Pobierz opis
Transkrypt
Pobierz opis
Marta Rusek Ul. Medalionów 6/89 20-486 Lublin tel. 48 667-195-153 e-mail: [email protected] Uniwersytet Medyczny II Wydział Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym Katedra i Zakład Patofizjologii Badania doświadczalne na temat N-homocysteinylacji białek i mechanizmów przeciwdziałających temu procesowi. Od wielu lat homocysteina (Hcy) jest przedmiotem intensywnych badań ze względu na pozytywną korelację z występowaniem różnych stanów patologicznych. Badania kliniczne pokazują, że podwyższony poziom Hcy we krwi (>15 M) jest niezależnym czynnikiem ryzyka rozwoju miażdżycy, choroby niedokrwiennej serca, chorób zakrzepowo-zatorowych, udaru mózgu oraz chorób neurodegeneracyjnych. Dotychczasowe badania nad metabolizmem Hcy sugerują, że jeden z jej metabolitów, tiolakton homocysteiny (HTL) jest wysoce reaktywny, który w niskich stężeniach, rzędu 10 nM, spontanicznie tworzy wiązanie amidowe z grupą ε-aminową reszt lizyny w białku (N-homocysteinylacja). Wykazano, że różne białka osocza ulegają modyfikacji przez HTL, zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. N-homocysteinylowane białka występują powszechnie w organizmach ludzi i zwierząt. W patofizjologii chorób człowieka wykazano, że HTL powoduje powoduje: upośledzenie/inaktywacje funkcji tych białek, aktywację szlaków immunologicznych prowadzących do syntezy przeciwciał przeciw N-Hcy-białkom, agregację N-Hcy-fibrynogenu w zakrzepicy oraz zaostrzenie stanu zapalnego naczyń krwionośnych. Choroby serca, miażdżyca i osteoporoza to powszechne schorzenia, które występują w starzejących się populacjach. W ostatnich latach wykazuje się istnienie związku między obiema chorobami, gdyż mają szereg wspólnych czynników dla ich powstawania. Należą do nich: hiperlipidemia, nadciśnienie tętnicze, cukrzyca, menopauza u kobiet, stres oksydacyjny, proces zapalny oraz hiperhomocysteinemia. Leki hipolipemiczne, tj. statyny hamują rozwój miażdżycy, ale także stymulują procesy tworzenia tkanki kostnej. Natomiast leki stosowane w leczeniu osteoporozy tj. bisfosfoniany mają wpływ na stężenie cholesterolu i hamują rozwój płytki miażdżycowej. Okazuje się, że czynniki zwiększające ryzyko rozwoju miażdżycy i choroby niedokrwiennej serca wywierają istotny wpływ na procesy przebudowy tkanki kostnej i rozwój osteoporozy. Ponadto stosowanie obu grup leków jest długotrwałe i może powodować skutki uboczne dla całego organizmu. Obecnie coraz częściej wskazuje się na próby kompleksowej profilaktyki i leczenia obu schorzeń. Celem pracy jest wykazanie znaczenia homocysteiny w procesach N-homocysteinylacji białek oraz w patogenezie zmian miażdżycowych i zakrzepowych oraz zbadanie wpływu stosowania bisfosfonianów na proces rozwoju i leczenie chorób układu krążenia, szczególnie hiperlipidemii oraz biochemiczna ocena dynamiki wczesnych i długoterminowych zmian przy długotrwałym stosowaniu tych preparatów. Pierwsza część pracy dotyczy toksyczności Hcy oraz N-homocysteinylacji kolagenu, głównego białka tkanki łącznej, występującego mi.in w ścięgnach, kościach, skórze, chrząstkach stawowych,. Uważa się, że mechanizm patogennego działania Hcy na układ sercowo-naczyniowy wiąże się z bezpośrednim cytotoksycznym wpływem na komórki śródbłonka naczyniowego, co może upośledzać syntezę DNA komórki, hamować jej wzrost i procesy naprawcze. Ponadto nadmiar Hcy pobudza proliferację mięśni gładkich naczyń, zwiększa produkcję i gromadzenie kolagenu w ścianie naczynia. Dodatkowo HTL powoduje potranslacyjną modyfikację kolagenu. Materiał badawczy stanowią mysie modele zwierzęce z nokautem genu dla syntazy β-cystationinowej. Do oznaczenia poziomu tHcy, S-Hcy oraz NHcy w ekstraktach kolagenu stosuje się metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Z kolei druga część pracy obejmuje badanie wpływu leków stosowanych w terapii osteoporozy (bisfosfonianów) na proces rozwoju i leczenie chorób układu krążenia, szczególnie hiperlipidemii oraz ocenę biochemiczną dynamiki wczesnych i długoterminowych zmian przy ciągłym stosowaniu tych preparatów. W wielu badaniach epidemiologicznych udokumentowano istnienie związku pomiędzy stosowaniem tych preparatów, a występowaniem chorób zakrzepowo-zatorowych, choroby niedokrwiennej serca i udaru mózgowego. Wskazuje na to relacja między poziomem Hcy, a układem naczyniowo-sercowym i kostnym. Istotą promiażdżycowego działania Hcy jest jej wpływ na śródbłonek naczyń tętniczych i generowanie procesów oksydacyjnych i zapalnych. Jako aminokwas o kwaśnym odczynie wpływa hamująco na remodeling kości. Bisfosfoniany są stabilnymi analogami pirofosfonianu. Mechanizm ich działania nie jest do końca poznany, ale polega prawdopodobnie na hamowaniu migracji i adhezji osteoklastów do struktur tkanki kostnej oraz hamowaniu proliferacji komórek prekursorowych osteoklastów. Ponadto bisfosfoniany hamują adhezję komórek nowotworowych i w wyniku tego zmniejszają uwarunkowaną nowotworem osteolizę oraz hiperkalcemię. Leki te działają drogą niereceptorową przez endocytozę (w czasie degradacji i resorpcji składników macierzy kostnej). Obecnie stosowane bisfosfoniany należą do dwóch grup: 1) bisfosfoniany proste o krótkim łańcuchu bocznym, bezazotowe (np. etydronian, tiludronian, klodronian); 2) bisfosfoniany złożone, o długim łańcuchu bocznym – aminobisfosfoniany (zawierające jeden lub więcej atomów azotu), np. alendronian, risedronian, ibandronian, zoledronian, pamidronian. Na podstawie badań klinicznych w Polsce zostały zarejestrowane leki zawierające: etydronian sodu, alendronian sodu, risedronian sodu, ibandronian sodu oraz zoledronian sodu. W pracy zostaną wykorzystane dwa modele zwierzęce: osobniki szczurów zdrowych oraz osobniki z hiperlipidemią, którym zostaną podane preparaty najczęściej stosowane u ludzi w odpowiednio mniejszych dawkach. Substancja czynna Nazwa handlowa preparatu/ Wytwórca Etydronian sodu Difosfen/ Ostedron/ Klodronian sodu Bonefos/Schering AG Alendronian sodu Fosamax/MERCK Rekostin/Biofarm Sp. z.o.o. Ostenil/Teva Kutno S.A. Ostolek/LEK-AM Sp. z.o.o. Ostemax/Polpharma Risedronian sodu Actonel/Sanofi-Aventis Ibandronian sodu Bonviva/Roche Kwas zolendronowy Aclasta/Novartis Zometa/ Dawkowanie 400 mg/doba przez 2 tygodnie, potem 76 dni przerwy, podczas której podaje się wapń i witaminę D3 1600 mg/doba (3 mg/kg mc. raz na tydzień u szczurów) 10 mg/doba lub 70 mg/raz na tydzień (0,1 mg/kg mc./doba lub 1 mg/kg mc./doba u szczurów) 5 mg/doba lub 35 mg/raz na tydzień 2,5 mg/doba lub 150 mg/raz na miesiąc (1 µg/dzień; 0,05 mg/kg mc./doba u szczurów) 5 mg/raz na rok (0,2-5 µg/ dzień; 120 µg/kg mc./dwa razy w tygodniu) Istotne jest bowiem poznanie nie tylko bisfosfonianów, ale również wykazanie ewentualnych różnic pomiędzy rożnymi lekami tej grupy. Może to mieć znaczenie w doborze konkretnych preparatów u pacjentów ze współistnieniem osteoporozy i podwyższonego ryzyka miażdżycy lub na przykład u chorych z niską aktywnością PON1. Następnie planowane jest wykonanie oznaczeń biochemicznych, aktywności PON1 w osoczu i w wątrobie względem paraoksanu oraz HTL, aktywności aminotransferaz w celu wykluczenia lub stwierdzenia ewentualnego działania hepatotoksycznego, ekspresja genu PON1 w wątrobie metodą RT-PCR, określenie profilu lipidowego oraz oznaczenie stężenia tHcy oraz N-Hcy-białek. Poprzednie badania wykazały, że niedobór PON1 powoduje nasilenie homocysteinylacji białek, nawet przy prawidłowym stężeniu Hcy w osoczu. Schorzenie to jest wyzwaniem dla współczesnej medycyny, ze względu na wzrost średniej długości życia ludzkiej populacji. Nowe formuły leczenia pozwalają obniżać koszty profilaktyki oraz samego leczenia. Standardowe, długotrwałe terapie, podobnie jak źle leczone choroby wymagają ogromnych nakładów finansowych (hospitalizacja, inwalidztwo, zgony), za które płaci całe społeczeństwo. Tworzenie nowych rozwiązań oznacza dla pacjentów szansę na lepsze życie. Poprzednie badania wykonane w Katedrze i Zakładzie Patofizjologii Uniwersytetu Medycznego w Lublinie wykazały, że statyny - leki powszechnie stosowane w profilaktyce i terapii chorób krążenia mają niekorzystne działanie na aktywność paraoksonazy 1 (PON1). Paraoksonaza 1 jest enzymem odpowiedzialnym za przeciwmiażdżycowe działanie lipoprotein o dużej gęstości (HDL). PON1 hamuje rozwój miażdżycy rozkładając produkty peroksydacji lipidów oraz tiolakton homocysteiny (HTL) – endogenną pochodną homocysteiny, która powoduje potranslacyjne modyfikacje białek. Statyny są inhibitorami reduktazy HMG-CoA – kluczowego enzymu w syntezie cholesterolu i niesterydowych izoprenoidów. Bisfosfoniany natomiast hamują kolejny enzym tego szlaku – kinazę mewalonianiową. Ze względu na pokrewny mechanizm działania oraz częste współistnienie miażdżycy i osteoporozy, a co za tym idzie przewlekle stosowanie bisfosfonianów u osób z hiperlipidemią z podwyższonym ryzykiem miażdżycy lub już istniejącą miażdżycą uzasadnione jest zbadanie wpływu tych leków na aktywność PON1.