RECENZJA PRACY DOKTORSKIEJ P. MAGISTRA SEBASTIANA

RECENZJA PRACY DOKTORSKIEJ
P. MAGISTRA SEBASTIANA LIJEWSKIEGO, PT. „SYNTEZA,
CHARAKTERYSTYKA FIZYKOCHEMICZNA ORAZ OCENA
MOŻLIWOŚCI ZASTOSOWANIA W MEDYCYNIE ORAZ
NANOTECHNOLOGII SIARKOWYCH POCHODNYCH
PORFIRAZYN”
Przedłożona do oceny praca doktorska pana magistra Sebastiana Lijewskiego
została wykonana w Katedrze i Zakładzie Technologii Chemicznej Środków
Leczniczych, Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, pod
kierownictwem promotora, pana dr hab. Tomasza Goślińskiego, prof. UM oraz
promotora pomocniczego, pani dr hab. Ewy Tykarskiej, zaś przedstawione w niej
badania były prowadzone w ramach współpracy łącznie z sześcioma jednostkami
badawczymi w kraju i za granicą.
Już na wstępie chciałam, zatem, wyrazić słowa wysokiego uznania dla owocnej
kooperacji Doktoranta uwieńczonej nie tylko przedstawioną do oceny dysertacją, ale
również załączoną do niej listą pięciu znakomitych publikacji w czasopismach JCR o
współczynniku oddziaływania (IF= 13.957, MNiSzW= 150 pkt) godnym osiągnięcia
habilitacyjnego, w których Doktorant jest pierwszym bądź drugim autorem, co
podkreśla na jego znaczący udział.
Tematyka badawcza niniejszego doktoratu stanowi istotny wycinek
światowych badań nad porfirynoidami, skoncentrowany na siarkowych pochodnych
porfirazyn. Poszukiwanie nowych układów porfirazyn jest ważnym wyzwaniem
współczesnych nauk farmaceutycznych. Porfirynoidy, ze względu na swoje unikalne
właściwości foto- i elektrochemiczne, dają szerokie możliwości praktycznego
wykorzystania w terapii i diagnostyce. W szczególności stwarzają szanse na skuteczną
walkę z rakiem, gdzie mogą być stosowane jako fotosensybilizatory w terapii
fotodynamicznej (PDT), bądź w skojarzonej z nią terapii fototermicznej (PTT). Oba
podejścia umożliwiają miejscowe hamowanie zmian nowotworowych, a przez to
minimalizację działań niepożądanych w obrębie całego organizmu, stanowiących
podstawowe, obok lekooporności, ograniczenie przeciwnowotworowych terapii
farmakologicznych.
Projektowanie i synteza chemiczna nowych układów porfirazyn jest ważnym i
zarazem trudnym zagadnienieniem współczesnej chemii medycznej, niszowym w
naszym kraju, gdzie wiodącym (jeśli nie jedynym) ośrodkiem zajmującym się tą
problematyką jest wysoce wykwalifikowany zespół profesora T. Goślińskiego.
Nawiązując do tradycji swojej Jednostki, Doktorant skierował zainteresowania
badawcze na modyfikacje układu porfirazyny, polegające na wprowadzeniu atomów
siarki i rozbudowaniu części peryferyjnej tegoż układu. Założone w Jego badaniach
powiększenie części peryferyjnej jest zabiegiem w pełni uzasadnionym, biorąc pod
uwagę doniesienia literaturowe dowodzące korzystnego wpływu rozmiarów
fotouczulaczy na skuteczność i bezpieczeństwo terapii fotodynamicznej oraz jej
selektywność wobec specyficznych komórek nowotworowych. Z kolei wprowadzenie
ciężkiego atomu siarki w rozbudowanym peryferyjnym układzie porfirazynowym
może znacząco podnosić aktywność fotodynamiczną takich połączeń, w związku z
większą zdolnością do przechodzenia w stan trypletowy.
Wysoko, zatem, należy ocenić ambitny i przemyślany cel badań przedstawionej
do oceny pracy doktorskiej.
Pod względem kompozycji, praca doktorska p. magistra Lijewskiego ma formę
tradycyjną, składającą się z sześciu głównych rozdziałów (I-VI) oraz sześciu
dodatkowych (VII-XII), zawierających polsko- i anglojęzyczne streszczenie, spisy
elementów graficznych, skrótów, literatury, a także suplement, w którym
zamieszczono widma magnetycznego rezonansu jądrowego.
Główne rozdziały pracy rozpoczyna czterostronicowy Wstęp, w którym Autor
w sposób zwięzły i przejrzysty przedstawia podstawowe informacje dotyczące
układów porfirynoidowych, możliwości ich praktycznego wykorzystania, szczególnie
akcentując ważną z punktu widzenia terapeutycznego zdolność do generowania
aktywnych from tlenu oraz kwestie wykorzystania tej grupy makrocykli w terapii i
diagnostyce fotodynamicznej. Na podkreślenie zasługuje niezwykle czytelny sposób,
w jaki Doktorant tłumaczy podstawy PDD i PDT oraz rolę, jaką odgrywają w nich
właściwości fizykochemiczne porfirynoidów, w szczególności rozmiar cząsteczki w
świetle różnic przepuszczalności zdrowej i zmienionej chorobowo tkanki.
Rozdział ten stanowi świetny prolog do przedstawionego następnie
jednostronicowego planu badań zawartych w doktoracie, zaś jego kontynuacją jest
kolejny rozdział pt. Część literaturowa: Porfirynoidy zawierające w strukturze siarkę.
Opracowany tu przez Doktoranta przegląd literatury jest niezwykle wciągającą
lekturą, przejrzyście przedstawiającą obecny stan wiedzy w zakresie otrzymywania i
właściwości siarkowych pochodnych porfirynoidów. Omawiane grupy połączeń
podzielił na trzy odrębne kategorie. Rozdział zawiera przegląd struktur chemicznych
przynależnych do każdej z grup, wybiórczo metody otrzymywania oraz bogatą
informację na temat skuteczności przeciwnowotworowej siarkowych pochodnych
porfirynoidów w świetle badań z wykorzystaniem różnorodnych linii komórek raka.
Oprócz omówienia różnych wariantów terapii fotodynamicznych, przytacza również
inne nowoczesne podejścia w walce z rakiem, w tym w terapię borowo–neutronową
(BNCT, Boron neutron capture therapy), a także analizuje aktywność
przeciwbakteryjną wybranych grup siarkowych porfirynoidów, bezpośrednią oraz w
połączeniu z nanocząsteczkami.
W podsumowaniu na końcu Przeglądu literaturowego znaleźć można
wytyczne, jakimi, w świetle istniejącego stanu wiedzy, warto się kierować projektując
nowe połączenia porfirynoidowe przydatne w terapii PDT. Doktorant zwraca tu
uwagę na korzystne właściwości fizykochemiczne siarkowych ftalocyjanin i porfirazyn
oraz rolę ugrupowań sulfanylowych w części peryferyjnej układu makrocyklicznego,
czym wprowadza czytelnika w klimat własnych badań opisanych w kolejnych
rozdziałach dysertacji.
Wyniki i dyskusja badań własnych zostały przedstawione w pracy w formie
trzech podrozdziałów utworzonych w oparciu o różnice strukturalne trzech rodzin
siarkowych pochodnych porfirazyn syntetyzowanych w ramach doktoratu. Każdy
podrozdział opisuje przeprowadzone syntezy, badania nad identyfikacją struktury
oraz ocenę właściwości fizykochemicznych warunkujących aktywność biologiczną
oraz potencjalne zastosowanie praktyczne wybranych przedstawicieli poszczególnych
grup. Cały 50-stronicowy rozdział kończy się podsumowaniem przeprowadzonych
prac.
Począwszy od pierwszego podrozdziału, dotyczącego badań w grupie trzech
porfirazyn z peryferyjnymi ugrupowaniami 4-nitroimidazolilobutylosulfanylowymi,
uwagę przyciąga świetny warsztat Doktoranta w zakresie syntezy organicznej,
umiejętność dogłębnej analizy wyników wyrafinowanych metod spektroskopowych,
które wykorzystane zostały do identyfikacji struktury otrzymywanych połączeń.
W miarę rozbudowy części peryferyjnej do potężnych rozmiarów dendrymerycznych
pochodnych aryloksylowych (21), opisanych w kolejnym podrozdziale, identyfikacja
struktury staje się coraz bardziej skomplikowana. Czytając tę część pracy należy
szczególnie pogratulować Doktorantowi biegłości i wnikliwości, w interpretacji
wyników szerokiej gamy badań spektroskopowych: UV-Vis, jedno- i
dwuwymiarowego magnetycznego rezonansu jądrowego (1H NMR, 13C NMR, 1H-1H
COSY, 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC) czy spektrometrii MS MALDI. Dodatkowo, w celu
lepszej charakterystyki struktury przestrzennej, w podrozdziale dotyczącym związków
z peryferyjnym ugrupowaniem arylometylosulfanylowym została zamieszczona
analiza krystalograficzna dwóch półproduktów oraz finalnej porfirazyny z
podstawieniem bifenylowym.
W pracach syntezy chemicznej Doktorant przyjął analogiczny algorytm dla
otrzymywania przedstawicieli wszystkich trzech zaplanowanych rodzin porfirazyn.
Rozpoczynając od ścieżki syntetycznej prowadzącej do uzyskania produktu finalnego
z centralnym atomem magnezu, usuwał następnie magnez, uzyskując porfirazyny
bezmetaliczne, aby na koniec wprowadzić inne kationy koordynacyjne: Mn(II), Zn(II)
czy Co(II). Kluczowe znaczenie miał tu proces makrocyklizacji odpowiednio
podstawionych dimerkaptomaleonitryli prowadzony w warunkach Linsteada, co
służyło uzyskaniu serii porfirazyn z centralnym kationem magnezu. Należy nadmienić,
że Doktorant podjął również próbę uzyskania na drodze osobnej makrocyklizacji
pochodnej manganowej, jednak bez oczekiwanych rezultatów.
Biorąc pod uwagę całokształt prac syntezy organicznej objętych niniejszym
doktoratem sam etap makrocyklizacji, choć wymagający specjalnych warunków i
wysokich umiejętności syntetyka, stanowi jedynie kroplę w oceanie różnorodnych
procesów chemicznych, które prowadził Doktorant. Nadmienić tu należy szereg
różnych metod alkilacji, demetalacje i metalacje, transestryfikacje, syntezy
prowadzone metodą Högera z wykorzystaniem procesów protekcji i deprotekcji grup
hydroksylowych, redukcji, reakcji Mitsunobu, czy reakcje sprzęgania metodą Suzuki–
Miyaura. Wykorzystanie tak różnorodnych metod pozwoliło Doktorantowi otrzymać
9 tetracyklicznych produktów finalnych oraz 5 półproduktów, dla których detale
procedur syntetycznych oraz analiz tożsamości opisał w Części Eksperymentalnej.
Szczególnie trudnym wyzwaniem okazała się synteza związków z grupy
pochodnych arylometylosulfanylowych ze względu na brak reaktywności związków z
podstawieniem 4-bromobenzylosulfanylowym w zaplanowanych reakcjach
sprzęgania. Mimo, że próby zsyntetyzowania takich połączeń nie zakończyły się
sukcesem, bardzo wysoko oceniam ten etap prac Doktoranta, jak również
poświęcony mu podrozdział. Wynika z niego, że Doktorant próbował otrzymać
pożądane produkty stosując 23 próby reakcji Suzuki-Miyaura w różnych warunkach.
Wykorzystywał jako substrat, zarówno bromofenylową pochodną makrocyklicznej
porfirazyny, jak i maleonitrylu, a także różne typy katalizatora palladowego, zasad i
rozpuszczalników. Wnikliwa analiza przyczyn niepowodzenia przeprowadzonych
reakcji ma wysoką wartość naukową i świadczy o znakomitym poziomie wiedzy
chemicznej Autora.
Tym samym pragnę wyrazić wysokie uznanie dla całokształtu badań
chemicznych opisanych w rozdziale Wyniki i dyskusja, który, w zestawie z
komplementarną Częścią Doświadczalną i Suplementem, tworzy interesujący i
przystępnie napisany podręcznik chemii organicznej układów porfirazynowych, który
może stanowić skarbnicę przepisów dla początkującego chemika-syntetyka oraz ucztę
intelektualną dla konesera.
Oprócz interesujących opisów, poświęconych syntezie organicznej, w
przedłożonej do oceny pracy zamieszczone zostały wyniki badań właściwości
fotochemicznych, elektrochemicznych oraz aktywności fotodynamicznej względem
komórek nowotworowych dla wytypowanych przedstawicieli rozważanych trzech
grup sulfanylowych pochodnych porfirazyn. W ten sposób w grupie pochodnych z
peryferyjnymi fragmentami 4-nitroimidazolilobutylosulfanylowymi, związek z
centralnym atomem magnezu (5) badano pod kątem zdolności generowania tlenu
singletowego oraz tlenku azotu, a także pod kątem przeciwnowotworowej
aktywności fotodynamicznej in vitro na ludzkich liniach komórkowych raka prostaty
oraz czerniaka, zaś pochodną manganową (6), zaadsorbowaną na powierzchni
elektrody węglowej, poddano badaniom elektrochemicznym z wykorzystaniem
woltamperometrii cyklicznej. W grupie dendrymerycznych porfirazyn, ocenie
aktywności fotodynamicznej poddano magnezową pochodną, o rozgałęzionych
peryferyjnych ugrupowaniach dendrymerycznych pierwszej generacji (21), a do
badań elektrochemicznych wybrano strukturę zawierającą centralny jon kobaltu (14),
natomiast w grupie połączeń arylometylosulfanylowych uzyskane produkty finalne
(24 i 27) badano pod kątem przeciwnowotworowej aktywności fotodynamicznej z
wykorzystaniem komórek raka kolczystokomórkowego języka oraz raka szyjki macicy.
Uzyskane wyniki dowodzą różnorodnej aktywności badanych połączeń, co
może znaleźć przełożenie na przyszłe wykorzystanie praktyczne. Należy tu wymienić
zdolność generowania tlenu singletowego w DMF i DMSO przez magnezową
pochodną nitroimidazolilobutylosulfanylową (5) oraz jej zauważalny wpływ toksyczny
na komórki linii raka prostaty PC3. Wysoką aktywność przeciwnowotworową
względem ludzkiego raka kolczystokomórkowego (HSC-3) stwierdzono, natomiast,
dla pochodnej 4-bromofenylometylosulfanylowej (24). Badania elektrochemiczne
wykazały poprawę wydajności elektroredukcji tlenu wynikającą z zastosowania
elektrody węglowej z zaadsorbowanym makrocyklem manganowym (6) oraz
możliwość wykorzystania makrocyklu kobaltowego (14) jako katalizatora
przeniesienia ładunku w reakcjach utleniania – redukcji.
Doktorant przygotowując dysertację opierał się na 97 pozycjach literatury
naukowej, w większości opublikowanej po roku 2000. Wszystkie rozdziały pracy
przygotowane są bardzo starannie i przejrzyście służy temu bogata szata graficzna,
którą tworzy: 38 rysunków, 19 schematów, 10 tabel oraz 10 wykresów. Dodatkowo
Doktorant wzbogacił rysunkami struktur procedury otrzymywania poszczególnych
związków zamieszczone w Części eksperymentalnej.
Można, zatem, stwierdzić, że praca prezentuje wysoki poziom, tak pod
względem merytorycznym, jaki i graficznym.
Czytając przedłożoną do oceny rozprawę doktorską nasunęły mi się
następujące pytania i uwagi:
1. Ile i jakie struktury finalne zostały zaplanowane do syntezy w ramach pracy? W
rozdziale pt. „Cel Pracy” brak precyzyjnej informacji na ten temat. Rozdział ten byłby
bardziej wymowny, gdyby zamieszczono w nim zaplanowane struktury, przynajmniej
w postaci wzorów ogólnych.
2. Jakie przesłanki zadecydowały o wyborze związków 5 i 21, jako
reprezentatywnych w swoich grupach do badań na aktywność fotodynamiczną in
vitro?
3. W badaniach zdolności generowania tlenu singletowego wyliczono wydajności
kwantowe dla związku 5 w DMF oraz DMSO (ΦΔDMF = 0.045; ΦΔDMSO = 0.035). Jak
silne zdolności generowania tlenu singletowego ma związek 5, biorąc pod uwagę
uzyskane wartości? W pracy nie udało mi się znaleźć stosownego komentarza na ten
temat.
4. Czy reakcja alkoholizy (transestryfikacji), w wyniku której doszło do wymiany
grupy metoksylowej na butoksylową w procesie makrocyklizacji z wytworzeniem
produktów 11 i 21 była zabiegiem zamierzonym?
5. W Części eksperymentalnej pojawia się kilkakrotnie sformułowanie „suchą
pozostałość chromatografowano”. Jaki rodzaj chromatografii kryje się w tym
enigmatycznym słowie?
Ponadto szukając, z obowiązku recenzenta, słabych stron pracy, natknęłam się
na kilka następujących bardzo drobnych uchybień:
Strona 7 (ostatnie 2 linijki): jest „terasulfonowej” powinno być: „tetrasulfonowej”
Strona 8 – symbol „XII” został nadany dwóm różnym związkom
Strona 17 – jest: „Otrzymano”, powinno być „Otrzymaną”
Strona 29, linijka 11 – jest: „odpornością”, powinno być: „odporność”
Strona 29, linijka 13 – jest: „porfriazyną”, powinno być: „porfirazyną”
Strona 81- czcionka w strukturze o najbardziej rozbudowanym obszarze peryferyjnym (21) jest
zbyt mała, co skutkuje „zanikiem” dwóch wiązań przy jonie centralnym. Doktorant powinien
był zrobić wyjątek dla tej struktury i przedstawić ją w większym formacie.
Te, jak widać, bardzo drobne i nieliczne niedostatki nie dotyczą merytorycznej
strony pracy, a jedynie formy prezentacji jej rezultatów i w najmniejszym stopniu nie
wpływają na moją bardzo wysoką opinię na temat niniejszej dysertacji oraz sylwetki
naukowej Doktoranta – jego kunsztu chemicznego oraz szerokiej wiedzy i
umiejętności w dziedzinie chemii medycznej i farmaceutycznej.
Wysoko oceniam, zatem, całokształt przedłożonej mi do oceny pracy
doktorskiej, która w sposób wyróżniający spełnia wymagania stawiane doktoratom
w świetle ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule
naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. z 2003 r. Nr 65, poz.
595 z późn. zm.).
W związku z powyższym zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału
Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w
Poznaniu o dopuszczenie pana magistra Sebastiana Lijewskiego do dalszych etapów
przewodu doktorskiego.
Kraków, 4 maja 2016
Dr hab. Jadwiga Handzlik
.