Saubere Lösungen

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59. Jahrgang | Mai 2015 | S. 48–52
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Saubere Lösungen
Wasser zur Aufreinigung von Glutathion-S-transferase (GST)
mittels Affinitätschromatographie
J. Erwig und E. Herbig
Fachartikel
Saubere Lösungen
Wasser zur Aufreinigung von Glutathion-S-transferase (GST)
mittels Affinitätschromatographie
J. Erwig und E. Herbig
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Arabidopsis thaliana
© Dawid Skalec
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Affinitätschromatographie ist ein chromatographisches Verfahren zur Isolation
von Proteinen aus Lösungen. Das
Grundprinzip der Affinitätschromatographie [1] wird schon seit längerer Zeit in Laboren angewandt.
Durch Verwendung von Fast Protein
Liquid Chromatographie-Systemen
(FPLC) kann eine hohe Reinheit und
Menge der Zielproteine erreicht
werden. Außerdem ermöglichen
solche Systeme eine Automatisierung des Prozesses.
Abb. 1: Der gesamte Zellextrakt, welcher das gewünschte rekombinante Protein enthält, wird
auf die entprechende Säule gegeben. Unspezifisch gebundene Proteine werden ausgewaschen und
das spezifisch gebundene Protein mit reduziertem Glutathion eluiert.
(Zeichnung Jan Erwig in Anlehnung an Bende 1974 (1)).
Im Rahmen der Arbeiten zur Funktionsbestimmung von Proteinen, welche in der
Pflanze-Pathogen-Interaktion (Arabidopsis thaliana) eine Rolle spielen, werden in
dieser Arbeit Versuche zur Aufreinigung
des Proteins Glutathion-S-transferase (GST)
beschrieben. GST wird als so genannter
Anhang (Tag) an Proteine gefügt, um diese
dann mittels Affinitätschromatographie aufzureinigen.
Die natürliche Aufgabe von GlutathionS-transferasen ist die Funktion bei der Entgiftung externer organischer Stoffe (sogenannter Xenobiotika) in Pflanzen. Detailiertere Angaben zur Funktion und Regulation
von GSTs in Pflanzen können der Publikation von Marrs 1996 [2] entnommen werden.
Bei der Aufreinigung dieses Proteins
kommt es auf absolute Sauberkeit aller verwendeten Chemikalien und Lösungen an.
Daher ist es nötig alle Chemikalien und
Lösungen in Reinstwasser anzusetzen und
aus diesem Grund werden hohe Anforderungen an das Lösungsmittel Reinstwasser für
diese Untersuchungen gestellt.
Grundlage der Affinitäts­
chromatographie
Um eine Aufreinigung eines bestimmten Proteins zu erreichen, verwendet man sogenannte Protein-Tags, einen zusätzlichen Anhang
von Aminosäuren oder ganzen Proteinen mit
bestimmter Funktion. Hierfür wird das gewünschte Protein mit molekularbiologischen
Methoden (u. A. Klonierung und Transformation) insofern verändert, dass dieser Anhang
mit dem eigentlichen Protein hergestellt wird
und dadurch ein rekombinantes Protein entsteht. Das Ziel der Affinitätschromatographie ist es, eine möglichst große Menge des
rekombinanten Proteins aufzureinigen. Das
jeweilige Genkonstrukt wird dafür vorher
häufig in bakterielle Systeme transformiert
und dort überexprimiert. Als Wirtsorganismus bedient man sich meist dem Bakterium
Escherichia coli, doch auch Bacillus-Stämme
oder nicht-bakterielle Systeme wie Hefen, Insekten-, Säugetier- oder Pflanzenzellen finden hierbei Anwendung [3].
Die Aufreinigung beruht auf der spezifischen Wechselwirkung zwischen zwei
Reaktionspartnern. Ein Reaktionspartner ist
der Protein-Tag der andere ist ein kovalent
an einer Matrix gebundener Ligand oder
Antikörper. An diesen Liganden bindet das
rekombinante Protein (bzw. der Tag) spezifisch. Nach dem Auswaschen unspezifischer
Proteine kann das rekombinante Zielprotein
durch einen Kompetitor spezifisch eluiert
werden (beispielhaft siehe Abb. 1).
Die Wahl der Säulenmatrix ist hierbei
abhängig von dem gewählten Protein-Tag.
Protein-Tags sollten verschiedene Anforderungen wie etwa hohe Spezifität zur Matrix,
einfache Nachweisbarkeit, Elution mit niedermolekularen Substanzen und die Möglichkeit zu N- wie C-terminalen Fusionsproteinen erfüllen. Darüber hinaus sollten die
Tags möglichst keinen Einfluss auf die Tertiärstruktur haben und die biologische Aktivität des Proteins nicht beeinflussen [4].
Bei dem hier gezeigten Beispiel wird die
Glutathion-S-transferase (GST), über eine
Glutathion-haltige Matrix aus einem Zel-
lextrakt aufgereinigt. GST hat eine Größe
von etwa 26 kDa und ist damit um ein Vielfaches größer als, zum Beispiel ein Polyhistidin-Tag (1 kDa). Die Vorteile größerer
Protein-Tags sind potenziell bessere Löslichkeit des rekombinanten Proteins und eine
spezifischere Aufreinigung. Viele kürzere
Polypeptid-Tags werden über Matrices aufgereinigt, an die unspezifische Proteine im
geringen Maß binden können. Damit ist die
aufgereinigte Fraktion weniger rein, verglichen mit beispielsweise dem GST-Tag. Die
Elution der gebundenen rekombinanten Proteine wird meistens durch kompetitive Bindung von freiem Liganden oder aber durch
Änderung des pH-Wertes oder der Salzkonzentration erreicht. Wie in vielen Bereichen,
wird auch diese Methode weitgehend automatisiert. Im vorliegenden Beispiel wird die
Aufreinigung der GST via Protein Liquid
Chromatography unter Benutzung des ÄKTA
purifier™ UPC10 Systems gezeigt (siehe Abb.
2). Diese Methode erlaubt schnelle und effiziente Aufreinigung von Proteinen. Durch
den komplexen Aufbau des Systems, ist
genaues und vor allem sauberes Arbeiten
unerlässlich. So könnten z. B. schwankende
pH Werte und wechselnde Salzkonzentrationen sich auf das Bindungs- und Eluierungsverhalten auswirken und damit die
Ergebnisse verfälscht werden. Daher muss
strikt auf saubere Lösungen geachtet und
von vornherein die Lösungen zur Chromatographie in Reinstwasser angesetzt werden. Im hier gezeigten Beispiel wird die
gebundene GST mit reduziertem Glutathion
von der Säule eluiert und in unterschiedlichen Fraktionen aufgefangen. Diese Frak-
Abb. 2: Äkta purifier™ System zur Proteinaufreinigung im Schwann-Schleiden Forschungszentrum für Molekulare Zellbiologie, Abteilung Zellbiologie der Pflanze, Georg-August Universität
Göttingen.
Abb. 3: Reinstwassersystem arium® pro DI
(Foto: Sartorius)
tionen werden anschließend auf ihre Reinheit untersucht. Alle Lösungen wurden zur
Eliminierung störender Einflüsse im arium®
Reinstwasser angesetzt. Die Herstellung des
verwendeten Reinstwassers wird im folgenden beschrieben.
Ein 0,2 µm Endfilter ist am Wasserauslass installiert und dient der Entfernung von
Partikeln und Bakterien aus dem erzeugten
Reinstwasser während der Dosierung. Der
Prozess der gerätspezifischen Wasserreinigung ist in Abbildung 4 (Flussdiagramm
arium® pro DI) dargestellt.
Die auf diese Weise hergestellte Wasserqualität wird unter anderem für sensible Fragestellungen im Rahmen der Proteinaufreinigung eingesetzt. Die erzielten Forschungsergebnisse werden im Folgenden beschrieben.
Herstellung des Reinstwassers für die
Versuche
Beschreibung des arium® pro DI Reinstwasser Systems
Das hier in den Versuchen verwendete
arium® pro DI Wandsystem (Abb. 3; Tischgerät) wurde zur Herstellung von Reinstwasser
aus vorbehandeltem Trinkwasser konzipiert
und entfernt aus diesem noch vorhandene
Verunreinigungen. Die Reinstwasserproduktion erfordert kontinuierliche Rezirkulation und einen konstanten Wasserfluss, was
durch ein Pumpensystem mit Druckregelung
erreicht wird. Die Leitfähigkeit des Wassers
wird am Speisewasser-Einlass und beim
Produktwasser (Wasser-Auslass) gemessen.
Das bei den hier dargestellten Untersuchungen verwendete System arium® pro DI
arbeitet mit zwei unterschiedlichen Kartuschen. Diese sind mit einem speziellen Aktivkohle-Adsorber und Mischbett-Ionenaustauscherharzen gefüllt, um hochreines Wasser
bezüglich organischer und anorganischer
Ionen (z. B. Salze) zu liefern.
Abb. 4: Schematische Darstellung des Flussdiagramms beim Reinstwassersystem arium® pro DI.
Materialien und Methoden
Für die Aufreinigung wurde eine 250 ml
Flüssigkultur mit E. coli TOP10 Zellen, die
mit dem pGEX4T1 Expressionvektor transformiert wurden, beimpft. Die Zellen wurden
bis zu einer OD600 ~0.6 heran wachsen gelassen. Der Induktor (IPTG) wurde mit einer
Endkonzentration von 0,2 mM zugegeben
und die Kultur anschließend für 4 Stunden
bei 28 °C schüttelnd wachsen gelassen. Vor
und nach der Induktion wurden je 1 mL Kultur als Kontrolle genommen.
Die Flüssigkultur wurde dann bei 2000
x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in kaltem PBS-Puffer,
der PMSF und Lysozym enthielt, resuspendiert. Die Zelllyse wurde durch Ultraschallbehandlung mit einem Bandelin Sonoplus
Ultraschallgerät (Bandelin Electronic, Berlin)
weiter erleichtert. Das Zelllysat wurde dann
bei 24000 x g zentrifugiert. Nach jedem
Schritt (Resuspendierung, Lyse und Zentrifugation) wurden Kontroll-Proben genommen.
Der Überstand wurde dann überführt und
in einem Ultraschallbad entgast. Die Auf-
Abb.5: SDS-Page eines
10%igen Acrylamidgels auf dem der totale
SDS- Zellextrakt der
uninduzierten (-) und
induzierten (+) E. coli
Zellen aufgetragen
wurde. Colloidal Coomassie-Blau gefärbtes
Gel. GST durch * gekennzeichnet
Abb. 6: Das von der UNICORN 5.2 Software (GE Healthcare, München) erstellte Chromatogramm erlaubt eine direkte Analyse der einzelnen Parameter in Echtzeit. UV Absorption (blau),
Konzentration des Elutionspuffers (grün) sowie der Start der Ladung der Probe auf die Säule
sind eingezeichnet. Elutionspeak markiert durch *.
reinigung wurde in einem ÄKTA purifier™
UPC10 (GE Lifescience, München) System
(siehe Abb. 2) durchgeführt.
Die UNICORN 5.2 Software (GE Lifescience, München) wurde für die Bestimmung
der Flussparameter und der abschließenden
Chromatogramm-Analysen verwendet. Für
die selektive Bindung wurde die GSTrap™
FF 1 mL Säule (GE Healthcare, München)
angeschlossen. Die Säule wurde zuerst mit
arium® pro DI Reinstwasser gewaschen und
dann mit PBS equilibriert. Da das System
auch die UV Absorption der Probe während
der Aufreinigung misst, kann das Zielprotein durch einen Anstieg der UV Absorption bei der Elution mit reduziertem Glutathion identifiziert werden. Das aufgereinigte
Protein wurde in 200 µL Fraktionen gesammelt. Für die weitere Analyse mittels SDSPAGE wurden 20 µL von einzelnen oder zwei
gepoolten Peakfraktionen mit 4x SDS- Ladepuffer gemischt und auf ein 10%iges Polyacrylamidgel geladen. Das Gel wurde dann
mit colloidalem Coomassie gefärbt [5]. Alle
Puffer, Lösungen und Medien wurden für
die Versuche mit arium® pro DI Reinstwasser angesetzt.
Ergebnisse
Um die Expression des Zielproteins zu untersuchen, wurden uninduzierte und induzierte
E.coli-Zellen direkt in SDS aufgeschlossen
und mittels SDS-PAGE in einem 10 % Polyacrylamidgel aufgetrennt (siehe Abb. 5).
GST hat eine molekulare Masse von etwa 26
kDa. Die induzierten Zellen zeigen hier eine
eindeutige Zunahme eines Proteins in derselben Größe (vgl Abb. 5: *). Die induzierten
Zellen wurden dann lysiert und das Zelllysat
in unlösliche und lösliche Fraktionen mittels
Zentrifugation getrennt (siehe Abb. 7). Die
Aufreinigung eines Proteins mittels Affinitätschromatographie setzt voraus, dass das
aufzureinigende Protein in wässriger Phase
löslich ist. Die Löslichkeit des GST-Proteins
wurde durch SDS-PAGE mit anschließender
Coomassie-Färbung bestätigt (Abb. 7).
Die lösliche Proteinfraktion wurde für die
Affinitätschromatographie benutzt. Die UNICORN 5.2 Software (GE Healthcare, München) erlaubt eine Echtzeitanalyse während
der Aufreinigung präsentiert als Chromatogramm (siehe Abb. 6). Die Beladung der
Säule mit der Proteinprobe verursacht einen
Anstieg der UV-Absorbtion (vgl. Abb 6 blaue
Linie). Nach erfolgter Ladung sinkt folglich
der UV Wert. GST ist im ersten Drittel der
Elutionsfraktionen als eindeutiger Peak in
der UV- Absorption zu erkennen (siehe Abb.
6 Stern).
Nach der Aufreinigung wurden die jeweiligen Fraktionen bezogen auf ihren Proteingehalt und Reinheit mittels SDS-PAGE untersucht. Geladen wurden die jeweiligen Kontrollen (totaler Zellextrakt, Zellextrakt nach
Lyse, Überstand und ungebundene Proteine),
sowie Fraktionen innerhalb (A7-B7) und
außerhalb (A4 und C4) des UV-Peaks. Es ist
zu sehen, dass die Peakfraktionen das Zielprotein in hoher Menge und Reinheit enthalten (Abb. 7). Im Vergleich mit den Kontrollen
ist eine eindeutige Proteinbande bei 26 kDa
zu erkennen, die in den Peakfraktionen A11B12 den höchsten Proteingehalt aufweist.
Gleichzeitig ist im Vergleich des eingesetzten
Überstandes und dem ungebundenen Proteingehalt zu sehen, dass die exprimierte und
lösliche GST nahezu komplett aufgereinigt
werden konnte. Das deutet auf eine erfolgreiche und saubere Aufreinigung sowie Anreicherung des Proteins unter Verwendung von
arium® Reinstwasser hin. Unsauberes Wasser könnte bspw. durch veränderten Salzgehalt oder pH eine frühere oder spätere Elution von der Säulenmatrix zur Folge haben,
wodurch vor allem die Reproduzierbarkeit
des Experimentes beeinflusst werden würde.
Diskussion
Aufreinigung und Isolation spezifischer Proteine und die anschließende biochemische
Analyse dieser ist eine wichtige Methode
um die Funktion der Proteine besser verstehen zu können. Die Ergebnisse belegen, dass
das gesuchte Protein eindeutig als differenzierbare Bande isoliert werden konnte. Eine
solche distinkte Auftrennung lässt sich nur
durch absolut saubere Lösungen erzielen. Als
Grundlage der eingesetzten Lösungen diente
das arium® Reinstwasser, das problemlos für
die Versuchsdurchführung verwendet werden konnte, weil es sich durch seine gleichbleibende hohe Qualität bezüglich aller geforderten Werte wie z. B. Leitfähigkeit, TOC,
Salzgehalt auszeichnet. Die Identifizierung
über Gelektrophorese zeigte keine störenden
Schlieren, schlechte Fokussierung oder unspezifische Proteinbanden, wie es bei Anwesenheit von Salzen oder geladenen organischen Partikeln in den Lösungen geschehen
kann [6]. Um reproduzierbare verlässliche
Gelauswertungen zu bekommen, muss auf
saubere Puffer und Färbelösungen geachtet
werden. Da die hier beschriebene Versuchsdurchführung über Anzucht der Bakterien,
Herstellung der Lösungen bis hin zu den
Abb. 7: Colloidal Coomassie gefärbtes 10% SDS-PAGE Gel welches die aufgereinigte GST in
Nichtpeak- und Peakfraktionen zeigt. Kontrollen: Totaler Zellextrakt, nicht löslicher Teil nach
Zelllyse (Zellextrakt nach Lyse), löslicher Teil der eingesetzt wurde für die Chromatographie
(Überstand) und ungebundene Proteine.
Chromatographie-Läufen und abschließender Gelelektrophorese arbeitsintensive, kostspielige und zeitaufwendige Arbeiten sind,
schließt sich eine Verwendung von unsauberem Wasser/Chemikalien von vornherein
aus. Ein direkter Vergleich unterschiedlicher
Reinstwasserqualitäten konnte daher aus
diesen Gründen nicht durchgeführt werden.
Das in den beschriebenen Versuchen
frisch aufbereitete Reinstwasser stellt eine
kostengünstige Alternative zu käuflichem,
abgefüllten Reinstwasser dar und soll nach
Tarun et al., 2011 [6] auch zu erhöhter Anzahl
und besserer Verteilung von Proteinspots in
einem 2D-Gel im Vergleich zu Flaschenwasser führen.
Danksagung
Ein besonderer Dank der Autoren gilt Herrn
Prof. Dr. Volker Lipka für die wissenschaftliche Betreuung der Arbeit sowie Frau Dr. Elena Petutschnig (beide Schwann-Schleiden
Forschungszentrum für Molekulare Zellbiologie, Abteilung Zellbiologie der Pflanze,
Georg-August Universität Göttingen) für die
Durchsicht des Manuskriptes sowie für die
konstruktive Diskussion zum Thema.
Literatur
1.)Bende, Heinz: Affinitäts-Chromatographie,
Chemie in unserer Zeit, 8. Jahrgang, Nr. 1
(1974)
2.) Marrs, Kathleen A.: The Functions and Regulation of Glutathione S-Transferases in
Plants, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.
Biol., 47:127-158 (1996)
3.) Terpe, K.: Overview of bacterial expression
systems for heterologous protein production:
from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 72: 211-222, (2006)
4.)Terpe, Kay: Protein-Affinitäts-Tags, BIO­
spektrum, 0.4 07, 13. Jahrgang (2007)
5.) Dyballa, N.; Metzger, S.: Fast and Sensitive
Colloidal Coomassie G-250 Staining for
Proteins in Polyacrylamide Gels. JoVE. 30,
(2009) www.jove.com/details.php?id=1431,
doi: 10.3791/1431
6.) Tarun, M.; Mabic, S. und Schrader, M.: „Auf
die Reinheit kommt es an – Laborwasser­
qualität beeinflusst die Proteinauftrennung“,
Laborpraxis, Seiten 48-50, Okt. 2011
Kontakt |
Jan Erwig, M.Sc.
Schwann-Schleiden Forschungszentrum
für Molekulare Zellbiologie
Abteilung Zellbiologie der Pflanze,
Georg-August Universität Göttingen
Dr. Elmar Herbig
Sartorius Lab Instruments
GmbH & Co. KG
Göttingen