DNAPointer® System INSTRUKCJA OBSŁUGI BioVectis

Transkrypt

DNAPointer® System
INSTRUKCJA OBSŁUGI
Numer katalogowy
105-100
BioVectis
1
Produkt DNAPointer® System przeznaczony do wykorzystania wyłącznie do celów
badawczych
Wszystkie znaki towarowe są wyłączną własnością ich przedstawiciela
Producent
BioVectis
ul. Pawińskiego 5 A blok D
02-106 Warszawa,
Poland
Tel. +48 22 668 71 47
Fax +48 22 668 71 64
e-mail:[email protected]
Zamówienia:
Tel. +48 22 668 71 47
Fax +48 22 668 71 64
e-mail:[email protected]
DNA Pointer® System
Rok budowy: 2010
Należy zachować oryginalne opakowanie do momentu zakończenia okresu gwarancji.
OSTRZEŻENIE
Urządzenie może być źródłem potencjalnie śmiertelnego napięcia i może być
obsługiwane tylko przez wykwalifikowany technicznie personel.
Proszę dokładnie przeczytać całą instrukcję obsługi przed uruchomieniem
urządzenia.
Urządzenie DNA Pointer jest zgodne z ustawowymi wytycznymi bezpieczeństwa Unii Europejskiej:
73/23/EEC Dyrektywa Niskonapięciowa
89/336/EEC Dyrektywa EMC
2
Metoda MSSCP (z ang. Multitemperature Single Strand Conformation
Polymorphism)
To End-User License Agreement (EULA)
Ograniczona umowa licencyjna dla zastosowań wyłącznie badawczych
End-User License Agreement (EULA) jest umową prawną między użytkownikiem/klientem i
właścicielem metody MSSCP (z ang. Multitemperature Single Strand Conformation
Polymorphism) oraz producentem DNAPointer® System firmą Krzysztof Kucharczyk Techniki
Elektroforetyczne Sp. z o. o. (Biovectis).
Metodę MSSCP można używać tylko w systemie DNAPointer® System i tylko w celach
badawczych. Wszelkie komercyjne wykorzystanie metody wymaga dodatkowej umowy
licencyjnej pomiędzy Biovectis i użytkownikiem systemu.
Metoda w ramach procedury PCT (PCT/PL/01/00012) jest chroniona przez międzynarodowe
i krajowe prawa i traktaty. Metoda jest licencjonowana i nie podlega sprzedaży.
1. Przyznanie licencji. Niniejsza Umowa Licencyjna przyznaje Ci prawo do stosowania
metody MSSCP w badaniach naukowych tylko w jednej jednostce DNAPointer®
System.
2. Opis innych praw i ograniczeń. Metoda nie może być używana na innym urządzeniu
niż DNAPointer® System. Metoda jest licencjonowana z DNAPointer® System jako
jego integralna część. Na podstawie licencji użytkownika nie wolno wynajmować lub
dzierżawić metody MSSCP. Można przenieść na stałe wszystkie swoje prawa
wynikające z niniejszej Umowy Licencyjnej tylko jako sprzedaż lub przeniesienie
systemu, pod warunkiem, że zaprzestanie się używania metody MSSCP na
jakimkolwiek innym sprzęcie. Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o.
o. (Biovectis) może wypowiedzieć niniejszą Umową Licencyjną, jeśli postępowanie
użytkownika nie jest zgodne z warunkami niniejszej Umowy Licencyjnej. W takim
przypadku należy zwrócić właścicielowi metody wszystkie materiały i dokumentację
metody MSSCP.
3. Prawa autorskie. Wszystkie prawa własności oraz prawa autorskie do metody (w
tym, ale nie wyłącznie, zdjęcia lub teksty włączone do materiałów), załączone
3
materiały drukowane są własnością Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne
Sp.z o.o.(Biovectis).
4. Pomoc techniczna. Pomoc techniczną dla produktu, metody i systemu zapewnia
firma Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o. o.(Biovectis) lub jej
pełnomocnik. Jeśli mają Państwo jakiekolwiek pytania dotyczące niniejszej Umowy,
lub też potrzebują skontaktować się z Krzysztof Kucharczyk Techniki
Elektroforetyczne Sp. z o. o. (Biovectis), proszę zapoznać się z danymi
teleadresowymi zawartymi w instrukcji użytkownika.
4
DNAPointer® System
GWARANCJA
Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o. o. (Biovectis) gwarantuje, że
dostarczony Państwu aparat DNAPointer® System został przetestowany i spełnia wszystkie
warunki specyfikacji. Niniejsza gwarancja jest ważna przez 12 miesięcy tylko wtedy, gdy
produkt i funkcje zostały wykorzystane zgodnie z instrukcją obsługi.
Producent nie bierze odpowiedzialności za straty lub szkody wynikające z
nieprawidłowego korzystania z aparatu DNAPointer® System. Odpowiedzialność producenta
jest ograniczona do naprawy, wymiany urządzenia lub zwrotu kosztów zakupu. Krzysztof
Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. (Biovectis) zastrzega sobie prawo do zmiany
specyfikacji systemu bez wcześniejszego powiadomienia.
Proszę uważnie przeczytać w instrukcji obsługi przed rozpoczęciem korzystania z
systemu DNA Pointer® System.
POINTER DNA powinny być używane tylko przez osoby odpowiednio wykwalifikowane i
przeszkolone. Jeśli system DNA Pointer® System nie jest używany w sposób określony w
niniejszej instrukcji, ochrona niniejszej gwarancji może być naruszona.
5
Rozdział 1. Informacje podstawowe
1.1.
Wprowadzenie
Urządzenie DNA Pointer® System jest narzędziem skutecznej analizy zmienności
genetycznej. System jest otwartą platformą dla kilku metod genetycznych w oparciu o
elektroforetyczne rozdzielanie kwasów nukleinowych:
• Single Temperature - SSCP
• MultiTemperature - MSSCP
• Gradient Temperature – Gradient temperatury w czasie
• Custom – dowolne połączenie powyższych metod
DNAPointer System jest szczególnie skuteczny w wykrywaniu mutacji punktowych w
analizowanych produktach PCR za pomocą wielotemperaturowego SSCP (MSSCP).
DNAPointer® System jest szczególnie przydatny przy analizie niejednorodnego materiału lub
analizie wysoce zmiennych regionów DNA. Analiza MSSCP pozwala na wykrycie
mniejszościowych wariantów genetycznych w różnorodnym materiale jak również pozwala
na wykrycie nowych mutacji punktowych.
Zalety Systemu DNA Pointer:
System DNA Pointer jest wyposażony w unikalny algorytm kontroli temperatury badanej
próbki, który gwarantuje:
• wysoki współczynnik wykrywania mutacji i SNP na poziomie 90-95%,
• wysoką powtarzalność wyników
• krótki czas analizy
DNA Pointer® System wyposażony jest w intuicyjne oprogramowanie sterujące procesem
elektroforezy.
Zastosowanie wymienionych powyżej metod w systemie DNA Pointer® System jest
szczególnie skuteczne, gdy do analiz używane są dedykowane i zoptymalizowane zestawy
chemiczne.
6
Rysunek 1.
DNA Pointer® System.
DNA Pointer® System składa się z dwóch podstawowych modułów:
1. DNA Pointer® System – jednostka główna (zawierająca wbudowany zasilacz
wysokonapięciowy)
2. Komputer PC Notebook z dedykowanym oprogramowaniem sterującym
1.2.
Metoda MSSCP
DNA Pointer® System połączony z metodą MSSCP jest wyjątkowo skutecznym narzędziem
gwarantującym:
• Wyższy współczynnik wykrywania mutacji niż przy wykorzystaniu klasycznej metody SSCP.
Współczynnik wykrywania dla metody MSSCP wynosi 90-95% w porównaniu z 85-90% przy
SSCP.
• Krótki czas analizy
• Znacząca redukcja kosztów genotypowania (stosując elektroforezę natywną w żelach
poliakrylamidowych: nie ma potrzeby oznaczania fragmentów PCR, nie ma potrzeby
powtarzania elektroforez SSCP w różnych warunkach temperaturowych)
• Wysoką powtarzalność wyników dzięki wykorzystaniu modułu MULTIPOL do równoległego
wylewania do 8 żeli
7
• Równoczesną analizę i oczyszczanie próbki do dalszego wykorzystania np.
sekwencjonowania –(próbki DNA mogą być odzyskane z ssDNA uzyskanych po elektroforezie
w celu późniejszej analizy).
Rysunek 2.
Porównanie wyników za pomocą genotypu SSCP i MSSCP metody siedmiu wariantów eksonu
7 ludzkiego genu PAH. Siedem różnych wariantów eksonu 7 ludzkiego genu PAH było
multiplikowanych w reakcji PCR. Produkty amplifikacji zostały zdenaturowane (94C, 5 min.)
i schłodzone na lodzie, a następnie nałożone na natywny żel PA w buforze TBE. Po
elektroforezie (około 60 minut) fragmenty ssDNA zabarwiono stosując barwienie srebrem
(Silver Stain kit) w czasie 40 minut. (A-C) Wyniki analizy SSCP próbek w różnych
temperaturach żelu: (A) 34C, (B) 22C, (C) 10C. (D). Wyniki analizy MSSCP w zakresie
temperatur 34/22/10C.
1.3.
Specyfikacja
Tabela 1. DNAPointer System - dane techniczne
Parametr
Wartość
Rozmiar żelu
2 40 mm x 180 mm
8
Zakres kontroli temperatury
2°C do 65°C
Dokładność pomiaru temperatury
- 0.2°C w pełnej skali
Maksymalne napięcie elektroforetyczne
3000 VDC
Maksymalna moc elektroforezy
50 W
Maksymalny prąd elektroforezy
300 mA
Dokładność kontroli parametrów elektrycznych ± 1,5%
500 A
Upływność prądu powodująca odcięcie napięcia
elektroforetycznego
Zasilanie
220-240 VAC,
50-60 Hz, 600 W
Waga netto
26 kg
Wymiary (wxhxd ) mm
502 x 504 x 570 mm
UWAGA! Aparat ten jest przeznaczony tylko do użytku wewnętrznego.
Tabela 2. Warunki środowiskowe
Parametr
Wartość
Zakres temperatury otoczenia
4°C - 35°C.
Maksymalna wilgotność względna 80% w zakresie 4°C - 25°C
1.4.
Zasady bezpieczeństwa
UWAGA!
• Urządzenie jest zdolne do wytworzenia potencjalnie śmiertelnego napięcia i może być
obsługiwane tylko przez wykwalifikowany personel.
• Przeczytaj całą instrukcję operacji przed użyciem.
• Podczas elektroforezy pokrywa komory elektroforetycznej ze względów bezpieczeństwa
powinna być zawsze zamknięta.
• Należy napełniać zbiorniki na bufor elektroforetyczny tylko do wyznaczonego poziomu
maksymalnego.
• Nie należy przenosić urządzenia, gdy jest uruchomione.
9
• Podczas elektroforezy bardzo niewielkie ilości różnych gazów są wytwarzane na
elektrodach w wyniku elektrolizy. Rodzaj gazu zależy od składu wykorzystanego buforu.
Urządzenie używać w sprawnie wentylowanym pomieszczeniu.
1.5.
Informacje o zamawianiu
DNAPointer System
numer katalogowy 105-100
10
Rozdział 2. Opis głównych elementów systemu
2.1.
Jednostka główna
DNAPointer ® System jest zaawansowanym, łatwym w użyciu systemem elektroforetycznym
o unikalnej zdolności do kontroli temperatury próbki z dokładnością do 0,2°C. W skład
systemu wchodzą: zintegrowany aparat do elektroforezy składający się z komory
elektroforetycznej wyposażonej w moduł wymiany ciepła oraz komputer z dedykowanym
oprogramowaniem. Temperatura w żelu jest kontrolowana podczas elektroforezy z
dokładnością do 0,2C, poprzez kontakt zestawu szyb i żelu z blokiem wymiennika ciepła.
Podczas elektroforezy temperatura może być utrzymywana na stałym poziomie (SSCP), lub
zmieniać się liniowo (Gradient temperatury) lub zmieniać się krokowo (MSSCP). Precyzyjna
regulacja temperatury pozwala wykonywać powtarzalne elektroforezy i skuteczne wykrywać
mutacje. Całkowity czas elektroforezy w DNA Pointer® System zależy od aplikacji.
Rysunek 3.
DNA Pointer® System
11
2.2.
Moduł wymiany ciepła
Moduł wymiennika ciepła pozwala na prowadzenie elektroforez w warunkach dużej mocy
(40-50 W) przy zadanej temperaturze. Zastosowanie wysoce wydajnych termomodułów
zapewnia doskonałą stabilizację temperatury próbek w żelu lub dynamiczną jej zmianę.
Moduł wymiany ciepła stabilizuje temperaturę żelu podczas elektroforezy w zakresie od 4°C
do 65°C z dokładnością 0,2°C.
2.3. Zasilacz wysokonapięciowy
Zasilacz wysokonapięciowy jest zintegrowany z systemem DNAPointer. Zapewnia do 50 W
mocy podczas elektroforezy. Zasilacz jest zaprogramowany i sterowany oprogramowaniem
DNAPointer.
2.4. Jednostka sterująca - Komputer PC
Jednostką sterującą jest komputer PC z systemem MS Windows, który dzięki
zainstalowanemu oprogramowaniu prowadzi elektroforezę oraz kontroluje wszystkie jej
warunki. Parametry elektroforezy projektowane są poprzez łatwy w obsłudze interfejs.
Profile elektroforezy można zapisywać i korzystać z nich przy kolejnych elektroforezach.
2.5. Oprogramowanie DNA Pointer® System software
Algorytm wprowadzony do oprogramowania pozwala na precyzyjną kontrolę temperatury
Algorytm oparty na modelu rozpraszania ciepła pozwala na precyzyjną kontrolę temperatury
próbki wewnątrz żelu, niezależnie od mocy zastosowanej w elektroforezie.
2.6. DNA Pointer® System Multipol – moduł równoległego wylewania żeli
DNA Pointer® System Multipol pozwala na jednoczesne przygotowanie do ośmiu
identycznych poliakrylamidowych żeli. Żele poliakrylamidowe powinny być przygotowane co
najmniej 18 godziny przed elektroforezą. Stosowanie tej zasady zapewnia wiarygodność
wyników i wysokie tempo wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu we
fragmentach DNA . Żele odpowiednio zabezpieczone przed wyschnięciem mogą być
przechowywane w Multipolu w temperaturze +4°C przez 1 do 2 tygodni. Aby zapobiec
12
wysuszeniu żeli należy Moduł Multipol szczelnie zamknąć, wlewając uprzednio do pudełka
kilka mililitrów buforu TBE.
DNA Pointer® System MULTIPOL zawiera:
1. Główne pudełko z ruchoma ścianką przednią
1 szt.
2. Śruby dokręcające
8 szt.
3. Arkusze folii
9 szt.
4. Pokrywę
1 szt.
5. Rurkę ze strzykawką
1 szt.
6. Zaworek
1 szt.
7. Uchwyt do podtrzymania korpusu strzykawki
1 szt.
Rysunek 4.
DNA Pointer® System MULTIPOL
2.7. DNA Pointer® System DryOut – moduł suszenia żeli PA
DNA Pointer® System DryOut jest to zestaw do ręcznego wygodnego i łatwego suszenia żeli.
Żele są suszone przez noc pomiędzy dwoma arkuszami folii półprzepuszczalnej pozwalającej
na odparowanie wody. Wysuszone żele są idealne do skanowania i mogą być
przechowywane przez bardzo długi okres bez utraty jakości.
13
Rysunek 5.
DNA Pointer® System DryOut
14
Rozdział 3. Rozpakowanie i instalacja
3.1. Rozpakowanie
Prosimy o zachowanie wszystkich materiałów opakowaniowych, aż do wygaśnięcia
gwarancji.
3.2. Lista elementów zestawu
Tabela 3. Lista elementów DNAPointer® System
Nr. kat.
Opis
Ilość
105-100
DNA Pointer® System jednostka główna
1 szt.
105-210
Komputer PC Notebook
1 szt.
200-101
Silver Staining Kit (15 żeli)
1 szt.
200-150
Bufor TBE 10x (pH 8,5)
1 litr
200-131
Poliakrylamidy mix 30% T, 3,3% C (29:1) + 15% glicerolu
100 ml
200-175
Ammonium Persulfate solution 10% (w/v)
5 ml
200-155
TEMED
1 ml
200-141
MSSCP Bufor denaturujący A
5 ml
200-142
MSSCP Bufor denaturujący B
2 ml
200-145
Bufor obciążający (loading buffer) 6x
1 ml
105-111
Przekładki 0,5 mm (2 szt.)
1 zestaw
105-123
Grzebień 0,5 mm x 44 studzienki
1szt.
105-151
Zestaw szyb gr. 3 mm – szyba z nacięciem 1 szt. +
1 zestaw
szyba pełna 1 szt. (240 x 197 mm)
105-171
Stelaż do suszenia szyb
1 szt.
105-161
DNA Pointer® System Multipol
1 szt.
105-181
Pojemnik szklany do barwienia żeli PA z pokrywką (210 x 260 x 40 1 szt.
mm)
105-191
DNA Pointer® System DRYOUT + folie do suszenia (35 szt.)
1 zestaw
105-200
Oprogramowanie DNA Pointer® System
1 szt.
15
105-195
DNA Pointer® System Instrukcja obsługi
1 szt.
3.3. Wybór miejsca pracy
Instalacji DNAPointer® System należy dokonać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Nie
należy umieszczać Pointer DNA w miejsce w pobliżu elementów grzewczych. System
powinien zostać zainstalowany na płaskiej, równej powierzchni.
UWAGA!
Należy unikać zasłaniania otworów wentylacyjnych w obudowie jednostki
głównej DNA Pointer® System. Należy zapewnić możliwość swobodnej
wentylacji urządzenia.
3.4. Instalacja DNA Pointer® System
a) Ustaw DNAPointer® System jednostkę główną na równej powierzchni stołu lub blatu
roboczego.
b) Umieść w pobliżu jednostki główne komputer PC Notebook.
c) Podłącz przewód zasilający do gniazda zasilania znajdującego się na tylnej ściance
jednostki głównej DNAPointer® System. Drugi koniec kabla zasilającego podłącz do
sieci zasilającej.
d) Połącz kablem komunikacyjnym jednostkę główną DNAPointer® System (dokręć
nakrętkę przy nasadzie wtyczki portu komunikacyjnego) z komputerem PC
umieszczając wtyczkę USB w dowolnym porcie USB komputera.
e) Podłącz komputer PC za pomocą dołączonego zasilacza do sieci zasilającej.
16
Rysunek 6.
Widok z tyłu jednostki głównej DNA Pointer® System.
f) Włącz komputer PC i poczekaj, aż system operacyjny będzie gotowy do pracy.
g) Uruchom poprzez dwukrotne kliknięcie program Instacal (ikona na pulpicie
komputera) lub START/Wszystkie programy/ Measurement Computing/Instacal
(Rysunek 7).
Rysunek 7.
Ikona programu instalacyjnego Instacal.
h) Po prawidłowym podłączeniu jednostki głównej DNA Pointer® System do komputera
i uruchomieniu oprogramowania na ekranie komputera powinien pokazać się
komunikat jak na rysunku 8.
Rysunek 8.
Okno zgłoszenia jednostki głównej DNAPointer® System
i) Kliknij przycisk OK. Następnie prawym przyciskiem muszy naciśnij na zgłoszonej
karcie i wybierz Configure (Rysunek 9).
17
Rysunek 9.
Wybór okna konfiguracji.
j) Z rozwijanej listy No. Of Channels: wybierz opcję 8 Single Ended, kliknij OK i zamknij
program Instacal (Rysunek 10).
Rysunek 10.
Wybór trybu pracy „8 Sinle Ended”.
k) Uruchom oprogramowanie DNAPointer® System software.
18
UWAGA!
W celu zapewnienia prawidłowej pracy systemu zaleca się każdorazowo po
każdym uruchomieniu komputera lub po rozłączeniu kabla komunikacyjnego
ponowna instalację systemu za pomocą programu Instacal. Jeśli po
uruchomieniu programu Instacal karta komunikacyjna będzie widoczna
należy postępować wg kolejnych poniższych punktów instrukcji
l) Usuń kartę komunikacyjną poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy na nazwie
karty i wybór polecenia Remove Board i zatwierdzenie OK (Rysunek 11). Następnie kliknąć
przycisk Refresh Boards (Rysunek 12) i postępować wg punktów od 8 do 11.
Rysunek 11.
Usuwanie karty komunikacyjnej.
19
Rysunek 12.
Refresh Boards.
3.5. Instalacja oprogramowania DNA Pointer® System
Oprogramowanie DNA Pointer® System software jest zainstalowane w komputerze
sterującym PC.
W przypadku potrzeby ponownej instalacji oprogramowania prosimy o kontakt z działem
technicznym firmy Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. Dane
teleadresowe zamieszczone są w rozdziale 12.
3.6. Wymagania sprzętowe.
Komputer PC:
1. Procesor 600 MHz lub szybszy (Intel, Intel Celeron, AMD)
2. Windows 2000, Windows XP, Windows Vista, Windows 7.
3. 256 MB pamięci RAM lub więcej.
4. 200 MB wolnego miejsca na dysku twardym.
5. Dodatek DotNetFX v.4
20
Rozdział 4. Metoda MSSCP
4.1. Zalecenia dla metody MSSCP
Multitemperature Single Stand Conformation Polymorphism (MSSCP) jest prostą i
niezawodną techniką elektroforezy, którą można wykorzystać do wykrywania mutacji
punktowych w kwasach nukleinowych. Najlepsze wyniki uzyskuje się analizując fragmenty
PCR o długości od 150 do 350 par zasad.
MSSCP wykorzystuje własności fizyczne kwasów nukleinowych. Pojedyncze nici kwasów
nukleinowych przyjmują charakterystyczną strukturę przestrzenną w warunkach natywnych.
Struktura ta zależy od sekwencji nukleotydów fragmentu DNA. Pojedynczy fragment nici
DNA zawierających mutację punktową przyjmie inną strukturę od typu dzikiego. Różniące się
od siebie struktury można rozdzielić za pomocą elektroforezy wykorzystując ich różną
mobilność elektroforetyczną. Technika MSSCP jest udoskonaleniem metody SSCP (Single
Strand Conformation Polymorphism), powszechnie stosowanej techniki wykrywania mutacji.
Głównymi parametrami fizycznymi wpływającymi na konformery ssDNA i na ich strukturę
przestrzenną są pH, siła jonowa i temperatura.
W wielotemperaturowym SSCP (MSSCP) separacja elektroforetyczna odbywa się w krokowo
zmienianej temperaturze. Zmiany temperatury w trakcie elektroforezy powodują zmianę
konformacji przestrzennej fragmentów ssDNA. Działanie takie zwiększa
prawdopodobieństwo, że cząsteczki ssDNA różniące się nawet jednym nukleotydem przyjmą
różne kształty w kolejnym kroku temperatury analizy MSSCP, a zatem zmienią swoją
mobilność elektroforetyczną w stosunku do poprzedniego kroku temperaturowego i ulegną
rozdzieleniu. Efekcie, wykrywalność mutacji techniką MSSCP w porównaniu do SSCP jest
znacznie wyższa. Metoda MSSCP daje wiarygodne wyniki we wszystkich eksperymentach,
gdzie znaczna liczba próbek badana jest pod kątem mutacji znanych i nieznanych. MSSCP
może być z powodzeniem stosowane w projektach exon re-sequencing w celu ograniczenia
próbek przeznaczonych do ponownego sekwencjonowania.
Zaleca się aby podczas analizy MSSCP ilość nanoszonego DNA wynosiła 100-500 ng.
21
Referencje:
1. R. Kaczanowski, L. Trzeciak, K. Kucharczyk, Electrophoresis 2001, 22, 3539-3545.
2. Orita, M., Iwahana, H., Kanazawa, H., Hayashi K., Sekiya, T., Mat. Natl. Acad. Sci. USA
1989, 86, 2766-2770.
3. Hongyo, T., Buzard, GS, Calvert, RJ, Weghorst, CM, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 36373642.
4. Murakami Y. Hayashi K., Sekiya, T., Cancer Res. 1991, 51, 3356-3361.
5. Sheffield, VC, Beck, JS, Kwitek, AE, Sandstrom, DW, Stone, EM, Genomics 1993, 16, 325332.
4.2. Protokół MSSCP
Protokół MSSCP zawiera sześć kroków, które są wymagane do poprawnego wykonywania
elektroforezy metodą MSSCP:
1. Amplifikacja interesującego obszaru za pomocą reakcji PCR.
2. Przygotowanie DNAPointer® System do elektroforezy
2.1. Wylanie żelu.
2.2. Zaprogramowanie profilu elektroforezy MSSCP.
2.3. Przeprowadzenie preelektroforezy.
3. Denaturacja próbek.
4. Naniesienie próbek na żel i przeprowadzenie elektroforezy.
5. Barwienie żelu.
6. Interpretacji wyników.
Wszystkie powyższe czynności są opisane w kolejnych rozdziałach instrukcji.
4.3.
Amplifikacja DNA w reakcji PCR
Długość fragmentów DNA nie powinna przekraczać 150-350 par zasad. W przypadku
dłuższych fragmentów obserwujemy stały spadek efektywności wykrywania mutacji przy
użyciu metody MSSCP.
Produkty PCR wykorzystywane do analizy powinny być specyficzne. Niespecyficzne produkty
PCR tworzą dodatkowe prążki w profilu MSSCP co znacznie utrudnia interpretację wyników.
22
Rozdział 5. Przygotowanie systemu do elektroforezy
DNA Pointer® System to otwarta platforma oparta na elektroforetycznej separacji
DNA/RNA. Skład żelu elektroforetycznego uzależniony jest od zastosowanej metody.
Zalecamy stosowanie DNA Pointer® System Multipol do równoległej polimeryzacji do ośmiu
żeli, które mogą być przechowywane przez 1 do 2 tygodni w temperaturze +4°C.
Wykorzystanie modułu Multipol gwarantuje pełną polimeryzację żelu PA przed elektroforezą
oraz ich jednorodność. Przygotowanie żeli w DNA Pointer® System Multipol jest wygodne i
szybkie.
5.1. Wylewanie żeli poliakrylamidowych dla elektroforezy MSSCP
Procedura postępowania:
1. Przygotuj odpowiednią liczbę czystych, suchych zestawów szybowych – szyby należy
umyć wodą destylowaną i wysuszyć na powietrzu. Zaleca się przetrzeć płytki szklane 10%
roztworem EtOH przed zalaniem żelu.
2. Przygotuj roztwór akrylamidu zgodnie z dołączoną do zestawu instrukcją.
3. Odkręć śruby dociskające i zdejmij przednią ściankę w DNA Pointer® System Multipol.
4. Umieść pojemnik na płaskiej powierzchni (Rysunek 13).
Rysunek 13.
Pudełko Multipol umieszczone na płaskiej powierzchni.
5. Umieścić wewnątrz zestawy szybowe składające się z szyb, grzebieni i przekładek i
oddziel kolejne zestawy foliowymi arkuszami dystansowymi w następującej kolejności
(Rysunek 14):
23
a) Arkusz folii
b) Zestaw szybowy z grzebieniem i przekładkami
c) Arkusz folii
d) Kolejny zestaw szybowy z grzebieniem i przekładkami Itd.
Rysunek 14.
Złożenie zestawu DNA Pointer® System Multipol.
6. Po umieszczeniu ostatniego zestawu szybowego należy umieścić ostatni arkusz folii,
nałożyć ściankę przednią i dokręcić ją za pomocą śrub dociskowych (Rysunek 15).
Rysunek 15.
Montaż ścianki
dociskowej.
7. Ustaw DNA
Pointer® System
24
Multipol w pozycji pionowej, umieść pokrywę na górnej powierzchni pojemnika i dokręć ją
śrubami (Rysunek 16).
Rysunek 16.
Montaż ścianki górnej DNA Pointer® System Multipol.
6. Podłącz rurkę ze strzykawką do króćca i napełnij pojemnik roztworem akrylamidu do
poziomu wyznaczonego przez krawędź górną włożonych szyb (Rysunek 17).
Rysunek 17.
Podłączenie rurki do króćca.
25
8. Po wstępnej polimeryzacji żelu (około 1 h) odłącz rurkę i usuń z niej pozostałości
akrylamidu. Na powierzchnię polimeryzującycego akrylamidu nalej około 5 ml buforu TBE
0,5x i zamontuj pokrywę górną. Przechowuj żele przez okres od 1 do 2 tygodni.
5.2. Instalacja żelu w komorze elektroforetycznej
1. Wyjąć jeden zestaw szybowy ze spolimeryzowanym żelem i przepłucz zewnętrzne
powierzchnie szklane wodą dejonizowaną w celu pozbycia się pozostałości akrylamidu.
Należy zwrócić uwagę czy do szyby nie jest przyklejony bezbarwny arkusz folii.
2. Delikatnie wyjmij grzebień, upewniając się, że studzienki nie są uszkodzone. (Grzebień
można również usunąć po zalaniu zbiorników buforem)
3. Otwórz pokrywę jednostki głównej DNA Pointer® System.
4. Przesuń przedni panel dociskowy zwalniając zatrzaski, przekręcając je ruchem skrętnym
do środka aparatu i odciągając do siebie panel (Rysunek 18).
Rysunek 18.
Otwieranie przedniego panelu komory elektroforetycznej.
5. Umieść zestaw szybowy z żelem pomiędzy panelem dociskowym i płytą termiczną w taki
sposób by wycięcie w jednej z szyb zwrócone było na zewnątrz aparatu.
6. Dociśnij przedni panel dociskowy, przekręć zatrzaski ruchem skrętnym na zewnątrz a
następnie je zatrzaśnij.
26
5.3. Napełnienie zbiorników buforowych
W celu przygotowania buforu elektroforetycznego patrz załącznik. Na jedną elektroforezę
zużywany jest bufor elektroforetyczny w objętości około 400 ml. Należy zwrócić uwagę by
napełniając zbiorniki buforowe nie przekroczyć poziomu maksymalnego zaznaczonego na
zbiorniku wyżłobioną linią.
5.4.
Czyszczenie studzienek przed elektroforezą
Przed elektroforezą należy pozbyć się ze studzienek ewentualnych pozostałości żelu PA. W
tym celu należy przemyć każdą studzienkę silnym strumieniem roztworu buforu TBE
używając 1 ml pipety lub strzykawki.
5.5.
Programowanie profilu elektroforezy
Szczegółowy opis zaprogramowania profilu elektroforezy w DNA Pointer® System
przedstawiony jest w załączniku. Prosimy o zapoznanie się przed uruchomieniem
elektroforezy.
5.6.
Preelektroforeza
Preelektroforeza pozwala na stabilizację żelu przed elektroforezą. Podczas preelektroforezy,
która trwa około 100 Vxh w temperaturze 20°C, 30 W usuwany jest nadmiar jonów z żelu.
Pozwala to na wykonywanie bardziej powtarzalnych rozdziałów kw. nukleinowych.
5.7.
Przygotowanie próbek
Próbki powinny być wymieszane z buforem denaturującym w stosunku 1:2 lub wyższym. Do
analizy powinno wyć wykorzystywane od 100 do 500 ng DNA dla każdej próbki.
a) Wymieszanie próbki z buforem denaturującym
b) Denaturacja termiczna w temperaturze 95°C przez 5 min
c) Przełożenie próbek na lód I dodanie 1/6 objętości buforu denaturującego B
d) Nakładanie próbek na żel
27
UWAGA!
Dla grzebienia o ilości zębów 44 maksymalna objętość próbki (z buforami) powinna wynosić
10 uL.
Dla grzebienia o ilości zębów 33 maksymalna objętość próbki (z buforami) powinna wynosić
14 uL.
5.8.
Elektroforeza
Proces elektroforezy w DNA Pointer® System po nałożeniu próbek i uruchomieniu procesu
nie wymaga uwagi. Rozdział odbywa się automatycznie i trwa około 1,5-2 godzin w
zależności od długości fragmentów DNA, gęstości i rodzaju użytego poliakrylamidu i
parametrów elektrycznych elektroforezy.
5.9.
Usunięcie żelu
Po zakończeniu elektroforezy zasilacz przełącza się w tryb Gel Saver. Jest to końcowy etap, w
którym utrzymywane są warunki 30V i +4°C w celu zapobieżenia dyfuzji biernej próbek w
trakcie oczekiwania na działanie użytkownika. Po przejściu w tryb Gel Saver na ekranie
pojawia się odpowiedni komunikat.
a) Wyłącz tryb Gel Saver odpowiednim przyciskiem
b) Wybierz opcję New Electrophoresis jeśli zamierzasz prowadzić kolejną
elektroforezę lub zakończ działanie programu.
c) Wyłącz DNA Pointer® System poprzez wyłączenie wyłącznika głównego
d) Otwórz pokrywę
e) Usuń bufor elektroforetyczny poprzez otwarcie zaworów i zlanie buforu
wężykami.
f) Zamknij zawory
g) Oczyść zbiorniki buforowe wodą destylowaną zlewając wodę tak jak bufor
elektroforetyczny.
h) Otwórz przedni panel dociskowy komory.
i) Wyjmij zestaw szybowy z żelem w środku.
j) Pozostaw pokrywę aparatu DNA Pointer® System otwartą w celu osuszenia.
28
k) Delikatnie wydobądź żel rozkładając szyby. Umieścić żel w roztworze 10%
EtOH i rozpocznij procedurę barwienia (patrz załącznik dotyczący barwienia srebrem oraz
suszenia żeli).
l) Barwienie za pomocą Silver Stain Kit.
Uwaga! Aby utrzymać wysoką jakość barwienie srebrem nie wolno dotykać powierzchni
żelu.
m)
Suszenie żelu w zestawie DNA Pointer® System DryOut.
n)
Skanowanie i analiza żelu.
29
Rozdział 6. Analiza żelu
W celu archiwizacji lub dalszej obróbki obrazu żelu należy żel zarchiwizować przy użyciu
dedykowanego systemu archiwizacji żeli KTE Video (nr kat. 134-190). Dalsza obróbkę obrazu
żelu można przeprowadzić za pomocą oprogramowania GelScan (nr kat. 190-100)
Rysunek 19.
Analiza MSSCP mutacji punktowych w eksonie 1 genu ludzkiego KCNE1. Produkty PCR po
denaturacji zostały rozdzielone w 9% żelu poliakrylamidowym T w temperaturze 35-15-5°C.
Po elektroforezie żel barwiono Silver Stain Kit (nr kat. 200-101), suszono i skanowano.
30
Rozdział 7. Utrzymanie
7.1. Czyszczenie
Wszystkie części plastikowe DNA Pointer® System wykonane są z PMMA. Należy je czyścić
wodą z łagodnym detergentem. Nie należy używać rozpuszczalników organicznych (etanol,
kwasy) do czyszczenia części plastikowych. Ich grozi trwałym zniszczeniem części
plastikowych.
Po każdej elektroforezie należy przepłukać górny i dolny zbiornik buforowy wodą
destylowaną w celu usunięcia resztek żelu PA oraz buforu elektroforetycznego. Po płukaniu
należy pozostawić aparat z otwartą pokrywą przednią do wyschnięcia.
W okresach 6-miesięcznych należy kontrolować poziom płynu chłodniczego. W razie
potrzeby należy go uzupełnić wodą destylowaną z dodatkiem glikolu etylenowego.
7.2. Awarie systemu
Żadna część DNA Pointer® System nie może być serwisowana przez osoby nie przeszkolone.
W razie konieczności urządzenie powinno zostać przekazane do autoryzowanego serwisu lub
do producenta.
31
Rozdział 8. Wsparcie techniczne
8.1. Dane teleadresowe - kontakty
Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o.o.
ul. Pawińskiego 5A/D
02-106 Warszawa, Polska
Tel.: +48 22 668 71 64
Tel.: +48 22 668 71 47
Fax: +48 22 668 71 64
Email: [email protected]
32
Rozdział 9. Sprzęt i akcesoria
DNA Pointer® System Akcesoria
Tabela 4. Akcesoria
Numer
katalogowy
Opis
105-161
Multipol DNA Pointer – zestaw do wylewania kilku żeli jednocześnie
105-151
Szyby DNAPointer® (szkło float)
105-171
Statyw do suszenia szyb
105-181
Pojemnik szklany przezroczysty z pokrywą
105-111
Przekładki teflonowe gr. 0,5 mm
105-112
Przekładki teflonowe gr. 1,0 mm
105-121
Grzebień teflonowy 0,5 mm/24 studzienek
105-122
Grzebień teflonowy 0,5 mm/33 studzienki
105-123
105-124
Grzebień teflonowy 1,0 mm/24 studzienek
105-125
105-126
152-102
Kable połączeniowe
105-191
Dryout Zestaw do suszenia żeli
33
Rozdział 10. Procedury dodatkowe
10.1. Ekstrakcja ssDNA z żelu.
Podczas elektroforezy MSSCP konformery ssDNA są rozdzielane i mogą być ekstrahowane z
żelu a następnie używane jako matryca do sekwencjonowania metodą Sangera.
10.2. MSSCP Starter Kit
MSSCP Starter Kit jest dedykowanym zestawem odczynników chemicznych przeznaczonym
do genotypowania metodami MSSCP i SSCP. Zoptymalizowany zestaw zawiera wszystkie
materiały niezbędne do przygotowania i uruchomienia metod MSSCP i SSCP systemie DNA
Pointer® System. Zestaw zawiera roztwór akrylamidu, katalizatory polimeryzacji, bufor
elektroforetyczny TBE oraz bufory denaturujące do przygotowania próbki. Odczynniki
zapewniają wysoki współczynnik wykrywania SNP, wysoką jakość rozdziałów i ich
powtarzalność.
10.3. Przygotowanie roztworu akrylamidu do wylania żelu
Czułość MSSCP i SSCP jest uzależniona od typu żelu stosowanego do elektroforezy.
Zazwyczaj używane są żele poliakrylamidowe o stężeniu 6-10% akrylamidu i stężeniu
bisakrylamidu 1,5-5%. Glicerol w stężeniu 3-5% jest powszechnie stosowany jako dodatek do
żelu i zazwyczaj poprawia czułość wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu.
Żele do techniki MSSCP przygotowywane są w buforze TBE. Zalecamy stosowanie żeli
przygotowanych z użyciem 0,75x TBE oraz buforów elektroforetycznych o stężeniu 0,5x TBE.
Zalecamy przygotowywanie żeli za pomocą zestawu DNA Pointer® System Multipol.
UWAGA! Żel poliakrylamidowy powinien być przygotowany co najmniej 18 godzin przed
elektroforezą. Rekomendujemy przygotowanie 4 lub 8 żeli w zestawie DNAPointer® System
Multipol. Zabezpieczone żele mogą być przechowywane w temperaturze+4°C przez 1 do 2
tygodni. Aby zapobiec wysuszeniu żelu należy wlać około 5 ml 1x TBE lub 0,75x TBE na górę
każdej żelu i owinąć go szczelnie folią lub pozostawić w szczelnie zamkniętym pudełku DNA
Pointer® System Multipol.
Stężenie żelu zależy od wielkości badanego fragmentu PCR. Stężenie żeli stosowanych w
34
MSSCP wynosi od 6% dla fragmentów PCR dłuższych niż 300 bp do 10% dla fragmentów
krótszych niż 150 bp.
Tabela 5. Przygotowanie 10%T, 3,3%C, 5% glicerolu w 0,75x TBE dla DNA Pointer® System
Multipol.
4 żele
8 żeli
12 ml
24 ml
53,3 ml
106,6 ml
APS 10% (w/v)
1,12 ml
2,24 ml
H2O
93,42 ml
186,84 ml
160 l
320 µl
10x TBE buffer
Roztwór akrylamidu
(30% T, 3,3 %C 15%
glycerol)
TEMED
10.4. Przygotowanie buforu elektroforetycznego TBE
Zalecamy stosowanie 0,5x TBE jako buforu do elektroforezy.
Aby przygotować 400 ml 0,5x TBE należy zmieszać 20 ml 10x TBE z 380 ml dejonizowanej
wody (miliQ 18,4 MOhm)
10.5. Zestaw Silver Stain Kit
Zestaw do barwienia Silver Stain Kit to zestaw odczynników chemicznych do barwienia żeli
poliakrylamidowych MSSCP. Zoptymalizowany zestaw do barwienia srebrem zapewnia
powtarzalne nieradioaktywne wykrywanie kwasów nukleinowych lub białek w żelu
poliakrylamidowym w sposób szybki, wygodny i wydajny. Zestaw wykrywa już 10 pg DNA z
minimalnym tłem. Barwienie trwa ok. 40 min.
10.6. Wizualizacja DNA w MSSCP z Silver Stain Kit
Silver Stain Kit zawiera:
1. Utrwalacz - 125 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Roztwór srebra - 15 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
3. Wywoływacz A - 1000 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
35
4. Wywoływacz B - 3 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
UWAGA!
Pojemniki przeznaczone do barwienia srebrem powinny być dokładnie oczyszczone. Do
barwienia zalecamy stosowanie tylko dejonizowanej wody 18,4 mOhm lub wody
destylowanej.
Procedura barwienia:
Czas [min]
(dla żelu gr. 0,5 mm)
Denaturacja
3-5 min
10% EtOH - 110 ml
Usunięcie roztworu za pomocą pompki
Utrwalacz
2 min, powtórzyć 2 razy
8 ml + 212 ml of H2O
Srebrzenie
1 ml roztworu srebra dodać do 110 ml wody
10 min
Płukanie (powtórzyć 3 razy)
5 sekund
H2O, 110 ml
Wywołanie
60 ml Wywoływacz A dodać do 240 ml wody,
dodać 132 l Wywoływacza B bezpośrednio
przed użyciem
Pierwszy raz 3 min lub do
zaciemnienia roztworu, drugi
raz i trzeci raz do pojawienia
się prążków
Optymalna temperatura wody to 18 °C
Zatrzymać reakcję kiedy prążki są wyraźne I
zadowalające poprzez dodanie 100 ml 10%
10 min
kwasu octowego
Przemycie w wodzie (3 razy)
Pierwszy raz – 15 sekund
36
Drugi I trzeci raz po 10 min
Uwagi ogólne:
1. Wszystkie płukania są wykonywane ze 110 ml roztworu.
2. Należy unikać dotykania żelu nawet przez rękawice.
3. Wytrzymałość mechaniczna żelu jest obniżona podczas barwienia, należy traktować go
delikatnie.
4.Najlepszą ostrość zostaje osiągnięta po płukaniu w kwasie octowym lub po wysuszeniu.
Uwagi
1. Wszystkie czasy inkubacji wizualizacji prążków są zoptymalizowane dla 0,5 mm grubości
żelu. Zwiększenie grubości żelu o 100% powinno wydłużyć czas barwienia o 100%.
2. Roztwór srebra powinien być przygotowany bezpośrednio przed użyciem.
3. Aby zwiększyć kontrast barwienia i zmniejszyć poziom tła należy zmienić roztwór
każdorazowo kiedy pojawia się ciemny osad.
4. Należy zatrzymać reakcję, gdy osiągnięta została odpowiednia intensywność prążków
(zwykle 5-10 min).
Literatura:
1. Wray, W., T. Boulikas, V.P. Wray i R. Hancock. 1981 roku.
Barwienie srebrem białka w żelu poliakrylamidowym. Anal. Biochem 118: 197-203.
10.7. Suszenie żelu
W zestawie DryOut żele suszone są w dwóch arkuszy folii w temperaturze pokojowej. Po
wysuszeniu żele mogą być przechowywane bez utraty jakości przez długi czas.
Zestaw DryOut obejmuje:
1. ramki 2 szt.
2. stolik
3. Folię do suszenia 35 szt.
4. Zaciski 8 szt.
Procedura:
37
1. Arkusz folii zwilżyć wodą.
3. Na stoliku umieścić jedną z ramek.
4. Umieścić połowę nasączonej folii na stoliku, tak aby folia obejmowała całą ramkę.
5. Umieścić żel na folii a następnie zalać go niewielką ilością wody.
6. Przykryć żel drugą połową folii upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza
pomiędzy obiema warstwami folii.
7. Nałożyć na folię z żelem drugą ramkę, a następnie spiąć ramki zaciskami (po 2 zaciski po
każdej stronie).
8. Umieścić statywy w pionie. Pozwolić na wypływ wody z pomiędzy plastrów folii.
9. Pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc (Rysunek 20).
Rysunek 20.
Suszenie żelu.
Ważne: Przed suszeniem żelu należy przepłukać żel w wodzie w celu usunięcia kwasu
octowego, który mógłby spowodować pękanie żelu podczas suszenia.
Suszone żele mogą być przechowywane w dzienniku laboratorium przez długi czas bez
utraty jakości.
Żele grubsze niż 1,5 mm lub z koncentracją poliakrylamidu wyższą niż 10% powinna być
zanurzona przed suszeniem przez 10-15 min w roztworze 50-65% MeOH (v/v) + 5% glicerol,
aby zapobiec ich pękaniu podczas suszenia.
38
Rozdział 11. Oprogramowania DNAPointer
11.1. Uruchamianie aplikacji
Rysunek 21. Ikona programu
Uruchomienie aplikacji następuje poprzez dwukrotne kliknięcie na ikonę o nazwie
dnapointer.exe znajdującą się na pulpicie komputera sterującego (Rysunek 21)
Po uruchomieniu zostanie przez 3 s wyświetlony ekran powitalny (Rysunek 22). Następnie
program przejdzie do okna logowania.
Rysunek 22. Ekran powitalny
11.2. Okno logowania
Okno logowania pozwala użytkownikowi na zalogowanie się do programu po uprzednim
wyborze własnego konta z rozwijanej listy. Przyciśnięcie przycisku Login zatwierdza wybór i
przenosi użytkownika do okna wyboru profilu. Każde konto użytkownika przechowuje w
swojej własnej przestrzeni użytkownika dane dotyczące utworzonych profili elektroforezy
(Rysunek 23).
Formularz New User: pozwala na dodanie nowego użytkownika. Utworzenie nowego konta
użytkownika zatwierdzane jest przyciskiem Add user.
Przycisk Delete user zatwierdza polecenie usunięcia konta użytkownika wybranego na liście
User. Przycisk Exit program powoduje wyjście z programu.
39
Rysunek 23. Okno logowania
11.3. Okno wyboru trybu pracy
Okno wyboru trybu pracy pozwala na wybór jednej z dwóch opcji:
1. New - tworzenie nowego profilu elektroforezy
2. Existing - korzystanie z wcześniej utworzonego profilu elektroforezy
Po wybraniu jednej z dwóch opcji program przenosi użytkownika do kolejnego okna.
Przycisk Back przenosi użytkownika do poprzedniego okna.
Przycisk Sernice Panel zarezerwowany jest dla serwisu. Okno serwisowe zabezpieczone jest
hasłem i użytkownik nie ma do niego dostępu.
Rysunek 24. Okno wyboru trybu pracy
11.4. Okno wyboru profilu elektroforezy
Okno wybory profilu elektroforezy pozwala użytkownikowi na wybór jednej z czterech opcji
(Rysunek 25):
1. One Temperature - tworzenie profilu elektroforezy SSCP
2. Multitemperature - tworzenie profilu elektroforezy MSSCP
3. Gradient - tworzenie profilu elektroforezy o liniowo zmiennej temperaturze w
czasie
40
4. Custom - tworzenie profilu elektroforezy łączącej w jednym procesie cechy
elektroforezy SSCP lub MSSCP z Gradientową
Po wybraniu jednej z czterech opcji program przenosi użytkownika do formularza
projektowania profilu. Przycisk Back przenosi użytkownika do poprzedniego okna.
Okno wyboru profilu elektroforezy dla obu opcji z punktu B.5 jest takie samo.
Rysunek 25. Okno wyboru profilu elektroforezy
11.5. Profil - One Temperature
Okno projektowania profilu elektroforezy One Temperature pozwala na utworzenie profilu
elektroforezy SSCP.
Sekcja Preelectrophoresis służy do wprowadzenia parametrów preelektroforezy.
Parametry Preelektroforezy:
1. Power [W] - moc preelektroforezy
2. Gel Temp [C] - temperatura żelu
3. Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach
Sekcja Concetration of samples służy do wprowadzenia parametrów fazy zagęszczania
próbek.
Parametry fazy zagęszczania próbek:
1. Voltage [V] - napięcie
3. Duration [min] - czas wyrażony w minutach
Sekcja Electrohoresis phase #1 służy do wprowadzenia parametrów fazy elektroforezy
właściwej.
Parametry fazy właściwej elektroforezy:
41
Sekcja Gel Saver służy do wprowadzenia parametrów fazy Gel Saver
Parametry fazy gel saver:
3. Duration [min] - nieskończoność
Należy wprowadzić wszystkie parametry i zachować profil przyciskając przycisk Save profile
(Rysunek 26)
Rysunek 26. Okno projektowania profilu One Temperature (SSCP)
11.6. Profil - Multitemperature
Okno projektowania profilu elektroforezy Multitemperature pozwala na utworzenie profilu
elektroforezy MSSCP.
próbek.
2. Gel Temp[C] - temperatura żelu
3. Duration[min] - czas wyrażony w minutach
42
właściwej. Po wprowadzeniu parametrów i naciśnięciu przycisku Add Step 2 sekcja zmieni
nazwę na Electrohoresis phase #2 umożliwiając wprowadzenie parametrów dla drugiego
kroku elektroforezy MSSCP, a przycisk zmieni nazwę na Add Step 2. Możliwe jest
zaprogramowanie do 9 kroków elektroforezy MSSCP.
3. Duration [Vxh] czas wyrażony w woltogodzinach
(Rysunek 27)
Rysunek 27. Okno projektowania profilu Multitemperature (MSSCP)
11.7. Profil – Gradient
Okno projektowania profilu elektroforezy Gradient pozwala na utworzenie profilu
elektroforezy o gradientowo zmiennej temperaturze w czasie.
43
próbek.
właściwej.
1. Duration[min] - czas wyrażony w minutach
2. Start Temp [C] - temperatura początkowa
3. End Temp [C] - temperatura końcowa
5. Gradient [C/min] - gradient
2. Gel Temp[C] - temperatura żelu
3. Duration[min] - nieskończoność
(Rysunek 28).
44
Rysunek 28. Okno projektowania profilu Gradient
11.8. Profil – Custom
Okno projektowania profilu elektroforezy Custom pozwala na utworzenie profilu
elektroforezy o cechach elektroforezy zarówno gradientowej jak i stałej lub schodkowej
(MSSCP lub SSCP).
2. Gel Temp [C] temperatura żelu
próbek.
właściwej. Wprowadzenie odpowiednich parametrów pozwala na zaprojektowanie etapu
elektroforezy o charakterystyce temperatury gradientowej jak i stałej. Przycisk Add Step
pozwala na dodanie kolejnego kroku jak to miało miejsce w przypadku tworzenia profilu
elektroforezy Multitemperature
2. Start Temp [C] - temperatura początkowa
3. End Temp [C] - temperatura końcowa
5. Gradient [C/min] - gradient
Należy wprowadzić wszystkie parametry i zachować profil przyciskając przycisk Save profile.
11.9. Zapisywanie profilu elektroforezy
Po utworzeniu profilu elektroforezy należy ją zapisać w pamięci komputera za pomocą
formularza. Należy nadać profilowi specyficzną nazwę i nacisnąć przycisk Save (Rysunek 29).
45
Rysunek 29. Okno projektowania profilu Gradient
11.10. Preelektroforeza
Po zapisaniu profilu pojawia się okno przygotowujące do Preelektroforeza. Należy wypełnić
kolejne polecenia:
1. Zainstalować żel w komorze elektroforetycznej
2. Wlać do zbiorników bufor elektroforetyczny
3. Zamknąć pokrywę aparatu
4. Włączyć zasilanie aparatu włącznikiem na tylnej ściance jednostki głównej
Rysunek 30. Okno uruchomienia elektroforezy
46
Rysunek 31. Okno główne programu
W oknie głównym programu wyświetlanych jest szereg informacji przydatnych
użytkownikowi:
1. Preelectrophoresis time left – czas pozostały do końca Preelektroforeza czyli do
momentu w którym możliwe będzie naniesienie próbek a żel.
2. Gel Temp[C] – temperatura próbek w żelu.
3. Linie wykresu:
a. Cienkie linie wykresu oznaczają zaprojektowany teoretyczny przebieg
zmiennych w czasie parametrów
i. Linia czarna- zaprojektowany wykres temperatury
ii. Linia czerwona – zaprojektowany wykres mocy elektroforezy
iii. Linia niebieska - zaprojektowany wykres napięcia elektroforezy
b. Grube linie wykresu oznaczają rzeczywisty przebieg parametrów w czasie
i. Linia czarna- rzeczywisty wykres temperatury
ii. Linia czerwona – rzeczywisty wykres mocy elektroforezy
iii. Linia niebieska - rzeczywisty wykres napięcia elektroforezy
Widoczny w oknie głównym przycisk Pause jest aktywny tylko w momentach kiedy
przerwanie elektroforezy jest możliwe. Pozostaje nieaktywny kiedy czynności system
wykonać nie może.
Po prawej stronie przy krawędzi znajdują się dwie skale. Czerwona skala dotyczy mocy
elektroforezy. Niebieska skala dotyczy napięcia elektroforezy.
Po lewej stronie przy krawędzi znajduje się jedna czarna skala. Można za jej pomocą
odczytać wartość temperatury w danej chwili.
47
Kiedy Preelektroforeza dobiegnie końca wyświetlany jest odpowiedni komunikat (Rysunek
32).
Rysunek 32. Okno informujące o zakończeniu Preelektroforeza
Po nałożeniu próbek cały proces przebiegnie automatycznie i nie będzie wymagał uwagi
użytkownika.
Należy zastosować się do poleceń zawartych w komunikacie:
1. Otworzyć pokrywę aparatu
2. Nałożyć próbki na żel
3. Zamknąć pokrywę
4. Uruchomić elektroforezę
11.11. Elektroforeza
Rysunek 33. Faza zagęszczania próbek
48
Rysunek 34. Faza Elektroforezy #1 - 35°C
49
Rysunek 37. Zakończanie elektroforezy
Rysunek 38. Gel Saver
11.12. Wyjście z programu
Możliwe jest zatrzymanie elektroforezy w trakcie jej trwania. Należy to zrobić pauzując
proces przyciskiem Pause ( nie zawsze jest aktywny) a następnie wybierając z belki górnej
poleceń polecenie Quit.
50

DNAPointer® System INSTRUKCJA OBSŁUGI BioVectis

Transkrypt

Podobne dokumenty