Zastosowanie mikrobiocydów alkiloamoniowych w ochronie papieru

Zastosowanie mikrobiocydów alkiloamoniowych w ochronie papieru

PRACE NAUKOWO - BADAWCZE
Zastosowanie mikrobiocydów alkiloamoniowych
w ochronie papieru przed grzybami
strzępkowymi
Applications of alkylammonium microbiocides
to protect paper materials against moulds
ANNA KOZIRÓG, BEATA GUTAROWSKA, BOGUMIŁ BRYCKI
W artykule przedstawiono wyniki badań skuteczności mikrobiocydów
alkiloamoniowych ograniczających populację grzybów strzępkowych
o właściwościach celulolitycznych, powodujących biodegradację
wyrobów papierniczych.
Słowa kluczowe: biocydy, ochrona papieru, grzyby strzępkowe
The article provides results of biocidal efficacy of alkylammonium
microbiocides against cellulite fungi which are responsible for biodegradation of paper materials.
Keywords: biocides, paper protection, moulds
Wprowadzenie
Papier należy do materiałów technicznych, które są szczególnie wrażliwe na niszczącą aktywność mikroorganizmów,
przede wszystkim grzybów. Grzyby strzępkowe odpowiedzialne
za biodegradację papieru pojawiają się już na etapie produkcji,
a ich dalszy rozwój w gotowych produktach zależy od sposobu
przechowywania (1-3). W korozji mikrobiologicznej gotowych
wyrobów papierniczych biorą udział głównie mikroorganizmy,
które mają zdolność do hydrolizowania celulozy zawartej w papierze. Rozwój grzybów celulolitycznych w papierze powoduje
nie tylko zmiany na jego powierzchni, ale również zmienia chemiczną i fizyczną strukturę papieru (4). Skutkiem tego procesu
może być całkowite zniszczenie materiału. Zarodniki grzybów są
wszechobecne i mogą pochodzić nie tylko z samego papieru, ale
również z otaczającego środowiska, przede wszystkim z powietrza. Zarodniki są mało wrażliwe na niesprzyjające środowisko
zewnętrze i mogą w tych warunkach przetrwać wiele lat. Widoczne makroskopowo grzybnie mogą się rozwinąć nawet przy
niewielkiej wilgotności.
W celu ograniczenia rozwoju grzybów stosuje się mikrobiocydy,
substancje chemiczne o działaniu przeciwdrobnoustrojowym,
których właściwy dobór możliwy jest po określeniu mikroflory
dominującej w danym środowisku. Z przeprowadzonych dotychczas badań wynika, że każda postać morfologiczna pleśni
reaguje inaczej na działanie środków biobójczych (5). Nie bez
50
znaczenia pozostaje także wiek szczepu. Szczepy młode są
bardziej wrażliwe na działanie mikrobiocydów, w porównaniu
do szczepów dojrzałych, które pozostają na powierzchni papieru
w formie konidiów (6). Dlatego też, przed wyborem odpowiedniego preparatu biobójczego, istotne jest stwierdzenie, jaka
mikroflora występuje w miejscu przeznaczonym do dezynfekcji.
Stosowanie mikrobiocydów w odpowiednim stężeniu i czasie dla
konkretnej mikroflory i danego środowiska powoduje inaktywację
i skuteczne zniszczenie drobnoustrojów. Zły dobór związków
chemicznych może prowadzić nie tylko do tego, że proces dezynfekcji staje się nieskuteczny, ale co więcej, w dezynfekowanym
obszarze mogą pojawić się formy oporne, które przystosowały
się do tych warunków.
Celem przeprowadzonych badań była identyfikacja grzybów
strzępkowych wyizolowanych z pomieszczeń bibliotecznych
w Polsce, ocena ich właściwości celulolitycznych oraz określenie wrażliwości na mikrobiocydy przygotowane na bazie soli
alkiloamoniowych.
Część doświadczalna
Identyfikacja grzybów strzępkowych i ich uzdolnienia celulolityczne
Badane szczepy grzybów strzępkowych wyizolowano z różnych
pomieszczeń i zbiorów bibliotecznych w Polsce. Diagnostykę
grzybów przeprowadzono na podłożu Czapek (firmy Merck)
i podłożu naturalnym – brzeczce (5°Blg) porównując cechy
makro- i mikroskopowe wyizolowanych gatunków z kluczami
diagnostycznymi (7).
Ocenę właściwości celulolitycznych określono na podłożu
o pH=6,4 z dodatkiem celulozy jako jedynego źródła węgla.
Dr A. Koziróg, dr hab. B. Gutarowska, Instytut Technologii Fermentacji
i Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika
Łódzka, 90-924 Łódź ul. Wólczańska 171/173; Prof. UAM dr hab. B. Brycki,
Pracownia Chemii Mikrobiocydów, Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama
Mickiewicza, 60-780 Poznań, ul. Grunwaldzka 6
e-mail: [email protected], [email protected], [email protected]
PRZEGLĄD PAPIERNICZY · 68 · STYCZEŃ 2012
PRACE NAUKOWO - BADAWCZE
Podłoże na płytkach Petriego szczepiono mikroorganizmami
punktowo, inkubowano w temperaturze 27°C. Po 48 i 168 godzinach inkubacji, w celu sprawdzenia efektu hydrolizy celulozy
przez badane gatunki grzybów strzępkowych, powierzchnię podłoża zalano płynem Lugola i obserwowano strefy przejaśnienia
wokół kolonii.
Ocena skuteczności działania mikrobiocydów metodą dyfuzyjną
Do oceny wybrano pięć najbardziej aktywnych celulolitycznie szczepów. Zastosowano pięć preparatów na bazie
czwartorzędowych soli alkiloamoniowych, poliamin alkilowych
i sekwestrantów, które przygotowano w Pracowni Chemii Mikrobiocydów Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu.
Skład mikrobiocydów podano w tabeli 1. Każdy preparat przygotowano w stężeniach 0,8; 0,4; 0,1; 0,05 i 0,01 μl/ml. Wartości
minimalnych stężeń hamujących wzrost drobnoustrojów (MIC)
wyznaczono metodą dyfuzyjną.
Tabela 1. Substancje czynne w mikrobiocydach wykorzystywanych w badaniach
Substancje czynne
Chlorki tetraalkiloamoniowea
Poliaminy alkiloweb
Sekwestrantyc
Oznaczenia mikrobiocydów/Zawartość
substancji czynnych (mg/g)
M-1
M-2
M-3
M-4
M-5
150
150
150
150
150
17
34
17
34
34
0
0
40
40
60
a)
5. generacja soli tetraalkiloamoniowych (mieszanina chlorków dialkilodimetyloamoniowych (dioktylo, 25%; didecylo, 25%, oktylodecylo, 50%)
z chlorkiem benzalkoniowym (C12, 40%; C14, 50%; C16, 10%) (11)
b)
bis(N,N-aminopropylo)-N-alkilo(C8 - 25%, C12 - 50%, C14 - 25%) amina
c)
PBTC, NTA
W pierwszym etapie przeprowadzono standaryzację inokulum
w celu uzyskania gęstości zarodników 106 jtk/ml. Kolejno na płytki
z pożywką MEA (firmy Merck) wprowadzono 0,1 ml zawiesiny
zarodników i rozprowadzono na całej powierzchni pożywki sterylnym gładzikiem. Następnie w pożywce wycinano studzienki
średnicy 10 mm, do których wprowadzano przygotowane wcześniej roztwory badanych preparatów. Tak przygotowane hodowle
inkubowano 48 godzin w temperaturze 27°C. Po tym czasie obserwowano strefy zahamowania wzrostu grzybów strzępkowych
wokół studzienek. Wielkości strefy wyliczono wg wzoru:
gdzie:
X – wielkość strefy zahamowania wzrostu,
A – średnica strefy bez widocznego wzrostu,
B – średnica otworu wyciętego w pożywce, do którego wprowadzono biocyd.
Omówienie wyników
Spośród wyizolowanych grzybów strzępkowych dominowały
dwa rodzaje – Aspergillus i Penicillium (rys. 1). Są to grzyby powszechnie występujące w środowisku, m.in. w glebie
i powietrzu, powodujące psucie żywności czy biodeteriorację
drewna i papieru. Ze względu na ich częstą obecność w różnych
PRZEGLĄD PAPIERNICZY · 68 · STYCZEŃ 2012
Rys. 1. Rodzaje grzybów strzępkowych w zbiorach bibliotecznych w Polsce
(% całkowitej ilości wyizolowanych grzybów)
pomieszczeniach magazynowych, nazywane są też „pleśniami
magazynowymi” (8). Wśród badanych pleśni z rodzaju Aspergillus zdiagnozowano 3 gatunki, a z rodzaju Penicillium – 7
gatunków.
Wyniki aktywności celulolitycznej wyizolowanych szczepów
przedstawiono w tabeli 2. Trzy spośród 22 izolatów nie wykazały
zdolności celulolitycznych – Alternaria tenussima i dwa gatunki
z rodzaju Mucor. Najwcześniej, po 2 dobach hodowli, zdolność
do rozkładu celulozy zaobserwowano u Chaetomium globosum
i Aspergillus flavus. Jednak największą aktywnością cechowały
się Aspergillus niger, Penicillium cyclopium i Chaetomium globosum, u których występowały największe strefy przejaśnienia
wokół kolonii.
Tabela 2. Gatunki grzybów strzępkowych wyizolowanych z badanych
bibliotek i ich aktywność celulolityczna
Rodzaj
Gatunek
Aktywność
celulolityczna
po 7 dniach
wyizolowanych grzybów strzępkowych
1
Aspergillus
2
Penicillium
3
Alternaria
4
Cladosporium
5
Chaetomium
6
Mucor
7
8
Acremonium
Fusarium sp.
A. niger
A. flavus
A. ochraceus
P. cyclopium
P. terrestre
P. purpurogenum
P. variable
P. notatum
P. virdicatum
P. albidum
A. tenussima
A. alternata
C. herbarum
C. macrocarpum
Ch. globosum
M. hiemalis
M. racemosus
A. strictum
++
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
+
+
Na podstawie przeprowadzonych badań wytypowano mikroflorę dominującą, która charakteryzowała się uzdolnieniami celulolitycznymi. Do tej grupy należą: Aspergillus niger, Aspergillus
ochraceus, Chaetomium globosum, Penicillium terrestre i Penicillium cyclopium. Powyższe drobnoustroje poddano działaniu
mikrobiocydów M-1 – M-5. W tabeli 3 przedstawiono wartości
minimalnych stężeń testowanych środków przeciwgrzybowych
wobec pięciu testowanych gatunków grzybów strzępkowych. Na
podstawie tych wyników określono wartości MIC, które zebrano
w tabeli 4.
51
PRACE NAUKOWO - BADAWCZE
Tabela 3. Wielkość stref zahamowania wzrostu grzybów strzępkowych
pozwalająca określić wartości minimalnych stężeń hamujących wzrost
Gatunki grzybów strzępkowych
A.niger
A. ochraceus
Ch. globosum
P. terrestre
P. cyclopium
Rodzaj
biocydu
M-1
M-2
M-3
M-4
M-5
M-1
M-2
M-3
M-4
M-5
M-1
M-2
M-3
M-4
M-5
M-1
M-2
M-3
M-4
M-5
M-1
M-2
M-3
M-4
M-5
Kontrola
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Stężenia mikrobiocydów [μl/ ml]
0,8
0,4
0,1
0,05
0,01
15
17
16
18
20
15
16
15
18
18
15
17
15
20
20
14
14
12
24
22
14
16
14
24
26
13
14
15
13
18
13
12
13
15
15
14
14
13
14
14
12
13
12
17
15
12
14
11
18
20
6
12
9
11
15
7
12
8
13
13
8
12
9
12
12
10
12
10
13
12
10
12
10
12
12
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
11
0
11
11
0
11
0
11
11
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
izolatów stanowią pleśnie z rodzaju Aspergillus i Penicillium.
Wymienione w tabeli 2 gatunki bardzo często występują na materiałach bibliotecznych, takich jak książki, papier i pergamin, co
potwierdzają wyniki uzyskane przez innych badaczy (9, 10).
Do najskuteczniejszych mikrobiocydów należą te, które
w swoim składzie zawierają oprócz czwartorzędowych soli
alkiloamoniowych również sekwestranty i poliaminy alkilowe
o podwyższonym stężeniu (34 mg/g). Wśród badanych grzybów
strzępkowych najbardziej wrażliwe okazały się szczepy z rodzaju
Penicillium.
Z przeprowadzonych badań wynika, że przed przeprowadzeniem dezynfekcji należy określić rodzaj dominującej w danym
środowisku mikroflory i w stosunku do niej dobrać właściwe
mikrobiocydy. Odpowiedni rodzaj i stężenie preparatu biobójczego pozwoli uniknąć pojawienia się szczepów opornych. Bardzo
dobra aktywność przeciwdrobnoustrojowa badanych preparatów
umożliwia ich praktyczne wykorzystanie jako inhibitorów biodeterioracji papieru.
Serdeczne podziękowania składamy Pani prof. dr hab. Zofii
Żakowskiej z Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii
za cenne wskazówki i dyskusje, które pozwoliły na powstanie
niniejszej pracy.
Pracę tę dedykujemy naszemu Koledze Zbyszkowi Pajewskiemu, który był łącznikiem między mikrobiologami i konserwatorami dzieł sztuki.
Tabela 4. Wartości minimalnych stężeń mikrobiocydów (MIC, μl/ml) hamujących rozwój wybranych gatunków grzybów strzępkowych
Oznaczenia
biocydów
M-1
M-2
M-3
M-4
M-5
Literatura
Gatunki grzybów strzępkowych
A.
niger
0,1
A. ochraceus
0,1
Ch. globosum
0,1
P. terrestre
0,1
0,05
0,1
0,05
0,05
P. cyclopium
0,1
0,05
0,1
0,05
0,05
Najskuteczniejsze w działaniu okazały się preparaty M-2, M-4
i M-5. Zastosowanie ich w stężeniu 0,05 μl/ml było wystarczające
do zahamowania wzrostu szczepów z rodzaju Penicillium. Dla
osiągnięcia tego samego efektu w przypadku środków biobójczych M-1 i M-3 wymagane jest użycie dwukrotnie większych
stężeń.
Najmniejszą wrażliwość na zastosowane mikrobiocydy
wykazywały grzyby Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus
i Chaetomium globosum. Dla tych gatunków wartość MIC dla
wszystkich preparatów wynosiła 0,1 μl/ml. Stwierdzono, że
najskuteczniejszymi preparatami są mikrobiocydy M-4 i M-5
zawierające czwartorzędowe sole alkiloamoniowe w stężeniu 150
mg/g, poliaminy alkilowe w stężeniu 34 mg/g oraz sekwestranty.
Powyższe preparaty w stężeniu 0,8 μl/ml powodowały pojawienie
się największych stref zahamowania wzrostu.
Podsumowanie
Stwierdzono, że wśród zidentyfikowanych w środowisku bibliotecznym grzybów strzępkowych występuje duża różnorodność,
zarówno rodzajów, jak i gatunków, chociaż ponad 50% wszystkich
52
1. Stobińska H., Zyska B.: „Papier – produkcja, wytwory papiernicze, materiały w zbiorach bibliotecznych”, [w] Praca zbiorowa: „Mikrobiologia
materiałów”, red. Zyska B., Żakowska Z., Wyd. Politechniki Łódzkiej,
Łódź 2005, s. 137-185.
2. Gutarowska B, Cichocka A.: „Ocena zanieczyszczenia mikrobiologicznego
mas papierniczych oraz wody technologicznej stosowanych w procesie
produkcji papieru”, Przegl. Papiern. 65, 9, 551 (2009).
3. Gutarowska B., Cichocka A.: „Zastosowanie metody oznaczania ergosterolu do szybkiej oceny zanieczyszczenia grzybami na różnych etapach
produkcji papieru”, Przegl. Papiern. 66, 1, 45 (2010).
4. Pinzari F., Pasquariello G, De Mico A.: “Biodeterioration of Paper: A SEM
Study of Fungal Spoilage Reproduced Under Controlled Conditions”,
Macromolecular Symposia 238, 1, 57 (2006).
5. Koziróg A.: „Oporność grzybów strzępkowych na N,N-bis(3-aminopropylo)
dodecyloaminę”, Praca doktorska, Politechnika Łódzka 2006.
6. Koziróg A., Pajewski Z., Żakowska Z., Brycki B.: „Skuteczność działania
biocydów na grzyby strzępkowe rozwijające się na powierzchniach materiałów”, Ochrona przed Korozją 10s/A, 50, 95-98 (2007).
7. Samson R.A., Hoekstra E.S., Frisvad J.C., Filtenborg O.: “Introduction to
food and air borne fungi”, CBS Baarn, The Netherlands, 1996.
8. Piotrowska M., Żakowska Z.: „Grzyby strzępkowe” [w] Praca zbiorowa:
„Mikrobiologia techniczna”, red. Libudzisz Z., Żakowska Z., Kowal K.,
PWN, Warszawa 2007, s. 60-83.
9. Zyska B.: “Fungi Isolated from Library Materials. A Review of The Literature”, International Biodeterioration and Biodegradation 40, 1, 43-51
(1997).
10. Fabbri A.A., Ricelli A., Brasini S., Fanelli C.: “Effect of Different Antifungals
on the Control of Paper Biodeterioration Caused by Fungi”, International
Biodeterioration and Biodegradation 39, 1, 61-65 (1997).
11. Block S.S. (ed) 2001. Disinfection, Sterilization, and Preservation,
Lippincott Williams and Wilkins, 5th Edition, Philadelphia, USA.
PRZEGLĄD PAPIERNICZY · 68 · STYCZEŃ 2012