Oznaczanie aktywności cytotoksycznej chemoterapeutyków wobec

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Oznaczanie aktywności cytotoksycznej chemoterapeutyków
wobec komórek nowotworowych
Badania aktywności biologicznej chemoterapeutyków prowadzone są na
modelach komórkowych (aktywność cytotoksyczna) lub zwierzęcych (aktywność
przeciwnowotworowa). Do ilościowego określenia aktywności cytotoksycznej najczęściej
wykorzystuje się róŜnego rodzaju testy komórkowe prowadzone w hodowli in vitro.
Pozwala to ograniczyć ilość badań na zwierzętach, co jest waŜne ze względów
humanitarnych. Ponadto moŜliwości automatyzacji badań pozwala na testowanie wielu
związków, na wielu liniach komórkowych jednocześnie.
KaŜdy test składa się z tych samych etapów:
1. inkubacji komórek danego typu z badanym związkiem przez określony czas i
przy wzrastających stęŜeniach (zwykle 3-4 cykle podwojenia komórek), w celu
wystąpienia efektu cytotoksycznego działania związku,
2. oznaczenia parametru związanego ze wzrostem (proliferacją) komórek.
Ten ostatni etap odróŜnia poszczególne testy od siebie, poniewaŜ oznaczane są róŜne
parametry np.:
• ilość komórek,
• zdolność do podziałów komórkowych,
• funkcjonowanie błony komórkowej,
• aktywność mitochondriów,
• inkorporacja barwników do lizosomów,
• całkowita zawartość białka czy DNA w komórce,
• zahamowanie syntezy DNA itd.
Do oznaczania aktywności cytotoksycznej związków stosowanych jest szereg metod
wykorzystujących róŜnorodne barwniki np. MTT, SRB, DAPI, jodek propidyny, błękit
trypanu itd. (tab. 1).
MIERZONY PARAMETR
ZASADA POMIARU
całkowita zawartość białka
barwniki mają zdolność wiązania się z białkami
komórkowymi np. sulforodamina B,
Coommasie Brilliant Blue
całkowita zawartość DNA
fluorochromy mające zdolność do
stechiometrycznego wiązania się z DNA np. DAPI,
Hoechst 33342,
Aktywność oksydoredukcyjna mitochondriów
barwienie martwych komórek
mierzona jest zdolność do redukcji barwnika MTT
zachodząca w Ŝywych komórkach
barwniki wnikają do komórek, których integralność
błony komórkowej jest naruszona;
np. jodek propidyny, błękit trypanu, erytrozyna B
Tabela 1. Zasady najczęściej stosowanych testów uŜywanych do oznaczania
aktywności cytotoksycznej.
Ilościowo, aktywność biologiczną związku moŜna wyrazić na dwa sposoby:
1. Dawka (stęŜenie) wywołujące standardową odpowiedź biologiczną.
2. % odpowiedzi w stosunku do kontroli przy standardowej dawce (stęŜeniu).
Pierwszy sposób jest najczęściej stosowaną i uznawaną za najbardziej precyzyjną
metodę ilościowego wyraŜania aktywności biologicznej, w której moŜna wymienić takie
miary jak:
IC50 – inhibitory concentration – stęŜenie hamujące wzrost komórek w 50%
EC50 – efective concentration – efektywne stęŜenie związku
ED50 – efective dose – dawka efektywna
LD50 – lethal dose – dawka związku powodująca śmierć 50% komórek
MIC – minimum inhibitory concentration – minimalne stęŜenie hamujące wzrost
komórek
MTD – maximum tolerated dose – maksymalna tolerowana dawka
W celu wyznaczenia tego typu miar aktywności naleŜy wykonać wykres zaleŜności
zahamowania wzrostu komórek (wyraŜonej jako procent w stosunku do kontroli, którą
przyjmuje się za 100%) od stęŜenia badanego związku (rys.1). Na podstawie liniowego
fragmentu tej zaleŜności wyznacza się trzy wielkości, stanowiące podstawę do oceny
cytotoksyczności badanego związku. Są to:
EC10 - stęŜenie związku, przy którym proliferacja komórek w hodowli in vitro
zostaje zahamowana w 10% w stosunku do komórek kontrolnych
– tzw. pierwsza dawka toksyczna;
EC50 - stęŜenie związku, przy którym proliferacja komórek w hodowli in vitro
zostaje zahamowana w 50% w stosunku do komórek kontrolnych
– tzw. miara cytotoksyczności;
EC90 - stęŜenie związku, przy którym proliferacja komórek w hodowli in vitro
zostaje zahamowana w 90% w stosunku do komórek kontrolnych
– tzw. dawka letalna (śmiertelna);
100
% kontroli
80
60
40
20
EC10
0
0,00001
0,0001
0,001
EC50
EC90
0,01
0,1
1
stęŜenie związku [µM]
Rys.1 Zahamowanie wzrostu komórek w zaleŜności od stęŜenia badanego związku.
WYKONANIE ĆWICZENIA
1. pomiar zahamowania wzrostu komórek, metodą liczenia komórek
Oznaczanie aktywności cytotoksycznej związków metodą liczenia komórek,
polega na wykorzystaniu elektronicznego urządzenia Coulter Counter (rys.2).
Urządzenie to zlicza komórki w zawiesinie, które przechodzą przez specjalny otwór,
zmieniając opór przepływającego prądu. Zmiana tego oporu jest proporcjonalna do
objętości komórki. Powstają w ten sposób pulsy które są wzmacniane i zliczane.
Rys.2 Licznik Coulter Counter [1].
Zawiesinę komórek naleŜy dobrze rozpipetować, pobrać 1 ml do naczynka (do
liczenia komórek) i dodać dwie porcje buforu izotonicznego (2 x 9,5 ml = 19 ml)
(rozcieńczenie próbki komórek wynosi 1:19). Coulter pobiera do liczenia 0,5 ml
roztworu, dlatego teŜ wynik z wyświetlacza na Coulterze naleŜy pomnoŜyć przez 40, aby
otrzymać ilość komórek w tysiącach/ml.
2. pomiar zahamowania wzrostu liczby komórek z wykorzystaniem aktywności
oksydoredukcyjnej mitochondriów – metoda MTT
Oznaczanie aktywności biologicznej metodą MTT opiera się na załoŜeniu, Ŝe
tylko w Ŝywych komórkach dochodzi do redukcji tego barwnika. W wyniku działania
mitochondrialnej dehydrogenazy Ŝółta, rozpuszczalna w wodzie, sol tetrazolowa
(formazan błękitu triazolowego – MTT) przekształcana jest do purpurowych,
nierozpuszczalnych w wodzie kryształów formazanu (rys.3). Ilość wytworzonych
kryształów formazanu jest proporcjonalna do ilości komórek.
Rys. 3 Konwersja MTT do formazanu [2].
MATERIAŁY I SPRZĘT
1. wybrana linia komórek nowotworowych
2. wyjściowy roztwór badanego związku
3. etanol: 50 % (V/V) roztwór w wodzie
4. MTT: roztwór barwnika w wodzie o stęŜeniu 4 mg/ml
5. DMSO
6. probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml
7. pipety automatyczne
8. rękawiczki
Przygotowanie komórek do doświadczenia:
Komórki w fazie logarytmicznego wzrostu wysiewa się na płytkę 24-studzienkową w
ilości 20 tys.komórek/2 ml poŜywki na studzienkę, a następnie inkubuje w temperaturze
37°C, 5% CO 2 przez 24 godziny.
Przygotowanie roztworów badanego związku:
Roztwory badanego związku przygotowuje się w 50% etanolu w zakresie stęŜeń: 0,05;
0,1; 0,5; 1; 5; 10; 50; 100; 500 µM. Wyjściowe roztwory związku są stukrotnie
stęŜone w stosunku do załoŜonych stęŜeń, gdyŜ dodawane są one w objętości 20
µl do 2ml poŜywki w studzience z komórkami.
Traktowanie komórek badanym związkiem:
Pracując w komorze laminarnej, zapewniającej sterylne warunki pracy, komórki
traktuje się roztworami badanego związku w następujący sposób:
• dwie pierwsze studzienki to komórki słuŜące jako kontrola i do nich dodaje się 20
µl 50% etanol,
• do następnych studzienek dodaje się kolejne roztwory badanego związku,
począwszy od najniŜszego stęŜenia,
Płytkę umieszcza się w inkubatorze na 72 godziny.
Określenie stopnia zahamowania wzrostu komórek przez badaną substancję:
1. Po 72 godzinach inkubacji komórek ze związkiem, do kaŜdej studzienki dodaje się po
200 µl roztworu barwnika MTT i pozostawia w inkubatorze na 4 godziny.
2. Pod próŜnią odsysa się delikatnie płyn znad kryształów formazanu i dodaje się po 2
ml DMSO do kaŜdej studzienki.
3. Płytki umieszcza się na orbitalnej wytrząsarce i łagodnie miesza przez 30 minut, aby
kryształy formazanu uległy rozpuszczeniu.
4. Z kaŜdej studzienki z płytki 24-studzienkowej przenosi się po 200 µl roztworu do
dwóch studzienek na płytce 96-studzienkowej.
5. Absorpcję roztworów oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali 540 nm za
pomocą czytnika płytek.
2. pomiar zahamowania wzrostu liczby komórek z wykorzystaniem barwnika
sulforodaminy B (SRB)
Sulforodamina B (SRB) (rys.4) jest anionowym barwnikiem, który wiąŜe się z
podstawowymi aminokwasami białek komórkowych. Oznaczanie aktywności
cytotoksycznej w tym teście prowadzi się na podstawie pomiaru ilości białka
komórkowego.
Rys.4 Sól sodowa sulforodaminy B.
MATERIAŁY I SPRZĘT
1. wybrana linia komórek nowotworowych
2. wyjściowy roztwór badanego związku
3. etanol: 50% (V/V) roztwór w wodzie
4. 50% roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA), zimny (4O C)
5. 0.4% (w/V) roztwór sulforodaminy B (SRB) w 1% kwasie octowym
6. 1% kwas octowy
7. 10 mM Tris-base (pH 10,5)
8. probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml
9. pipety automatyczne
10. płytki wielostudzienkowe (24 i 96)
11. lignina
12. rękawiczki
WYKONANIE
Przygotowanie komórek do doświadczenia:
Komórki w fazie logarytmicznego wzrostu wysiewa się na płytkę 24-studzienkową w
ilości 20 tys.komórek/2 ml poŜywki na studzienkę, a następnie inkubuje w temperaturze
37°C, 5% CO 2 przez 24 godziny.
Przygotowanie roztworów badanego związku:
Roztwory badanego związku przygotowuje się w 50% etanolu w zakresie stęŜeń: 0,05;
0,1; 0,5; 1; 5; 10; 50; 100; 500 µM. Wyjściowe roztwory związku są stukrotnie
stęŜone w stosunku do załoŜonych stęŜeń, gdyŜ dodawane są one w objętości 20
µl do 2ml poŜywki w studzience z komórkami.
Traktowanie komórek badanym związkiem:
Pracując w komorze laminarnej, zapewniającej sterylne warunki pracy, komórki
traktuje się roztworami badanego związku w następujący sposób:
• dwie pierwsze studzienki to komórki słuŜące jako kontrola i do nich dodaje się 20
µl 50% etanol,
• do następnych studzienek dodaje się kolejne roztwory badanego związku,
począwszy od najniŜszego stęŜenia,
Płytkę umieszcza się w inkubatorze na 72 godziny.
Określenie stopnia zahamowania wzrostu komórek przez badaną substancję:
1. Po zakończonej inkubacji przyklejone komórki utrwala się 500 µl zimnego 50% TCA
(4oC) w 4°C przez 1 godzin ę.
2. KaŜdą studzienkę płucze się wodą z kranu i suszy na powietrzu, powtarzając tą
czynność 5 razy.
3. Do kaŜdej studzienkę dodaje się po 500µl 0,4% roztworu SRB rozpuszczonego w
1% kwasie octowym i barwi się przez 30 minut.
4. Niezwiązany barwnik usuwa się zlewając go przez odwrócenie płytki do góry
nogami. Komórki płucze się 4 razy 1% kwasem octowym. Następnie płytkę suszy się
na powietrzu przez ok. 5 min;
5. Związany barwnik rozpuszcza się poprzez dodanie do kaŜdej studzienki 1500 µl 10
mM Tris-base i miesza się przy uŜyciu orbitalnej wytrząsarki przez 5 minut.
6. Przenosi się po 200 µl roztworu z kaŜdej studzienki z płytki 24-studzienkowej do
dwóch studzienek na płytce 96-studzienkowej;
7. Absorpcję roztworów oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali 490-530
nm za pomocą czytnika płytek.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
1. Obliczyć średnie wartości absorpcji dla kaŜdego stęŜenia badanego związku.
2. Wyznaczyć, jaki procent wartości uzyskanej dla komórek kontrolnych (100%)
stanowią wyliczone średnie wartości absorpcji dla poszczególnych stęŜeń
badanego związku.
% kontroli:
Aśrednia dla komórek kontrolnych
Aśrednia dla komórek traktowanych związkiem
– 100 %
–x%
X = (Aśrednia dla komórek traktowanych związkiem * 100%) / Aśrednia dla komórek kontrolnych
Odchylenie standardowe z % wzrostu komórek: (Odchylenie standardowe * 100) / Aśrednią
Uzyskane wyniki zestawić w postaci tabeli:
StęŜenie [µ
µM]
K
0,0005
...
50
A1 [nm]
A2 [nm]
Aśrednia [nm]
Odchylenie
standardowe
%
kontroli
Odchylenie
standardowe
z % wzrostu
komórek
100
3. Sporządzić wykres zaleŜności zahamowania wzrostu komórek (% kontroli) od
logarytmu stęŜenia badanej substancji. Z powyŜszego wykresu wyznaczyć
fragment prostoliniowy i podać jego równanie. Obliczyć wartości parametrów
EC10, EC50, EC90.
4. Skomentować uzyskany wynik.
Literatura:
1. http://www.gmi-inc.com/CliniLab/Coulter%20Z2%20Series.htm
2.http://www.dojindo.com/products/category/dsp_detail.cfm?requesttimeout=500&ProdN
ame=MTT