Artykuł naukowy

OKREŚLANIE IN VITRO I IN SILICO BIODOSTĘPNOŚCI
ORAZ ABSORPCJI W JELICIE CZCZYM I CACO-2
WYBRANYCH SKŁADNIKÓW EKSTRAKTÓW
ROŚLINNYCH
K. E. STĘPNIKa, I. MALINOWSKAa, E. RÓJb
a
UMCS, Wydział Chemii, Katedra Chemii Fizycznej, Zakład Chromatografii
Planarnej, Pl. Marii Curie – Skłodowskiej 3, 20-031 Lublin
b
INS w Puławach, Al. Tysiąclecia Państwa Polskiego 13a, 24-110 Puławy
Abstrakt
Ocena jakości surowców stosowanych w komercyjnej produkcji dóbr jest ważnym
czynnikiem umożliwiającym wyrób towarów mogących sprostać wymogom rynku
międzynarodowego. Zbadano skład jakościowy bioaktywnych ekstraktów
roślinnych otrzymanych metodą ekstrakcji nadkrytycznej z zastosowaniem CO 2.
Ekstrakty te mogą zostać wykorzystane jako potencjalne surowce w produkcji
komercyjnej różnorodnych dóbr o szerokiej gamie zastosowań. W badanych
ekstraktach zidentyfikowano kwasy tłuszczowe nasycone oraz monoi wielonienasycone, fenolokwasy, a także naturalne
polifenole (kwas
chlorogenowy), których odpowiednia zawartość w produktach może determinować,
prawidłowe bądź nie, funkcjonowanie organizmu człowieka. W niniejszych
badaniach zastosowano metodę micelarnej chromatografii cieczowej (MLC) oraz
chromatografii Biopartitioning (BMC).
W prezentowanych badaniach skupiono się na najważniejszych deskryptorach
aktywności biologicznej, z punktu widzenia wykorzystania badanych ekstraktów
w medycynie, przemyśle farmaceutycznym, spożywczym czy kosmetyce, tj.
biodostępność substancji po jej doustnym podaniu oraz absorpcja jelitowa, zarówno
w jelicie czczym, jak i względem linii komórkowej Caco-2, imitującej ludzki
nabłonek jelitowy. Kluczową barierą absorpcji leku podanego doustnie jest błona
śluzowa jelit, gdzie leki są przyswajane na drodze dyfuzji biernej. Linia komórkowa
nowotworu jelit Caco-2 jest powszechnie stosowanym obecnie systemem
modelowym do badań farmaceutycznych przede wszystkim z uwagi na zdolność
tworzenia monowarstwy komórek wykazującej funkcjonalne podobieństwo do
nabłonka jelita cienkiego naturalnie występującego w warunkach in vivo.
Otrzymane wartości tychże deskryptorów porównano z danymi retencyjnymi
uzyskanymi metodą MLC oraz BMC, stosując model QRAR (Quantitative
Retention – Activity Relationships). Dane retencyjne zestawiono ponadto z różnego
rodzaju innymi parametrami, np. deskryptorem lipofilowości logPo/w (współczynnik
podziału w układzie n-oktanol/woda), a także parametrami ściśle związanymi ze
strukturą oraz właściwościami fizykochemicznymi badanych związków, tj.
polaryzowalność czy rozpuszczalność w wodzie. W tym celu zastosowano
odpowiednie modele QSAR (Quantitative Structure – Activity Relationships).
Wprowadzenie
Micelarna chromatografia cieczowa (MLC), której początek datuje się
umownie na rok 1980 [1], jest jedną z odmian chromatografii cieczowej, w której
podstawowym składnikiem fazy ruchomej są jonowe lub niejonowe surfaktanty
o stężeniu wyższym od krytycznego stężenia micelizacji (cmc). Od narodzin metody
chromatografii micelarnej minęło już ponad trzydzieści lat, ale liczne publikacje
wskazują na niesłabnące i coraz bardziej powszechne nią zainteresowanie. Warto
podkreślić, że metoda ta stanowi jedną z odmian chromatografii cieczowej
w odwróconym układzie faz, jednak specyficzne cechy układów micelarnych czynią
ją unikatową, przesądzając o możliwości zastosowania jej
m.in.
w bezpośredniej analizie składu płynów ustrojowych oraz związków wykazujących
aktywność biologiczną. Amfifilowa budowa głównego składnika fazy ruchomej
(surfaktantu) sprawia, że po przekroczeniu cmc w roztworze tworzą się micele
(normalne bądź odwrócone) o rozmaitej budowie i zróżnicowanych rozmiarach,
które mają zdolność do organizowania się w większe skupiska (agregaty) [2]. Dzięki
amfifilowej budowie surfaktantów w roztworach wodnych zaobserwować można
zjawisko solubilizacji towarzyszące układom micelarnym. Polega ono na
utworzeniu termodynamicznie trwałego izotropowego roztworu substancji
nierozpuszczalnej lub słabo rozpuszczalnej w danym rozpuszczalniku, np. wodzie,
po dodaniu amfifilu o stężeniu powyżej cmc [3]. W wyniku solubilizacji obserwuje
się wzrost rozpuszczalności związków trudno rozpuszczalnych w danym środowisku
[4].
Szczególnym rodzajem chromatografii micelarnej jest chromatografia
Biopartitioning (BMC), w której niejonowy surfaktant Brij35, eter laurylowy
glikolu polioksyetylenowego (23), stanowi podstawowy składnik fazy ruchomej, zaś
najczęściej używaną fazą stacjonarną jest żel krzemionkowy modyfikowany fazą
oktadecylową (RP-18). Metoda BMC może być użyteczna w opisywaniu zachowań
o charakterze biologicznym, biochemicznym czy biopodziałowym różnego rodzaju
związków organicznych w żywym organizmie, tj. penetracja bariery krew-mózg,
absorpcja jelitowa, przenikalność przez skórę i błony biologiczne czy też proces
dystrybucji leków [5 – 11]. Chromatografia BMC pełni zatem rolę pewnego rodzaju
instrumentu predykcji in vitro zjawisk i procesów związanych z szeroko
rozumianym funkcjonowaniem żywego organizmu. Użyteczność BMC w
konstruowaniu dobrych modeli predykcji może wynikać z faktu, że charakterystyki
układów BMC są podobne do barier biologicznych i płynów pozakomórkowych, tj.
osocze krwi i limfy, płyn mózgowo – rdzeniowy czy płyn tkankowy [12].
Szczególną właściwością układów micelarnych jest zdolność do modyfikacji
powierzchni fazy stacjonarnej przez monomeryczne cząsteczki surfaktantu obecne w
fazie ruchomej. Retencja związków w MLC, podobnie jak w BMC, zależy od
rodzaju oddziaływań pomiędzy zmodyfikowaną surfaktantem fazą stacjonarną
a micelami obecnymi w fazie ruchomej. Złożony mechanizm retencji
w chromatografii micelarnej nie jest do końca wyjaśniony przede wszystkim
z uwagi na wspomnianą już możliwość modyfikacji powierzchni fazy stacjonarnej
oraz występowanie w skomplikowanych układach micelarnych wielu oddziaływań
o charakterze hydrofobowym, elektrostatycznym i sterycznym [13-14].
Chromatografia micelarna kładzie główny nacisk na badania leków i innych
związków wykazujących aktywność biologiczną w wielu obszarach. Zanim związek
chemiczny zostanie zarejestrowany jako lek, musi zostać poddany licznym
badaniom laboratoryjnym i klinicznym. W dzisiejszych czasach niezmiernie istotną
płaszczyznę wiedzy stanowią badania z zakresu farmakologii leków sensu largo.
Niemało uwagi poświęca się tu aspektom zarówno etycznym, jak i ekonomicznym
badań farmakokinetycznych nowych leków, które prowadzone są z zastosowaniem
metod in vivo na myszach, szczurach, królikach, a nawet psach. Tak prowadzona
metodologia jest droga i czasochłonna, dlatego też coraz częściej akcentuje się
potrzebę rozwijania metod predykcji wybranych deskryptorów aktywności
biologicznej in vitro i in silico, mających na celu zredukowanie do minimum liczby
eksperymentów prowadzonych na żywych organizmach, a także obniżenie kosztów
badań.
Losy leku w organizmie można zamknąć w akronimie ADME [15], w którym
A oznacza absorpcję (Absorption), D – dystrybucję (Distribution), M – metabolizm
(Metabolism), E – wydalanie (Elimination). W badaniach farmakologicznych to
właśnie procesy mieszczące się w pojęciach ADME są głównym przedmiotem
zainteresowań.
W niniejszej pracy skupiono się na badaniu bioaktywnych składników
ekstraktów
roślinnych
otrzymanych
metodą
ekstrakcji
nadkrytycznej
z zastosowaniem CO2. W wyniku tak prowadzonego procesu ekstrakcji otrzymuje
się cenne gospodarczo produkty zawierające oleje wielonienasycone, flawonoidy,
antocyjany, barwniki, których odpowiednia zawartość w ekstraktach przesądza
o możliwości ich wykorzystania w różnych gałęziach przemysłu, np. w przemyśle
farmaceutycznym, kosmetycznym czy medycynie. Dla testowanych składników
ekstraktów roślinnych, tj. kwasy tłuszczowe mono- i wielonienasycone, nasycone
kwasy tłuszczowe, fenolokwasy oraz polifenole, oszacowano wielkość ich absorpcji
w jelicie czczym oraz absorpcję względem linii komórkowej Caco-2, a także
określono ich biodostępność po podaniu doustnym.
Leki o działaniu ogólnym podaje się doustnie. Głównym mechanizmem
wchłaniania leków podanych drogą doustną jest dyfuzja bierna, zaś miejscem ich
wchłaniania błona śluzowa przewodu pokarmowego, najczęściej jelit i żołądka.
W ostatnich latach do opisu in vitro transportu jelitowego substancji coraz
powszechniej stosuje się linię komórkową Caco-2, która jest najbardziej
rozpowszechnionym systemem komórkowym imitującym ludzki nabłonek jelitowy.
Warto podkreślić, że w przeciwieństwie do wielu innych ustalonych linii
komórkowych, linia Caco-2 wykazuje zdolność do tworzenia monowarstwy
komórek morfologicznie, funkcjonalnie i strukturalnie podobnej do nabłonka jelita
cienkiego naturalnie występującego w warunkach in vivo [16]. Obecnie wiele
koncernów farmaceutycznych traktuje linię komórkową Caco-2 jako narzędzie
przesiewowe w określaniu absorpcji jelitowej różnego rodzaju substancji [10].
Jednakże oprócz badań farmaceutycznych przy opracowywaniu coraz
bezpieczniejszych i aktywnych leków, kultury Caco-2 stanowią model komórkowy
wykorzystywany w wielu innych kierunkach badawczych, tj. badania adhezji
bakterii probiotycznych i chorobotwórczych do komórek nabłonka jelitowego,
badania nad odpowiedzią immunologiczną na obecność alergenów pokarmowych,
metabolizmem toksyn, a także działaniem związków mutagennych
i kancerogennych [16].
Kluczowym czynnikiem decydującym o absorpcji leków jest ich
hydrofobowość, określana najczęściej poprzez logarytm współczynnika podziału
w układzie n-oktanol/woda (logPo/w). Wyznaczono wartości parametru lipofilowości
logPo/w, a także parametrów sterycznych, tj. masa molowa, objętość molowa,
refrakcja molowa i parachora. Korzystając z modeli empirycznych QSAR i QRAR,
oszacowano wielkość absorpcji jelitowej wybranych składników badanych
ekstraktów. Dane retencyjne uzyskane metodą chromatografii Biopartitioning,
porównano z parametrami lipofilowości, sterycznymi i wybranymi deskryptorami
aktywności biologicznej.
Część eksperymentalna
Analizie poddano ekstrakty z nasion czarnej porzeczki, aronii, róży
pomarszczonej, maliny, truskawki oraz z owoców palmy sabałowej, otrzymane
metodą ekstrakcji nadkrytycznej z zastosowaniem CO2. Celem pierwszego etapu
badań była identyfikacja w badanych ekstraktach kwasów tłuszczowych,
fenolokwasów i kwasu chlorogenowego, istotnych z punktu widzenia
funkcjonowania organizmu człowieka. W badanych ekstraktach roślinnych
największy udział w grupie kwasów tłuszczowych przypada kwasom nienasyconym:
oleinowemu, linolowemu (LA) oraz -linolenowemu (ALA) i -linolenowemu
(GLA). Identyfikacja nienasyconych kwasów tłuszczowych w ekstraktach
roślinnych może przesądzać o możliwości ich zastosowania jako surowców
w produkcji rozmaitych dóbr w przemyśle spożywczym, kosmetycznym czy
medycynie. Analizowane wielonienasycone kwasy tłuszczowe (kwas LA, ALA oraz
GLA) należą bowiem do grupy tzw. niezbędnych nienasyconych kwasów
tłuszczowych (NNKT), z grupy kwasów omega 3 i 6, których doniosła rola
w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu człowieka jest powszechnie znana.
Warto też dodać, że rodzina kwasów chlorogenowych obejmuje estry trans
cynamonowych kwasów oraz kwasu chinowego i stanowi dominującą frakcję
polifenoli w kawie, truskawkach, jabłkach, słoneczniku czy jagodach [17].
Najistotniejsze składniki badanych ekstraktów, zgodnie z doniesieniami
literaturowymi, przedstawiono w Tabeli 1.
Tabela 1. Najistotniejsze składniki badanych ekstraktów.
kwasy tłuszczowe nienasycone
kwasy
tłuszczowe
nasycone
jedno-
laurynowy
oleinowy
mirystynowy
erukowy
dwu-
stearynowy
kaprylowy
oleopalmitynowy
cztero-
linolenowy
(GLA)
fenolokwasy
polifenole
2kwas chlorohydroksycynamonowy
genowy
(kumarowy)
linolenowy
(ALA)
linolowy
palmitynowy
trój-
stearydynowy
(SDA)
3hydroksycynamonowy
(ester kwasu
chinowego i
kawowego)
4hydroksycynamonowy
kaprynowy
Optymalizacja układów chromatograficznych dla rozdziału składników
badanych ekstraktów polegała na doborze techniki chromatograficznej oraz doborze
fazy stacjonarnej i ruchomej. Na tym etapie wszystkie pomiary prowadzono
z zastosowaniem techniki chromatografii cienkowarstwowej TLC (Thin Layer
Chromatography) oraz wysokosprawnej techniki cienkowarstwowej HPTLC (High
Performance Thin Layer Chromatography), wykorzystując klasyczne układy
chromatografii cieczowej, tj, układ faz normalny i odwrócony (RP).
Wykonanie analizy TLC obejmowało następujące czynności: przygotowanie
próbek do analizy, zaaplikowanie badanego roztworu na fazę stacjonarną,
rozwinięcie chromatogramu, wizualizacja (detekcja) chromatogramu, analizę
wyników (oznaczenie jakościowe składników próbki)
Przygotowanie próbek do analizy
Sporządzono roztwory wyjściowe badanych ekstraktów, a także standardów
odpowiednich kwasów tłuszczowych, fenolokwasów i kwasu chlorogenowego w
acetonitrylu, uzyskując stężenia próbek ok. 1mg*mL -1. Dozowana objętość
roztworów wyjściowych ekstraktów każdorazowo wynosiła 6μL, a standardów
kwasów 4μL (zawartość substancji w plamce to ok. 4 μg).
Wizualizacja chromatogramów
Do wywoływania chromatogramów w prowadzonej analizie stosowano
alkoholowy roztwór aldehydu anyżowego. Wywołane chromatogramy oglądano w
świetle UV = 254 nm lub 366 nm, a następnie archiwizowano za pomocą
wideokamery Reprostar 3 z oprogramowaniem WinCats. Podstawowy parametr
chromatograficzny uzyskany metodą TLC, tj. współczynnik opóźnienia RF
(retardation factor) wyznaczono stosując oprogramowanie Video Scan.
Opracowanie wyników
Identyfikacja podstawowych składników badanych ekstraktów
Najbardziej optymalne układy do separacji składników badanych ekstraktów
zebrano w Tabeli 2.
Tabela 2. Układy chromatografii HPTLC i TLC do rozdziału składników badanych ekstraktów.
Technika
Faza
Faza ruchoma
Detekcja
chromatograficzna
stacjonarna
HPTLC
TLC
SiO2 HPTLC
heptan – izopropanol –kwas
mrówkowy(100:10;0.5 v/v/v)
RP-18 HPTLC
acetonitryl – izopropanol
(20:10 v/v)
RP-18 HPTLC
acetonitryl – metanol (10:10 v/v)
SiO2
heksan – aceton (25:4 v/v)
SiO2
heksan – eter dietylowy – kwas octowy
(70:30:1 v/v/v)
SiO2
heksan – aceton – kwas mrówkowy (25:4:0.5
v/v/v)
SiO2
toluen – aceton (95:5 v/v)
SiO2
heptan – izopropanol – kwas mrówkowy
(100:10;0.5 v/v/v)
SiO2
toluen – octan etylu (95:5 v/v)
aldehyd
anyżowy
SiO2
I. heksan – aceton – kwas mrówkowy
(25:4:0.5 v/v/v)
II. heksan
SiO2
I. chloroform – metanol – kwas octowy
(90:10:1 v/v/v)
II. heksan – eter dietylowy – aceton (60:40:5
v/v/v)
III. heksan eter dietylowy (17:3 v/v)
Po przeprowadzeniu rozdziału składników badanych ekstraktów dokonano
identyfikacji kwasów tłuszczowych, fenolokwasów i kwasu chlorogenowego
stosując metodę porównawczą danych retencyjnych, w której obok ekstraktów
roślinnych przedmiotem badań były wzorce wybranych związków. Zidentyfikowano
nienasycone kwasy tłuszczowe we wszystkich badanych ekstraktach, a szczególnie
kwas oleinowy w ekstraktach z nasion maliny i truskawki i kwas linolowy oraz
ALA i GLA w ekstraktach z nasion maliny, truskawki i czarnej porzeczki. Spośród
kwasów nasyconych stwierdzono największą ilość w badanych ekstraktach kwasu
palmitynowego oraz stearynowego w nasionach czarnej porzeczki, maliny
i truskawki. Fenolokwasy, a wśród nich kwasy hydroksycynamonowe znajdują się
w największej ilości w ekstraktach z nasion aronii, maliny, truskawki i czarnej
porzeczki. Kwas chlorogenowy, naturalny polifenol i antyoksydant o szerokim
spektrum działania obecny był przede wszystkim w ekstraktach z nasion aronii
i truskawki.
Chromatografia micelarna oznaczonych składników badanych ekstraktów
W celu zbadania aktywności biologicznej oznaczonych składników
ekstraktów przetestowano wiele układów chromatografii micelarnej. Optymalizacja
układów MLC jest czasochłonnym i żmudnym procesem, bowiem wymaga
jednoczesnego doboru wielu parametrów, tj. faza stacjonarna, rodzaj i stężenie
surfaktantu w fazie ruchomej, rodzaj i stężenie modyfikatora organicznego oraz pH
fazy ruchomej. Układy wykorzystane w badaniach zaprezentowano w Tabeli 3:
Tabela 3. Zoptymalizowane układy MLC i BMC.
Faza ruchoma
Faza
modyfikator
stacjonarna
surfaktant
organiczny
CN F254
10x10
SDS (dodecylosiarczan
sodu)
CN F254
10x10
CTAB (bromek
cetylotrimetyloamoniowy)
CN F254
10x10
Brij35 eter laurylowy
glikolu
polioksyetylenowego (23)
Stężenie w fazie ruchomej
surfaktantu
Charakter
modyfikatora surfaktantu
organicznego
0,04M,
tetrahydrofuran
0,06M,
aceton
0,08M, 0,1M,
dioksan
012M
20% v/v
anionowy
acetonitryl
0,04M,
0,06M,
0,08M, 0,1M,
012M
20% v/v
kationowy
acetonitryl
0,04M,
0,06M,
0%, 5%, 10%,
0,08M, 0,1M, 15%, 20% v/v
012M
obojętny
Stosowaną techniką badawczą była tu chromatografia TLC. Wszystkie
analizowane roztwory faz ruchomych były buforowane. Stosowano bufor cytrynowo
– fosforanowy o pH 7.4. Tak dobrane pH pozwala na lepszą i pełniejszą imitację
układów biologicznych żywego organizmu, bowiem jest to pH ludzkiej krwi.
W przypadku układów zawierających jonowe surfaktanty: SDS i CTAB,
zbadano wpływ stężenia surfaktantu na retencję badanych związków, a w przypadku
układów z SDS oceniono także wpływ rodzaju modyfikatora organicznego na
retencję. Układy chromatografii BMC przetestowano pod kątem stężenia zarówno
surfaktantu, jak i modyfikatora organicznego w fazie ruchomej. Detekcji
chromatogramów dokonano po uprzednim rozwinięciu i wysuszeniu płytek
chromatograficznych w parach jodu.
Dla wszystkich przebadanych układów micelarnych wykreślono zależności
1/k vs. CM (zależności odwrotności współczynnika retencji od stężenia surfaktantu
w micelach, CM = C – cmc, gdzie C – całkowite stężenie surfaktantu). Krytyczne
stężenie micelizacji (cmc) wyznaczono eksperymentalnie dla testowanych faz
ruchomych metodą pomiaru napięcia powierzchniowego. Wybrane zależności 1/k
vs. CM dla badanych układów BMC przedstawiono na Rys. 1.
1/k
kwas linolowy
0,6
kwas 4hydroksycynamo
nowy
kwas alfa
linolenowy
0,3
kwas gamma
linolenowy
0
0
0,05
0,1
CM [mol/dm3]
0,15
Rys. 1. 1/k vs. CM w testowanych układach BMC dla wybranych składników badanych ekstraktów.
Zgodnie z klasyfikacją Armstronga i Stine’a wszystkie badane (z wyjątkiem
jednego) w niniejszej pracy związki należą do grupy analitów wiążących, bowiem
następuje spadek ich retencji (wzrost 1/k) wraz ze wzrostem stężenia surfaktantu w
micelach. Jedynie kwas 4-hydroksycynamonowy zachowuje się w odmienny
sposób. Retencja jego rośnie wraz ze wzrostem stężenia CM i zgodnie z wyżej
wspomnianą klasyfikacją należy on do grupy analitów antywiążących. Determinantą
tych różnic jest typ oddziaływań analitu z micelą. Warto nadmienić, że kwas
4-hydroksycynamonowy jest analitem antywiążącym względem surfaktantów
jonowych (SDS i CTAB). Jednak względem niejonowego Brij35 zachowuje się on
jak analit wiążący. Kluczową rolę odgrywają tu zatem oddziaływania o charakterze
elektrostatycznym.
Chromatografia Biopartitioning w przewidywaniu biodostępności badanych
związków po ich doustnym podaniu
Leki o działaniu ogólnym podaje się doustnie (per os). Szybkość absorpcji
leku z miejsca podania zależy od dawki, właściwości fizykochemicznych leku oraz
od wielkości i stopnia unaczynienia powierzchni absorpcyjnej [18]. W celu
oszacowania wielkości wchłaniania leków podanych drogą doustną skorzystano
z modelu QRAR, łączącego wielkość absorpcji wybranych substancji z danymi
retencyjnymi uzyskanymi metodą BMC dla fazy ruchomej zawierającej 0.1M Brij35
bez dodatku modyfikatora organicznego (pH 7.4). Z uwagi na utrudnioną detekcję
nasyconych kwasów tłuszczowych, nie określono dla nich wielkości biodostępności.
Dla pozostałych związków oszacowano ich biodostępność po podaniu
doustnym wyrażoną jako ułamek dawki leku, jaki przechodzi do krążenia ogólnego.
Biodostępność po podaniu doustnym (%) =
[10]
n = 74, SE = 9.8, R2 = 0.72, F = 3174, kBMC - współczynnik retencji wybranych
związków w układzie CN/0.1M Brij35 (bez dodatku modyfikatora organicznego).
100
biodostępność
po podaniu doustnym (%)
R² = 0.98
80
60
0
10
kBMC (0.1M Brij35)
20
Rys. 2. Biodostępność związku podanego drogą doustną (%) obliczony na podstawie danych
retencyjnych
dla
kwasów:
linolowego
(LA),
-linolenowego
(ALA),
-linolenowego (GLA), 3-hydroksycynamonowego oraz 4-hydroksycynamonowego.
Wyznaczono także wielkość biodostępności wybranych związków stosując
dane retencyjne dla faz ruchomych BMC różniących się zawartością modyfikatora
organicznego (Tabela 4).
Tabela 4. Biodostępność związku podanego drogą doustną (%) obliczona dla faz ruchomych BMC.
Zawartość acetonitrylu w fazie ruchomej
Kwas
0% v/v
5% v/v
10% v/v
15% v/v
20% v/v
LA
94,1
89,7
85,3
81,3
78,7
ALA
91,2
89,5
87,7
86,1
84,5
GLA
87,1
85,3
84,3
83,2
82,5
3-hydroksycynamonowy
73,9
71,6
66,9
65,0
62,4
4-hydroksycynamonowy
79,9
77,1
70,4
67,5
63,5
Substancje o współczynniku retencji logk > 1 są szybko i całkowicie
wchłaniane z biodostępnością ponad 90 %. Z Tabeli 4 wynika również, że wyżej
wskazany model QRAR najlepiej opisuje biodostępność badanych związków na
podstawie danych retencyjnych BMC uzyskanych z faz ruchomych nie
zawierających w ogóle (lub zawierających w niewielkim stopniu) dodatku
modyfikatora organicznego. Fazy ruchome zawierające wyłącznie buforowany
roztwór (pH 7.4) surfaktantu Brij35 najlepiej i najwłaściwiej imitują układy
biologiczne żywego organizmu.
Modele predykcji QRAR biodostępności związków po ich podaniu doustnym
mogą okazać się bardzo użyteczne w początkowym stadium badań nad nowymi
lekami. Dzieje się tak dlatego, ponieważ retencja w BMC może świadczyć
o właściwościach transportowych danego związku, jeżeli za jego absorpcję
odpowiedzialny jest mechanizm dyfuzji biernej.
QSAR a wchłanianie badanych kwasów w jelicie czczym. Model Caco-2.
Wchłanianie leków podanych drogą doustną ma najczęściej miejsce w jelicie
cienkim w zakresie pH od 4.5 do 8. Jednakże przyjmuje się, że leki o charakterze
słabych kwasów powinny absorbować się lepiej w jelicie czczym, zaś związki
o charakterze słabych zasad, w jelicie krętym.
Wyznaczono in silico wielkości pasywnej absorpcji jelitowej badanych
kwasów, składników ekstraktów roślinnych, w jelicie czczym człowieka.
Tabela 5. Absorpcja pasywna wybranych składników badanych ekstraktów w ludzkim jelicie czczym (pH
6.5) oraz absorpcja względem linii komórkowej Caco-2.
Absorpcja
Absorpcja
pasywna w
Kwas
względem Caco-2
jelicie czczym
[*10-6cm/s]
[*10-4cm/s]
laurynowy
8.49
38
mirystynowy
8.22
36
palmitynowy
7.89
0.3
stearynowy
7.61
0
linolowy
7.69
0.5
oleinowy
7.65
0.1
kumarowy
1.24
6
3-hydroksycynamonowy
0.87
5
4-hydroksycynamonowy
1.27
5
alfa linolenowy
7.73
2
gamma linolenowy
7.46
0.4
chlorogenowy
7.58
0
Jak wspomniano wcześniej, linia komórkowa Caco-2 jest powszechnie
stosowanym obecnie systemem modelowym przede wszystkim do badań
farmaceutycznych, lecz także do badań nad transportem produktów trawienia ze
światła przewodu pokarmowego do krwi lub limfy. Model Caco-2 został tu
wykorzystany do badania wchłaniania wybranych kwasów, składników ekstraktów
roślinnych.
Z Tabeli 5 wynika, że najmniejszą wielkością absorpcji w jelicie czczym
charakteryzują się fenolokwasy (kwasy hydroksycynamonowe), zaś brak
wchłaniania względem Caco-2 wykazuje kwas stearynowy i chlorogenowy. Należy
jednak podkreślić, że wielkość absorpcji może być zdeterminowana przez fizyczne
właściwości substancji, a przede wszystkim przez lipofilowość związków. W Tabeli
6 zebrano najistotniejsze parametry steryczne, elektronowe i fizykochemiczne
z punktu widzenia oznaczanych deskryptorów aktywności biologicznej.
Tabela 6. Parametry fizykochemiczne badanych związków.
Parametry steryczne
Kwas
laurynowy
mirystynowy
palmitynowy
stearynowy
linolowy
oleinowy
kumarowy
3hydroksycynamon
owy
4hydroksycynamon
owy
alfa linolenowy
gamma
linolenowy
chlorogenowy
Parametry
elektronowe
Właściwości
fizyczne
Właściwo
ści
lipofilowe
Polaryzowaln
ość [*10-24
cm3]
Rozpuszczaln
ość w wodzie
logSw [mol/l]
logPo/w
23.34
27.03
30.71
34.40
34.54
34.51
16.81
-4.463
-5.569
-6.662
-7.762
-7.298
-7.525
-1.620
4.68
6.19
7.02
8.06
6.74
7.37
1.81
Masa
molowa[g/m
ol]
Paracho
ra [cm3]
200.32
228.37
256.42
284.48
280.45
282.46
164.16
531.36
610.93
690.50
770.07
744.49
757.28
347.04
Objęto
ść
molow
a [Å3]
225.77
259.82
293.52
327.76
312.20
320.05
144.63
164.16
347.04
144.56
18.07
-1.620
1.68
164.16
347.04
144.61
18.07
-1.620
1.69
278.43
731.70
304.67
34.56
-7.037
6.02
306.48
838.27
338.54
40.09
-8.153
6.83
354.31
681.77
298.23
32.52
-10.628
-0.33
absorpcja względem Caco-2
[*10-6 cm/s]
Wszystkie badane związki są słabo rozpuszczalne w wodzie i także
wszystkie, z wyjątkiem jedynie kwasu chlorogenowego, posiadają własności
lipofilowe. Należy też podkreślić, że większość badanych kwasów tłuszczowych,
zarówno nasyconych, jak i nienasyconych należą do grupy związków silnie
lipofilowych (logPo/w >6).
Aby prześledzić wpływ parametrów związanych ze strukturą badanych
związków na ich absorpcję względem linii komórkowej Caco-2, dokonano
odpowiednich korelacji. Skorelowano wielkość absorpcji wyznaczonej in silico
z parametrem lipofilowości logPo/w (Rys. 3).
6,5
R² = 0,98
4
1,5
-1
0
5
10
logPo/w
Rys. 3. Wielkość absorpcji względem Caco-2 vs. logPo/w.
Otrzymany wysoki współczynnik dopasowania potwierdza duży wpływ
własności lipofilowych badanych związków na wielkość ich absorpcji względem
Caco-2 w organizmie człowieka.
Podobne porównanie przeprowadzono dla wielkości absorpcji w jelicie
czczym. Otrzymany współczynnik korelacji R2 > 0.60 może świadczyć o tym, że
lipofilowość związku nie jest tu kluczowym czynnikiem determinującym
wchłanianie substancji. Znacznie większy wpływ na absorpcję w jelicie czczym
wywiera polaryzowalność związku (R2 ~ 0.9).
Wnioski
W niniejszej pracy oznaczono najistotniejsze składniki ekstraktów
roślinnych, a następnie poddano je analizie pod kątem ich właściwości
biologicznych i biopodziałowych, dając tym samym informacje o możliwości ich
wykorzystania jako surowców w produkcji dóbr o szerokiej gamie zastosowań.
Oszacowano in vitro i in silico wielkość absorpcji wybranych składników
ekstraktów roślinnych w ludzkim jelicie czczym oraz względem linii komórkowej
Caco-2, a także oznaczono ułamek biodostępności związków po ich doustnym
podaniu. Badane deskryptory aktywności biologicznej porównano z parametrami
lipofilowości, sterycznymi, elektronowymi oraz parametrami fizykochemicznymi.
Chromatografia micelarna, a zwłaszcza chromatografia Biopartitioning,
stanowi dobrą alternatywę dla odmiennego od metod klasycznych rodzaju badań
oznaczania aktywności biologicznej związków. Ten rodzaj chromatografii jest
niewątpliwie cennym narzędziem predykcji kierunku i rozmiaru różnego rodzaju
procesów zachodzących w żywym organizmie, przede wszystkim z uwagi na
możliwość imitacji środowiska komórkowego. W dobie powszechnej dyskusji nad
względami etycznymi i ekonomicznymi badań in vivo, to właśnie metoda BMC
wydaje się być obiecująca, szczególnie z uwagi na możliwość całkowitej redukcji
lub przynajmniej znacznego ograniczenia liczby eksperymentów wykonywanych na
żywych organizmach, a także z uwagi na relatywnie niskie koszty badań.
Literatura
1. D.W. Armstrong, S.J. Henry, J. Liq. Chromatogr., 3 (1980) 657.
2. A. Berthod, M.C. García – Alvarez – Coque, Micellar Liquid Chromatography,
Marcel Dekker, New York, 2000, s. 29.
3. A. Szymański, Badania retencyjne i oznaczanie wybranych sulfonamidów
w środkach spożywczych metodą micelarnej chromatografii cieczowej,
Wydawnictwo Naukowe UAM w Poznaniu, Poznań 2006.
4. R. Nagarajan, Curr. Opin. Colloid In., 1 (1996) 391.
5. M. Molero – Monfort, Y. Martín – Biosca, S. Sagrado, R.M. Villanueva –
Camañas, M.J. Medina – Hernández, J. Chromatogr. A, 870 (2000) 1.
6. J.J. Martínez – Pla, Y. Martín – Biosca, S. Sagrado, R.M. Villanueva – Camañas,
M.J. Medina – Hernández, Biomed. Chromatogr., 17 (2003) 530.
7. L. Escuder – Gilabert, M. Molero – Monfort, R.M. Villanueva – Camañas,
S. Sagrado, M.J. Medina – Hernández, J. Chromatogr. B, 807 (2004) 193.
8. L. Escuder – Gilabert, J.J. Martínez – Pla, S. Sagrado, R.M. Villanueva –
Camañas, M.J. Medina – Hernández, J. Chromatogr. B, 797 (2003) 21.
9. J.J. Martínez – Pla, Y. Martín – Biosca, S. Sagrado, R.M. Villanueva – Camañas,
M.J. Medina – Hernández, J. Chromatogr. A, 1047 (2004) 255.
10. M. Molero – Monfort, L. Escuder – Gilabert, R.M. Villanueva – Camañas,
S. Sagrado, M.J. Medina – Hernández, J. Chromatogr. B, 753 (2001) 225.
11. M. Cuenca – Benito, S. Sagrado, R.M. Villanueva – Camañas, M.J. Medina –
Hernández, J. Chromatogr. A, 814 (1998) 121.
12. C. Quiñones – Torrelo, S. Sagrado, R.M. Villanueva – Camañas, M.J. Medina –
Hernández, J. Med. Chem., 42 (1999) 3154.
13. D.W. Armstrong, F. None, Anal Chem., 53 (1981) 1662.
14. M.J. Medina – Hernández, M.C. García – Alvarez – Coque, Analyst, 117 (1992)
831.
15. D. Butina, M.D. Segall, K. Frankcombe, Drug Discov. Today, 7 (2002) S83.
16. A. Olejnik, M. Schmidt, K. Wojnarowska, W. Grajek, Żywność. Nauka.
Technologia. Jakość, 46 (2006) 46.
17. U. Gawlik – Dziki, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 41 (2004) 29.
18. R. Gryglewski, E. Kostka – Trąbka, J. Spławiński, J. Robak, Farmakologia,
Wydawnictwo Akademii Medycznej im. Mikołaja Kopernika w Krakowie, Kraków
1990.