pobierz

Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 3, str. 443–459
PRACA POGLĄDOWA – Review Article
ALEKSANDRA PALACZ, ANNA KORYCKA
Diagnostyczne i rokownicze znaczenie badań cytogenetycznych w przewlekłej białaczce limfocytowej
The diagnostic and prognostic implication of cytogenetic studies in
chronic lymphocytic leukemia
Z Kliniki Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. n. med. Tadeusz Robak
STRESZCZENIE
Rozwój cytogenetyki i biologii molekularnej przyczynił się w ostatnich kilkunastu latach do
istotnego postępu w poznaniu aberracji chromosomowych występujących w przewlekłej białaczce limfocytowej B-komórkowej (B-PBL) i pozwolił ustalić szereg nowych czynników prognostycznych. Wśród aberracji chromosomowych wykrywanych techniką fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) największe znaczenie rokownicze przypisuje się delecji długiego ramienia
chromosomu 13 [del(13)(q14)], wykrywanej u ponad 50% chorych i związanej z najkorzystniejszym rokowaniem co do czasu przeŜycia, delecji długiego ramienia chromosomu 11
[del(11)(q22-23], trisomii chromosomu 12 (+12), delecji krótkiego ramienia chromosomu 17
[del(17)(p13)], obarczonej najgorszym rokowaniem i pozwalającej na zakwalifikowanie chorych do grupy wysokiego ryzyka oraz delecji długiego ramienia chromosomu 6 [del(6q)]. Nadal
poszukuje się jednak dodatkowych, nieznanych dotąd aberracji chromosomowych, których znaczenie moŜe okazać się istotne zarówno diagnostycznie, jak i rokowniczo, a których wykrycie
moŜe umoŜliwić cytogenetyka klasyczna z zastosowaniem nowych mitogenów, takich jak ligand
CD40 (CD40L) oraz oligonukleotydy CpG (CpG-ODN).
SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka limfocytowa – Cytogenetyka klasyczna – Oligonukleotydy CpG – Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) – Aberracje chromosomowe
SUMMARY
The development of cytogenetic and molecular biology in the last few years has led to important
progress in the field of chronic lymphocytic leukemia (CLL) studies and allowed to establish
chromosomal abnormalities as new prognostic markers. Among chromosomal abnormalities detected by fluorescence hybridization in situ (FISH) the most important prognostic role is attributed to deletion in the long arm of chromosome 13 [del(13)(q14)], found in up to 50% of cases,
and connected with a good prognosis, to deletion in the long arm of chromosome 11
[del(11)(q22-23)], to trisomy 12 (+12), to deletion in the short arm of chromosome 17
[del(17)(p13)], associated with rapid disease progression and classification of patients to the high
risk group and to deletion of the long arm of chromosome 6 [del(6q)]. However, further studies
are being conducted to find additional, as yet unknown chromosomal aberrations which may
prove significant for diagnostic and prognostic purposes, and which may be detected by conven-
444 A. PALACZ, A. KORYCKA
tional cytogenetic methods with the application of new mitogens, such as CD40L or CpGoligionucleotides (CpG-ODN).
KEY WORDS: Chronic lymphocytic leukemia – Classical cytogenetic studies – CpG- Oligonucleotides – Fluorescent in Situ Hybridization (FISH) – Chromosomal abnormalities
WSTĘP
Przewlekła białaczka limfocytowa (PBL) stanowi grupę chorób nowotworowych
układu krwiotwórczego, cechującą się niekontrolowaną, klonalną proliferacją limfocytów, prowadzącą do ich akumulacji we krwi obwodowej, szpiku kostnym, węzłach
chłonnych, śledzionie, wątrobie, a w zaawansowanych stadiach takŜe w innych narządach wewnętrznych. Najczęściej rozpoznawaną PBL jest postać B-komórkowa (BPBL), w której na limfocytach stwierdza się ekspresję antygenów typowych dla linii
B, takich jak: CD19, CD20, CD21, CD23 z koekspresją antygenu CD5, obecnego na
prawidłowych limfocytach T (1,2). Postać T-komórkowa PBL, jak równieŜ postać
wywodząca się z komórek NK jest znacznie rzadsza (1).
B-PBL charakteryzuje się znaczną róŜnorodnością przebiegu klinicznego. Klasyfikacje PBL opracowane ponad 30 lat temu przez Rai i wsp. (3) oraz Bineta i wsp. (4),
jak równieŜ schemat postępowania diagnostycznego i leczniczego oparty na standardach zaproponowanych w 1996 r. przez National Cancer Institute- Sponsored Working
Group (5) nadal stanowią podstawę rozpoznania i określają wskazania do rozpoczęcia
leczenia. Podkreśla się takŜe wartość prognostyczną markerów surowiczych takich jak:
aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH), stęŜenie β2-mikroglobuliny oraz surowicze stęŜenie rozpuszczalnego antygenu CD23 (sCD23) i aktywność kinazy tymidynowej (6, 7).
Do istotnego postępu w zrozumieniu biologii B-PBL przyczynił się w ostatnich
kilkunastu latach rozwój cytogenetyki i biologii molekularnej. Pozwolił on ustalić
szereg nowych niezaleŜnych czynników prognostycznych, takich jak: stan zmutowania
genów dla części zmiennej łańcucha cięŜkiego immunoglobulin (IgVH), ekspresja kinazy ZAP-70 oraz antygenu błonowego CD38. DuŜe znaczenie przypisuje się takŜe
aberracjom chromosomowym, których wykrycie ma obecnie znaczenie rokownicze co
do przebiegu choroby oraz ułatwia wybór właściwej strategii leczniczej (2, 6, 7).
Stosowana od wielu lat cytogenetyka klasyczna ze względu na niewielką ilość uzyskiwanych podziałów komórek białaczkowych, pomimo uŜywania klasycznych stymulatorów, nie pozwala na dokonanie pełnej oceny anomalii chromosomowych. Dlatego
teŜ jej zastosowanie do celów diagnostycznych jest znacznie ograniczone. Metafazy
przydatne do oceny uzyskuje się bowiem zaledwie w 2–3% badanych komórek, a aberracje chromosomowe są wykrywane jedynie u ok. 40–50% badanych chorych (8, 9).
Istotnym przełomem stało się wprowadzenie techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in
situ (FISH), dzięki której odpowiednio skonstruowane sondy molekularne pozwalają
na wykrycie aberracji chromosomowych u ponad 80% chorych na B-PBL (10,11).
Metoda ta umoŜliwia ocenę anomalii cytogenetycznych nie tylko w płytkach metafazalnych, ale takŜe w jądrach interfazowych, a tym samym pozwala na wykrycie aber-
Diagnostyczne i rokownicze znaczenie badań cytogenetycznych w PBL
445
racji w nie dzielących się komórkach. FISH umoŜliwia jednak wykrywanie aberracji
jedynie w regionach, przeciwko którym skierowane są zastosowane sondy.
W ostatnich latach pojawiły się prace, opisujące metodę cytogenetyki klasycznej,
wykorzystującą ligand CD40 (CD40L) oraz oligonukleotydy CpG (CpG-ODN), w celu
stymulowania limfocytów chorych na PBL w warunkach hodowli in vitro, dzięki czemu moŜliwe jest uzyskiwanie znacznie większej liczby mitoz, niŜ przy uŜyciu klasycznych mitogenów (12–14). Stwarza to szansę na wykrycie w tej chorobie nieznanych
dotąd aberracji chromosomowych, których istnienia nie moŜna stwierdzić metodą
FISH z zastosowaniem standardowo uŜywanych sond.
Do najczęstszych aberracji chromosomowych wykrywanych w B-PBL naleŜą delecja długiego ramienia chromosomu 13 [del(13)(q14)], wykrywana u ponad połowy
chorych, trisomia chromosomu 12 (+12), delecja długiego ramienia chromosomu 11
[del(11)(q22-23)] oraz delecja krótkiego ramienia chromosomu 17 [del(17)(p13)] (2, 6,
15, 17). Do rzadszych naleŜą trisomia chromosomów 19 lub 18 (+19, +18) oraz mutacje w obrębie kilku loci obu ramion chromosomu 6 (6,18). Opisano takŜe występowanie aberracji dotyczących chromosomu 1p34, 4p16, 4q35, 9q11-32, translokację
t(14;18)(q32;q21), t(14;19)(q32;q13) oraz trisomię chromosomu 7 (+7) (9, 19, 20).
Praca nasza stanowi przegląd metod cytogenetycznych stosowanych w B-PBL,
dzięki którym moŜliwa jest zarówno pełniejsza diagnostyka tej choroby, jak równieŜ
zwiększenie skuteczności jej leczenia. Omówiliśmy takŜe aberracje chromosomowe
najczęściej występujące w PBL oraz ich znaczenie rokownicze.
METODY BADAŃ CYTOGENETYCZNYCH
Cytogenetyka klasyczna
Aberracje chromosomowe u chorych na B-PBL są bardzo trudne do wykrycia. Ich
występowanie stwierdzono na początku lat 80-tych ubiegłego wieku, stosując wykorzystywaną do dziś metodę klasycznej prąŜkowej analizy chromosomów (9). Technika
ta polega na wykonaniu hodowli limfocytów krwi obwodowej, stymulowanych do
wejścia do cyklu mitotycznego, a następnie blokowanych w stadium metafazy. Po
zakończeniu 24–48 godzinnej inkubacji komórki poddaje się tzw. szokowi hipotonicznemu, a utrwalony materiał barwi się jedną z technik prąŜkowych, wśród których najpopularniejsza jest technika GTG (G-band by Trypsin using Giemsa). Wynik analizy
cytogenetycznej zaleŜny jest od jakości rozproszenia chromosomów w płytkach metafazalnych oraz liczby rozproszonych metafaz. Większość limfocytów białaczkowych
znajduje się w fazie spoczynku (G0) lub jest zatrzymana we wczesnej fazie G1. Ich
akumulacja in vivo jest wynikiem zwiększonego przeŜycia na skutek zahamowania
procesu apoptozy (2, 21). Tylko niewielka liczba komórek B-PBL ulega spontanicznym podziałom, stąd teŜ dla uzyskania odpowiedniej liczby metafaz nadających się do
analizy konieczna jest ich stymulacja do wejścia do cyklu mitotycznego. Limfocyty
białaczkowe są jednak w warunkach hodowli in vitro oporne na stymulację znanymi
mitogenami, dlatego teŜ analiza nieprawidłowości chromosomowych w PBL wykonywana klasycznymi metodami cytogenetycznymi jest znacznie utrudniona.
446 A. PALACZ, A. KORYCKA
Przez dłuŜszy czas podstawowym mitogenem stosowanym w celu uzyskania większej liczby metafaz był wyciąg z fasoli (fitohemaglutynina; PHA) (9). Okazało się
jednak, Ŝe związek ten oddziaływuje głównie na komórki T, co powodowało uzyskiwanie wyników fałszywie ujemnych. W późniejszym czasie zaczęto stosować aktywatory specyficzne dla komórek B takie jak: mitogen szkarłatki (pokeweed mitogen,
PWM), estry forbolu (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA), poliklonalne aktywatory limfocytów B takie jak: wirus Epsteina-Barra (EBV), lipopolisacharydy uzyskiwane z E.coli (LPS), siarczan dekstranu, stymulujące komórki B zarówno do syntezy DNA, jak i do wydzielania immunoglobulin oraz gronkowcowe białko A, IL-4 i
przeciwciała anty-CD40 (8, 9, 22). Większość wyŜej wymienionych substancji znacznie łatwiej stymuluje jednak podziały prawidłowych komórek B niŜ komórek białaczkowych, natomiast estry forbolu pobudzają prawidłowe komórki zarówno T jak i B.
Dlatego teŜ metafazy nadające się do oceny uzyskuje się tylko w około 3% badanych
komórek, a nieprawidłowości chromosomowe wykrywa się zaledwie u 40–50% przypadków zdatnych do analizy (8, 22). Jedną z kolejnych przyczyn niepowodzeń w wykrywaniu zmian cytogenetycznych w B-PBL jest utrata materiału genetycznego, która
często dotyczy zbyt małego regionu chromosomu, aby mogła zostać uwidoczniona w
analizie prąŜkowej. Wykazano,Ŝe 5–10% delecji regionu 13(q14) stanowią delecje
submikroskopowe (mikrodelecje), których wykrycie jest moŜliwe jedynie za pomocą
metody FISH (12, 17).
W roku 1991, na II Międzynarodowych Warsztatach Cytogenetycznych poświęconych badaniom chromosomów w PBL przeprowadzono analizę anomalii chromosomowych u 649 chorych (23). Dobrze rozproszone metafazy uzyskano w 604 przypadkach, natomiast obecność klonalnych aberracji stwierdzono tylko u 311 pacjentów
(48%). Do najczęściej występujących zaburzeń cytogenetycznych naleŜała +12 oraz
anomalie w długim ramieniu chromosomu 13. Wykazano ponadto, Ŝe typ aberracji
wykazywał związek z długością przeŜycia chorych. Pacjentów, których komórki białaczkowe posiadały prawidłowy kariotyp, cechowało dłuŜsze przeŜycie w porównaniu
z chorymi, w komórkach których stwierdzano obecność aberracji chromosomowych.
Chorzy ze złoŜonymi nieprawidłowościami wykazywali gorsze rokowanie co do całkowitego czasu przeŜycia, w porównaniu z grupą posiadającą izolowane aberracje.
Wykazano równieŜ, Ŝe u chorych z +12 lub markerem 14q+ obserwuje się krótsze
przeŜycie, podczas gdy obecność aberracji chromosomu 13 nie wpływa na pogorszenie
rokowania, w porównaniu z grupą chorych o prawidłowym kariotypie.
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) oraz porównawcza hybrydyzacja
genomowa (CGH)
Przełomem w badaniach aberracji chromosomowych stało się opracowanie techniki FISH, słuŜącej do wykrywania specyficznych sekwencji DNA w preparatach cytologicznych i pozwalającej wykryć jedną nieprawidłową komórkę na 200–600 analizowanych jąder interfazowych. Metoda ta umoŜliwia w krótkim czasie identyfikację
róŜnej wielkości regionów lub całych chromosomów na drodze hybrydyzacji sondy
Diagnostyczne i rokownicze znaczenie badań cytogenetycznych w PBL
447
molekularnej, o znanej i komplementarnej do badanego regionu chromosomu sekwencji nukleotydów, z analizowanym fragmentem chromosomu (15, 24, 25). Wykrycie
sondy w badanym preparacie jest moŜliwe dzięki jej wyznakowaniu bezpośrednio fluorochromem lub wykorzystaniu róŜnego rodzaju chemicznych modyfikacji cząsteczki
kwasu nukleinowego jak np. wbudowanie biotyny lub digoksygeniny oraz zastosowanie odpowiedniego znacznika. W przypadku biotyny znacznikiem moŜe być np. kompleks awidyny z fluoresceiną. Świecące w róŜnych kolorach sygnały widoczne w mikroskopie fluorescencyjnym korelują z umiejscowieniem i liczbą kopii genu/chromosomu.
W zaleŜności od tego, czy sondy wykrywają całe chromosomy, czy jedynie centromer, telomer lub inne ściśle określone miejsce w chromosomie, produkowane są
obecnie róŜne ich rodzaje, takie jak sondy unikalne (specyficzne)- komplementarne do
określonego regionu chromosomu, centromerowe –słuŜące do wykrywania sekwencji
nukleotydowych w rejonie centromeru, telomerowe – komplementarne do telomerów
oraz malujące pokrywające cały chromosom lub jego poszczególne ramiona. Na Ryc.1
przedstawiono przykładowy obraz FISH przedstawiający jądra interfazowe limfocytów
B-PBL, po zastosowaniu sondy unikalnej i centromerowej.
Ryc. 1. Analiza wykonana techniką FISH w jądrach interfazowych limfocytów B-PBL, z zastosowaniem
sondy unikalnej dla regionu D13S319 w długim ramieniu chromosomu 13 oraz sondy centrometrowej dla
chromosomu 12. Czerwone sygnały odpowiadają del(13)(q14), zielone sygnały odpowiadają prawidłowemu chromosomowi 12.
Fig. 1. The analysis prepared by FISH method in interphase nuclei of lymphocytes B-CLL, using LSI
D13S319 probe to target the region in the long arm of chromosome 13 and CEP12 DNA probe specific for
the centrometric region of chromosome 12. The red dots represent del(13)(q14) and the green dots represent normal chromosome 12.
448 A. PALACZ, A. KORYCKA
Udoskonaleniem podstawowej techniki FISH jest tzw. M-FISH, w którym poszczególne pary chromosomów róŜnią się kolorem. Stosowane w tej metodzie sondy
malujące stanowią mieszaninę sond zawierających 1–5 róŜnych fluorochromów, przy
czym zastosowanie 5 fluorochromów pozwala na uzyskanie 24 widm emisyjnych,
a odpowiedni zestaw filtrów umoŜliwia akwizycję poszczególnych obrazów w mikroskopie fluorescencyjnym. W jednej komórce moŜna więc równocześnie przebadać
kilka najczęściej spotykanych aberracji liczbowych. Jeszcze nowszą metodą jest analiza widmowa kariotypu (Spectral Karyotyping, SKY), która wykorzystuje 24 sondy
molekularne: dla kaŜdej z 22 par chromosomów autosomalnych oraz osobno dla chromosomów X i Y. W metodzie tej stosowany jest jednak tylko jeden filtr do jednorazowej ekspozycji, a widmo emisyjne chromosomu podlega analizie spektrofotometrycznej (26). Tak uzyskiwane obrazy są szczególnie przydatne przy identyfikacji rearanŜacji chromosomów.
Jak wspomniano wcześniej, przewaga techniki FISH nad klasyczną prąŜkową analizą chromosomów polega na moŜliwości wykrywania aberracji chromosomowych nie
tylko w chromosomach metafazowych, ale takŜe w jądrach interfazowych, co pozwala
na uniknięcie stosowania mało skutecznych mitogenów. Technika FISH umoŜliwia
ponadto identyfikację bardzo małych regionów ulegających aberracji, którym odpowiadają małe docelowe sekwencje sond DNA. Jest szybką metodą pozwalającą ocenić
duŜą liczbę komórek w krótkim czasie i charakteryzuje się wysoką czułością i specyficznością. UmoŜliwia równieŜ uzyskanie danych cytogenetycznych z materiału ubogokomórkowego i archiwalnego, zatopionego w bloczkach parafinowych, a takŜe pozwala na ocenę zaleŜności pomiędzy uzyskanymi aberracjami, a morfologią komórek,
w których stwierdzono ich obecność (10). Pomimo licznych zalet, FISH nie jest jednak
techniką pozbawioną wad. Główną wadą tej metody, pomijając wysoki koszt sond, jest
fakt, iŜ umoŜliwia ona identyfikację aberracji tylko w regionach komplementarnych do
zastosowanych sond.
Czułą metodę przydatną dla rozpoznawania niezrównowaŜonych zmian w materiale genetycznym (delecji, duplikacji czy amplifikacji) jest porównawcza hybrydyzacja
genomowa (comparative genomic hybridization, CGH). Metoda ta polega na równoczesnej hybrydyzacji mieszaniny wyznakowanego w róŜny sposób DNA komórki nowotworowej i referencyjnego DNA komórki prawidłowej do prawidłowych chromosomów znajdujących się w metafazie. W kolejnym etapie, po zastosowaniu dwubarwnej fluorescencyjnej detekcji zhybrydyzowanego DNA nowotworowego i prawidłowego, dokonywana jest ilościowa analiza komputerowa wzajemnego stosunku obu sygnałów fluorescencyjnych. CGH nie jest jednak przydatna do wykrywania zrównowaŜonych translokacji, inwersji lub triploidii (27). W przeciwieństwie do FISH umoŜliwia
ona badanie całego genomu i nie wymaga hodowli komórek pacjenta. Technologią
przyszłości wydaje się ponadto array CGH, którego zasada jest podobna do klasycznej
CGH, ale sekwencją docelową są małe odcinki DNA umieszczone na nośniku (mikromacierzy). Pozwoli to na szybkie i równoczesne ocenienie wielu aberracji (26).
Diagnostyczne i rokownicze znaczenie badań cytogenetycznych w PBL
449
CD40L i OLIGO CpG
Coraz większe znaczenie, jakie przypisuje się aberracjom chromosomowym jako
czynnikom prognostycznym w B-PBL oraz ograniczenia metod FISH i CGH, doprowadziły do opracowania nowych metod umoŜliwiających wykrywanie zarówno znanych, jak i nie opisanych dotąd aberracji chromosomowych. W ostatnich latach zsyntetyzowano i wprowadzono do badań in vitro nowe mitogeny, stymulujące podziały białaczkowych limfocytów B, które w istotny sposób mają zwiększyć wydajność metody
cytogenetyki klasycznej i pozwolić na dokładniejszą i pełniejszą ocenę kariotypu chorych na B-PBL. Do najwaŜniejszych z nich naleŜą ligand CD40 (CD40L) oraz oligonukleotyd CpG (CpG-ODN) (12, 28, 29). Ich zastosowanie pozwala na wykrycie aberracji chromosomowych u ok. 90% chorych (28).
CD40L jest naturalnym odpowiednikiem śródbłonowej glikoproteiny CD40 występującej na prawidłowych komórkach B, komórkach nabłonkowych i niektórych komórkach nowotworowych (22). Buhman i wsp. (29) wykazali, Ŝe związek ten indukował metafazy w limfocytach 93% badanych chorych, podczas gdy klasyczne mitogeny pozwoliły na uzyskanie metafaz u 78% chorych. Ponadto, stymulacja limfocytów białaczkowych przez CD40L pozwoliła na wykrycie nieprawidłowego kariotypu u
89% chorych, podczas gdy zastosowanie metod konwencjonalnych ujawniało aberracje
chromosomowe tylko u 22% badanych. Wszystkie aberracje wykryte z zastosowanie
CD40L zostały potwierdzone metodą FISH. U 11 spośród 27 chorych (41%) stwierdzono występowanie aberracji złoŜonych. W jednym przypadku wykryto nie opisywaną wcześniej w B-PBL zrównowaŜoną translokację t(11;16)(p15;p13.1), która
współistniała z del(11q) i izochromosomem 1. Pomimo, Ŝe zastosowanie CD40L mogłoby okazać się cennym narzędziem do oceny ewolucji kariotypu oraz wykrywania
nowych zrównowaŜonych aberracji chromosomowych, nie wykrywalnych metodą
CGH, metoda ta jest czaso- i pracochłonna, co utrudnia jej zastosowanie w rutynowej
diagnostyce. Większe nadzieje budzi obecnie CpG-ODN nazwany DSP30, którego
zastosowanie pozwala na uzyskanie podobnego do CD40L odsetka komórek w stadium metafazy (12, 13).
DSP30 posiada sekwencję TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCTTGCC, zawierającą 3 powtarzające się dinukleotydy: cytozynę i guaninę (CG). Zarówno bakteryjne
DNA jak i syntetyczne CpG-ODN stymulują komórki układu immunologicznego,
m.in. limfocyty, komórki NK, komórki dendrytyczne i monocyty do proliferacji, wydzielania i/lub róznicowania (13, 30, 31). Syntetyczne CpG-ODN indukują proliferację limfocytów B (zarówno prawidłowych, jak i komórek B-PBL), produkcję cytokin
(m.in. IL-2 i TNF- α) oraz regulują ekspresję powierzchniowych cząstek CD25 i CD86
w limfocytach B (13, 32). W badaniach przeprowadzonych przez Dicker i wsp. (12)
hodowle limfocytów B-PBL były stymulowane DSP30 i IL-2, jako specyficznymi
mitogenami. Metafazy zdatne do analizy uzyskano w 95% przypadków, wśród których aberracje wykryto u ponad 80% badanych chorych. Wyniki te były porównywalne
z uzyskanymi w analizie FISH lub z zastosowanie CD40L. Na uwagę zasługuje fakt,
Ŝe u 47 spośród 101 (46%) chorych, u których wykazano istnienie aberracji chromosomowych, metoda ta ujawniła dodatkowe anomalie nie wykryte za pomocą FISH.
450 A. PALACZ, A. KORYCKA
W badanej grupie translokacje zrównowaŜone i niezrównowaŜone obserwowano
u 30% chorych, a translokacje niezrównowaŜone okazały się ponadto częstą przyczyną
delecji. Stwierdzono takŜe związek pomiędzy występowaniem translokacji niezrównowaŜonych, a nieobecnością mutacji w obrębie IgVH, co wiązało się ze złym rokowaniem. Obecność złoŜonego kariotypu wykazywała natomiast zaleŜność z ekspresją
antygenu CD38 i wiązała się z nieco lepszym rokowaniem. Meyr i wsp. (28) stosowali
stymulację limfocytów uzyskanych od 96 chorych na PBL za pomocą CpG-ODN
z IL-2 lub CD40L. Translokacje wykryto u 33 chorych (34%), u których średni czas
wolny od leczenia był znamiennie krótszy, niŜ u pozostałych chorych (24 vs 106 miesięcy, p<0,001), a całkowite przeŜycie wynosiło 94 miesiące.
Klasyczna cytogenetyka prąŜkowa z uŜyciem DSP30 jest metodą nieskomplikowaną technicznie, umoŜliwiającą ocenę zaburzeń cytogenetycznych nie opisywanych
i nie powtarzających się w B-PBL, a mogących mieć znaczenie rokownicze co do
przebiegu tej choroby.
Aberracje cytogenetyczne i ich znaczenie kliniczne
Obecnie wiadomo, Ŝe w patogenezie B-PBL istotną rolę odgrywa utrata lub przemieszczenie materiału genetycznego. Aberracje cytogenetyczne okazały się teŜ waŜnymi czynnikami rokowniczymi co do dynamiki rozwoju choroby, odpowiedzi na
leczenie i długości przeŜycia pacjentów dotkniętych tym schorzeniem. W obrębie niektórych obszarów ulegających tym aberracjom zlokalizowano geny supresorowe transformacji nowotworowej, mogące odgrywać kluczową rolę w patogenezie B-PBL,
a takŜe ponad 13 genów microRNA, których ekspresja koreluje z ekspresją ZAP-70
oraz stanem zmutowania genów IgVH (7, 33). W 1999 r. Dohner i wsp. (15) dokonali
analizy częstości występowania aberracji chromosomowych wykrywanych metodą
FISH, w duŜej grupie chorych na B-PBL. Wśród 325 przebadanych pacjentów anomalie chromosomowe wykryto u 82%, przy czym u 29% wykazano więcej niŜ jedną nieprawidłowość. Do najczęstszych z nich naleŜały: del(13)(q14), del(11)(q22.3-q23.1),
+12, del(17)(p13) oraz del(6q) (Tabela 1).
• delecje i translokacje 13q14 / 13q12
Najczęstszą nieprawidłowością cytogenetyczną, opisywaną u 40-65% chorych na
PBL, są delecje części długiego ramienia chromosomu 13 lub, rzadziej, jego translokacje (6, 15, 28, 34). W ok. 1/3 przypadków są to delecje bialleliczne. Najnowsze doniesienia dowodzą, Ŝe częstym mechanizmem delecji regionu 13q14 jest wzajemna translokacja niezrównowaŜona, polegająca na wymianie materiału genetycznego między
13q, a zazwyczaj którymś z chromosomów partnerskich (12, 35).
W regionie 13q14 zlokalizowano gen podatności na siatkówczaka zarodkowego
(gen retinoblastoma; RB1). Początkowo sądzono, Ŝe to właśnie jego utrata odgrywa
rolę w patogenezie PBL (11). O ile jednak monoalleliczna utrata genu RB1 opisywana
jest u ok. 30% chorych, aberracja dotycząca obu alleli jest rzadko spotykana (11, 36).
Kolejne badania wykazały, Ŝe del(13)(q14) dotyczy częściej sekwencji oznaczonych
Diagnostyczne i rokownicze znaczenie badań cytogenetycznych w PBL
451
Tabela 1. Najczęstsze aberracje chromosomowe o znaczeniu rokowniczym w B-PBL
Table 1. The most frequent chromosomal abnormalities with prognostic implications for B-CLL
% chorych z poszczególnymi aberracjami
Ogólna liczba
chorych/
liczba chorych
z aberracjami
Delecja
13q14
Delecja
11q22-q23
Delecja
17p13
Trisomia
12
Delecja
6q
(%)
325/268 (82%)
55%
18%
7%
16%
6%
113/87 (77%)
64%
15%
8%
25%
0%
132/104 (79%)
59%
16%
5%
13%
7%
144/104 (72%)
52%
21%
12%
8%
1%
93/75 (81%)
63%
13%
7,5%
14%
0%
58/41 (71%)
48%
7%
2%
22%
0%
Piśmiennictwo
Dohner i wsp.
(15)
Dewald i wsp.
(40)
Dicker i wsp.
(12)
Krober i wsp.
(16)
Mayr i wsp.
(28)
Aoun i wsp.
(25)
symbolem D13S319 oraz D13S25, połoŜonych dystalnie od genu RB1 i zlokalizowanych w regionie 13q14.3, w którym zlokalizowany jest hipotetyczny gen supresorowy
nazywany genem DBM (deleted in B-cell malignancy) (37, 38). W badaniach GarciaMarco i wsp. (38) częstość delecji genu RB1 wynosiła 24%, podczas gdy regionu
D13S25 aŜ 60%. Podobnie Liu i wsp. (36), badając grupę 75 chorych na B-PBL,
u 44% spośród nich wykryli delecję regionu D13S319, a utratę D13S25 i RB1 odpowiednio w 39 i 21% przypadków. W przeciwieństwie do nich, La Starza i wsp. (26)
opisali przypadek chorego, u którego stosując metodę FISH i CGH wykazali, Ŝe
del(13)(q14) obejmowała gen RB1, natomiast zaskakujący był brak udziału w tej aberracji regionów D13S319 i D13S25.
W regionie 13q14.3 zlokalizowane są takŜe geny miR15a, miR16-1 i Leu2, których
utrata w wyniku delecji powoduje zwiększenie ekspresji antyapoptotycznego białka
BCL-2 (31, 33, 36). Wiadomo obecnie, Ŝe geny miR15a i miR16-1 związane są z powolnym przebiegiem choroby, podczas gdy inne, jak np. miR29 czy miR181 regulują
ekspresję onkogenu TCL-1, którego utratę bierze się pod uwagę w patogenezie bardziej agresywnych postaci B-PBL (7, 39). W rejonie 13q12.3 zlokalizowano natomiast
gen supresorowy BRCA2, połoŜony centromerycznie w stosunku do RB1, którego
utrata w komórkach somatycznych takŜe moŜe odgrywać istotną rolę w patogenezie
oraz progresji B-PBL (37).
Wykazano równieŜ związek pomiędzy nieprawidłowościami chromosomu 13q,
a wczesnym stadium klinicznym choroby oraz dłuŜszym przeŜyciem i dłuŜszym czasem od rozpoznania do wdroŜenia leczenia (9, 40). W badaniach Dohnera i wsp. (15)
prawie 1/3 chorych z del(13q14) nie wymagała leczenia. Starostik i wsp. (41) wykazali
wprawdzie, Ŝe delecja regionu D13S319/D13S25 wykryta u 37% badanych chorych
na B-PBL korelowała z bardziej agresywną postacią choroby, ale wyniki te nie zostały
452 A. PALACZ, A. KORYCKA
potwierdzone przez innych autorów. Obecnie uwaŜa się, Ŝe obecność del (13)(q14),
podobnie jak prawidłowy kariotyp, wiąŜą się z lepszym rokowaniem i łagodniejszym
przebiegiem choroby i wykazują związek z wykrywaną mutacja genów IgVH (2, 32,
41). Współistnienie del(13q) z dodatkowymi translokacjami znacznie pogarsza rokowanie w tej grupie chorych (8).
• delecje 11q22.3 - q23.1
Delecje dotyczące długiego ramienia chromosomu 11 występują u około 15– 20%
chorych na B-PBL i są drugim pod względem częstości występowania zaburzeniem
cytogenetycznym w tej chorobie. Delecje chromosomu 11 dotyczą szczególnie regionu
11q22.3 – q23.1, w którym zlokalizowane są geny, których utrata uwaŜana jest za jedną z przyczyn chorób nowotworowych układu krwiotwórczego. Wśród nich znajduje
się gen ATM (ang. ataxia telangiectazia mutated), uwaŜany za jeden z istotniejszych
genów supresorowych hamujących transformację nowotworową poprzez aktywację
szlaku apoptotycznego zaleŜnego od p53 oraz gen MLL (myeliod/lymphoid leukemia)
(15, 34, 42, 43). W ostatnich latach zainteresowanie wzbudziły ponadto nowe geny,
których ekspresja ulega zahamowaniu u chorych na PBL z wykrytą del(11q). NaleŜą
do nich gen NPAT (cell-cycle regulation), CUL5 (ubiquitin-dependent apoptosis regulation) oraz PPP2R1B (component of the cell-cycle and apoptosis) (44).
Dohner i wsp. (15) w wielowariantowej analizie wykazali, Ŝe del(11)(q22-q23) jest
niezaleŜnym czynnikiem prognostycznym wpływającym na czas przeŜycia chorych.
Postacie PBL z del(11q) opisywane są częściej u młodych pacjentów (poniŜej 55 r.Ŝ.),
u których występowała znamiennie krótsza mediana przeŜycia, w porównaniu z chorymi w tym samym wieku, ale bez tej aberracji (64 vs 209 mies.). Natomiast wśród
pacjentów powyŜej 55 r.Ŝ. nie stwierdzono istotnych róŜnic w czasie przeŜycia w grupie z del(11q) i bez tej anomalii (94 vs 111 mies.) (15, 42).
Zdaniem niektórych autorów istnieje związek pomiędzy del(11q)(22-q23),
a uogólnioną i/lub masywną limfadenopatią, bardziej zaawansowanym stadium klinicznym choroby i szybką jej progresją, a takŜe z wysoką ekspresją ZAP- 70, ekspresją
CD38, nieobecnością mutacji w obrębie genów IgVH oraz zahamowaniem ekspresji
onkogenu TCL-1 (6, 15, 45). W badaniach przeprowadzonych przez Cuneo i wsp. (46)
wykazano, Ŝe w niektórych przypadkach del(11q) posiadała charakter wtórnej anomalii, która ujawniała się w czasie progresji choroby, w której pierwotnie wykryto
del(13)(q14).
• trisomia chromosomu 12
Trisomia 12 jest najczęstszą anomalią liczbową chromosomów w B-PBL. Częstość
+12, ocenianej metodą FISH, szacuje się na 16 – 25% (15,17,40). Występuje ona jako
aberracja izolowana lub w powiązaniu z del(6q), del(13q14) lub innymi anomaliami
(6). Rola +12 w patogenezie B-PBL pozostaje jednak nadal niejasna.
Anomalia ta jest częściej obserwowana w późniejszym okresie choroby i na ogół
dotyczy tylko części komórek klonu białaczkowego, co sugeruje, Ŝe jest wtórną anomalią genetyczną, pojawiającą się podczas progresji choroby. Zdaniem niektórych
Diagnostyczne i rokownicze znaczenie badań cytogenetycznych w PBL
453
autorów aberracja ta wiąŜe się z tendencją do bardziej agresywnego i szybszego przebiegu B-PBL, krótszego całkowitego przeŜycia oraz koniecznością wcześniejszego
wdroŜenia leczenia (15, 47). Opublikowano jednak takŜe badania, wskazujące, Ŝe +12
nie jest niekorzystnym czynnikiem rokowniczym i nie wykazuje związku z stadium
zaawansowania klinicznego choroby oraz występowaniem limfadenopatii i splenomegalii (47). Chorzy z +12 zwykle wykazują wraŜliwość na fludarabinę (FA) i mają
dłuŜszy całkowity czas przeŜycia, w porównaniu z grupą chorych, u których występuje del(17p) lub del(11q) (48). Matutes i wsp. (47) zwrócili ponadto uwagę na częstsze
występowanie +12 u chorych z atypową postacią PBL w porównaniu z grupą chorych,
u których morfologia limfocytów jest typowa. Za szczególnie niekorzystny czynnik
rokowniczy uwaŜa się natomiast współistnienie + 12 z del(17p).
• delecja 17p13
Zaburzenia dotyczące regionu 17p13, w którym zlokalizowany jest gen supresorowy p53, naleŜą do najczęstszych aberracji genetycznych występujących w nowotworach u ludzi. Aktywność białka p53 często nazywanego „straŜnikiem genomu”, zapobiega utrwalaniu się i kumulowaniu mutacji w kolejnych generacjach komórkowych.
Delecje w obrębie krótkiego ramienia chromosomu 17 są wykrywane metodą FISH
u ok. 10% chorych z B-PBL oraz u ponad 30% chorych z zespołem Richtera (6, 15,
49). Dohner i wsp. (50) wykazali, Ŝe del(17)(p13) ma istotny wpływ na przebieg choroby i wyniki leczenia. Stwierdzono silną zaleŜność pomiędzy występowaniem
del(17p), a wysokim stadium zaawansowania klinicznego, krótkim okresem od rozpoznania do rozpoczęcia leczenia oraz czasem całkowitego przeŜycia. W badaniach tych
średni czas przeŜycia chorych z del(17)(p13) wynosił tylko 7 mies. Ponadto, u chorych
z del(17)(p13) bądź mutacją p53 stwierdza się oporność zarówno na leki alkilujące, jak
i na FA (6, 50). Robak i wsp. (51) wykazali jednak, Ŝe schemat cyklofosfamid/kladrybina (CC), jako leczenie pierwszej linii pozwala uzyskać wysoki odsetek
odpowiedzi takŜe u chorych, u których wykryto del(17)(p13.1) /TP53.
Chevallier i wsp. (52) wykorzystali metodę FISH do oceny ewolucji kariotypu
w przebiegu choroby u 31 pacjentów z PBL. Powtórna ocena kariotypu, wykonana po
upływie 37–123 mies. od pierwszego badania, u 13 chorych wykazała pojawienie się
nowych aberracji. U 11 z nich była to del(17)(p13), która okazała się być najczęstszą
aberracją nabyta podczas ewolucji choroby i wiązała się z najgorszym rokowaniem.
Autorzy sugerują bowiem, Ŝe obecność wtórnej del(17)(p13) ma bardzo złe znaczenie
prognostyczne, szczególnie u chorych w stadium A wg klasyfikacji Bineta, a pojawienie się jej jest związane z wysokim ryzykiem zgonu w ciągu 12 mies. Ponadto pojawienie się klonu z del(17p), jako zmiany wtórnej u leczonych chorych związane jest
z opornością tych chorych na stosowane leki (53).
Lekiem z wyboru u chorych z del(17)(p13) bądź mutacją genu p53, pierwotnie
opornych na leczenie FA, jest humanizowane przeciwciało anty-CD (alemtuzumab,
ALT). U 42% (15/36) chorych opornych na FA stwierdzono występowanie
del(17)(p13) i/lub mutacji p53. Wszyscy chorzy otrzymywali ALT jako drugą linie
leczenia. Kliniczną odpowiedź na ten lek stwierdzono u 40% (6/15) chorych
454 A. PALACZ, A. KORYCKA
z del(17)(p13) /mutacją p53, w porównaniu do 19% (4/21) chorych, u których nie wykryto tej anomalii (54). Szansą dla chorych obarczonych niekorzystnymi cytogenetycznymi czynnikami rokowniczymi, takimi jak del(17p) i del(11q) moŜe być przeszczep komórek kwiotwórczych, a w szczególności przeszczep allogeniczny z zastosowaniem niemieloablacyjnego kondycjonowania (39).
• delecje 6q
Delecje w długim ramieniu chromosomu 6 są opisywane w B-PBL z częstością 6 –
7% (12, 52). Regionami najczęściej ulegającymi delecji są 6(q21-q24) i 6(q25-q27)
(18, 55). Stilgenbauer i wsp. (56) wykazali u chorych z del(6)(q21) występowanie
wyŜszej leukocytozy oraz uogólnionej limfadenopatii, w porównaniu z grupą chorych
bez tej anomalii. Nie ujawniono natomiast niekorzystnego znaczenia rokowniczego tej
delecji. Całkowity czas przeŜycia oraz długość okresu wolnego od leczenia były bowiem zbliŜone w grupach chorych z del(6q) i bez tej anomalii. Późniejsze badania
wykazały występowanie zwiększonej ekspresji CD38 oraz atypowej morfologii limfocytów u nosicieli del(6q), w porównaniu z grupą bez zaburzeń struktury tego chromosomu, a takŜe częstsze występowanie splenomegalii, krótszego całkowitego czasu
przeŜycia i krótszego czasu wolnego od leczenia, w porównaniu z grupą chorych z
prawidłowym kariotypem, bądź z del(13q) (18).
U niektórych chorych aberracja 6q- jest nieprawidłowością wtórną, pojawiającą się
podczas choroby i wpływającą na jej przebieg. Finn i wsp. (55) wykonując dwukrotne
badanie kariotypu u 51 chorych na PBL, w 43% przypadków stwierdzili klonalną ewolucję. W przeciwieństwie do Chevallier i wsp. (52), którzy jako wtórną aberrację najczęściej obserwowali del(17p), cytowani powyŜej autorzy wykazali, Ŝe najczęstszym
zaburzeniem cytogenetycznym pojawiającym się w czasie trwania choroby była translokacja bądź delecja dotycząca długiego ramienia chromosomu 6 w regionie q21–q24.
Chorych z wtórną del(6q) cechował szybszy postęp choroby i krótszy czas bez leczenia
w stosunku do chorych bez tej anomalii.
• inne aberracje chromosomowe opisywane w B-CLL
U chorych na B-PBL oprócz najczęstszych aberracji chromosomowych, opisanych
wyŜej, wykrywane są dodatkowe anomalie, które rzadko występują jako zmiany izolowane (Tabela 2). La Starza i wsp. (24) opisali przypadek chorego na B-PBL, u którego badanie FISH ujawniło obecność del(14)(q24). Analiza CGH wykazała ponadto,
Ŝe aberracja ta była ściśle związana z del(13)(q12-q14). Inną opisywaną aberracją jest
t(14;19)(q32;q13) obejmująca gen BCL3 umiejscowiony w chromosomie 19q13 oraz
gen dla IgVH zlokalizowany w chromosomie 14q32. Jest ona najczęściej wykrywana
wraz z +12 i często występuje w nietypowych postaciach PBL (19). Cavazzini i wsp.
(20) wykryli ponadto rearanŜacje dotyczące chromosomów 1p34-36, 4p16, 4q35, 9q
oraz +7, które mogą stanowić wczesne defekty cytogenetyczne, odgrywające rolę
w transformacji nowotworowej. Opublikowano takŜe wyniki badań, w których opisano t(14;18)(q32;q21), związaną z +12, t(1;14)(q22;q32) związaną z +18 oraz
t(11;14)(q13;q32)(25).
Diagnostyczne i rokownicze znaczenie badań cytogenetycznych w PBL
455
Tabela 2. Niektóre dodatkowe aberracje chromosomowe wykrywane w B-PBL
Table 2. Some additional chromosomal abnormalities detected in B-CLL
Liczba chorych /
Liczba chorych
z aberracjami
Rodzaj aberracji
Translokacje
Mitogen
ZrównowaŜone
NiezrównowaŜone
Inne aberracje
Piśmiennictwo
(%)
96/33 (34%)
CD40L
t(12;14)(q13;q32)
t(1;1)(p36;q10)
t(10;18)(q21;q21)
t(1;22)(p32;q11)
t(2;18)(p12;q21)
der(2)t(2;16)(p11;p13)
der(4)t(2;4)(p21;q13)
der(7)t(4;7)(q13;q22)
der(13)t(7;13)(q22;q14)
der(16)t(2;16)(p11;p13)
del(11)(q13q22)
del(11)(q14)
dup(8)(q11q23)
+5
+12
Mayr
i wsp.
(28)
27/24 (89%)
CD40L
t(1;22)(p32;q11)
t(2;18)(p12;p21)
t(11;14)(q13;q32)
der(17)t(7;17)(q11;q32)
der(18)t(13;18)(q21;q22)
der(3)t(3;11)(p25;q22)
del(13)(q12q14)
del(13)(q13q21)
i(1)(q10)
Buhmann
i wsp.
(29)
125/101 (81%)
CpGODN
t(11;14)(q13;q32)
t(8;22)(q11;q13)
t(8;14)(p21;q32)
t(7:11)(p15;q13)
t(14:18)(q32;q21)
der(12)t(12;17)(p13;q21)
der(19)(t(11;19)(p11;p13)
der(18)t(2;18)(p11;p11)
der(1)t(1;11)(q32;q13)
der(8)t(2;8)(p13;p23)
+12
+18,
+19
i(17)(q10)
del(14)(q32)
Dicker
i wsp.
(12)
PODSUMOWANIE
B-PBL cechuje róŜny przebieg kliniczny, a czas przeŜycia chorych waha się od
kilku miesięcy do kilkudziesięciu lat. Coraz większego znaczenia nabiera w ostatnich
latach ocena aberracji chromosomowych jako czynników prognostycznych. Biorąc pod
uwagę ryzyko progresji i oczekiwany całkowity czas przeŜycia Monserrat (48) zaproponował podział populacji chorych na grupę niskiego ryzyka, do której naleŜy zaliczyć
chorych z prawidłowym kariotypem lub izolowaną del(13q) oraz grupę wysokiego
ryzyka, do której naleŜą pacjenci z del(17p) lub del(11q). Chorzy z +12 pomimo, Ŝe
istnieje u nich wysokie ryzyko szybkiej progresji choroby, w przeciwieństwie do chorych z wykrytą del(17p) lub del(11q) zwykle reagują na leczenie FA i mają dłuŜszy
czas przeŜycia. Ostatnio obserwuje się takŜe powrót do cytogenetyki klasycznej, wykorzystującej nowe mitogeny, specyficzne dla komórek B, takie jak CD40L i CpGODN. UmoŜliwiają one bowiem wykrycie nie znanych dotąd aberracji chromosomowych, których obecność moŜe w przyszłości przyczynić się do jeszcze lepszego poznania biologii PBL i pełniejszego jej diagnozowania, jak równieŜ wpłynąć na wybór
odpowiedniej strategii leczenia.
Praca finansowana z Grantu KBN Nr 2553/B/PO1/2008/34
456 A. PALACZ, A. KORYCKA
PIŚMIENNICTWO
1. Dighiero G, Hamblin TJ. Chronic lymphocytic leukaemia. Lancet 2008; 371: 1017-1029.
2. Hallek M, Cheson BD, Catovsky D et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic
lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia
updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood 2008; 111: 5446-5456.
3. Rai KR, Savitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RP, Pasternack BS. Clinical staging of
chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975; 46: 219-234.
4. Binet JL, Auquire A, Digiero G et al. A new prognostic classification of chronic lymphocytic
leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer 1981; 48: 198-206.
5. Cheson BD, Bennett JM, Grever M et al. National Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 1996; 87:
4990-4997.
6. Inamdar KV, Bueso_Ramos CE. Pathology of chronic lymphocytic leukemia: an update. Ann
Diagn Pathol. 2007; 11: 363-389.
7. Moreno C, Montserrat E. New prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia. Blood Rev.
2008; 22: 211-219.
8. Carlsson M, Totterman TH, Matsson P&Nilsson K. Cell cycle progression of B-chronic lymphocytic leukemia cells induced to differentiate by TPA. Blood 1988; 71: 415-421.
9. Gahrton G, Robert KH, Friberg K, Zech L, Bird AG. Nonrandom chromosomal aberrations in
chronic lymphocytic leukemia revaled by polyclonal B-cell mitogen stimulation. Blood 1980; 56: 640647.
10. Gozzetti A., Le Beau MM. Fluorescence in situ hibridization: Uses and limitation. Semin Hematol 2000; 37: 320-333.
11. Stilgenbauer S, Leupolt E, Ohl S et al. Heterogeneity of deletions involving RB1 and the
D13S319 locus in B cell chronic lymphocytic leukemia revealed by FISH. Cancer Res 1995; 55: 34753477.
12. Dicker F, Schnittger S, Haferlach T, Kern W, Schoch C. Immunostimulatory oligonucleotideinduced metaphase cytogenetics detect chromosomal aberrations in 80% of CLL patients: a study of 132
CLL cases with correlation to FISH, IgVH status, and CD38 expression. Blood 2006; 108: 3152-3160.
13. Decker T, Schneller F, Sparwasser T, Tretter T, Lipford GB, Wagner H. Immunostimulatory
CpG-oligonucleotides cause proliferation proliferation, cytokine production, and an immunogenic phenotype in chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood 2000; 95: 999-1006.
14. Jahrsdorfer B, Muhlenhoff L. Blackwell SE et al. B-cell lymphoma differ in their responsiveness
to CpG Oligodeoxynucleotides. Clin Cancer Res. 2005; 11: 1490-1499.
15. Dohner H, Stilgenbauer S, Dohner K, Bentz M, Lichter P. Chromosome aberration in B-cell
chronic lymphocytic leukemia: reassessment based on molecular cytogenetuc analysis. J Mol Med. 1999;
77: 266-281.
16. Kröber A, Bloehdorn J, Hafner S et al. Additional Genetic High-Risk Features Such As 11q Deletion, 17p Deletion, and V3-21 Usage Characterize Discordance of ZAP-70 and VH Mutation Status in
Chronic Lymphocytic Leukemia. J Clin Oncol. 2007; 24: 969-975.
17. Haferlach C, Dicker F, Schnittger S, Kern W, Haferlach T. Comprehensive genetic characterization of CLL: a study on 506 cases analysed with chromosome banding analysis, interphase FISH, IgVH,
status and immunophenotyping. Leukemia 2007; 21: 2442-2451.
18. Cuneo A, Rigolin GM, Bigoni R, Angeli CD, Veronese A, Cavazzini F. Chronic lymphocytic
leukemia with 6q- shows distinct hematological features and intermediate prognosis. Leukemia 2004; 18:
476-483.
Diagnostyczne i rokownicze znaczenie badań cytogenetycznych w PBL
457
19. Huh YO, Abruzzo LV, Rassidakis GZ et al. The t(14;19)(q32;q13)- positive small B-cell leukaemia: a clinicopathologic and cytogenetic study of seven cases. Br J Haematol. 2006; 136: 220-228.
20. Cavazzini F, Cuneo A, De Angeli C et al. Abnormakities of chromosomes 1p34-36, 4p16, 4q35,
9q11-32 and +7 represent novel recurrent cytogenetic rearrangements in chronic lymphocytic leukemia.
Leuk Lymphoma 2004; 45: 1197-1203.
21. Wołowiec D, Benchaib M, Pernas P et al. Expression of cell cycle regulatory proteins in chronic
lymphocytic leukemias. Comparison with non-Hodgkin's lymphomas and non-neoplastic lymphoid tissue.
Leukemia. 1995; 9:1382-1388.
22. Crawford DH, Catovsky D. In vitro activation of leukaemia B cells by interleukin-4 and antibodies to CD40. Immunology 1993; 80: 40-44.
23. Juliusson G, Oscier D, Gahrton G, for the International Working Party On Chromosomes in
CLL (IWCCLL). Cytogenetic findings and survival in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Second
IWCCLL compilation of date on 662 patients. Leukemia Lymph 1991; 5: 21-25.
24. Glassman AB, Hayes KJ. The value of fluorescence in situ hybridization in the diagnosis of
chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet. 2005; 158: 88-91.
25. Aoun P, Blair HE, Smith LM et al. Fluorescence in situ hybridization detection of cytogenetic
abnormalities in B-cell chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma. Leuk Lymphoma
2004; 45: 1595-1603.
26. La Starza R, Barba G, Matteucci C et al. Chronic lymphocytic leukemia. Is terminal
del(14)(q24) a new marker for prognostic stratification? Leuk Res. 2006; 30: 1569-1572.
27. Summersgill B, Thornton P, Atkinson S, Matutes E, Shipley J, Catovsky D. Chromosomal imbalances in familial chronic lymphocytic leukaemia: a comparative genomic hybridisation analysis. Leukemia 2002; 16: 1229-1232.
28. Mayr Ch, Speicher MR, Kofler DM, Buhmann R, Strehl J, Busch R. Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukaemia. Blood 2006; 107: 742-751.
29. Buhmann R, Kurzeder Ch, Rehklau J, Westhaus D, Bursch S, Hiddemann W. CD40L stimulation enhances the ability of conventional metaphase cytogenetics to detect chromosome aberrations in Bcell chronic lymphocytic leukaemia cells. Br J Haematol 2002; 118: 968–975.
30. Sparwasser T, Koch ES, Vabulas RM et al. Bacterial DANN and immunostimulatory CpG oligonucleotides tigger maturation and activation of murine dendritic cells. Eur J Immunol. 1998; 28: 20452054.
31. Klinman D, Takeshita F, Gursel I et al. CpG DNA: recognition by and activation of monocytes.
Microbes Infections 2002; 4: 897-901.
32. Decker T, Schneller F, Hipp S et al. Cell cycle progression of chronic lymphocytic leukemia
cells is controlled by cyclin D2, cyclin D3, cyclin-dependent kinase (cdk) 4 and the cdk inhibitor p27.
Leukemia 2002; 16: 327-334.
33. Calin GA, Pekarsky Y, Croce CM. The role of minroRNA and other non-coding RNA in the
pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia. Best Pract Res Clin Haematol. 2007; 20: 425-437.
34. Mehes G. Chromosome abnormalities with prognostic impact in B-cell chronic lymphocytic
leuekamia. Pathol Oncol Res. 2005; 11: 206-210.
35. Herholz H, Kern W, Schnittger S, Haferlach T, Dicker F, Haferlach C. Translocations as a
mechanism for homozygous deletion of 13q14 and loss of the ATM gene in a patient with B-cell chronic
lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2007; 174: 57-60.
36. Liu Y, Hermanson M. Grander D, Merup M, Wu X, Heyman M. 13q deletions in lymphoid malignancies. Blood 1995; 86: 1911-1915.
458 A. PALACZ, A. KORYCKA
37. Hogan WJ, Tefferi A, Borell TJ, Jenkins R, Li C-Y. Prognostic relevance of monosomy at the
13q14 locus detected by fluorescence in situ hybridization in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Cancer
Genet Cytogenet 1999; 110: 77-81.
38. Garcia-Marco J, Caldas C, Price CM, Wiedermann LM, Ashworth A, Catovsky D. Frequent somatic deletion of the 13q12.3 locus encompassing BRCA2 in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1996;
88:1588-1575.
39. Caballero D, Garcia-Marco JA, Martino R, Mateos V, Ribera JM, Sarra J. Allogeneic transplant
with reduced intensity conditioning regimens may overcome the poor prognosis of B-cell chronic lymphocytic leukemia with unmutated immunoglobulin variable heavy-chain and chromosomal abnormalities
(11q- and 17p-). Clin Cancer Res 2005; 11: 7757-7763.
40. Dewald GW, Brockman SR, Paternoster SF, Bone ND, O`Fallon JR, Allmer C. Chromosome
anomalies detected by interphase fluorescence in situ hybridization: correlation with significant biological
features of B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol 2003; 121: 287-295.
41. Starostik P, O’Brien S, Chung CY, Haidor M, Manshouri T, Kantarjian H. The prognostic significance of 13q14 deletion in chronic lymphocytic leukemia. Leuk. Res. 1999; 23: 795-801.
42. Dohner H, Stilgenbauer S, James MR, Benner A, Weilgunc T, Bentz M. 11q deletion identify a
new subset of B-cell chronic lymphocytic leukemia characterized by extensive nodal involvement and
inferior prognosis. Blood 1997; 89: 2516-2522.
43. Stankovic T, Hubank M, Cronin D et al. Microarray analysis reveals that TP53- and ATMmutant B-CLLs share a defect in activating proapoptotic responses after DNA damage but are distinguished by major differences in activating prosurvival responses. Blood 2004; 103: 291-300.
44. Kalla C, Scheuermann MO , Kube I et al. Analysis of 11q22-q23 deletion target genes in B-cell
chronic lymphocytic leukemia: evidence for a pathogenetic role of NPAT, CUL5 and PPP2R1B. Eur J
Cancer 2007; 43: 1328-1335.
45. Dickinson JD, Gilmore J, Iqbal J, Sanger W, Lynch JC, Chan J. 11q22.3 deletion in B-chronic
lymphocytic leukemia is specifically associated with bulky lymphadenopathy and ZAP-70 expression but
not reduced expression of adhesion/cell surface receptor molecules. Leuk Lymphoma. 2006; 47: 231-44.
46. Cuneo A, Bigoni nR, Rigolin GM et al. Late appearance of the 11q22.3-23.1 deletion involving
the ATM locus in B-cell chronic lymphocytic leukemia and related disorders. Clinico-biological significance. Haematologica 2002; 87: 44-51.
47. Matutes E, Oscier D, Garcia-Marco J, Ellis J, Copplestone A, Gilingham R. Trisomy 12 defines
a group of CLL with atypical morphology: correlation between cytogenetic, clinical and laboratory features in 544 patients. Br J Haematol. 1996; 92: 382-388.
48. Montserrat E. New prognostic markers in CLL. Hematology Am Soc Hematol Educ Program
2006: 279-284.
49. Robak. Recent progress in the management of chronic lymphocytic leukemia. Cancer Treat Rev.
2007; 33: 710-728.
50. Dohner H, Fischer K, Bentz M, Hansen K, Benner A, Cabot G. P53 gene deletion predicts for
poor survival and non – response to therapy with purine analogs in chronic B-cell leukemias. Blood 1995;
85: 1580-1589.
51. Robak T, Blonski JZ, Wawrzyniak E. et al. Activity of cladribine combined with cyclophosphamide (CC regimen) in frontline therapy of chronic lymphocytic leukemia with 17p13.1/TP53 deletion;
report from the Polish Adult Leukemia Group (PALG). Cancer 2008 (w druku).
52. Chevellier P, Penther D, Avet-Loiseau H, Robillard N, Ifrah N, Mahe B. CD38 expression and
secendary 17p deletion are important prognostic factors in chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol
2002; 116: 142-150.
Diagnostyczne i rokownicze znaczenie badań cytogenetycznych w PBL
459
53. Stilgenbauer S, Sander S, Bullinger R, Benner A, Leupolt E, Winkler D. Clonal evolution in
chronic lymphocytic leukemia: acquisition of high-risk genomic aberrations associated with unmutated
VH, resistance to therapy, and short survival. Haematologica 2007; 92: 1242-1245.
54. Lozanski G, Heerema NA, Flinn IW, Smith L, Harbison J, Webb J. Alemtuzumab is an effective therapyfor chronic lymphocytic leukemia with p53 mutations and deletions. Blood 2004; 103: 32783281.
55. Finn WG, Kay NE, Kroft SH, Church S, Peterson LC. Secondary abnormalities of chromosome
6q in B-cell chronic lymphocytic leukemia: a sequential study of karyotypic instability in 51 patients. Am
J Hematol 1998; 59: 223-229.
56. Stilgenbauer S, Bullinger L, Benner A, Wildenberger K, Bentz M, Dohner K. Icidence and clinical significance of 6q deletions in B cell chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 1999; 13: 1331-1334.
Praca wpłynęła do Redakcji 24.06.2008 r. i została zakwalifikowana do druku 28.08.2008 r.
Adres Autorów:
Klinika Hematologii UM w Łodzi
ul. Ciołkowskiego 2
93-510 Łódź