FLEX Monoclonal Mouse Anti-Epstein-Barr Virus, LMP
Transkrypt
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Epstein-Barr Virus, LMP
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Epstein-Barr Virus, LMP Klony CS. 1-4 Ready-to-Use (Link) Nr kat. IR753 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti Epstein-Barr Virus, LMP, Klony CS 1-4, Ready-to-Use (Link), jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciało znakuje komórki zakaŜone wirusem Epstein-Barr, w których zachodzi ekspresja późnego białka błonowego (LMP-1) i stanowi przydatne narzędzie w identyfikacji komórek nowotworowych w związanej z wirusem Epstein-Barra chorobie Hodgkina (1-3) oraz raka nosogardzieli (4). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Podsumowanie i wyjaśnienie Wirus Epstein-barr (EBV) to ludzki wirus opryszczki, normalnie występujący w postaci szeroko rozpowszechnionej infekcji bezobjawowej u >95% dorosłej ludności świata, będących przez całe Ŝycie nosicielami wirusa. Genom wirusa składa się z dwułańcuchowej cząsteczki DNA o długości około 172 par zasad, kodującego przynajmniej 80 białek. Istnieją dwie linie wirusa EBV, choć większość genomu wydaje się być identyczna (5, 6). Komórki zainfekowane EBV oraz zmiany nowotworowe zasadniczo wykazują jeden z trzech wzorów ekspresji genów wirusowych związanych z utajeniem. W utajeniu typu I ekspresji ulega tylko zakodowany antygen jądrowy EBV 1 (EBNA-1), wraz z dwoma małymi poliadenylowanymi jądrowymi RNA (EBER 1 i 2), obserwowanymi w chłoniaku Burkitta. W utajeniu typu II obserwuje się dodatkową ekspresję trzech późnych białek błonowych, LMP-1, LMP-2A i LMP-2B, występujących w chorobie Hodgkina oraz raku nosogardzieli. Utajenie typu III obserwowane jest w chorobach limfoproliferacyjnych rozwijających się u osób z obniŜoną odpornością oraz transformowaną przez EBV linią komórek limfoblastoidalnych. W grupie tej ekspresji ulega wszystkie sześć genów EBNA (EBNA-1/2/3A/3B/3C/LP), wszystkie trzy geny LMP oraz dwa geny EBER (6). Integralne białko błonowe, LMP-1, kodowane jest przez gen BNRF1 i zawiera 386 aminokwasów, o łącznej masie cząsteczkowej 63 kDa. Białko to uwaŜa się za onkogenne i bierze ono udział w czterech szlakach transkrypcyjnych czynników sygnalizacyjnych, oraz indukuje ekspresję licznych markerów powierzchniowych komórek oraz komórkowych molekuł adhezyjnych (4, 5). EBV związany jest z pewnymi nowotworami pochodzenia chłonnego i nabłonkowego, w tym chłoniakiem Burkitta, chłoniakiem immunoblastycznym, chłoniakiem z komórek T, chorobą Hodgkina, rakiem nosogardzieli oraz rakiem Ŝołądka (5, 6). Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Odczynnik dostarczony Gotowa do uŜyci mieszanina czterech monoklonalnych mysich przeciwciał w postaci ciekłej jako nadsącz hodowli tkankowej dializowany wobec buforu Tris/HCl o stęŜeniu 0,05 mol/L, o pH 7,2, zawierającego NaN3 w stęŜeniu 0,015 mol/L. Klon: CS 1, CS 2, CS 3 i CS 4 Izotyp: IgG1, kappa. Immunogen Rekombinowane białko fuzyjne zawierające sekwencje bakteryjnej beta-galaktozydazy oraz karboksylową połowę LMP kodowanego przez EBV (7). Swoistość W badaniu techniką Western blot lizatów przekształconych przez EBV linii komórek limfoblastycznych przeciwciało znakuje duŜe pasmo 57–66 kDa, w zaleŜności od izolatu wirusa, czasem wraz z mniejszym pasmem 50–55 kDa odpowiadającym pełnej długości i skróconej formie LMP. Przeciwciało rozpoznaje 20 odległych geograficznie izolatów EBV (7). Przeciwciało reaguje krzyŜowo z posiadającym masę 43–44 kDa dubletem niescharakteryzowanych prawidłowych białek komórkowych w ekstraktach komórkowych, włącznie z tymi z linii komórkowej kontroli ujemnej pozbawionej EBV (7). Przeciwciało znakuje prawidłowe linie komórek limfoblastycznych EBV-dodatnich wyprowadzonych przez zainfekowanie prawidłowych spoczynkowych komórek B wirusem B95.8, podczas gdy linia komórkowa BL2, wyprowadzona z rzadkich, EBV-ujemnych pacjentów BL, oraz inne niezwiązane izolaty komórkowe, włącznie z migdałkowymi komórkami B i T, wątrobą i grasicą płodową, hodowlami fibroblastów płodowych, liniami ludzkich komórek białaczki HSB2 i K562 oraz 7 liniami EBV-ujemnych komórek B nie wykazują znakowania oprócz komórkowego dubletu białkowego (7). Środki ostroŜności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji. 3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować właściwe procedury postępowania. (118010-002) Dako Denmark A/S IR753/PL/MNI/2009.12.04 str. 1/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne. 5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami. Przechowywanie Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, oraz gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przygotowanie próbek oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm. Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004). Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania. Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Procedura barwienia oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000). W systemie Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana objętość uŜytego odczynika to 1 x 200 µL lub 2 x 150 µL na preparat. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym systemie Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Optymalne warunki mogą zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. JeŜeli patolog oceniający preparat Ŝyczy sobie wybarwienia innym natęŜeniu, czasy inkubacji oraz uŜycie szablonów wizualizacji EnVision FLEX/EnVision FLEX+ mogą zostać zmienione. W celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (nr kat. K8008). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować EBV-dodatnie chłoniaki Burkitta i Hodgkina, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750). Interpretacja wybarwienia Komórki znakowane przeciwciałem wykazują odczyn cytoplazmatyczny i błonowy. Charakterystyka działania Tkanki normalne: Przeciwciało nie znakuje ani prawidłowej błony śluzowej nosogardzieli, ani nacieczonego limfocytami, desmoplastycznego zrębu i prawidłowego nabłonka okrywającego w pierwotnych preparatach nosogardzieli (4). Przeciwciało nie wykazuje znakowania w obrębie jelita grubego, wyrostka robaczkowego oraz trzustki (8) Silne znakowanie prawidłowych wczesnych prekursorowych komórek mieloidalnych i erytroidalnych moŜna zaobserwować pomimo stwierdzonego metodą PCR całkowitego braku dowodów obecności EBV (9). Tkanki patologiczne: Przeciwciało znakowało 22/46 zatopione w parafinie tkanki przypadków choroby Hodgkina z 1/12 przewagą limfocytów, 12/24 stwardnień guzowatych, 6/7 typem mieszanokomórkowym oraz 3/3 podtypy z nadmierną utratą limfocytów (2). W innych badaniach obejmujących 47 chłoniaków Hodgkina 32/47 zostały wyznakowane przeciwciałem, w tym 28/42 przypadki podtypu stwardnień guzowatych oraz 4/5 podtypu mieszanokomórkowego (3). Wśród 51 raków nosogardzieli przeciwciało znakowało 40/51, w tym 8/10 raków płaskonabłonkowych rogowaciejących, 7/12 raków płaskonabłonkowych nierogowaciejących oraz 25/29 raków niezróŜnicowanych (4). Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. 6. (118010-002) Dako Denmark A/S Pallesen G, Hamilton-Dutoit SJ, Rowe M, Young LS. Expression of Epstein-Barr virus latent gene products in tumour cells of Hodgkin’s disease. Lancet 1991;337:320-2. Murray PG, Young LS, Rowe M, Crocker J. Immunohistochemical demonstration of the Epstein-Barr virusencoded latent membrane protein (LMP-1) in paraffin sections of Hodgkin’s disease. J Pathol 1992;166:1-5 Engel M, Essop MF, Close P, Hartley P, Pallesen G, Sinclair-Smith C. Improved prognosis of Epstein-Barr virus associated childhood Hodgkin’s lymphoma: study of 47 South African cases. J Clin Pathol 2000;53:182-6. Vera-Sempere FJ, Burgos JS, Botella MS, Cordoba J, Gobernado M. Immunohistochemical expression of Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein (LMP-1) in paraffin sections of EBV-associated nasopharyngeal carcinoma in Spanish patients. Oral Oncol, Eur J Cancer 1996;32B:163-8. Baumforth KRN, Young LS, Flavell KJ, Constandinou C, Murray PG. The Epstein-Barr virus and its association with human cancers [review]. J Clin Pathol: Mod Pathol 1999;52:307-22. Cruchley AT, Williams DM, Niedobitek G, Young LS. Epstein-Barr virus: biology and disease [review]. Oral Diseases 1997;3 Suppl 1: S156-63. IR753/PL/MNI/2009.12.04 str. 2/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 7. 8. 9. Rowe M, Evans HS, Young LS, Hennessy K, Kieff E, Rickinson AB. Monoclonal antibodies to the latent membrane protein of Epstein-Barr virus reveal heterogeneity of the protein and inducible expression in virustransformed cells. J Gen Virol 1987;68:1575-86. Jiwa NM, Oudejans JJ, Dukers DF, Vos W, Horstman A, van der Valk P, et al. Immunohistochemical demonstration of different latent membrane protein -1 epitopes of the Epstein-Barr virus in lymphoproliferarive diseases. J Clin Pathol 1995;48:438-42. Leong ASY, Cooper K, Leong FJWM, Manual of diagnostic antibodies for immunhistology. Oxford University Press; 199 p. 162. Obja śnienie s ym boli Nume r kata lo go wy Temp era tu ra p rzec ho wywa ni a Zu Ŝyć p rzed Wyr ób me dycz ny d o d ia gn ostyki i n vi tro Zawa rtość wystarcz a na <n > te stów Prod uce nt Sp ra wdz ić w i nstru kcji sto sow an ia Nu mer se rii (118010-002) Dako Denmark A/S IR753/PL/MNI/2009.12.04 str. 3/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17