Wyróżniona praca w formacie pdf

STRESZCZENIE
Niniejsza praca badawcza wskazuje na fitosanitarny charakter gryki zwyczajnej
Fagopyrum sagittatum. Dowodzi istnienia w jej tkankach związków allelopatycznych,
(m. in. metodycznie wyizolowanej rutyny) oraz ich inhibicyjnego wpływu na wzrost
i rozwój perzu właściwego Agropyron repens. Materiał badawczy składał się z 10 prób,
w tym 4 doświadczalnych, 4 kontrolnych oraz 2 zapasowych, którymi uzupełniano nasiona
wypadające. Po upływie 14 dni od daty rozpoczęcia obserwacji analizie poddano długości
pędów gatunku testowego Agropyron repens. Na podstawie obliczeń i pewnych założeń
stwierdzono, iż perz rosnący w podłożu po siewkach Fagopyrum sagittatum wykazuje
ujemne reakcje przyrostowe, tzn. przyrasta w stopniu ograniczonym bądź wcale. Wyniki
badań nie dowodzą związku pomiędzy tempem przyrostu akceptora a jego zagęszczeniem
w szalce oraz zagęszczeniem rośliny donora. Biorąc jednak pod uwagę czas trwania
obserwacji oraz fakt, że proces wydzielania allelozwiązków przebiega intensywniej u roślin
młodych można przypuszczać, iż ujemne reakcje przyrostowe Agropyron repens miały
związek z wiekiem donora. (Doświadczenie przeprowadzono na dwutygodniowych
siewkach.)
Z zielonej masy Fagopyrum sagittatum wyizolowano metodycznie jeden
z allelozwiązków- rutynę, która wpłynęła hamująco na wzrost Agropyron repens.
WSTĘP
Zjawisko allelopatii może być podyktowane przez szereg czynników, takich jak:
promieniowanie słoneczne, różnice temperaturowe i wilgotnościowe, dostęp do składników
odżywczych, działalność edafonu i entomofauny oraz stosowanie środków ochrony
roślin.[1] Często mylone jest jednak ze zjawiskiem konkurencji. Allelopatia nie ogranicza
dostępu do zasobów, a jedynie oddziałuje na roślinę poprzez uwalniane substancje
chemiczne. W celu rozpoznania i odróżnienia jej od konkurencji można wykorzystać model
„density-dependent phytotoxity”. Zakłada się w nim, że intensywność oddziaływania
uwalnianych do podłoża allelozwiązków jest zależna od zagęszczenia roślin akceptorów.
Im mniejsze ich zagęszczenie tym większą ilość allelopatyn pobiorą. Przy większym
zagęszczeniu dawka docierających fitotoksyn jest relatywnie mniejsza. Przypuszcza się
więc, że skoro w przypadku małego zagęszczenia roślin konkurencja między nimi jest
niemożliwa, to zmniejszenie bądź zahamowanie ich wzrostu może dowodzić wpływów
allelopatycznych.[2]
Efektywne wykorzystanie zjawiska allelopatii w rolnictwie pozwoliłoby na
ograniczenie stosowania chemicznych zabiegów odchwaszczających. Właściwie dobrany,
konkurencyjny wobec chwastów gatunek mógłby skutecznie wyprzeć używane
współcześnie herbicydy syntetyczne. Obecnie za bogate źródło allelopatyn uważa się
resztki roślinne, pozostawione na polu w celu zwiększenia ilości węgla organicznego lub
poprawy warunków wilgotnościowych gleby. Doświadczalnie udowodniono m.in., że
pozostałości donora Secale cereale poprzez zacienianie redukują kiełkowanie i wzrost
niepożądanych gatunków, obniżają temperaturę gleby oraz łagodzą dzienne wahania
temperatury powietrza. [1]
Celem niniejszej pracy badawczej jest wykazanie właściwości allelopatycznych gryki
zwyczajnej Fagopyrum sagittatum na podstawie interakcji zachodzących między nią
a perzem właściwym Agropyron repens. Doświadczalnie sprawdza się czy jej obecność
wpływa na wzrost gatunku testowego. Czynnikiem potwierdzającym otrzymane wyniki,
tj. herbicydowość gryki jest metodyczna izolacja z jej masy zielonej rutyny - glikozydu,
wywołującego u wielu roślin silną aktywność allelopatyczną. Wg dostępnych badań, m.in.
K. Dzidzica i wsp. na temat zawartości wybranych związków przeciwutleniających rutyna
w gryce uchodzi za substancję dominującą zarówno pod względem ilości, jak i aktywności
biologicznej.[3]
MATERIAŁ I METODY
Badanie oddziaływania gryki zwyczajnej Fagopyrum Sagittatum na wzrost perzu
właściwego Agropyron repens
Badania przeprowadzono w warunkach domowych. Czas trwania obserwacji wyniósł
14 dni (nie obejmował 7- dniowego doświadczenia na zdolność do wykiełkowania nasion
Fagopyrum sagittatum). Materiał doświadczalny składał się z 1 kilograma nasion gryki
zwyczajnej Fagopyrum sagittatum oraz 120 sztuk kłączy perzu właściwego Agropyron
repens. Kłącza zostały odpowiednio spreparowane i ujednolicone pod względem długości
tak, że długość początkowa każdej sztuki była równa 1 centymetr. Nasiona Fagopyrum
sagittatum zakupiono bez świadectwa kwalifikacji. Były wyczyszczone, nie zaprawione do
siewu, o niesprawdzonej zdolności do wykiełkowania. Ich wilgotność wynosiła 14%.
Zdolność kiełkowania, czyli procent nasion kiełkujących w czasie określono metodą
doświadczalną. Po uśrednieniu otrzymanych wartości wynik końcowy oszacowano na 89%.
Badania prowadzono w warunkach oświetlenia naturalnego. Temperatura powietrza
w pomieszczeniu mieściła się w granicach 23-250C. Nasiona Fagopyrum sagittatum
umieszczano w szalkach Petriego na trzech warstwach ligniny, regularnie zwilżanych wodą
destylowaną. Po skiełkowaniu rośliny rozwijały się przez okres jednego tygodnia. (Nasiona
wypadające uzupełniano zapasowymi z 2 prób rezerwowych, w których gatunek
Fagopyrum sagittatum rozwijał się w identycznych warunkach oraz tym samym okresie.)
W tym czasie uwalniały do podłoża odpowiednie dla siebie związki chemiczne. Po upływie
7 dni młode siewki gryki zwyczajnej usuwano, natomiast w ich miejsce na ligninie
umieszczano kłącza perzu właściwego. Obserwacja jego reakcji na substancje zawarte
w podłożu trwała kolejne 7 dni.
W celu sprawdzenia, czy reakcje przyrostowe gatunku testowego uzależnione będą
także od jego zagęszczenia w szalce oraz od stężenia roślin donorów materiał
doświadczalny podzielono w sumie na 4 próby:
1. 30 nasion Fagopyrum sagittatum po 20 sztuk kłączy Agropyron repens
2. 15 nasion Fagopyrum sagittatum po 20 sztuk kłączy Agropyron repens
3. 30 nasion Fagopyrum sagittatum po 10 sztuk kłączy Agropyron repens
4. 15 nasion Fagopyrum sagittatum po 10 sztuk kłączy Agropyron repens
Każdej próbie doświadczalnej odpowiadała próba kontrolna, która składała się z określonej
liczby kłączy Agropyron repens (10 lub 20 sztuk). Dzięki niej porównano wzrost gatunku
testowego Agropyron repens w obecności substancji uwolnionych przez Fagopyrum
sagittatum i w „środowisku wolnym”. Przyrosty długości pędów mierzono za pomocą
suwmiarki. Otrzymane wartości uśredniono (obliczono odchylenie standardowe).
W próbach kontrolnych zdarzały się kłącza wypadające. (Kłącza wykazują wolniejsze
tempo adaptacji do warunków podłoża aniżeli nasiona).Nie uzupełniano ich jak
w przypadku wypadających nasion Fagopyrum sagittatum. Doświadczenie wykonano
w dwóch powtórzeniach.
2
Metodyczne oznaczanie zawartości rutyny w gryce zwyczajnej Fagopyrum sagittatum
Przed oznaczeniem zawartości rutyny w Fagopyrum sagittatum zważono
dwutygodniowe siewki z czterech prób doświadczalnych i zanotowano ich masę. Próby
zalano 20 ml chloroformu, a następnie umieszczono w aparacie Soxleta na 2 godziny
w celu usunięcia chlorofilu, olejków eterycznych, żywic i innych związków. Chloroform
odlano, natomiast próby suszono w temperaturze 75 0C przez 0,5 godziny, później także
w eksykatorze. W celu wyekstrahowania rutyny próbki siewek Fagopyrum sagittatum wraz
z ligniną, na której kiełkowały umieszczono w kolbach i zalano 80ml 96% metanolu.
Uzyskany ekstrakt przelano do 100- mililitrowych kolbek i dopełniono do „kreski”
(zrobiono wyciąg metanolowy). Dla obliczenia zawartości rutyny w próbie na podstawie
odczytu ze spektrofotometru wykonano krzywą wzorcową. W tym celu naważkę rutyny
0,05g rozpuszczono w metanolu. Z takiego rozwoju rutyny pobierano do 4 probówek
odpowiednio 0,25; 0,5; 1,0 i 1,5 ml roztworu. Do każdej probówki dodano 2 ml 22,5%
HCl, intensywnie wstrząsano kolbę, po czym szybko ją oziębiono przez 1 min polewając
kolbę bieżącą wodą. Zaraz po ochłodzeniu dodano 0,5 ml 0,5% azotynu srebra ( w celu
zwiększenia czułości reakcji) i mierzono ekstynkcję światła na spektrofotometrze.
Na podstawie odczytów ekstynkcji światła program komputerowy sprzężony ze
spektrofotometrem wyznaczył krzywą wzorcową, z której obliczył zawartość rutyny
w badanych próbach (siewki gryki + ekstrakt z ligniny).[4]
WYNIKI
1. W próbach doświadczalnych nr I, II, III i IV stwierdzono minimalny przyrost pędów
gatunku Agropyron repens, mieszczący się w granicy 0,1 – 0,6 centymetrów.
W obserwowanych przez taki sam okres czasu próbach kontrolnych odnotowano
przyrosty pędów na długość ±3 centymetrów.
Tab. 1. Porównanie długości pędów gatunku Agropyron repens przy długości
początkowej jego kłączy równej 1cm
Nr próby
Próba
doświadczalna
Próba
kontrolna
Uśrednione wartości przyrostów pędów gatunku Agropyron
repens
∆l[cm]
I
II
III
IV
0,23
0,26
0,15
0,11
2,91
2,89
3,15
3,01
2. Badania nad zjawiskiem allelopatii były równolegle prowadzone w dwóch
wariantach. Poza pierwszym omówionym w pracy wykonano badanie wazonowe
w warunkach zbliżonych do naturalnych (środowiska życia gryki zwyczajnej i perzu
właściwego). Wariant ten posłużył wyłącznie jako wstępna obserwacja, gdyż z uwagi
na rodzaj podłoża nie można było wykluczyć interakcji glebowych
i mikrobiologicznych. Obserwacje przebiegały podobnie jak w przypadku
pierwszego zestawu doświadczalnego, z tą różnicą, że nasiona Fagopyrum
3
sagittatum, a następnie kłącza Agropyron repens umieszczano w plastikowej
kuwecie wypełnionej ziemią kwiatową uniwersalną. (Powierzchnia kuwety: 0,24m2,
pojemność 30l.) Co więcej siewki Fagopyrum sagittatum nie były usuwane
z kuwety, a kłącza perzu były sadzone rzędowo w ich obecności. Doświadczenie
wykonano w dwóch powtórzeniach. Czas trwania obserwacji wynosił 2 tygodnie.
Po ich upływie zauważono, że w kuwecie doświadczalnej wykiełkowała i urosła na
wysokość ±16cm tylko gryka zwyczajna. U perzu właściwego nie zanotowano
przyrostu długości pędów. W kuwecie kontrolnej perz właściwy, bez udziału gryki
zwyczajnej wzrósł na wysokość ±20cm.
Ryc. 1. Przyrost długości pędu
Agropyron repens/ badanie wazonowe
– próba kontrolna
Ryc. 2. Wzrost i rozwój Fagopyrum sagittatum, brak reakcji
przyrostowej Agropyron repens/ badanie wazonowe- próba
doświadczalna
3. Z dwutygodniowych siewek Fagopyrum sagittatum wyizolowano substancję
o charakterze allelozwiązku – rutynę.
Tab. 2. Zawartość rutyny w siewkach Fagopyrum sagittatum i ligninie, na której
wykiełkowały
Próba
Zawartość rutyny
(wariant doświadczenia)
Kontrolna
(lignina bez Fagopyrum sagittatum)
w mg/kg s.m.*
0
15 siewek Fagopyrum sagittatum
251
30 siewek Fagopyrum sagittatum
460
* s.m.- sucha masa
4. Próbki z siewkami gryki (i ligniną) zawierały duże ilości rutyny, która wpłynęła
hamująco na rozwój Agropyron repens. Przy 15 siewkach Fagopyrum sagittatum
kłącza Agropyron repens wykształcały początkowo bardzo nieliczne korzonki
4
włośnikowe, które jednak zamierały. Przy próbach z 30 siewkami Fagopyrum
sagittatum, a jednocześnie większej koncentracji rutyny, nie stwierdzono pojawiania
się korzonków włośnikowych Agropyron repens.
Ryc. 3. Związki chemiczne uwalniane przez siewki
Fagopyrum sagittatum do podłoża (wśród nich
wyizolowana rutyna)
DYSKUSJA
Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na istnienie w tkankach gryki zwyczajnej
Fagopyrum sagittatum związków allelopatycznych. Przypuszczalnie ich obecność
spowodowała inhibicję kłączy gatunku testowego Agropyron repens. Potwierdzeniem dla
słuszności mojej hipotezy jest metodyczne wyizolowanie z Fagopyrum sagittatum rutyny.
Z łodyg badanego przeze mnie gatunku już wcześniej wyizolowano także alkaloidy i kwasy
fenolowe. W przypadku obu allelozwiązków udowodniono 50% inhibicję siewek Lactuca
sativa oraz zahamowanie wzrostu łodyg i korzeni u m.in. Lolium multiflorum i Amaranthus
palmeri. Ograniczający wpływ pozostałości resztek roślinnych krewnej gryki zwyczajnej Fagopyrum esculentum na kiełkowanie innych gatunków opisywał także Kumar.[1]
Wiek donora miał minimalne znaczenie ze względu na czas, w jakim prowadzono
obserwacje. Być może wartości przyrostów pędów w próbach kontrolnych były bliskie
zeru, gdyż uważa się, że proces wydzielania allelopatyn przebiega najintensywniej u roślin
młodych.[5] Badane siewki miały zaledwie 2 tygodnie. Po upływie 4 lub 6 tygodni wartości
przyrostów mogłyby być większe, choć badania H. Lipińskiej wskazywały na to, że
allelopatyny 4- tygodniowych siewek Poa pratensis miały mniejszy hamujący wpływ na
kiełkowanie nasion Phleum pratense aniżeli dwutygodniowych. Podobne spostrzeżenie
odnotowano w przypadku nasion Phleum Pratense oraz dwu i cztero- tygodniowych siewek
Lolium perenne. [2] O tym, że faza rozwojowa roślin wpływa na ich potencjał
allelopatyczny pisali również Stochmal i wsp. Ich badania wykazały, że kwasy
hydroksamowe występują w bardzo młodych, zaledwie sześciu- siedmiodniowych
siewkach żyta odmiany Dańkowskie Złote. Po upływie dwunastu dni w tych samych
siewkach znajdują się już tylko ich śladowe ilości. [5]
Wśród czynników warunkujących intensywność wydzielania związków
allelopatycznych oprócz w/w istnieje szereg innych. Na potencjał allelopatyczny roślin
donorów może wpływać stres termiczny, wodny i środowiskowy, niedobór składników
mineralnych w podłożu itd.
Istnieje wiele badań potwierdzających herbicydowość allelozwiązków, tj. możliwość
wykorzystania ich jako naturalnej metody odchwaszczającej. Obecnie poszukuje się
5
gatunków zbóż o jak najmniejszej podatności na działanie fitotoksyn, tak, by można było
zastosować je do wyhodowania odmian całkowicie uodpornionych na obecność chwastów.
Prawdopodobnie alternatywą dla herbicydów w walce z niepożądanymi gatunkami roślin
rolniczych będą odmiany owsa, kukurydzy, sorga, kostrzewy i jęczmienia. W Meksyku
dynia odchwaszcza np. pola fasoli i kukurydzy. W Polsce od dawna do tego celu
wykorzystuje się grykę lub gorczycę. Równie efektywne, a przy tym o wiele bardziej
konkurencyjne w stosunku do chwastów są zasiewy mieszane (jedno- lub wielogatunkowe).
W porównaniu do upraw monogatunkowych charakteryzują się jeszcze lepszą zdolnością
przystosowawczą, a także efektywniejszym wykorzystaniem przestrzeni i zasobów
środowiska. [5]
Zjawisko allelopatii jest powszechne w praktyce rolniczej od stosunkowo dawna.
Człowiek stosuje zmianowanie, uprawę z wsiewką, nawozi roślinę ekstraktem z innej.
Choć wszystkie te czynności postrzega się za proste i oczywiste, mało kto, wie, że
podstawą obserwowanych między roślinami interakcji jest działanie allelozwiązków.
Współczesna biotechnologia pracuje nad wykorzystaniem allelopatin do walki biologicznej
z chwastami. Zwiększa efektywność i skuteczność tego zjawiska dzięki dość obszernej
wiedzy na temat mechanizmu jego działania. Badanie potencjału allelopatycznego u
wybranych gatunków umożliwi izolację odpowiednich związków, a następnie konstrukcję
na ich bazie naturalnych herbicydów. Spośród poznanych dotychczas allelopatyn jako
środek chwastobójczy mogą być zastosowane np. laktony seskwiterpenów obecne w
tkankach słonecznika. Przypuszczalnie badany gatunek – gryka zwyczajna, dzięki
wysokiemu potencjałowi allelopatycznemu może także być wykorzystana do syntezy
herbicydów lub konstruowania transgenicznych roślin uprawnych zdolnych do produkcji
allelozwiązków. [6]
PIŚMIENNICTWO
1.
Kaczmarek S. (2009) Wykorzystanie potencjału allelopatycznego roślin
w wybranych uprawach rolniczych – Postępy w Ochronie Roślin 49(3), 1503:1505
2.
Lipińska H. (2006) Allelopatyczne działanie wybranych gatunków traw na
kiełkowanie nasion Phleum pratense w zależności od ich zagęszczenia - ACTA
AGROBOTANICA, 18,22
3.
Dziedzic K., Drożdżyńska A., Górecka D., Czaczyk K. (2009) Zawartość wybranych
związków przeciwutleniających w gryce i produktach powstałych podczas jej
przerobu – Żywność. Technologia. Jakość 6(67), 82
4.
Żurakowski M., W. Prądzyński, A. Wójcik (1990) Metodyka zmodyfikowana na
podstawie metodyki Borkowskiej i Czyszewskiej zamieszczonej w: Materiały do
ćwiczeń z technologii leśnych produktów ubocznych, AR, Poznań
5.
Parylak D., Zawieja J., Jędruszczak M., Stupnicka-Rodzynkiewicz E., Dąbkowska
T., Snarska K. (2006) Wykorzystanie zasiewów mieszanych, właściwości odmian
lub zjawiska allelopatii w ograniczaniu zachwaszczenia- Postępy w Ochronie Roślin
46(1),39,42, 34
6.
Gniazdowska A. (2007) Biotechnologia szansą dla zastosowania allelopatii jako
alternatywnej metody zwalczania chwastów- Prace przeglądowe, 46
6