Synen RNA Clean-up Kit

Syngen RNA Clean-Up Kit
Specyfikacja:
- Wydajność: 80-95%
- Skala wejścia: maksymalnie 100 ug RNA w maksymalnie 100 ul roztworu
- Złoże wiąże do 100 ug RNA
- Skala wyjścia: 30-50 ul
Co potrzeba:
- Etanol 96-98%
- Wirówka na 14000 rpm
- Pipety automatyczne i tipsy, najlepiej z filtrem
Zanim zaczniesz:
- Sprawdź, czy nie wytrąciło się nic w żadnym buforze, jeśli tak, podgrzej go w 37°C i ostudź
- Przygotuj bufor RP2 dodając etanol w ilości podanej na fiolce (1 x 80 ml lub 2 x 140 ml).
Procedura
1. Uzupełnij objętość próbki do 100 ul przy pomocy wody wolnej od RNaz (dostarczono)
2. Dodaj 350 ul buforu wiążącego RW, zamknij i wymieszaj na worteksie.
3. Dodaj 250 ul etanolu 96-98% (nie dostarczono), zamknij i wymieszaj na worteksie.
4. Przenieś całą zawartość probówek z kroku 3 na kolumienkę R umieszczoną w probówce 2 ml do
płukania. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Wylej przesącz, nie
wyrzucaj probówki.
5. Otwórz kolumienkę, dodaj 250 ul buforu RP1. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną
prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki.
*** Jeśli wymagane jest RNA wolne od DNA, otwórz kolumienkę, dodaj na sam środek membrany 100 ul
roztworu DNazy I o stężeniu 0.5U/ul (nie dostarczono), zamknij wieczko i inkubuj przez 15 minut w
temperaturze pokojowej.
6. Otwórz kolumienkę i dodaj 250 ul buforu RP1. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną
prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki.
7. Otwórz kolumienkę i dodaj 750 ul buforu RP2. Zamknij wieczko i wiruj przez 1 minutę z maksymalną
prędkością. Wylej przesącz, nie wyrzucaj probówki. Powtórz krok 7.
8. Wiruj przez 3 minuty z maksymalną prędkością, aby wysuszyć membranę i pozbyć się z kolumienki
resztek buforów zawierających etanol. Upewnij się, że w rogu kolumienki nie został żaden płyn.
9. Przenieś kolumienkę R do probówki elucyjnej 1,5 ml i wyrzuć starą probówkę z resztkami buforu
płuczącego. Otwórz kolumienkę, ostrożnie, nie dotykając membrany, dodaj na sam środek membrany
30-50 ul wody wolnej od RNaz. Zamknij wieczko i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej,
aż bufor wsiąknie w membranę. Wiruj przez 2 minuty w T pokojowej z maksymalną prędkością.
10. Ostrożnie wysuń kolumienkę i zamknij wieczko w probówce z wyizolowanym RNA. Wyizolowany RNA
należy rozporcjować i przechowywać w temperaturze od -70°C do -86°C.
Samodzielne rozwiązywanie problemów
– Mała wydajność – RNA zostało na kolumnie – powtórz elucję, podgrzej wodę do elucji do 70°C, inkubuj na
kolumnie 5 minut.
– RNA zdegradowane – zanieczyszczenie RNazami – pracuj zgodnie z zasadami pracy z RNA, sprawdź
zanieczyszczeni buforów.
– Problem w reakcjach enzymatycznych – przeniesienie soli do elucji – upewnij się, że przygotowano bufor
RP2 zgodnie z zaleceniami oraz że powtórzono płukanie buforem RP2 w kroku 7.
– Niewłaściwy współczynnik A260/A280 – obecność DEPC w DEPC-owanej wodzie uzytej do elucji lub
rozcieńczenia – używaj wody dostarczonej z zestawem, przed pomiarem spektrofotometrycznym
rozcieńczaj próbkę przy pomocy 10 mM Tris-HCl a nie DEPC-owanej wody.