Pdf version

ARTYKUŁY ORYGINALNE
Allel PlA1/A2 β3 integryny wiąże się ze zwiększoną
generacją trombiny u pacjentów z chorobą
wieńcową leczonych kwasem acetylosalicylowym
Wpływ leczenia statynami
The thrombin generation is associated with the PlA1/A2 β3 integrin polymorphism
in aspirin-treated patients with coronary artery disease: a role of statins
Ewa Stępień1, Konstanty Szułdrzyński2, Agnieszka Branicka1, Elżbieta Stankiewicz1, Agnieszka Pazdan1,
Łukasz Zieliński1, Maria Bożek1, Marek Tomala3, Bartłomiej Guzik3, Jacek Godlewski3, Tomasz Pawelec3,
Krzysztof Żmudka3
1
Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II, Kraków
2
II Katedra Chorób Wewnętrznych Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
3
Zakład Hemodynamiki i Angiokardiografii, Instytut Kardiologii, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
Streszczenie: Wprowadzenie. Polimorfizm PlA1/A2 genu β3 integryny występuje u 20–30% populacji
europejskiej. Obecność allelu PlA2 objawia się opornością zdrowych nosicieli na przeciwkrzepliwe działanie
aspiryny. Cele. Zbadano, czy u chorych z miażdżycą tętnic wieńcowych, leczonych przewlekle kwasem
acetylosalicylowym (ASA) w małych dawkach, polimorfizm PlA1/A2 wiąże się ze zwiększoną aktywacją
osoczowego układu krzepnięcia i płytek krwi w miejscu uszkodzenia mikrokrążenia oraz czy leczenie statynami
wpływa na te procesy. Pacjenci i metody. U 31 pacjentów (25 mężczyzn i 6 kobiet) w wieku 47–76 lat oceniono
w nadsączu krwi zbieranej z brzegów nacięć skóry co 60 s stężenia kompleksu trombina-antytrombina (TAT) oraz
rozpuszczalnej postaci liganda białka CD40 (sCD40L). Wyniki. W koronarografii w co najmniej jednej tętnicy nasierdziowej stwierdzono zwężenie ≥50%. Badania genetyczne wykryły 18 homozygot PlA1 i 13 nosicieli PlA2.
Obie podgrupy nie różniły się pod względem wieku, wybranych parametrów biochemicznych i klinicznych ani sposobu leczenia. U homozygot PlA1 stwierdzono większe stężenie fibrynogenu (4,2 [przedział międzykwartylowy: 2,39] g/l vs 2,5 [0,73] g/l, p <0,05). Maksymalne stężenie TAT zaobserwowano w 6 minucie po
uszkodzeniu naczyń – było ono większe u nosicieli PlA2 (p = 0,01). Stężenie sCD40L nie różniło się znamiennie
w zależności od polimorfizmu PlA1/A2. Maksymalna szybkość generacji TAT i sCD40L w modelu uszkodzenia
była u homozygot PlA1 i heterozygot PlA1/A2 podobna. Analiza powierzchni pól pod krzywą stężenia TAT jako
funkcji czasu wykazała, że u nosicieli PlA2 generacja trombiny była większa (o 17,5%, p <0,05). U pacjentów
przyjmujących statyny (n = 12) mniejsze były zarówno stężenia TAT (pole pod krzywą mniejsze o 20%,
p <0,005), jak i stężenia sCD40L (o 23%, p <0,005). Wpływ statyn nie zależał od obecności allelu PlA2. Wnioski.
U osób z chorobą wieńcową leczonych małymi dawkami ASA polimorfizm PlA1/A2 wiąże się z większą generacją
trombiny, ale nie z aktywacją płytek w miejscu uszkodzenia naczyń. PlA2 nie wpływa na korzystne działania
statyn w aspekcie generacji trombiny i aktywacji płytek.
Słowa kluczowe: aktywacja płytek, generacja trombiny, polimorfizm PlA1/A2, statyny
Abstract: Introduction. The PlA2 allele is present in about 20–30% of European population. This allele has been
associated with resistance to the antithrombotic action of aspirin in healthy PlA2 carriers. Objectives. To evaluate
the functional association of the PlA1/A2 polymorphism of β3 intergrins with increased thrombin generation and
platelet activation in patients with coronary artery disease (CAD), treated with low-dose aspirin and whether the
effect of this polymorphism is modulated by statin administration. Patients and methods. In 31 patients (25 M, 6 F) with CAD, aged 47 to 76 years, the thrombin-antithrombin complex generation (TAT) and the soluble form of CD40 ligand level (sCD40L) in blood collected every 60 seconds at sites of standardized microvascular injury
were determined. Results. Coronary angiography revealed ≥1 major epicardial artery stenosis (≥50%) in all
Allel PlA1/A2 β3 integryny wiąże się ze zwiększoną generacją trombiny...
33
ARTYKUŁY ORYGINALNE
patients. Genotyping determined 18 subjects homozygous for PlA1 and 13 PlA2 heterozygous carriers.
Homozygous PlA1 subjects exhibited increased fibrinogen levels compared with PlA2 carriers (4.2 [IQ 2.39] g/l
vs. 2.5 [0.73] g/l, p <0.05). Maximal TAT level observed 6 min after microvascular injury was higher in PlA2
carriers (p = 0.01). Maximal sCD40L did not differ between PlA1/A1 subjects and PlA2 carriers. The PlA2 allele
did not alter the velocity of TAT production and sCD40L release. The analysis of the area under the concentration
vs. time curve for TAT revealed that PlA2 carriers exhibited increased thrombin generation compared with
PlA1A1 subjects (by 17.5%, p <0.05). Subjects treated with statins (n = 12) had lower TAT generation and
sCD40L release than non-treated (by 20%, p <0.005 and 23%, p <0.005, respectively). This effect was not
altered by the PlA2 presence. Conclusions. In a model of microvascular injury the PlA1/A2 polymorphism
influenced thrombin formation but not platelet activation in CAD patients treated with low-dose aspirin. The PlA2
allele did not alter the beneficial effect of statins on blood coagulation.
Key words: PlA1/A2 polymorphism, platelet activation, statins, thrombin generation
WPROWADZENIE
β3 integryny stanowią część receptora dla witronektyny
oraz glikoproteiny płytkowej – GPIIb/IIIa – która odgrywa
istotną rolę w adhezji, agregacji i innych oddziaływaniach
międzykomórkowych płytek (więcej w artykule przeglądowym [1]). Jej rola biologiczna związana jest z receptorowym
powinowactwem do czynnika von Willebranda i fibrynogenu
oraz przekaźnictwem sygnału do komórki, co jest regulowane
przez oddziaływanie białek cytoszkieletu (talina, α-aktynina)
i aktywację kinaz białkowych (rodziny Src, FAK) regulujących
procesy adhezji [1].
Zahamowanie powinowactwa GPIIb/IIIa–fibrynogen
przez syntetycznych antagonistów GPIIb/IIIa (abciksymab,
integrelina) zmniejsza ryzyko wystąpienia powikłań zakrzepowych podczas zabiegów angioplastyki wieńcowej [2], a w powiązaniu z intensywnym leczeniem trombolitycznym sprzyja
reperfuzji w ostrych zespołach wieńcowych [3]. Wiadomo
również, że inne leki o działaniu antyagregacyjnym (kwas
acetylosalicylowy [ASA], pochodne tienopirydyny) w sposób
niespecyficzny zmniejszają aktywację płytek krwi związaną
z ekspresją GPIIb/IIIa [4].
Polimorfizm genu β3 integryny, znany jako PlA1/A2, polega na zamianie nukleotydu tymidyny na cytozynę w pozycji
1565, co powoduje substytucję leucyny w pozycji 33 β3 integryny (PlA1) na prolinę (PlA2). Polimorfizm ten występuje
u 20–30% zdrowych osób rasy białej [5] i u osób z zaawansowaną chorobą wieńcową [6].
Konsekwencje polimorfizmu PlA2 nie są jednoznaczne.
Wykazano, że obecność allelu PlA2 wiąże się ze skróceniem
czasu krzepnięcia [7,8], zwiększoną ekspresją P-selektyny oraz
z aktywacją kompleksu GPIIb/IIIa-fibrynogen na płytkach [9].
Kliniczne znaczenie tego polimorfizmu objawia się między innymi zwiększonym ryzykiem wystąpienia zawału serca [10]
Adres do korespondencji:
dr biol. Ewa Stępień, Samodzielna Pracownia Biologii Molekularnej i Badań Naukowych,
Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II, ul. Prądnicka 80, 31-202 Kraków,
tel.: 012-614-31-45, fax: 012-423-39-00, e-mail: [email protected]. pl
Praca wpłynęła: 08.03.2007. Przyjęta do druku: 26.03.2007.
Nie zgłoszono sprzeczności interesów.
Pol Arch Med Wewn. 2007; 117 (1-2): 33-40
Copyright by Medycyna Praktyczna, Kraków 2007
34
i restenozy u osób po przebytej angioplastyce wieńcowej [6].
Mimo że wyniki wcześniejszych badań podważają rolę polimorfizmu PlA1/A2 jako niezależnego czynnika ryzyka wystąpienia zawału (badania Ridkera i wsp. [11]) i restenozy [12],
związek występowania allelu PlA2 z ryzykiem incydentów
sercowo-naczyniowych nadal stanowi przedmiot badań [13].
Rola polimorfizmu w regulacji agregacji płytek jest kontrowersyjna. Z jednej strony doświadczenia in vitro pokazały, że
obecność allelu PlA2 zwiększa fosforylację kinazy białkowej
pp125FAK oraz adhezję komórek do fibrynogenu [14], co ma
bezpośrednie przełożenie na sytuację in vivo (adhezja płytek
w miejscu formowania skrzepu), z drugiej jednak strony wyniki dużego badania kliniczno-kontrolnego Framingham Heart
Study pokazały, iż zwiększoną agregację płytek towarzyszącą
zwiększonemu stężeniu fibrynogenu obserwowano u homozygot PlA1. Choć u nosicieli PlA2 agregacja była wzmożona, to
nie zależała od stężenia fibrynogenu [15].
Polimorfizm PlA1/A2 był wielokrotnie badany jako czynnik zakłócający działanie leków przeciwzakrzepowych o charakterze antyagregacyjnym, zwłaszcza ASA, u zdrowych osób
[8,16] oraz u osób z miażdżycą naczyń wieńcowych [17,18].
Wykazano, że obecność PlA2 może wpływać na proces generacji trombiny (uwalnianie łańcucha β-trombiny, tworzenie
kompleksu trombina-antytrombina), objawiający się opornością zdrowych nosicieli allelu PlA2 na przeciwkrzepliwe działanie ASA w miejscu uszkodzenia mikrokrążenia [19]. U nosicieli PlA2 czas krwawienia po zażyciu ASA w dawce 300 mg
jest krótszy niż u homozygot PlA1 [8], a agregacja płytek
silniejsza [7]. Niedawno opublikowano artykuł, którego autorzy stwierdzili, że u 9 pacjentów z chorobą wieńcową nosicieli
PlA2 generacja trombiny mierzona stężeniem fragmentu 1+2
protrombiny (F1+2) nie zmieniła się po 2 tygodniach stosowania ASA w dawce 300 mg/d, a u 19 badanych homozygot PlA1
zaobserwowano zmniejszenie stężeń F1+2 [17]. Nie jest jednak
jasne, czy u osób z chorobą wieńcową, z których ponad 90%
przewlekle zażywa mniejsze – zwykle 75 mg lub 150 mg/d
– dawki ASA (podstawowego leku w prewencji zawału serca),
można zaobserwować podobny związek między obecnością allelu PlA2 a generacją trombiny.
Celem pracy było zatem sprawdzenie, czy w grupie pacjentów z miażdżycą tętnic wieńcowych leczonych przewlekle ASA
POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (1-2)
ARTYKUŁY ORYGINALNE
w małych dawkach (75 mg/d) polimorfizm PlA1/A2 wiąże
się ze zwiększoną aktywacją osoczowego układu krzepnięcia
i płytek krwi w miejscu uszkodzenia mikrokrążenia. Drugim
celem było zweryfikowanie hipotezy, że statyny w dawce stosowanej w leczeniu hipolipemizującym, które podobnie jak ASA
zmniejszają generację trombiny [20] oraz aktywację płytek
[21], wpływają w odmienny sposób na te procesy w zależności
od polimorfizmu PlA1/A2.
PACJENCI I METODY
Badaniu poddano grupę kolejnych 31 pacjentów ze stabilną dławicą piersiową (CAD) przyjętych na oddział Zakładu
Hemodynamiki i Angiografii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego do planowanego badania koronarograficznego w okresie od maja do czerwca 2006 roku. Rozpoznanie CAD (dolegliwości III klasy CCS albo II klasy CCS przy
współistnieniu dużego ryzyka niedokrwienia w innych badaniach) potwierdzane było w elektrokardiograficznej próbie wysiłkowej lub w badaniach obrazowych (scyntygrafia, MSCT).
Do badania kwalifikowano także osoby z utrzymującymi się
albo nawracającymi dolegliwościami stenokardialnymi po
przebytym ostrym zespole wieńcowym (nie mniej niż 3 miesiące wcześniej). Powodem skierowania do koronarografii był
brak możliwości opanowania objawów choroby leczeniem zachowawczym. Wynik oznaczenia stężenia troponiny I w dniu
włączenia do badania wynosił <0,1 ng/ml. Kryteria wyłączające z udziału w badaniu to: objawy ostrej infekcji, stosowanie acenokumarolu, heparyny lub pochodnych tienopirydyny,
żylna choroba zakrzepowo-zatorowa w wywiadzie, przebycie
ostrego zespołu wieńcowego w okresie krótszym niż 3 miesiące
przed włączeniem do badania, poważne choroby współistniejące wpływające na hemostazę (nowotwór złośliwy, choroby
autoimmunologiczne, niewydolność nerek, uszkodzenie wątroby, niewydolność serca w III/IV klasie NYHA). Wszyscy
pacjenci wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu. Badanie
uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej działającej przy Uniwersytecie Jagiellońskim w Krakowie.
Badania laboratoryjne
U pacjentów wykonano rutynowe oznaczenia stężenia
cholesterolu całkowitego, frakcji LDL oraz HDL cholesterolu
i triglicerydów, białka C-reaktywnego metodą immunoturbidymetryczną (Dimention Expand, Dade-Behring, Niemcy), fibrynogenu (metoda Claussa), a także oznaczono stężenie TAT
(Enzygnost TAT, Dade-Behring, Niemcy) i sCD40L (R&D,
Wiesbaden-Nordenstadt, Niemcy) w osoczu krwi obwodowej.
Do oznaczeń generacji trombiny i stopnia aktywacji płytek
z obszaru uszkodzenia mikronaczyniowego krew pobierano
z nacięć wykonanych za pomocą urządzenia Simplate R (Organon Teknika). Krew pobierano co 60 sekund przez 6 minut do buforu zawierającego antykoagulant (0,9% roztwór
NaCl, EDTA 50 mmol/l, benzamidynę 20 mmol/l, inhibitor
trombiny D-Val-Leu-Lys-chlorometylketon [V3763 Sigma]
50 μM), a następnie wirowano w temperaturze 4°C (6000 g
przez 20 min), zbierano nadsącz i zamrażano w temperaturze
–70°C do dalszych badań. Stężenia kompleksu trombina-antytrombina (TAT) oraz rozpuszczalnej postaci liganda białka
CD40 (sCD40L) oznaczano za pomocą testów ELISA zgodnie
z instrukcją producenta (Dade-Berhring i R&D). Do analiz
wykorzystano następujące zmienne: pomiar obu parametrów
w poszczególnych punktach czasowych co 60 sekund, maksymalną szybkość narastania stężeń obu parametrów (zwykle
w 2–3 minucie krwawienia) oraz całkowite uwalnianie obu
białek w ciągu pierwszych 3 i 6 minut, wyrażone jako pole
pod krzywą S wyliczone metodą trapezów. Ze względu na
zmienność czasów krwawienia analizy ograniczono do pierwszych 6 minut krwawienia, ponieważ u większości badanych
czas krwawienia wynosił 5–6 minut.
Oznaczanie polimorfizmu PlA1/A2
Obecność alleli genu β3 integryny zbadano metodą reakcji
łańcuchowej polimerazy (PCR) [19] i trawienia enzymem restrykcyjnym MpsI (ER0541, Fermantas).
Analiza statystyczna
Normalność rozkładów sprawdzono za pomocą testu Kołmogorowa i Smirnowa, wyniki przedstawiono w postaci median ± rozstęp międzykwartylowy. Do porównania grup użyto
metody analizy ANOVA efektów głównych, różnice między
grupami zbadano testem U Manna i Whitneya (analiza nieparametryczna), udział niezależnych predyktorów zmiennej S
(pole pod krzywą zwiększenia stężeń markerów) sprawdzono,
stosując standardowy model regresji wielokrotnej. Analizy statystycznej dokonano za pomocą oprogramowania STATISTICA vs 7.1 (StatSoft, Inc. 2005).
WYNIKI
Badana grupa składała się z 25 mężczyzn w wieku 61
(47–76) lat i 6 kobiet w wieku 69 (54–71) lat (tab. 1). Wszyscy
pacjenci stosowali ASA, z czego 26 (84%) w dawce 75 mg/d,
a pozostali w dawce 150 mg (3) i 300 mg (2). 39% pacjentów
zażywało statyny – simwastatynę w dawce 20 mg/d (2 pacjentów w dawce 40 mg/d). Terapeutyczny efekt zażywania statyn
uwidoczniony był jako zmniejszenie stężenia cholesterolu całkowitego i cholesterolu frakcji LDL w stosunku do grupy niezażywającej leku: stężenie cholesterolu całkowitego 4,3 (1,25)
mmol/l vs 6,2 (1,30) mmol/l, p <0,0001, stężenie LDL 2,4
(1,32) mmol/l vs 4,0 (1,04) mmol/l, p <0,0001. W koronarografii co najmniej w jednej tętnicy nasierdziowej stwierdzono
zwężenie światła naczynia ≥50%.
W badanej grupie wykryto 18 (58%) homozygot PlA1 i 13
(42%) nosicieli allelu PlA2 – heterozygoty PlA1/A2. Stwier-
Allel PlA1/A2 β3 integryny wiąże się ze zwiększoną generacją trombiny...
35
ARTYKUŁY ORYGINALNE
Tabela 1. Wyjściowa charakterystyka badanej grupy
Zmienna
Cała grupa; n = 31
Homozygoty A1; n = 18
Nosiciele A2; n = 13
mężczyźni, n (%)
25 (81)
12 (67)*
13 (100)*
wiek, lata
62 (47–76)
66 (48–76)
60 (47–75)
mężczyźni
61 (47–76)
kobiety
69 (54–71)
fibrynogen (g/l)
2,9 (1,99)
4,2 (2,39)*
2,5 (0,73)*
CRP (mg/l)
1,6 (1,43)
1,6 (1,39)
1,9 (1,32)
cholesterol całkowity (mmol/l)
5,4 (1,89)
5,3 (2,07)
5,4 (1,53)
frakcja LDL cholesterolu (mmol/l)
3,4 (1,50)
3,5 (1,86)
3,3 (1,01)
frakcja HDL cholesterolu (mmol/l)
1,2 (0,23)
1,2 (0,32)
1,2 (0,15)
TG (mmol/l)
1,5 (0,76)
1,4 (0,84)
1,5 (0,53)
BT (s)
390 (170)
420 (155)
370 (160)
TAT żylny (mg/l)
3,2 (0,81)
3,4 (0,8)
3,0 (0,60)
sCD40L żylny (pg/ml)
228 (97)
230 (116)
228 (57)
12 (39)
6 (33)
6 (46)
2 (3)
2 (5,5)
0 (0)
palenie papierosów, n (%)
cukrzyca, n (%)
nadciśnienie, n (%)
12 (39)
6 (33)
6 (46)
ASA w dawce 75 mg, n (%)
26 (84)
16 (89)
10 (77)
b-adrenolityki, n (%)
20 (65)
12 (67)
8 (62)
inhibitory ACE, n (%)
17 (55)
12 (67)
5 (38)
statyny, min. 20 mg, n (%)
12 (39)
7 (39)
5 (38)
* p <0,01
ASA – kwas acetylosalicylowy, BT – czas krwawienia, CRP – białko C-reatywne, HDL – lipoproteiny o dużej gęstości, inhibitory ACE – inhibitory
konwertazy angiotensyny, LDL – lipoproteiny o małej gęstości, sCD40L – rozpuszczalna frakcja liganda białka CD40, TAT – kompleks trombina–
antytrombina, TG – triglicerydy
Tabela 2. A
ktywacja płytek wyrażona jako stężenie TAT i sCD40L u pacjentów z chorobą wieńcową, homozygot allelu PlA1 i nosicieli
PlA2
Homozygoty PlA1; n = 18
TAT (nmol/l)
stężenie maksymalne
prędkość maksymalna
34,9 (4,8)*
sCD40L (ng/ml)
8,9 (0,9)
Nosiciele PlA2; n = 13
TAT (nmol/l)
42,3 (3,4)*
sCD40L (ng/ml)
9,5 (1,1)
9,2 (3,1)
2,7 (0,9)
8,7 (4,6)
2,8 (0,7)
Scałk. 180 s
1438 (276)
546 (189)
1668 (624)
560 (77)
Scałk. 360 s
6288 (1050)*
1975 (237)
7620 (792)*
2051 (252)
Dane wyrażono jako medianę ± rozstęp międzykwartylowy, * p <0,05
dzono, że nosiciele allelu PlA2 nie różnili się od homozygot
PlA1 pod względem wieku, wybranych parametrów biochemicznych i klinicznych oraz sposobu leczenia (tab. 1). Istotne statystycznie różnice zaobserwowano dla płci (w badanej
grupie nosicieli PlA2 byli wyłącznie mężczyźni) oraz stężenia
fibrynogenu: 4,2 (2,39) g/l u homozygot vs 2,5 (0,73) g/l u nosicieli PlA2, p <0,05.
36
Pomiary stężenia TAT i sCD40L w modelu uszkodzenia
mikronaczyń wykazały, że stężenia obu markerów aktywacji
płytek krwi ulegały zwiększeniu, wykazując największą dynamikę między 2 a 3 minutą (prędkość maksymalna) od wykonania nacięcia (ryc. 1). Nie stwierdzono istotnych statystycznie
różnic w maksymalnej prędkości zwiększania się stężenia TAT
i sCD40L między homozygotami PlA1 a nosicielami PlA2. Po
POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (1-2)
ARTYKUŁY ORYGINALNE
60
TAT (nmol/l)
50
A
* p = 0,03
** p = 0,01
**
*
40
30
20
A1A2
A1A1
10
0
0
60
120
180
t (s)
240
300
360
B
12,0
sCD40L (ng/ml)
10,0
8,0
6,0
4,0
A1A2
A1A1
2,0
0,0
0
120
180
t (s)
240
50
20
*
sCD40L (ng/ml)
*
leczeni – statyny
nieleczeni
10
10
360
*
30
12
*
*
40
0
300
C
* p <0,005
60
TAT (nmol/l)
60
0
60
120
180
t (s)
D
*
* p <0,005
240
300
360
*
*
*
8
6
5 i 6 minucie od wykonania nacięcia u nosicieli PlA2 stężenie
TAT było statystycznie większe niż u homozygot i wynosiło
odpowiednio 39,2 (6,6) nmol/l vs 31,2 (2,7) nmol/l, p = 0,03
oraz 42,3 (3,4) nmol/l vs 34,9 (4,8) nmol/l, p = 0,01 (ryc. 1A),
wartość maksymalną osiągało w 6 minucie (tab. 2). Stężenie
sCD40L nie różniło się w sposób znamienny w obu grupach:
8,8 (0,7) ng/ml vs 9,1 (0,7) ng/ml, NS i 8,9 (0,9) ng/ml vs 9,5
(1,1) ng/ml, NS (ryc. 1B, tab. 2). Analiza powierzchni pól S pod
krzywą przyrostu stężeń wykazała, że nosiciele allelu PlA2 β3
integryny charakteryzowali się większą zdolnością do generacji
trombiny, obserwowaną jako tworzenie kompleksów trombina-anytrombina. Pole pod krzywą obliczone dla nosicieli PlA2
wynosiło 7620 (792) nmol/l·s, a dla homozygot PlA1 6288
(1050) nmol/l·s, p <0,05 (tab. 2). Wartości pól pod krzywą
wyliczone dla sCD40L się nie różniły.
Porównanie stężeń TAT i sCD40L w grupach podzielonych
pod względem zastosowanego leczenia statynami wykazało, że
u pacjentów przyjmujących statyny stężenia TAT były znamiennie mniejsze (p <0,005) w każdym punkcie czasowym,
począwszy od 2 minuty od nacięcia (ryc. 1C). Stężenia TAT
u leczonych statynami były o około 20% mniejsze niż u nieleczonych i wynosiły odpowiednio: 29,6 (2,7) nmol/l vs 37,6 (9,5)
nmol/l w 5 minucie oraz 33,2 (3,8) nmol/l vs 41,3 (8,1) nmol/l
w 6 minucie od nacięcia i osiągało wartość maksymalną (tab.
3). Podobną tendencję zaobserwowano w uwalnianiu sCD40L
przez płytki. Znamiennie mniejsze stężenia sCD40L (p <0,005)
u pacjentów leczonych statynami zaobserwowano od 3 minuty
po nacięciu (ryc. 1D); wynosiły one odpowiednio: 8,5 (2,4) ng/
ml vs 9,2 (0,9) ng/ml w 5 minucie oraz 8,8 (2,3) ng/ml vs 9,5
(1,0) ng/ml w 6 minucie po nacięciu (tab. 3). Zaobserwowano
również istotnie statystyczne różnice w wyliczonych polach S
pod krzywą dla stężeń TAT i sCD40L; w przypadku pacjentów leczonych statynami wartości S były istotnie mniejsze niż
u nieleczonych i wynosiły odpowiednio: 5760 (1188) nmol/l·s
vs 7509 (1971) nmol/l·s oraz 1961 (504) ng/ml·s vs 2093 (260)
ng/ml·s, p <0,005 (tab. 3). Siłę efektu zmniejszenia generacji
trombiny na skutek leczenia statynami zbadano również za pomocą analizy wariancji ANOVA (ryc. 2).
Zastosowanie modelu uogólnionej regresji do analizy niezależnych predyktorów produkcji TAT wyrażonej jako pole
pod krzywą pokazało, że jedynymi czynnikami w istotny sposób wpływającymi na wartość tej zmiennej są: polimorfizm
PlA1/A2 i leczenie statynami. Parametry regresji dla PlA1/A2
i statyn wynosiły odpowiednio 0,43 i -0,76, przy współczynniku korelacji R = 0,73 i determinacji R 2 = 0,53, p <0,005.
4
leczeni – statyny
nieleczeni
2
0
0
60
120
180
t (s)
240
300
360
Ryc 1. Efekt leczenia statynami u osób z zaawansowaną chorobą
wieńcową, nosicieli allelu PlA2 i homozygot PlA1. Analiza ANOVA
efektów głównych. Skróty jak w tabeli 1
OMÓWIENIE
W przedstawionej pracy wykazano, że u nosicieli PlA2
z chorobą wieńcową przewlekle leczonych małymi dawkami
ASA generacja trombiny po uszkodzeniu naczyń była większa, nie miało to jednak wpływu na tempo tego procesu. PlA2
nie różnicuje pacjentów pod względem poziomu aktywacji
płytek krwi mierzonej uwalnianiem sCD40L po uszkodzeniu
Allel PlA1/A2 β3 integryny wiąże się ze zwiększoną generacją trombiny...
37
ARTYKUŁY ORYGINALNE
Tabela 3. A
ktywacja płytek wyrażona jako stężenie TAT i sCD40L u pacjentów z chorobą wieńcową, leczonych i nieleczonych
statynami
Leczeni statynami; n=12
Nieleczeni statynami; n=19
TAT (nmol/l)
sCD40L (ng/ml)
TAT (nmol/l)
sCD40L (ng/ml)
stężenie maksymalne
33,2 (3,8)*
8,8 (2,3)**
41,3 (8,1)*
9,5 (1,0)**
prędkość maksymalna
8,6 (4,9)
2,4 (0,4)*
9,2 (3,6)
3,1 (0,6)*
Scałk. 180 s
1260 (327)*
394 (246)
1548 (369)*
554 (61)
Scałk. 360 s
5760 (1188)*
1961 (504)*
7509 (1971)*
2093 (260)*
Dane wyrażono jako medianę (rozstęp międzykwartylowy). * p <0,005, ** p <0,05
naczynia (ryc. 1B). Potwierdzono ponadto zmniej­szenie generacji trombiny u osób leczonych statynami, nie tylko tych
z hipercholesterolemią, ale wszystkich, mimo zaawansowanej
choroby wieńcowej i licznych czynników ryzyka. Jednak to
przeciwkrzepliwe działanie statyn nie wykazywało zależności
od polimorfizmu PlA1/A2; u nosicieli PlA2 i u pozostałych
pacjentów efekt był podobny (ryc. 2).
Nasz artykuł jest kolejnym głosem w dyskusji na temat
roli polimorfizmu PlA1/A2 podjednostki β3 integryny w regulacji procesów krzepnięcia. Wcześniejsze badania u zdrowych
mężczyzn wykazały, że obecność allelu PlA2 wiąże się z nasileniem procesu generacji trombiny (większa dynamika aktywacji protrombiny i tworzenia kompleksów TAT) [16,19].
W naszym badaniu, w którym uczestniczyła grupa osób
z chorobą wieńcową, zaobserwowaliśmy, że maksymalne stężenie TAT u nosicieli PlA2 jest istotnie większe, inna jest natomiast dynamika tego procesu. W pierwszych 3 minutach od
wykonania nacięcia (model uszkodzenia mikronaczyń) stężenia TAT zwiększają się podobnie jak u homozygot PlA1 i nosicieli PlA2. W ostatnim badaniu przeprowadzonym w grupie
pacjentów z zaawansowaną chorobą wieńcową i przebytym zawałem serca (Dropiński i wsp. [17]) zaobserwowano, że u nosicieli allelu PlA2 stopień generacji trombiny mierzony jako
krzywa narastania produktów konwersji protrombiny (F1+2)
nie różnił się od stwierdzanego u homozygot PlA1. Grupa ta
była porównywana w dwóch punktach czasowych: po 3-tygodniowym odstawieniu ASA oraz po 14-dniowym leczeniu ASA
dawką 300 mg/d. Autorzy tej pracy pokazali, że nosiciele PlA2
nie różnią się od homozygot PlA1 stopniem generacji trombiny w punkcie początkowym (bez ASA). Wykazali również,
że efektem włączenia leczenia ASA jest zmniejszenie stężenia
F1+2 tylko u homozygot PlA1. Autorzy nie stwierdzili różnic
między nosicielami PlA2 i homozygotami PlA1 w modelu
uszkodzenia mikrokrążenia w pierwszych 3 minutach od nacięcia. W naszym badaniu różnice były statystycznie istotne
po 5 i 6 minutach od wykonania nacięcia. Być może ta rozbieżność wyników spowodowana jest po pierwsze sposobem pomiaru generacji trombiny, po drugie zaś – różnicami w badanych
grupach. Aktywację układu krzepnięcia oznaczano w dłuższym przedziale czasowym (6 min), dzięki czemu można było
zaobserwować większe stężenie TAT u nosicieli PlA2. Grupa
pacjentów uczestniczących w naszym badaniu liczyła 31 osób,
38
z czego 13 stanowili nosiciele PlA2; w większości byli to mężczyźni w wieku 62 lat, bez zawału serca, a w grupie nieleczonych
statynami były osoby z hipercholesterolemią (>5,5 mmol/l).
Dropiński i wsp. nie podają dokładnej charakterystyki swojej
grupy (brak danych na temat płci i wieku badanych), a liczebność grupy nosicieli PlA2 wynosiła 9 osób. Brak również informacji na temat stosowanego leczenia hipolipemizującego;
podano tylko, że do badania włączano pacjentów z cholesterolemią <5,5 mmol/l.
Przedstawione wyniki pokazują, że polimorfizm PlA2
nie wpływa na tempo procesu generacji trombiny w modelu
uszkodzenia naczyń u osób z zaawansowaną chorobą wieńcową przewlekle leczonych małą dawką ASA. W badaniu
przeprowadzonym w grupie zdrowych mężczyzn [19] różnice w generacji trombiny u nosicieli PlA2 można zaobserwować już w ciągu pierwszych 3 minut; w naszym badaniu
zarówno stężenia TAT, jak i pole pod krzywą S wyliczone
dla 3 minuty nie różnią się istotnie. Przypuszczamy, że na
dynamikę tego procesu wpływa obciążenie pacjentów (choroba wieńcowa) oraz przewlekłe zażywanie ASA. Zróżnicowanie dawki ASA (3 pacjentów stosowało dawkę 150 mg/d,
2 dawkę 300 mg/d) nie powinno mieć związku z procesem generacji trombiny. We wcześniejszym badaniu kliniczno-kontrolnym udowodniono, że zarówno mała (75 mg), jak i duża
(300 mg) dawka ASA wykazują taki sam wpływ na generację
trombiny (uwalnianie F1+2) [22].
Innym aspektem naszej pracy było zbadanie roli statyn
w dawce stosowanej w leczeniu hipolipemizującym (czyli
10 osób przyjmujących simwastatynę w dawce 20 mg/d
i 2 osoby w dawce 40 mg/d) w procesie generacji trombiny
w zależności od polimorfizmu PlA1/A2. Nasze badania wykazały działanie przeciwkrzepliwe statyn w miejscu uszkodzenia mikrokrążenia, ujawniające się jako istotne różnice stężeń
TAT od 2 minuty od wykonania nacięcia. Dane te są zgodne
z wcześniejszymi obserwacjami Undas i wsp. [20] w grupie
chorych z hipercholesterolemią leczonych 3 dni simwastatyną
w takiej samej dawce oraz 3 miesiące simwastatyną w dawce
20–40 mg/d [23]. Na podstawie obserwacji własnych możemy
stwierdzić, że działanie statyn polegające na osłabieniu produkcji trombiny w miejscu uszkodzenia naczyń utrzymuje się
u pacjentów z chorobą wieńcową poddanych skutecznemu leczeniu hipolipemizującemu i nie zależy od polimorfizmu genu
POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (1-2)
ARTYKUŁY ORYGINALNE
homozygoty A1, p = 0,03
9000
TAT
8000
7000
6000
5000
NS
statyny
S
nosiciele A2, p = 0,01
9000
TAT
8000
sterolemią leczonych przez 8 tygodni prawastatyną (40 mg/d)
i ceriwastatyną (0,2 mg/d) [25]. Wcześniejsze doświadczenia
na modelu uszkodzenia mikronaczyń również wykazały hamowanie uwalniania sCD40L przez simwastatynę (40 mg/d)
u leczonych hipolipemicznie przez 3 dni i 4 tygodnie [21]. Obserwacje te potwierdziliśmy teraz w badaniach przeprowadzonych w grupie osób z chorobą wieńcową.
Nową obserwacją pochodzącą w tej pracy jest pokazanie,
że polimorfizm PlA1/A2 nie zaburza działania przeciwzakrzepowego statyn na poziomie generacji trombiny (TAT) i aktywacji płytek (uwalnianie sCD40L), dlatego stwierdzamy,
że genotypowanie polimorfizmu β3 integryny GPIIb/IIIa nie
jest pomocne w identyfikacji pacjentów, u których należy się
spodziewać małej efektywności leczenia przeciwzakrzepowego
w terapii złożonej (ASA+statyna). Nasze obserwacje potwierdzają, że w chorobie wieńcowej, w której przeplatają się ściśle liczne mechanizmy genetyczne i środowiskowe, nie należy
oczekiwać, by jedna – nawet często występująca – mutacja
miała istotny wpływ na inny niezwykle złożony proces, jakim
jest aktywacja układu krzepnięcia.
7000
PODZIĘKOWANIA
Autorzy pracy pragną podziękować doc. dr hab. Anetcie
Undas za cenne uwagi merytoryczne przy pisaniu pracy.
6000
5000
NS
statyny
S
Ryc 2. Pomiar stężenia kompleksu trombina-antytrombina (TAT)
i rozpuszczalnego liganda białka CD40 (sCD40L) wykonywany
w odstępach co 60 sekund w miejscu uszkodzenia mikrokrążenia,
u pacjentów z zaawansowaną chorobą wieńcową, zróżnicowanych
pod względem obecności allelu PlA2 β3 integryny i leczenia statynami (S). Dane wyrażono jako średnią z SD.
β3 integryny (PlA1/A2), jak wynika z analizy ANOVA. Mechanizm działania przeciwkrzepliwego statyn wiąże się prawdopodobnie z hamowaniem potranslacyjnej modyfikacji białek
uwalnianych przez śródbłonek, a zaangażowanych w proces
aktywacji kaskady krzepnięcia (np. czynnika tkankowego)
[23].
Przeciwpłytkowy efekt działania statyn był również wyrażony jako mniejsze stężenia sCD40L w miejscu uszkodzenia mikrokrążenia w pacjentów leczonych statynami. Białko
sCD40L w modelu uszkodzenia mikrokrążenia uwalniane jest
głównie z aktywowanych płytek [24], a jego stężenie zwiększa
się najszybciej między 1 a 3 minutą od wykonania nacięcia,
osiągając plateau w 5–6 minucie [21]. Począwszy od 3 minuty
od nacięcia stężenia sCD40L były znamiennie mniejsze u leczonych, podobne różnice stężeń zaobserwowano w krwi żylnej (nie pokazano). Wpływ leczenia statynami na uwalnianie
przez płytki rozpuszczalnej postaci CD40L do krwi obwodowej zaobserwowano wcześniej w grupie chorych z hiperchole-
PIŚMIENNICTWO
1. Bennett JS. Structure and function of the platelet integrin αIIβ3. J Clin Invest. 2005;
115: 3363-3369.
2. The EPILOG Investigators. Platelet glycoprotein IIb/IIIa receptor blockade and lowdose heparin during percutaneous coronary revascularization N Engl J Med. 1997;
336: 1689-1697.
3. Magnus Ohman E, Kleiman NS, Gacioch G, et al. Combined accelerated tissue-plasminogen activator and platelet glycoprotein IIb/IIIa integrin receptor blockade with
integrilin in acute myocardial infarction. Results of a randomized, placebo-controlled, dose-ranging trial. Circulation 1997; 95: 846-854.
4. Schneider DJ, Baumann PQ, Holmes MB, et al. Time and dose dependent augmentation of inhibitory effects of abciximab by aspirin. Thromb Haemost. 2001; 85:
309-313.
5. Sperr WR, Huber K, Roden M, et al. Inherited platelet glycoprotein polymorphisms
and a risk for coronary heart disease in young Central Europeans. Thromb Res. 1998;
90: 117-123.
6. Kastrati A, Schöming A, Seufarth M, et al. PlA polymorphism of platelet glycoprotein IIIa and risk of restenosis after coronary stent replacement. Circulation 1999;
99: 1005-1010.
7. Feng D, Lindpaintner K, Larson MG, et al. Increased platelet aggregability associated with platelet GPIIIa PlA2 polymorphism: the Framingham Offspring Study.
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999; 19: 1142-1147.
8. Szczeklik A, Undas A, Sanak M, et al. Relationship between bleeding time, aspiryn
and the PlA1/A2 polymorphism of platelet glycoprotein IIIa. Br J Haematol. 2000;
110: 965-967.
9. Michelson AD, Furman MI, Goldschmit-Clermont P, et al. Platelet GPIIIa PlA polymorphisms display different sensitivities to agonists. Circulation 2000; 101: 1013-1018.
10. Ardissino D, Mannucci PM, Merlini PA, et al. Prothrombotic genetic risk factors in
young survivors of myocardial infarction. Blood 1999; 94: 46-71.
11. Ridker PM, Hennekens CH, Schmitz C, et al. PlA1/A2 polymorphism of platelet glycoprotein IIIa and risks of myocardial infarction, stroke, and venous thrombosis.
Lancet 1997; 349: 385-388.
12. Mamotte CD, van Bockxmeer FM, Taylor RR. PlA1/A2 polymorphism of glycoprotein IIIa and risk of coronary artery disease and restenosis following coronary angioplasty. Am J Cardiol. 1998; 82: 13-16.
13. Oksala NK, Heikinnen M, Mikkelson J, et al. Smoking and the platelet fibrinogen
receptor glycoprotein IIb/IIIa PlA1/A2 polymorphism interaction the risk of lacunar
stroke and midterm survival. Stroke 2007; 38: 50-55.
Allel PlA1/A2 β3 integryny wiąże się ze zwiększoną generacją trombiny...
39
ARTYKUŁY ORYGINALNE
14. Vijayan KV, Goldschmidt-Clermont PJ, Christine Roos, et al. The PlA2 polymorphism
of integrin ß3 enhances outside-in signaling and adhesive functions J Clin Invest.
2000; 105: 793-802.
15. Feng D, Lindpaintner K, Larson MG, et al. Platelet glycoprotein IIIa Pl (a) polymorphism, fibrinogen, and platelet aggregability: The Farmingham Heart Study.
Circulation 2001; 104: 140-144.
16. Undas A, Sanak M, Musiał J, et al. Platelet glycoprotein IIIa polymorphism, aspirin
and thrombin generation. Lancet 1999; 353: 982-983.
17. Dropiński J, Musiał J, Sanak M, et al. Antithrombotic effects of aspiryn based on
PlA1/A2 glycoprotein IIIa polymorphism in patients with coronary artery disease.
Thromb Res. 2007; 119: 301-303.
18. Cook GE, Liu-Straton Y, Moeschberger ML, et al. Effect of platelet antigen polymorphism on platelet inhibition by aspirin, clopidogrel, or their combination. J Am Coll
Cardiol. 2006; 47: 541-546.
19. Undas A, Brummel K, Musiał J, et al. PlA2 polymorphism of β3 integrins is associated with enhanced thrombin generation and impaired antithrombic action of aspiryn at the site of microvascular injury. Circulation 2001; 104: 2666-2672.
20. Undas A, Celinska-Löwenhoff M, Brummel-Ziedins KE, et al. Simvastatin given for
3 days can inhibit thrombin generation and activation of factor V, and enhance factor Va inactivation in hypercholesterolemic patients. Arterioscler Thromb Vasc Biol.
2005; 25: 1524-1525.
21. Undas A, Celińska-Lowenhoff M, Stępień E, et al. Effects of simvastatin on angiogenic growth factors released at the site of microvascular injury. Thromb Haemost
2006; 95: 1045-1047.
22. Undas A, Undas R, Musiał J, et al. A low dose of aspirin (75 mg/day) lowers thrombin generation to a similar extent as a high dose of aspirin (300 mg/day). Blood
Coagul Fibrynolysis. 2000: 11: 231-234.
23. Undas A, Brummel K, Musiał J. Simvastatin depresses blood clotting by inhibiting
activation of prothrombin, factor V, and factor XIII and by enhancing factor Va inactivation. Circulation 2001; 103: 2248-2253.
24. Henn V, Slupsky JR, Grafe M, et al. CD40 ligand on activated platelets triggers an
inflammatory reaction of endothelial cells. Nature 1998; 391: 591-594.
25. Cipollone F, Mezzetti A, Porreca E, et al. Association between enhanced soluble
CD40L and prothrombotic state in hypercholesterolemia: effects of statin therapy.
Circulation 2002; 106: 399-402.
40
POLSKIE ARCHIWUM MEDYCYNY WEWNĘTRZNEJ 2007; 117 (1-2)