Podstawy rekonstrukcji obrazow mikroskopowych

Podstawy rekonstrukcji obrazów
mikroskopowych w przestrzeni
trójwymiarowej
PRAKTIKUM Z BIOLOGII KOMÓRKI
(BT 231)
Podstawy rekonstrukcji obrazów...
BT 231
Podstawy rekonstrukcji obrazów mikroskopowych w przestrzeni trójwymiarowej
Mikroskopia fluorescencyjna stanowi niezwykle uŜyteczne narzędzie w badaniach
struktury i funkcji komórek. Dzięki moŜliwości zastosowania fluorochromów o zdolności
wybiórczego wiązania się z badaną strukturą subkomórkową lub sprzęŜonych ze
specyficznymi przeciwciałami lub sondami molekularnymi umoŜliwia ona złoŜone analizy
zmian lokalizacji białek komórce w toku róŜnych procesów. Postęp technologiczny w
automatyzacji sprzętu pozwolił na opracowanie urządzeń umoŜliwiających rekonstrukcje
trójwymiarowe obrazów mikroskopowych, które okazały się szczególnie uŜyteczne przy
badaniach preparatów, których grubość znacznie przekracza głębię ostrości optyki klasycznych
mikroskopów fluorescencyjnych. Skaningowa mikroskopia konfokalna stanowi być moŜe
najdoskonalsze narzędzie tego typu, które dzięki złoŜonemu układowi optycznemu
odcinającemu sygnał pochodzący z rejonów preparatu pozostających poza ogniskiem
obiektywu daje moŜliwość analizy struktury preparatu w osi Z, t.j. równoległej do osi
optycznej układu. Jednak specyfika prowadzonych doświadczeń nie zawsze uzasadnia zakup
takiego sprzętu. Rozwiązaniem pośrednim jest zastosowanie konwencjonalnego mikroskopu
fluorescencyjnego szerokiego pola wyposaŜonego w zautomatyzowany układ zmieniający
połoŜenie stolika zarówno w płaszczyźnie x,y jak i z, oraz moŜliwość prowadzenia rejestracji
obrazów z kilku miejsc preparatu w czasie jednej sekwencji.
Mikroskop Leica DM IRE jest przykładem układu mikroskopowego wyposaŜonego w
oprogramowanie pozwalające jednocześnie na akwizycję obrazów mikroskopowych w trybie
„z-stack” i złoŜone operacje na plikach graficznych, w tym ich dwu- i trójwymiarową
dekonwolucję (w oparciu o funkcje rozproszenia (ang. point-spread function – PSF)). Celem
ćwiczeń jest zapoznanie się z moŜliwościami mikroskopu Leica DM IRE2 oraz programu
Leica FW4000 oraz Leica Deblur pozwalającymi na akwizycję obrazów mikroskopowych w
przestrzeni trójwymiarowej i ich wstępna dekonwolucję.
Cel doświadczenia:
1. Zapoznanie się z podstawowymi zasadami rządzącymi akwizycją i obróbką obrazów
mikroskopowych w przestrzeni trójwymiarowej.
2. Poznanie zasad obsługi automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego
Przebieg doświadczenia:
Ćwiczenie podzielone jest na dwie części:
1. Wielokanałowa akwizycja obrazów preparatów fluorescencyjnych w przestrzeni
trójwymiarowej
2. Zastosowanie technik dwu- i trójwymiarowej dekonwolucji do obróbki obrazów
mikroskopowych
Ad. 1.
1. Przygotuj do pracy mikroskop zgodnie z instrukcja z ćwiczeń p.t. „Automatyczny
mikroskop fluorescencyjny - zastosowanie cyfrowych, chłodzonych kamer CCD w
mikroskopii fluorescencyjnej” Uruchom program Leica FW4000 i zaloguj się jako Default
2
BT 231
Podstawy rekonstrukcji obrazów...
2.
3.
4.
5.
6.
7.
BT 231
User i uruchom opcję Create New Experiment. Wprowadź nazwę doświadczenia
(grupa[Nr]-1) i opis doświadczenia. Wciśnij klawisz Setup.
Przyciśnij klawisz X/Y. W oknie Setup Fluorochromes wybierz odpowiednie bloki
filtrów dla stosowanych fluorochrów (BrightField, DAPI, FITC i TRITC)
Umieść pod mikroskopem preparat, wybierz obiektyw imersyjny x40 i ustaw przesłony do
pracy w kontraście interferencyjnym Nomarskiego (przesłona kondensorowa: 40/63,
pryzmat: E).
Wybrać kanał dla światła przechodzącego (szara ikona). Włączyć podgląd obrazu na
monitorze (ikona z zielonym kwadratem), ustawić odpowiedni czas otwarcia przesłony –
taki, aby obraz na monitorze był najlepszy.
Wykonać zdjęcie i zapisać obraz naciskając pole Save in LabBook.
Operacje powtórzyć dla pozostałych kanałów optycznych.
Z wykorzystaniem juŜ ustawionych parametrów doświadczenia (przez wybranie jako
wzorca juŜ zapisanego eksperymentu) wykonać zapis innego miejsca preparatu przez
kolejnych uczestników ćwiczeń
-------------------------------------Dokonać wstępnego elektronicznego przetworzenia obrazów otrzymanych w trybie
jednopłaszczyznowym wg następującego wzorca:
1. Obejrzeć obrazy uzyskane w trybie jednopłaszczyznowym poprzez funkcję Lab
Book/Open existing exeriment/Review i wybrać najlepszy zestaw mikroforografii.
2. Uaktywnić jeden z kanałów fluorescencyjnych uruchomić następnie narzędzie
deconvolution, ustawiając odpowiednie połoŜenie suwaków: haze removal,
smoothing oraz spot removal ustawić najlepszy obraz dla danego kanału (podgląd
przycisk review, porównanie z wyjściowym – toggle, powrót do wyjściowego obrazu reset). Po zakończeniu procedury wcisnąć przycisk „No Neighbours”
3. Operację powtórzyć dla wszystkich kanałów a następnie sporządzić obrazy złoŜone
ustawiając odpowiednio intensywnść poszczególnych kanałów. Zapisać poszczególne
obrazy
w
formacie
bmp
(File,
save
image
as)
w
kartotece
C:\pulpit\Cwiczenia\Grupa[X]
------------------------------------Akwizycja w przestrzeni trójwymiarowej
8. Wybrać kanał dla światła przechodzącego i uruchomić „Ŝywy” obraz preparatu
9. Zogniskować obiektyw w centralnej płaszczyźnie ogniskowej preparatu
10. Wyzerować pozycję stolika z górnego panelu kontrolnego (przycisnąć na około 5 sekund
klawisz 2-gi z prawej)
11. Następnie przejść w tryb pracy „Z-stack”, aktywując przez naciśnięcie białego kwadratu i
naciskając przycisk Z (uwaga: przy aktywnym trybie Z naleŜy powstrzymać się od
„ręcznego” ustawiania ostrości preparatu !!!).
12. W oknie dialogowym „Z-stack” zidentyfikować diagram obrazujący aktualnie zadane
płaszczyzny obrazu w osi Z, przyciski słuŜące zdefiniowaniu płaszczyzny granicznej
górnej (set upper) i dolnej (set lower) i przycisk centrowania pozycji diagramu względem
stolika.
13. Zadać odległość w osi Z między poszczególnymi płaszczyznami akwizycji na 1 µm
14. Zogniskować obiektyw w centralnej płaszczyźnie ogniskowej preparatu i przycisnąć
klawisz „set to centre”. Następnie przesunąć płaszczyznę zaznaczoną kolorem zielonym w
górę obserwując obraz mikroskopowy tak, aby obraz stał się nieostry (ok. 5µm ponad
3
BT 231
Podstawy rekonstrukcji obrazów...
BT 231
płaszczyznę centralną-wyświetlane na panelu kontrolnym mikroskopu). Następnie
przesunąć tę płaszczyznę poniŜej płaszczyzny centralnej, aby uzyskać ten sam efekt i
przycisnąć klawisz „set lower”.
15. Na dole okna pojawi się wydruk liczby płaszczyzn, z których zbierany będzie obraz przy
zadanym kroku. Zmienić kanał optyczny na fluorescencyjny i zweryfikować ustawienia
płaszczyzn akwizycji obrazu.
16. Uruchomić zapisywanie obrazu przyciskiem - Capture
17. Obejrzeć zapisane obrazy naciskając przycisk - Review
18. Z wykorzystaniem juŜ ustawionych parametrów doświadczenia (przez wybranie jako
wzorca juŜ zapisanego eksperymentu), zmodyfikować parametry stosownie do właściwości
innych miejsc preparatu i wykonać jego zapis.
19. Wybrać najlepszy zestaw obrazów i wysłać do dalszej analizy (zaznaczyć wybrane obrazy
klikając biały kwadrat przy nazwie i nacisnąć klawisz "Export selected Images to Image
Processing"
Ad.2 Przygotować obrazy uzyskane w trybie wielopłaszczyznowym do dekonwolucji w
programie Leica Deblur.
1. Obejrzeć obrazy w trybie Maximum Projection (tryb ten sumuje płaszczyzny
wybierając piksel o najwyŜszej wartości - intensywności) i tak jak poprzednio wybrać
najlepszy zestaw obrazów uzyskanych w trybie „Z-stack”.
2. Zestaw wysłać do dalszej analizy (zaznaczyć obrazy z wybranego kanału klikając biały
kwadrat przy nazwie, wejść do Menu - Gallery i nacisnąć - Export selected Images
to Image Processing/Process/Send selection for processing/Send. Uruchomi się
automatycznie program Leica Deblur.
3. W programie Leica Deblur moŜliwa jest nie tylko obróbka obrazów, ale równieŜ
złoŜenia i obserwacje zestawu obrazów w róŜnych płaszczyznach (X,Y; XZ i YZ),w
trybie Maksymalnej i Minimalnej projekcji, jego rekonstrukcje trójwymiarowe i
przegląd "slice after slice".
4.
Program Leica Deblur umoŜliwia przeprowadzenie kilku typów dekonwolucji,
zarówno dwu-, jak i trójwymiarowej, spośród których najbardziej zaawansowana jest
tzw. ślepa dekonwolucja trójwymiarowa (pkt.6). W celu porównania działania obu
typów dekonwolucji wybrany zestaw mikrofotografii wyświetlić w trybie "slice
viewer".
5.
Otwórz menu Deconvolution i w Pasku zadań i uruchom okno okno 2-D Blind
Deconvolution. W oknie dialogowym zaznacz (Multiple frames) i zdefiniuj liczbe
iteracji na 20. Przyciśnij ikonkę Start. Porównaj obraz zdekonwoluowany z obrazem
oryginalnym wykorzystując tryb "slice viewer" i MaxProjection
6. Uruchom okno 3D Deconvolution. W otwartym oknie dialogowym sprawdź zgodność
zadanych parametrów drogi optycznej ze stanem faktycznym, zaznacz wariant
Best/High/Moderate. Ustaw liczbę iteracji na 60/Save interval na 30. Przyciśnij
Start. Wynik powinien pojawić się po kilku minutach.
Porównaj zdekonwoluowane obrazy w trybie 2D i 3D przy uŜyciu trybu "Clice viewer" i
"Crop". Operacje powtórzyć na zestawach obrazów z innych kanałów.
4
BT 231
Podstawy rekonstrukcji obrazów...
BT 231
Zagadnienia:
− Zasada działania mikroskopii szerokiego pola i mikroskopii konfokalnej
− Podstawowe zasady obsługi mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM IRE
Zalecana literatura:
− Podstawy biologii komórki, Wprowadzenie do biologii molekularnej pod redakcją
B. Alberts`a
− Automatyczny mikroskop fluorescencyjny - zastosowanie cyfrowych, chłodzonych
kamer CCD w mikroskopii fluorescencyjnej – instrukcja do ćwiczeń
5
BT 231