Specyficzne inhibitory enzymów o potencjalnym zastosowaniu

Specyficzne inhibitory enzymów o potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym
Maria Bretner*
Wydział Chemiczny, Politechnika Warszawska, Warszawa
Wydział Chemiczny, Politechnika
Warszawska, ul. Noakowskiego 3, 00664 Warszawa; tel.: (22) 234 75 70, e-mail:
[email protected]
*
Artykuł otrzymano 16 lipca 2015 r.
Artykuł zaakceptowano 29 lipca 2015 r.
Słowa kluczowe: inhibitory, helikaza wirusa
zapalenia wątroby typu C, kinaza kazeinowa
STRESZCZENIE
T
erapia wirusowego zapalenia wątroby typu C (HCV, ang. Hepatitics C virus), początkowo polegająca na podawaniu leku o szerokim spektrum działania, rybawiryny
oraz pegylowanego interferonu alfa-2a lub alfa-2b była skuteczna jedynie u 40–50% pacjentów. Celowym było poszukiwanie efektywnych inhibitorów replikacji wirusa HCV,
np. inhibitorów wirusowego enzymu, NTPazy/helikazy, niezbędnej w procesie translacji
oraz replikacji RNA HCV. Opracowano metody syntezy wielu związków należących do
różnych grup: pochodnych nukleozydów, benzotriazolu, benzimidazolu, tropolonu oraz
epirubicyny. Niektóre z pochodnych hamują w niskich stężeniach aktywność helikazy
HCV oraz wpływają na obniżenie replikacji wirusowego RNA w systemie subgenomowego replikonu. W procesie replikacji HCV ważną rolę odgrywa kinaza kazeinowa CK2,
która reguluje stopień fosforylacji białka NS5A, co wpływa na produkcję infekcyjnych
wirionów HCV. Skuteczne i selektywne inhibitory kinazy CK2 mogłyby znaleźć zastosowanie w terapii HCV w kombinacji z innymi lekami. Kinaza CK2 fosforyluje około
300 białek mających wpływ na wzrost, różnicowanie, proliferację czy apoptozę komórek.
Podwyższoną aktywność kinazy CK2 zaobserwowano w wielu rodzajach nowotworów
oraz innych chorobach. Badania prowadzone we współpracy z prof. Shugarem doprowadziły do syntezy jednego z najbardziej selektywnych inhibitorów tego enzymu jakim
jest 4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazol, który przyczynił się do poznania roli kinazy CK2
w wielu procesach metabolicznych w komórkach nowotworowych.
WPROWADZENIE
Genom wirusa HCV został sklonowany w 1989 roku [1]. W tym czasie na
świecie rozpoczęto intensywne prace mające na celu poznanie cyklu replikacji tego wirusa oraz badania dotyczące kluczowych dla opracowania terapii
enzymów. Genom wirusa HCV składa się z ok. 9600 nukleotydów i koduje
składającą się z około 3000 reszt aminokwasowych poliproteinę [2], która jest
proteolitycznie rozszczepiana (przez proteazy wirusowe, jak i komórkowe)
na 10 białek wirusowych — białka strukturalne oraz niestrukturalne.
Wśród białek niestrukturalnych znajdują się: białko NS2 (proteaza), białko
NS3 (proteaza oraz NTPaza/helikaza), białko NS4A (kofaktor proteazy NS3),
białko NS4B (białko służące jako kotwica kompleksu replikacyjnego do siateczki
endoplazmatycznej), białko NS5A (białko wiążące się z RNA wirusowym, zabezpieczające to RNA przed degradacją przez komórkowe RNAzy) oraz białko
NS5B (RNA zależna polimeraza RNA) [3].
Badania mające na celu opracowanie skutecznej terapii były i nadal są trudne,
ponieważ brak jest modelu zwierzęcego, a wirus namnaża się jedynie w ludzkich hepatocytach. Dodatkową trudnością jest duża zmienność genetyczna wirusa HCV spowodowana mutacjami w jego genomie.
INHIBITORY HELIKAZY WIRUSA ZAPALENIA WĄTROBY TYPU C
Firmy farmaceutyczne szukając środków przeciw HCV skupiły swe wysiłki na znalezieniu inhibitorów enzymów ważnych dla cyklu życiowego
tego wirusa: proteazy NS3-4A, polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp)
oraz NTPazy/helikazy. Znaleziono inhibitory proteazy NS3 [4] i polimerazy
[5,6], jednak niewiele było wzmianek w literaturze światowej o znalezieniu
inhibitorów NTPazy/helikazy, dlatego zajęliśmy się ich projektowaniem i
badaniem. Wiadomo było, że rozwijaniu podwójnej nici wirusowego RNA
towarzyszy hydroliza 5’trójfosforanów rybonukleozydów (głównie ATP) [7].
Zbadaliśmy więc czy inhibitory innych enzymów oddziałujących z ATP będą
hamowały aktywność ATPazową enzymu HCV i jak wpłynie to na aktywność helikazową NTPazy/helikazy HCV. Po zsyntetyzowaniu estrów 5’-fluorosulfonylobenzoilowych adenozyny, guanozyny, inozyny oraz rybawiryny (Ryc. 2) i zbadaniu ich wpływu na aktywność ATPazową helikazy HCV
292www.postepybiochemii.pl
Rycina 1. Schemat organizacji poliproteiny kodowanej przez genom wirusa HCV.
przeżywalność komórek Vero
i HeLa [12].
W poszukiwaniu związków hamujących aktywność
NTPazy/helikazy HCV dr
Borowski ze współpracownikami badali wpływ różnych
klas związków na aktywność
tego enzymu, między innymi
pochodnych tropolonu [13]
oraz różnych antybiotyków
[14]. Na podstawie uzyskanych przez niego wyników
Rycina 2. Struktury estrów 5’-fluorosulfonylobenzoilo-guanozyny (FSBG), -inozyny (FSBI) i rybawiryny (FSBR).
postanowiliśmy modyfikować
pochodne tropolonu oraz epiokazało się, że związki te słabo hamowały lub nie miały
rubicyny. Do syntezy nowych
wpływu na aktywność ATPazową enzymu HCV, natozwiązków adaptowane były metody syntezy stosowane
miast hamowały aktywność ATPazową helikaz wirusa
do innych typów związków chemicznych. Pozwoliło to
Zachodniego Nilu (WNV) i wirusa japońskiego zapalenia
na uzyskanie zadowalających wydajności pożądanych
mózgu (JEV). Aktywność helikazową NTPazy /helikazy
produktów. Struktury oraz czystość zsyntetyzowanych
HCV najsilniej hamowała 5’-fluorosulfonylobenzoilo-inozwiązków potwierdzono przeprowadzając analizę chrozyna [8,9].
matogramów (TLC), widm masowych (MS), magnetyczNastępnie zbadaliśmy wpływ analogów benzotrianego rezonansu jądrowego (NMR) oraz widm absorpcyjzolu i benzimidazolu na aktywność helikazową NTPanych w nadfiolecie (UV). Związki te były następnie badazy/helikazy HCV i stwierdziliśmy, że 4,5,6,7-tetrabrone w różnych współpracujących z nami laboratoriach, w
mo-1H-benzotriazol (TBBT) oraz 5,6-dichloro-1-β-Dcelu określenia ich aktywności biologicznej.
rybofuranozobenzotriazol (DCBTR) (Ryc. 3) hamują rozplatanie podwójnej nici DNA przy stężeniach odpowiednio 20 µM (TBBT) i 1,5 µM (DCBTR), natomiast rozplatanie RNA jest hamowane słabiej [10]. Nie zaobserwowano
wpływu badanych związków na aktywność ATPazową
helikazy HCV.
W celu wyjaśnienia mechanizmu hamowania aktywności helikazy HCV przez TBBT i DCBTR zsyntetyzowano szereg analogów benzotriazolu i benzimidazolu o
różnych właściwościach hydrofobowych, hydrofilowych
i sterycznych. Po zmodyfikowaniu stosowanych do alkilowania metod zsyntetyzowano 22 pochodne benzotriazolu i benzimidazolu. Pochodne alkilowe benzotriazolu
o właściwościach hydrofobowych takie jak N2-propylo-,
N2-etylo- oraz N2-metylo-TBBT okazały się silniejszymi
inhibitorami helikazy HCV niż macierzysty TBBT, ale
nieco słabszymi niż DCBTR, a ich IC50 wynosiło odpowiednio 5,8, 6,5 i 6,6 µM. Natomiast analogi benzimidazolu nie wpływały na aktywność ATPazy i helikazy HCV
[11]. Analogi benzotriazolu wykazują również wpływ na
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
Rycina 3. Struktury 4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazolu (TBBT) i 5,6-dichloro-1β-D-rybofuranozobenzotriazolu (DCBTR).
Wśród zsyntetyzowanych pochodnych tropolonu najlepszymi inhibitorami helikazy okazały się pochodne:
3,5,7-tri[(4’-metylopiperazyno-1’-ylo)metyleno]tropolon
(T05; IC50 3,4 μM) oraz 3,5,7-tri[(4’-pirolidyno-1”-ylopiperydyno-1’-ylo)metyleno]tropolon (T08; IC50 7 μM) (Ryc. 4)
[15].
293
RNA w podobnych jak T05 stężeniach, co prawdopodobnie jest spowodowane ich wysoką lipofilowością
(ClogP ~5) zwiększającą biodostępność. Korzystnie,
niektóre analogi tropolonu charakteryzują się wyższą
selektywnością (SI odpowiednio: >21,3, 17,4 oraz 9,8)
niż stosowana w terapii WZW-C, rybawiryna (SI 1,5).
Rycina 4. Struktury pochodnych tropolonu.
Także pochodne 4’-epidoksorubicyny: 3’-N-(N”,N”-dimetyloformamidyno)-4’-epidoksorubicyna
(E04;
IC50
2,2 μM), 3’-N,N-dimetylo-4’-epidoksorubicyna (E06; IC50
4,3 μM) oraz 3’-N,N-dimetylo-13-hydroksy-4’-epidoksorubicyna (E07; IC50 5,7 μM) [16] hamowały aktywność NTPazy/helikazy HCV (Ryc. 5).
Zespól kierowany przez dr Annę Boguszewską-Chachulską w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN opracował też
nowa fluorescencyjną metodę badania wpływu inhibitorów
na aktywność helikazy [17] oraz wprowadził opracowaną
przez Bartenschlagera [18] metodę badań z wykorzystaniem
subgenomowego replikonu, dzięki czemu w IBB badano też
wpływ zsyntetyzowanych przez nas związków na replikację RNA wirusa HCV. Spośród pochodnych benzotriazolu
oraz tropolonu najsilniejsze inhibitory helikazy NS3 okazały
się o rząd wielkości słabszymi inhibitorami replikacji RNA
Rycina 5. Struktury pochodnych epirubicyny.
wirusa w systemie subgenomowego replikonu w komórkach Huh-7 (DCBTR EC50 22 µM; T05 EC50 46,9 μM) [19].
Bardzo interesującym związkiem jest T05, który nie był cytotoksyczny dla komórek Huh-7 w stężeniu 1000 µM, może
więc służyć jako związek wyjściowy do dalszych modyfikacji, w celu opracowania skuteczniejszych inhibitorów replikacji RNA wirusa HCV. Nieoczekiwanie, słabsze niż T05
inhibitory helikazy NS3 hamowały replikację wirusowego
Spośród pochodnych 4’-epidoksorubicyny, najsilniejszym inhibitorem replikacji RNA wirusa HCV w
systemie subgenomowego replikonu okazał się E07
(EC50 0,06 μM; CC50 1,81 μM; SI ~30). Związek E04,
będący najsilniejszym inhibitorem helikazy HCV,
okazał się słabszym inhibitorem replikacji RNA w
systemie subgenomowego replikonu (EC50 0,65 μM).
Pochodna ta jest jednocześnie jedną z najmniej cytotoksycznych dla komórek Huh-7 (CC50 34,04 μM),
co daje najkorzystniejszy w tym systemie indeks selektywności ~52. 3’-N-Acetylo-4’-epidoksorubicyna
(E01) oraz 3’-N,4’-O,14-O-triacetylo-4’-epidoksorubicyna (E02) silniej wpływały na replikację kompletnego RNA wirusa HCV w komórkach PBMC (EC50 0,36 μM
oraz <0,10 μM) niż na replikację subgenomowego replikonu
(EC50 1,17 μM oraz 3,77 μM). Dla tych związków otrzymano wysokie indeksy selektywności w komórkach PBMC (SI
~92 oraz >490).
INHIBITORY KINAZY KAZEINOWEJ CK2
Kinazy białkowe zostały odkryte w latach pięćdziesiątych XX wieku [20] i do tej pory odkryto ich ponad 500.
Poznano ich ogromną rolę w regulacji procesów życiowych
komórek, a także w powstawaniu wielu chorób. Kinaza kazeinowa CK2 jest jedną z pierwszych poznanych kinaz, a
jej podwyższoną aktywność obserwuje się w wielu rodzajach nowotworów. CK2 jest kinazą serynowo-treoninową,
jednak znane są przypadki, że fosforyluje również reszty
tyrozynowe [21,22]. Kinaza kazeinowa CK2 jest zbudowana
z dwóch podjednostek
katalitycznych α oraz
dwóch podjednostek
regulatorowych β [23].
U człowieka podjednostki katalityczne występują jako trzy izoformy α i α’ oraz opisana
stosunkowo niedawno α’’ [24]. U ssaków
występuje tylko jedna
izoforma podjednostki
regulatorowej CK2β.
Dimer podjednostek β
stanowi rdzeń tetrameru kinazy kazeinowej
II, podjednostki α przyłączają się po przeciwnych stronach tego dimeru, tworząc
kompleks o kształcie „motyla” (Ryc. 6) [21].
Kinaza kazeinowa CK2 fosforyluje ponad 300 substratów
[25] pełniących rozmaite funkcje w metabolizmie organizmu. Są wśród nich białka, które biorą udział w przekazywaniu sygnałów (np. β-katenina, kalmodulina, receptor
NLS, PTEN), czynniki transkrypcji (m.in. c-Myc, p53, MAX,
294www.postepybiochemii.pl
Postępy
Biochemii 61 (2) 2015
294
rozwoju współpracy międzynarodowej.
Próby poprawienia właściwości TBBT
doprowadziły do syntezy wielu analogów TBBT, pochodnych benzotriazolu
i benzimidazolu [32], które hamują w
różnym stopniu aktywność kinazy CK2
przez co indukują apoptozę w komórkach nowotworowych, w tym komórkach glejaka ludzkiego [33].
Badania odnośnie wpływu pochodnych 1H-1,2,3-benzotriazolu (BT) oraz
1H-benzimidazolu (BI) na aktywność
kinazy CK2 wykonane w zespołach
współpracujących z prof. Shugarem
potwierdziły, że cztery atomy bromu
w pierścieniu benzenowym są konieczne do obniżenia aktywności kinazy
Rycina 6. Struktura tetrameru ludzkiej kinazy kazeinowej CK2 w obecności niehydrolizowalnego ATP (AMPCK2. Inne podstawniki (chlor, metyl)
PMP) w centrum aktywnym enzymu (na podstawie PDB: 1JWH).
w pierścieniu benzenowym prowadzą
do znacznego obniżenia efektu inhibiTal-1), białka wpływające na funkcje DNA i RNA oraz syntorowego względem kinazy CK2 z Saccharomyces cerevisiae,
tezę białek (np. DNA topoizomeraza, RNA polimeraza I,
szczura [34] oraz ludzkiej kinazy CK2 [35].
RNA polimeraza III, nukleolina, B23), białka wirusowe
(np. HPV E7, polimeraza PA wirusa grypy, EBV YEBRA,
Dzięki syntezie pochodnych z podstawnikami w pierHIV RT), białka strukturalne i cytoszkieletu (m.in. tubulina,
ścieniu imidazolowym zawierającymi różne grupy funkspektryna, koneksyna), enzymy metaboliczne (m.in. syntacyjne zbadano ich wpływ na aktywność podjednostki kaza glikogenowa, fosfolipaza) oraz inne (np. α-synukleina,
talitycznej ludzkiej kinazy CK2. Najbardziej aktywnymi inimmunofilina Fpr3, CDC34, osteopontyna).
hibitorami okazały się pochodne TBBT i TBBI podstawione
Kinaza kazeinowa CK2 poprzez proces fosforylacji bierze
grupą hydroksypropylową: 3-(4,5,6,7-tetrabromo-1H-benudział w regulacji wielu procesów komórkowych, natomiast
zotriazolo-1-ylo)propan-1-ol (N1-PrOH-TBBT), 3-(4,5,6,7-tenieprawidłowości w fosforylacji są przyczyną różnych chotrabromo-2H-benzotriazolo-2-ylo)propan-1-ol (N2-PrOHrób, m.in. nowotworowych, neurodegeneracyjnych, zapal-TBBT) oraz 3-(4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzimidazolo-1-ylo)
nych, układu krwionośnego, pasożytniczych i wirusowych.
propan-1-ol (N-PrOH-TBBI), dla których stężenia hamujące
Białko Rev, istotne dla namnażania wirusa HIV-1, jest fosaktywność kinazy CK2 są nieco niższe (0,32–0,54 µM), niż
forylowane przez kinazę CK2 [26]. Kinaza ta bierze również
dla związków macierzystych: 4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzoudział w fosforylacji białka Nef wirusa HIV oraz SIV (małtriazolu (TBBT, 0,50µM) oraz 4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzipi wirus niedoboru odporności), które odgrywa kluczową
midazolu (TBBI, 1,30 µM) [36] (Ryc. 7).
rolę w postępie zakażenia. Kinaza CK2 fosforyluje także
inne wirusowe białka na przykład niestrukturalne białko 2
Najsilniejszym, spośród zsyntetyzowanych związków,
wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) [27]. Białko to jest
inhibitorem kinazy CK2 (IC50 0,32 µM) okazał się N1-PrOHzaangażowane w różne funkcje, m.in. hamowanie apoptozy
-TBBT. Dodatkowo na podstawie wyników badań wpływu
komórek gospodarza oraz modulację transkrypcji genów.
nowych pochodnych hydroksypropylowych na aktywność
9 ludzkich kinaz można wnioskować, że związek ten jest
Znalezienie inhibitora kompetycyjnego w stosunku do
również najbardziej selektywnym inhibitorem kinazy CK2,
ATP, będącego jednocześnie całkowicie specyficznym wyspośród badanych. Inhibitor N1-PrOH-TBBT nie wykazydawało się początkowo dużym problemem w związku
wał działania cytotoksycznego (w stężeniach do 50 µM) na
z wysokim stopniem homologii, jaki istnieje zwłaszcza w
komórki prawidłowe (Balb/c 3T3) jednocześnie indukując
centrach katalitycznych, wśród kinaz białkowych. Zainicjoapoptozę komórek nowotworowych (HL-60) w stężeniu 50
wane przez prof. Shugara badania doprowadziły do odkryµM. Alkilowe pochodne TBBT, zakończone atomem halocia jednego z najselektywniejszych inhibitorów kinazy kagenu (bromu: N1-EtyloBr-TBBT, N2-EtyloBr-TBBT lub chlozeinowej 2 jakim jest 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazol (TBBT)
ru: N1-propyloCl-TBBT, N2-propyloCl-TBBT) wykazywały
[28,29]. Pomimo odkrycia wielu innych inhibitorów CK2,
znacznie mniejszy wpływ na aktywność kinazy CK2 niż
między innymi takich jak pochodne antrachinonu, ksanteodpowiednie izomery N-hydroksyporopylowe TBBT.
nonu, flawonu lub pyrazolotriazyny [30] lub CX-4945 [31]
TBBT jest używane bardzo często do badania funkcji kinazy
Innym miejscem modyfikacji może być pierścień benzeCK2 w różnych procesach metabolicznych.
nowy. Zsyntetyzowano pochodne zawierające w pozycji
5 podstawniki różniące się wielkością, elektroujemnością
Prof. Shugar od 1998 roku organizował cykliczne konfejak również hydrofobowością i wykazano, że w oddziałyrencje poświęcone inhibitorom kinaz, „International Conwaniach z centrum aktywnym podjednostki katalitycznej
ference Inhibitors of Protein Kinase”, które gromadziły
ważną rolę odgrywa zarówno wielkość jak i hydrofobowość
wielu światowej sławy naukowców i przyczyniały się do
podstawników w pierścieniu benzenowym [37]. Kolejnym
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
295
7. Locatelli GA, Gosselin G, Spadari S, Maga G (2001) Hepatitis C virus
NS3 NTPase/helicase: different stereoselectivity in nucleoside triphosphate utilisation suggests that NTPase and helicase activities are
coupled by a nucleotide-dependent rate limiting step. J Mol Biol 313:
683-694
8. Bretner M, Schalinski S, Borowski P, Kulikowski T (2003) 5’-O-fluorosulfonylbenzoyl esters of purine nucleosides as potential inhibitors of
NTPase/helicase and polymerase of Flaviviridae viruses. Nucleosides
Nucleotides Nucleic Acids 22: 1531-1533
Rycina 7. Struktury pochodnych benzotriazolu i benzimidazolu.
miejscem modyfikacji była pozycja 7 pierścienia benzotriazolu. Wychodząc z 2-bromo-6-nitrotoluenu, poprzez
nitrowanie, redukcje, następnie zamykanie pierścienia
triazolowego lub imidazolowego i wreszcie bromowanie
udało się zsyntetyzować 4,5,6-tribromo-7-metylo-benzotriazol (Br3MeBT) oraz 4,5,6-tribromo-7-metylo-benzimidazol
(Br3MeBI) z dobrymi wydajnościami. W podobny sposób
wychodząc z etyloaniliny poprzez zabezpieczenie grupy
aminowej, bromowanie, nitrowanie, odblokowanie grupy
aminowej, redukcje, zamykanie pierścienia triazolowego
lub imidazolowego i bromowanie otrzymano 4,5,6-tribromo-7-etylo-benzotriazol (Br3EtBT) i 4,5,6-tribromo-7-etylo-benzimidazol (Br3EtBI). Pochodne te hamują aktywność
CK2 w stężeniach podobnych do TBBT, najlepszym inhibitorem okazał się 4,5,6-tribromo-7-etylo-1H-benzotriazol
(IC50 0,18 µM) [38] (Ryc. 7).
Prace nad syntezą inhibitorów kinazy kazeinowej CK2
nadal są prowadzone zarówno w pracowniach kontynuujących badania rozpoczęte przez prof. Shugara jak i na świecie. Nowe wyniki wykazały, że TBBT oddziałuje również z
innymi białkami obecnymi w komórkach [39,40]. Niektóre
pochodne TBBI wykazują bardzo silne właściwości inhibitorowe i najprawdopodobniej będą szeroko wykorzystywane do dalszych badań biologicznych [41].
PIŚMIENNICTWO
1. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M
(1989) Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A,
non-B viral hepatitis genome. Science 244: 359-362
2. Moradpour D, Penin F, Rice CM (2007) Replication of hepatitis C virus. Nat Rev Microbiol 5: 453-463
3. Lanford RE, Bigger C (2002) Advances in model systems for hepatitis
C virus research. Virology 293: 1-9
4. Llina`s-Brunet M, Bailey M, Fazal G, Goulet S, Halmos T, LaPlante S,
Maurice R, Poirier M, Poupart MA, Thibeault D, Wernic D, Lamarre D
(1998) Peptide-based inhibitors of the hepatitis C virus serine protease.
Bioorg Med Chem Let 8: 1713-1718
5. Chan L, Reddy TJ, Proulx M, Das SK, Pereira O, Wang W, Siddiqui
A, Yannopoulos CG, Poisson C, Turcotte N, Drouin A, Alaoui-Ismaili
MH, Bethell R, Hamel M, L’Heureux L, Bilimoria D, Nguyen-Ba N
(2003) Identification of N,N-disubstituted phenylalanines as a novel
class of inhibitors of hepatitis C NS5B polymerase. J Med Chem 46:
1283-1285
6. Tomei L, Altamura S, Bartholomew L, Biroccio A, Ceccacci A, Pacini L, Narjes F, Gennari N, Bisbocci M, Incitti I, Orsatti L, Harper S,
Stansfield I, Rowley M, De Francesco R, Migliaccio G (2003) Mechanism of action and antiviral activity of benzimidazole-based allosteric
inhibitors of the hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase. J
Virology 77: 13225-13231
9. Bretner M, Schalinski S, Haag A, Lang M, Schmitz H, Baier A, Behrens SE, Kulikowski T, Borowski P (2004) Synthesis and evaluation of
ATP-binding site directed potential inhibitors of nucleoside triphosphatases/helicases and polymerases of hepatitis C and other selected
Flaviviridae viruses. Antivir Chem Chemother 15: 35-42
10.Borowski P, Deinert J, Schalinski S, Bretner M, Ginalski K, Kulikowski
T, Shugar D (2003) Halogenated benzimidazoles and benzotriazoles as
inhibitors of the NTPase/helicase activities of hepatitis C and related
viruses. Eur J Biochem 270: 1645-1653
11.Bretner M, Baier A, Kopańska K, Najda A, Schoof A, Reinholz M, Lipniacki A, Piasek A, Kulikowski T, Borowski P (2005) Synthesis and
biological activity of 1H-benzotriazole and 1H-benzimidazole analogues--inhibitors of the NTpase/helicase of HCV and of some related
Flaviviridae. Antivir Chem Chemother 16: 315-326
12. Bretner M, Najda A, Podwińska R, Baier A, Paruch K, Lipniacki A,
Piasek A, Borowski P, Kulikowski T (2004) Inhibitors of the NTPase/
helicases of hepatitis C and related Flaviviridae viruses. Acta Pol
Pharm 61: Suppl, 26-28
13.Borowski P, Lang M, Haag A, Baier A (2007) Tropolone and its derivatives as inhibitors of the helicase activity of hepatitis C virus nucleotide
triphosphatase/helicase. Antivir Chem Chemother 18: 103-109
14.Borowski P, Schalinski S, Schmitz H (2002) Nucleotide triphosphatase/helicase of hepatitis C virus as a target for antiviral therapy. Antiviral Res 55: 397-412
15.Boguszewska-Chachulska AM, Krawczyk M, Najda A, Kopańska K,
Stankiewicz-Drogoń A, Zagórski-Ostoja W, Bretner M (2006) Searching for a new anti-HCV therapy: synthesis and properties of tropolone
derivatives. Biochem Biophys Res Commun 341: 641-647
16. Kulikowski T, Bretner M, Najda A, Cova L, Trepo Ch, Narayan R,
Piasek A, Lipniacki A, Zagorski-Ostoja W (2012) Nowe pochodne
epirubicyny, ich nowe zastosowanie medyczne oraz farmaceutycznie
akceptowalna postać leku PL212279 (B1)
17.Boguszewska-Chachulska AM, Krawczyk M, Stankiewicz A, Gozdek
A, Haenni AL, Strokovskaya L (2004) Direct fluorometric measurement of hepatitis C virus helicase activity. FEBS Lett 567: 253-258
18.Lohmann V, Körner F, Koch J, Herian U, Theilmann L, Bartenschlager
R (1999) Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science 285: 110-113
19.Najda-Bernatowicz A, Krawczyk M, Stankiewicz-Drogoń A, Bretner
M, Boguszewska-Chachulska AM (2010) Studies on the anti-hepatitis
C virus activity of newly synthesized tropolone derivatives: identification of NS3 helicase inhibitors that specifically inhibit subgenomic
HCV replication. Bioorg Med Chem 18: 5129-5136
20.Burnett G, Kennedy EP (1954) The enzymatic phosphorylation of proteins. J Biol Chem 211: 969-980
21.Wilson LK, Dhillon N, Thorner J, Martin GS (1997) Casein kinase II catalyzes tyrosine phosphorylation of the yeast nucleolar immunophilin
Fpr3. J Biol Chem 272: 12961-12967
22.Donella-Deana A, Cesaro L, Sarno S, Brunati AM, Ruzzene M, Pinna
LA (2001) Autocatalytic tyrosine-phosphorylation of protein kinase
CK2 α and α’ subunits: implication of Tyr182. Biochem J 357: 563-567
23.Niefind K, Guerra B, Ermakowa I, Issinger OG (2001) Crystal structure
of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2
holoenzyme. EMBO J 20: 5320-5331
24.Shi X, Potvin B, Huang T, Hilgard P, Spray DC, Suadicani SO, Wolkoff
AW, Stanley P, Stockert RJ (2001) A novel casein kinase 2 α-subunit
regulates membrane protein traffic in the human hepatoma cell line
HuH-7. J Biol Chem 276: 2075-2082
296www.postepybiochemii.pl
25.Meggio F, Pinna LA (2003) One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. FASEB J 17: 349-368
mechanism of anti-tumor action of new potential CK2 inhibitors toward glioblastoma cells. Int J Oncol 35(5): 1091-100
26.Meggio F, D’Agostino DM, Ciminale V, Chieco-Bianchi L, Pinna LA
(1996) Phosphorylation of HIV-1 Rev protein: implication of protein
kinase CK2 and pro-directed kinases. Biochem Biophys Res Commun
226: 547-554
34.Zień P, Bretner M, Zastapiło K, Szyszka R, Shugar D (2003) Selectivity
of 4,5,6,7-tetrabromobenzimidazole as an ATP-competitive potent inhibitor of protein kinase CK2 from various sources. Biochem Biophys
Res Commun 306: 129-133
27.Franck N, Le Seyec J, Guguen-Guillouzo C, Erdtmann L (2005) Hepatitis C virus NS2 protein is phosphorylated by the protein kinase CK2
and targeted for degradation to the proteasome. J Virol 79: 2700-2708
35.Zień P, Duncan JS, Skierski J, Bretner M, Litchfield DW, Shugar D
(2005) Tetrabromobenzotriazole (TBBt) and tetrabromobenzimidazole
(TBBz) as selective inhibitors of protein kinase CK2: evaluation of their
effects on cells and different molecular forms of human CK2. Biochim
Biophys Acta 1754: 271-280
28.Szyszka R, Grankowski N, Felczak K, Shugar D (1995) Halogenated
benzimidazoles and benzotriazoles as selective inhibitors of protein
kinases CK I and CK II from Saccharomyces cerevisiae and other sources.
Biochem Biophys Res Commun 208: 418-424
29.Sarno S, Reddy H, Meggio F, Ruzzene M, Davies SP, Donella-Deana
A, Shugar D, Pinna LA (2001) Selectivity of 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole, an ATP site-directed inhibitor of protein kinase CK2 (‘casein kinase-2’). FEBS Lett 496: 44-48
30.Battistutta R (2009) Protein kinase CK2 in health and disease: Structural bases of protein kinase CK2 inhibition. Cell Mol Life Sci 66: 18681889
31.Pierre F, Chua PC, O’Brien SE, Siddiqui-Jain A, Bourbon P, Haddach M, Michaux J, Nagasawa J, Schwaebe MK, Stefan E, Vialettes A,
Whitten JP, Chen TK, Darjania L, Stansfield R, Anderes K, Bliesath J,
Drygin D, Ho C, Omori M, Proffitt C, Streiner N, Trent K, Rice WG,
Ryckman DM (2011) Discovery and SAR of 5-(3-chlorophenylamino)
benzo[c][2,6]naphthyridine-8-carboxylic acid (CX-4945), the first clinical stage inhibitor of protein kinase CK2 for the treatment of cancer. J
Med Chem 54: 635-654
32.Najda-Bernatowicz A, Łebska M, Orzeszko A, Kopańska K, Krzywińska E, Muszyńska G, Bretner M (2009) Synthesis of new analogs of
benzotriazole, benzimidazole and phthalimide-potential inhibitors of
human protein kinase CK2. Bioorg Med Chem 17: 1573-1578
33.Kaminska B, Ellert-Miklaszewska A, Oberbek A, Wisniewski P, Kaza
B, Makowska M, Bretner M, Kazimierczuk Z (2009) Efficacy and
36.Bretner M, Najda-Bernatowicz A, Łebska M, Muszyńska G, Kilanowicz A, Sapota A (2008) New inhibitors of protein kinase CK2, analogues of benzimidazole and benzotriazole. Mol Cell Biochem 316:
87-89
37.Wąsik R, Łebska M, Felczak K, Poznański J, Shugar D (2010) Relative
role of halogen bonds and hydrophobic interactions in inhibition of
human protein kinase CK2α by tetrabromobenzotriazole and some
C5-substituted analogues. J Phys Chem B 114: 10601-10611
38.Makowska M, Łukowska-Chojnacka E, Wińska P, Kuś A, Bilińska-Chomik A, Bretner M (2011) Design and synthesis of CK2 inhibitors. Mol Cell Biochem 356: 91-96
39.Gyenis L, Kuś A, Bretner M, Litchfield DW (2013) Functional proteomics strategy for validation of protein kinase inhibitors reveals new targets for a TBB-derived inhibitor of protein kinase CK2. J Proteomics
81: 70-79
40.Leung KK, Shilton BH (2015) Quinone reductase 2 is an adventitious
target of protein kinase CK2 inhibitors TBBz (TBI) and DMAT. Biochemistry 54: 47-59
41.Enkvist E, Viht K, Bischoff N, Vahter J, Saaver S, Raidaru G, Issinger
OG, Niefind K, Uri A (2012) A subnanomolar fluorescent probe for
protein kinase CK2 interaction studies. Org Biomol Chem 10: 86458653
The specific enzyme inhibitors for potential therapeutic use
Maria Bretner*
Faculty of Chemistry, Warsaw University of Technology, 3 Noakowskiego St., 00-664 Warsaw, Poland
*
e-mail: [email protected]
Key words: inhibitors, Hepatitis C virus helicase, casein kinase 2, CK2
ABSTRACT
Therapy for hepatitis C virus (HCV) initially consisted on administering ribavirin — having a broad spectrum of action — and pegylated
interferon, and was only effective in 40–50% of patients. Appropriate was to find effective inhibitors of viral replication e.g. by inhibition of
a viral enzyme, NTPase/helicase required in the process of translation and RNA replication of the HCV. We developed methods of synthesis
of many compounds belonging to different groups — derivatives of nucleosides, benzotriazole, benzimidazole, tropolone and epirubicine.
Some of the derivatives inhibit HCV helicase activity at low concentrations and reduces replication of the viral RNA in subgenomic replicon
system. In the process of HCV replication casein kinase CK2 plays an important role. It regulates the level of phosphorylation of HCV protein
NS5A, which affects the production of infectious virions of HCV. Effective and selective inhibitors of kinase CK2 could be of use in the treatment of HCV in combination with other drugs. CK2 kinase phosphorylates approximately 300 proteins that affect the growth, differentiation,
proliferation or apoptosis. Elevated CK2 kinase activity has been observed in several types of cancer and other diseases, therefore, inhibitors
of this enzyme are potential therapeutic importance, particularly for anti-cancer treatment. Research carried out in collaboration with prof.
Shugar led to the synthesis of one of the most selective inhibitors of this enzyme which is 4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazole, used for the
study of the role of kinase CK2 in a number of metabolic processes in tumor cells.
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
297