz znaczący
wpływ medium komórkowego na wartości pomiarowe.
Summary
One of the most significant markers of endothelial dysfunction is nitric oxide. There are numerous methods, which enable measuring nitric oxide in biological samples. Probably, this abundance of different approaches is caused by the lack of one, ideal
technique to sensitively and specifically assay nitric oxide - an extremely short living compound released in low concentrations.
The aim of this study was to assess the utility of a popular colorimetric Griess method to estimate the amount of nitric oxide
liberated from cultured endothelial cells. Endothelium was stimulated by acetylcholine, bradykinin or PMA for either 24 or 48
h. We used a commercial kit to estimate the concentrations of nitric oxide metabolites in both filtered and non-filtered samples
with different cell titers. Stimulated samples showed higher nitric oxide levels compared to non-stimulated ones, this increase
however, was beyond statistical significance. Moreover, in the samples with higher cell titers we observed increased nitric
oxide concentrations, which became reduced however, upon sample filtration. These findings strongly suggest that using the
Griess method for measurement of nitric oxide concentration in a supernatant of endothelial cell cultures may be misleading,
mainly because of relatively low sensitivity of this method and the interference of the assay with medium components.
Słowa kluczowe:śródbłonek, tlenek azotu, reakcja Griessa, metabolity NO, azotany, azotyny
Key words:endothelium, nitric oxide, Griess reaction, NO metabolites, nitrates, nitrites
307
Wykorzystanie metody Griessa do oznaczania azotanów/azotynów w supernatantach komórek śródbłonka ...
Praca współfinansowana z projektu „Przygotowanie preparatów polifenolowych o pochodzeniu roślinnym o właściwościach przeciwpłytkowych i kardioprotekcyjnych (FLAWOPIRYNA)”, współfinansowanego przez Unię Europejską, ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju
Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka, nr UDA-POIG.01.03.01-10-129/08.
Praca współfinansowana z projektów MNiSW (N N401 213934) i UM w Łodzi (502-16-814).
Wstęp
Śródbłonek naczyniowy odgrywa in vivo niesłychanie istotną rolę w regulacji napięcia ściany naczyniowej, a także
regulacji układu hemostazy i angiogenezy, jak również bierze udział w procesach zapalnych i immunologicznych [14].
Chociaż funkcjonowanie śródbłonka nie ogranicza się do
sprawowania jednej funkcji w organizmie, to utrzymanie prawidłowej wazomotoryki naczyń krwionośnych jest głównym
zadaniem komórek śródbłonka, za które odpowiada tlenek
azotu (NO). Związek ten, będący rodnikiem o krótkim czasie półtrwania, powstaje w wyniku redukcji L-argininy do
L-cytruliny, w obecności NADPH i tlenu, a reakcja jest katalizowana przez śródbłonkową izoformę syntazy tlenku azotu
(eNOS). Oprócz funkcji wazodylatacyjnej w ścianie naczyń,
tlenek azotu hamuje również aktywację i reaktywność płytek
krwi, zapobiega aktywacji leukocytów i proliferacji komórek
mięśniowych naczyń krwionośnych. Wszystko to stanowi o
istocie kardioprotekcyjnego działania śródbłonka, a zarazem świadczy o jego doniosłej roli w patogenezie chorób
sercowo-naczyniowych [3]. Z tego punktu widzenia, ocena
funkcjonowania komórek śródbłonka, dokonywana m.in. na
podstawie pomiaru tlenku azotu generowanego przez te komórki, wydaje się niezwykle ważna. Zważywszy, że stężenie
NO, nieustannie produkowanego przez komórki śródbłonka,
jest niewielkie, wszelkie zmiany stężenia NO w środowisku
są dobrym wskaźnikiem niedostatecznej sprawności i/lub
dysfunkcji śródbłonka.
Oznaczanie tlenku azotu w płynach biologicznych nastręcza wiele trudności, głównie ze względu na fakt, iż jest on
produkowany w niewielkim stężeniu (rzędu kilku mikromoli) i charakteryzuje się krótkim czasem półtrwania. W celu
oznaczenia stężenia NO wykorzystuje się różne metody
pomiaru NO, między innymi, spektroskopię ESR, metody
oparte na chemiluminescencji, elektrochemii, spektrofotometrii czy też spektrofluorymetrii [2,6-8,11]. Niestety, wiele z
opisanych metod, często dysponujących wysoką czułością,
wymaga wysoce specjalistycznej aparatury, niedostępnej
dla przeciętnego laboratorium, co niewątpliwie ogranicza
ich stosowanie. Jednak, niezależnie od dostępności, czy
czułości aparatury do pomiaru stężenia NO, każda metoda
ma swoje niedogodności i ograniczenia. Na przykład, bezpośrednia metoda detekcji elektrochemicznej tlenku azotu
przy użyciu elektrody należy do metod o dużej czułości,
pozwalającej mierzyć NO w obecności komórek. Z drugiej
strony, żywotność elektrody jest względnie niska, a mierzone stężenie NO jest zazwyczaj zaniżone, gdyż elektroda
mierzy miejscowo produkcję NO w czasie rzeczywistym, pomijając detekcję NO związanego z błoną komórkową oraz
308
strukturami wewnątrzkomórkowymi [10]. Ta stosunkowo
nowoczesna metoda pomiaru NO wychodzi naprzeciw konwencjonalnym technikom oznaczania NO, takim jak, metoda
chemiluminescencyjna oznaczania NO czy metoda kolorymetryczna oparta na reakcji Griessa [7,8]. Próg detekcji NO
dla tych dwóch metod jest podobny i sięga kilku mikromoli,
ale metoda chemiluminescencyjna jest znacząco droższa.
Biorąc pod uwagę niskie nakłady wykonania testu kolorymetrycznego oznaczania NO, prostotę wykonania i możliwość
zastosowania standardowego sprzętu laboratoryjnego, nie
budzi zdziwienia fakt, że metoda Griessa oznaczania NO w
płynach biologicznych jest ciągle popularna i chętnie stosowana. Na korzyść tej metody przemawiają również: 1/ możliwość mrożenia prób i oznaczania ich w dogodnym czasie, 2/
niewielka objętość próby potrzebna do oznaczenia anionów
azotanowych/azotynowych i 3/ krótki czas wykonania testu.
Dodatkowo, test Griessa daje możliwość oznaczania NO w
rozmaitych płynach biologicznych, takich jak, osocze, surowica, mocz, supernatanty kultur komórkowych i homogenaty
tkankowe.
Niniejsza praca ma na celu zweryfikowanie użyteczności
metody Griessa pod kątem oznaczania stężenia tlenku azotu w supernatantach komórek śródbłonka stymulowanych
bradykininą, acetylocholiną lub PMA.
Materiały i metody
Materiały i odczynniki
Komórki śródbłonka pochodzące z ludzkiej żyły pępowinowej
(Human Umbrical Vein Endothelial Cells; HUVEC), medium
200 i suplementy do medium (LSGS Kit) zostały zakupione
w firmie Invitrogen (USA). Butelki hodowlane pochodziły z
NUNC (USA), a 6-dołkowe płytki hodowlane zakupiono w
firmie TPP (Szwajcaria). Bradykinina, L- arginina, PMA i
acetylocholina zostały zakupione w Sigma-Aldrich (Niemcy).
Komercyjny test do oznaczania tlenku azotu Total NO/Nitrite/
Nitrate Parameter Assay Kit oraz filtry do sączenia (MWCO
10 kDa) zakupiono w R&D Systems (USA).
Hodowla komórek śródbłonka
Komórki śródbłonka hodowano w medium suplementowanym surowicą płodów cielęcych (2%), ludzkim śródbłonkowym czynnikiem wzrostu (10 ng/ml), hydrokortyzonem
(1mg/ml), podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów
(3 ng/ml), heparyną (10 µg/ml), penicyliną, amfoterycyną
oraz solami mineralnymi. Komórki pasażowano co siedem
dni, wysiewając 250 tysięcy komórek do butelki hodowlanej o powierzchni 75 cm2. Hodowlę prowadzono do ósmego pasażu w temperaturze 37oC, w wilgotnej atmosferze,
wzbogaconej o 5% CO2. Eksperymenty przeprowadzano na
M. Boncler i inni
komórkach od trzeciego do ósmego pasażu. W celach eksperymentalnych komórki przesiewano na 6-dołkowe płytki
hodowlane, po 100 tys. kom/ml na dołek. Po upływie czasu
niezbędnego dla adhezji komórek do podłoża (48 godz.) usuwano zużyte medium hodowlane i zastępowano je świeżym
podłożem (1 lub 0,5 ml medium dla uzyskania miana 200 lub
400 tys. komórek/ ml) z dodatkiem 100 µM L-argininy oraz
czynnika stymulującego śródbłonek do produkcji NO.
Oznaczanie stężenia tlenku azotu w supernatantach komórek śródbłonka stymulowanych agonistami w obecności L-argininy
Hodowlę stymulowano odpowiednio: 10 µM bradykininą,
100 µM acetylocholiną lub 500 nM PMA; próbę kontrolną
negatywną stanowił supernatant z hodowli komórek niestymulowanych. Podłoże hodowli stymulowanych jak i niestymulowanych zbierano po 24 i 48-godzinnej inkubacji, następnie odwirowywano (10 000 rpm, 5 min.) i natychmiast
zamrażano. Stężenie metabolitów tlenku azotu w uzyskanych supernatantach, zarówno w próbach filtrowanych, jak i
niefiltrowanych, oznaczano z zastosowaniem komercyjnego
testu. Badane supernatanty rozcieńczano dwukrotnie, absorbancję odczytywano przy długości fali 560 nm. Stężenie
NO3-/NO2- obliczano na podstawie krzywej kalibracyjnej sporządzonej w zakresie stężeń 0-200 µM, wykonywanej w 2
powtórzeniach, zgodnie z zaleceniami producenta.
Analiza statystyczna
Wyniki wyrażono jako wartości średnie ± SE. W przypadku
testowania różnic między grupami zastosowano test t -Studenta dla par wiązanych, którego wybór był poprzedzony
analizą normalności rozkładów. Minimalna liczebność próby
wynosiła 3. Przedstawione w pracy wartości oznaczają stężenie NO3-/NO2- obliczone dla próby 50 µl supernatantu komórek śródbłonka o mianie 200 lub 400 tys./ml, w zależności
od wariantu eksperymentalnego.
9,1 ± 1,5 µM (NS), 9,1 ± 1,8 µM (NS) oraz 10,3 ± 1,2 µM (NS)
odpowiednio po stymulacji BK, Ach oraz PMA. Wydłużenie
czasu stymulacji komórek śródbłonka agonistami do 48 godzin sprzyjało wzrostowi stężenia NO3-/ NO2- w porównaniu
do wartości otrzymanych dla komórek stymulowanych agonistami przez 24 godz., i wynosiło 11,2 ± 1,6 µM (p<0,025),
11,1 ± 1,7 µM (p=0,03) i 11,4 ± 0,6 µM (NS), odpowiednio dla
BK, ACh i PMA (n=4).
Po 24-godzinnej inkubacji komórek śródbłonka bez agonisty
lub z agonistą, wartości stężeń NO3-/NO2- w supernatantach
HUVEC o mianie 400 tys./ml były wyższe od wartości stężeń
ocenianego parametru mierzonego w supernatantach komórek o 2-krotnie mniejszym mianie (Ryc. 1.). Niezależnie od
miana komórek, filtracja prób przed ich oznaczeniem znacząco wpływała na wartości stężenia NO3-/NO2-, prowadząc
do wyraźnego spadku oznaczanego stężenia NO3-/NO2- w
badanych próbach (Ryc. 1). Istotny statystycznie wpływ filtracji zaobserwowano po 48-godzinnej stymulacji komórek
agonistami (Ryc. 2).
Dyskusja
Pomimo rozwoju nowych, wysoce specyficznych i czułych
metod oznaczania tlenku azotu w materiale biologicznym,
kolorymetryczna metoda oznaczania metabolitów NO jest
nadal bardzo często i chętnie wykorzystywana do oznaczania produkcji NO przez komórki w warunkach in vivo lub in
vitro. Ta łatwa i szybka do wykonania metoda pomiaru NO
jest metodą pośrednią, umożliwiającą pomiar powstających
w reakcji Griessa metabolitów NO (azotanów i azotynów) w
mikromolowym zakresie czułości. Według niektórych auto-
Wyniki
Zmiany w generacji tlenku azotu przez komórki ludzkiego
śródbłonka obserwowano na podstawie pomiaru azotanów
(NO3-) i azotynów (NO2-) w: 1/ w supernatantach komórek
śródbłonka o mianie 200 tys./ml po 24- lub 48-godzinnej
stymulacji HUVEC bradykininą (10 µM), acetylocholiną (100
µM) lub PMA (500 nM) oraz 2/ w supernatantach komórek
śródbłonka o mianie 400 tys./ml po 24-godzinnej stymulacji
komórek agonistami.
Bez względu na miano komórek, czy też przygotowanie materiału przed oznaczeniem azotanów/azotynów (filtracja),
stężenia NO3-/NO2- w supernatantach komórkach śródbłonka stymulowanych agonistami nie były istotnie wyższe od
stężeń NO3-/NO2- w komórkach niestymulowanych. Wartości
stężenia NO3-/NO2- w supernatantach komórek śródbłonka o
mianie 200 tys./ml, niestymulowanych i nie filtrowanych, wynosiły 8,9 ± 1,3 µM po 24- oraz 9,1 ± 1,0 µM po 48-godzinnej inkubacji komórek w medium. Po 24-godzinnej stymulacji agonistami, stężenie NO3-/NO2- wzrastało do wartości
Rycina 1.
Wpływ miana komórek na wytwarzanie NO monitorowanego jako stężenie NO3-/NO2-. Komórki śródbłonka o
mianie 200 tys./ml lub 400 tys./ml stymulowano BK, Ach
lub PMA przez 24h, a następnie w supernatantach komórkowych (niefiltrowanych i filtrowanych) oznaczano
stężenie NO3-/NO2-. Niefiltrowane komórki o mianie 200
lub 400 tys./ml oznaczono białym lub jasno-szarym symbolem, zaś filtrowane komórki o mianie 200 lub 400 tys./
ml oznaczono symbolem ciemno-szarym lub czarnym.
Przedstawiono wartości średnie ± SE dla n=3-5. Istotne
zmiany zaznaczono gwiazdką. *p<0.05, **p<0.03.
309
Wykorzystanie metody Griessa do oznaczania azotanów/azotynów w supernatantach komórek śródbłonka ...
Rycina 2.
Wpływ procedury filtracji na rejestrowane stężenie NO3-/
NO2-. Komórki śródbłonka o mianie 200 tys./ml stymulowano BK, Ach lub PMA przez 48h, a następnie w supernatantach komórkowych oznaczano stężenie NO3-/NO2-.
Na wykresie przedstawiono wartości średnie ± SE (n=3),
otrzymane dla prób niefiltrowanych (białe symbole) i filtrowanych (czarne symbole). Istotne zmiany zaznaczono gwiazdką. *p<0.05.
rów [1], mikromolowe stężenie metabolitów NO można uzyskać jedynie na drodze długotrwałej ekspozycji komórek na
czynnik zapalny (np. LPS), podczas której zachodzi synteza
de novo indukowalnej syntazy NO (iNOS) generującej duże
ilości NO. W świetle tych informacji, celem niniejszej pracy było sprawdzenie użyteczności kolorymetrycznej metody
detekcji azotanów/ azotynów w supernatantach komórek
śródbłonka stymulowanych przez 1 lub 2 doby wybranymi
agonistami. Na podstawie naszych obserwacji wydaje się,
że istnieją poważne ograniczenia w zastosowaniu metody
Griessa do oznaczania stężenia NO3-/ NO2- w supernatantach komórek śródbłonka stymulowanych wysokimi stężeniami BK, Ach lub PMA, nawet przez długi okres czasu.
Wybór stosowanych agonistów oraz czasu ekspozycji był
poprzedzony analizą literatury w kontekście oznaczania NO
metodą kolorymetryczną Griessa. Wskazuje ona na stosowanie różnych czynników stymulujących produkcję NO w
komórkach śródbłonka (m.in. cytokin, chemokin, histaminy,
BK, donorów NO), w różnych przedziałach czasowych (od
kilku minut do kilku dni, ze wskazaniem na dobowy czas
stymulacji) [4,5,10,12]. Stymulując komórki 24 godz. lub 48
godz. wykazaliśmy, że stężenie NO3-/NO2- w supernatantach
komórek śródbłonka może osiągać wartość maksymalnie
do kilkunastu mikromoli w próbie o objętości 50 µl, ale rejestrowane wartości absorbancji odpowiadają najniższym
stężeniom (tj. między 3,125 a 12,5 µM NO3-/NO2-) krzywej
standardowej sporządzonej dla zakresu od 0 do 200 µM.
Po rekomendowanej przez producenta testu filtracji prób,
wykonanej przed oznaczeniem metabolitów NO, stężenie
NO3-/NO2- w supernatantach komórek śródbłonka spadało,
a wartości absorbancji prób filtrowanych były porównywalne
310
z wartościami absorbancji odczytanymi dla bardzo niskich
zakresów stężeń krzywej standardowej, w wielu przypadkach
nie przekraczając wartości absorbancji wzorcowej odpowiadającej 6,25 µM NO3-/NO2-. Rejestrowane niskie wartości absorbancji badanych prób mogły być wynikiem zbyt dużego
ich rozcieńczenia, chociaż i tak było to rozcieńczenie 2.5 razy
niższe niż to, które zaleca producent testu (2-krotne zamiast
5-krotnego). Chociaż istotny statystycznie wpływ filtracji wykryliśmy w przypadku supernatantów komórek śródbłonka o
wyższym mianie komórek (400 tys./ml), to należy podkreślić,
że we wszystkich innych badanych próbach wpływ procesu filtracji został także zaobserwowany (nie zawsze jednak
zmiany okazały się istotne statystycznie). Taki znaczący
spadek stężenia NO3-/NO2- w filtrowanych próbach mógłby
być wynikiem interferencji innych składników supernatantu
komórkowego z reagentami wybranej metody pomiarowej.
Skoro tak, postanowiliśmy się przyjrzeć bliżej związkom potencjalnie zaburzającym prawidłowy odczyt stężenia NO3-/
NO2- i składowi medium hodowlanego przeznaczonego do
hodowli śródbłonka. Wśród substancji interferujących z metodą kolorymetryczną Griessa wymienia się antykoagulanty
(heparyna), azydek, kwas askorbinowy, DTT, merkaptoetanol, lub związki zawierające reszty sulfhydrylowe, takie jak,
cysteina czy glutation. W przypadku hodowli komórkowych
należy brać pod uwagę przede wszystkim możliwość interferencji składników samego medium komórkowego z metodą
Griessa, a konkretnie - wpływu soli azotanowych, których
stężenie w niektórych mediach komórkowych jest wysokie (np. medium RPMI 1640). W naszych eksperymentach
zostało zastosowane podstawowe medium przeznaczone
do hodowli komórek śródbłonka, medium 200, zawierające, prócz suplementów, aminokwasy, witaminy, inne, bliżej
nieokreślone związki organiczne, pierwiastki śladowe oraz
sole nieorganiczne. Procedura odbiałczania prób, jaka miała
miejsce w wyniku filtracji, razem z niekompletną charakterystyką medium (producent nie wzmiankuje o jakie sole chodzi,
a także nie podaje składu ilościowego zawartych związków),
pozwalają przypuszczać, że przynajmniej niektóre z wymienionych wyżej składników, tj. aminokwasy, białka i sole
nieorganiczne zawarte w medium 200, mogły mieć istotny
wpływ na wyniki oznaczeń NO3-/ NO2- w supernatantach komórek śródbłonka. Dodatkowym dowodem potwierdzającym
wpływ składników medium są obserwacje wskazujące na 1)
różnice między stężeniem NO3-/ NO2- w medium filtrowanym
w porównaniu do niefiltrowanego oraz 2) brak różnic między
stężeniem NO3-/ NO2- w medium w porównaniu do kontroli
(komórki niestymulowane).
Innym czynnikiem mającym wpływ na wartości stężenia NO3/ NO2- w supernatantach komórek śródbłonka jest gęstość
komórek wysiewanych do eksperymentu. Aby zweryfikować,
jak daleko idące są to zmiany, przeprowadzono analogiczne
eksperymenty do opisanych powyżej, stymulując komórki o
2-krotnie wyższej gęstości przez 24 godziny. Na tej podstawie stwierdzono, że zwiększona gęstość komórek podczas
hodowli sprzyja wzrostowi stężenia wykrywanych metaboli-
M. Boncler i inni
tów NO w supernatantach komórek śródbłonka, a zmiany są
szczególnie widoczne w filtrowanych próbach (Ryc. 1). To
oznacza, że gęstość komórek nie powinna być zaniedbywana w sytuacji, gdy spodziewamy się niewielkich stężeń NO3-/
NO2- w próbie. Przeciwnie, plan eksperymentu powinien zakładać możliwie jak najwyższą gęstość komórek, która jednak nie pozostaje w oderwaniu od projektu eksperymentu
(tutaj czynnikiem istotnym był czas stymulacji komórek śródbłonka), objętości medium oraz wielkości naczynia hodowlanego. Należy dodać, że otrzymane wartości stężenia NO3-/
NO2- dla komórek o wyższej gęstości nie przekraczały 20
µM, a wartości absorbancji utrzymywały się nadal na niskim
poziomie (do 12,5 µM wg krzywej standardowej).
Odniesienie się do literatury naukowej z zakresu oznaczania NO w komórkach śródbłonka metodą Griessa dostarcza
pewnych trudności związanych z rozbieżnościami w protokołach eksperymentalnych. Przede wszystkim testy oparte
na metodzie kolorymetrycznej Griessa pozwalają na oznaczanie stężenia wszystkich soli azotanowych lub oddzielnie
azotanów i azotynów, a przedstawiane dane odnoszą się
do zawartości wszystkich azotanów, lub często tylko azotynów. Poza tym, różnice dotyczą wyboru agonisty, jego
stężenia, czasu stymulacji, linii komórek śródbłonka, pochodzenia śródbłonka, zakresu informacji zawartej w procedurze eksperymentalnej, jak również różnego przedstawiania
wartości. W punktu widzenia porównywania rzeczywistych
stężeń przez nas otrzymanych do wartości literaturowych,
ostatni z wymienionych czynników jest kluczowy, oraz, jak
pokazuje literatura, nie zawsze pozwala na takie porównanie. Na przykład w pracy Montiel-Davalos i wsp., autorzy
wskazują, że dobowa, 2- lub 3-dniowa stymulacja komórek
śródbłonka czynnikiem martwicy nowotworu (TNFα; 10 ng/
ml) skutkuje zwiększeniem produkcji NO, co przekłada się
w teście Griessa na kilku- lub kilkunastomikromolowe stężenie NO2-. Należy podkreślić jednak, że bez przeliczenia
stężenia NO2- na mg białka lub gęstość komórek, te liczby
są zupełnie „bezwartościowe” i niemiarodajne [9]. Podobnie
wygląda analiza wyników Desideri i wsp., którzy stosowali
kolorymetryczną metodę oznaczania metabolitów NO w badaniach efektywności inhibitorów konwertazy angiotensyny.
W cytowanej pracy autorzy wskazują na znaczący wpływ
8-godzinnej stymulacji komórek śródbłonka bradykininą
podawaną w stężeniu 10-8 na stężenie NO3-/NO2- [4], przy
czym opis wyników ograniczający się do podania wyłącznie
wartości względnych na wykresie, pozbawia czytelnika możliwości wglądu w rzeczywiste wartości stężenia NO3-/NO2-.
Kilkumikromolowe stężenie NO2- w superntantach komórek
śródbłonka wykrywano nawet po ich krótkiej stymulacji 20
µM bradykininą [13]. Z kolei, kilkudziesięciomikromolowe
stężenie NO3-/NO2- wykrywano po 24-godzinnej inkubacji
śródbłonka z L-argininą, gdzie odnotowywano wzrost aż do
38 µM/100 tys. komórek [12]. Zagadką pozostają szczegóły
eksperymentalne odnoszące się do interferencji składników
medium czy do filtracji prób, które z reguły są zawarte tylko
w pracach metodycznych [8].
Podsumowując, metoda kolorymetryczna pomiaru NO w reakcji Griessa jest łatwą do wykonania metodą do oznaczania
metabolitów NO w zakresie czułości 1 - 200 µM. Z punktu
widzenia oznaczania NO3-/NO2- w supernatantach komórek
śródbłonka należy zachować daleko idącą ostrożność podczas planowania eksperymentu, analizy danych i interpretacji
wyników. Stosowanie tej metody może bardzo łatwo przywodzić do pozyskiwania artefaktów. Relatywnie niska czułość
metody oraz znacząca interferencja ze składnikami medium,
przy względnie niskiej wydajności wytwarzania NO przez
komórki śródbłonka, świadczy na niekorzyść stosowania tej
metody w oznaczeniach metabolitów NO w supernatantach
komórek śródbłonka. Znajduje to szczególne uzasadnienie
w wartościach absorbancji badanych supernatantów, które
często były na poziomie wartości absorbancji odnotowywanej dla stężenia wzorca w zakresie 3,125 a 12,5 µM. Wydaje
się, że zwłaszcza w takich przypadkach pożądane byłoby
korzystać z metody o większej czułości i wiarygodności.
Piśmiennictwo:
1. Berkels R, Purol-Schnabel S, Roesen R. A new method to measure nitrate/nitrite with a NO-sensitive electrode. J Appl Physiol
2001; 90: 317-320.
2. Boo YC, Tressel SL, Jo H. An improved method to measure nitrate/nitrite with an NO-selective electrochemical sensor. Nitric
Oxide 2007; 16: 306-312.
3. Calvert JW, Lefer DJ. Myocardial protection by nitrite. Cardiovasc Res 2009; 83: 195-203.
4. Desideri G, Grassi D, Croce G i wsp. Different effects of angiotensin converting enzyme inhibitors on endothelin-1 and nitric
oxide balance in human vascular endothelial cells: evidence of
an oxidant-sensitive pathway. Mediators Inflamm 2008; 2008:
1-7.
5. Feng HM, Walker DH. Mechanisms of intracellular killing of Rickettsia conorii in infected human endothelial cells, hepatocytes,
and macrophages. Infect Immun 2000; 68: 6729-6736.
6. Fink B, Dikalov S, Fink N. ESR techniques for the detection of
nitric oxide in vivo as an index of endothelial function. Pharmacol Rep 2006; 58 Suppl: 8-15.
7. Hausladen A, Rafikov R, Angelo M i wsp. Assessment of nitric
oxide signals by triiodide chemiluminescence. Proc Natl Acad
Sci U S A 2007; 104: 2157-2162.
8. Miranda KM, Espey MG, Wink DA. A rapid, simple spectrophotometric method for simultaneous detection of nitrate and nitrite.
Nitric Oxide 2001; 5: 62-71.
9. Montiel-Davalos A, Ibarra-Sanchez MJ, Ventura-Gallegos JL i
wsp. Oxidative stress and apoptosis are induced in human endothelial cells exposed to urban particulate matter. Toxicol In
Vitro 2010; 24: 135-141.
10. Privat C, Lantoine F, Bedioui F i wsp. Nitric oxide production by
endothelial cells: comparison of three methods of quantification.
Life Sci 1997; 61: 1193-1202.
11. Rathel TR, Leikert JJ, Vollmar AM i wsp. Application of 4,5-diaminofluorescein to reliably measure nitric oxide released from
endothelial cells in vitro. Biol Proced Online 2003; 5: 136-142.
12. Vassalle C, Domenici C, Lubrano V i wsp. Interaction between
nitric oxide and cyclooxygenase pathways in endothelial cells. J
Vasc Res 2003; 40: 491-499.
13. Watts VL, Motley ED. Role of protease-activated receptor-1 in
endothelial nitric oxide synthase-Thr495 phosphorylation. Exp
Biol Med (Maywood) 2009; 234: 132-139.
311
Wykorzystanie metody Griessa do oznaczania azotanów/azotynów w supernatantach komórek śródbłonka ...
14. Wnuczko K, Szczepanski M. Endothelium--characteristics and
functions. Pol Merkur Lekarski 2007; 23: 60-65.
Adres do korespondencji:
Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi
Katedry Diagnostyki Laboratoryjnej
312
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Uniwersytecki Szpital Kliniczny nr 2 im. WAM
ul. Żeromskiego 113, 90-549 Łódź
tel.: 42 6393471, faks: 42 6787567
(Praca wpłynęła do Redakcji: 2010-09-16)
(Praca przekazana do opublikowania: 2010-10-11)