Morfologia komórki apoptotycznej

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Morfologia komórki apoptotycznej
1.Wstęp
PrzeŜycie wielokomórkowego organizmu zaleŜy nie tylko od namnaŜania się
i róŜnicowania odpowiedniej liczby komórek, ale takŜe od ich obumierania. Utrzymanie
równowagi pomiędzy powstawaniem nowych, a eliminacją niepotrzebnych komórek jest
niezwykle istotne dla funkcjonowania organizmu.
Samobójcza śmierć komórki jako naturalny element Ŝycia długo pozostawała
tajemnicą. O tym, Ŝe kaŜda komórka organizmu jest zaprogramowana tak, aby popełnić
samobójstwo po otrzymaniu odpowiednich sygnałów, przekonano się dopiero na początku lat
siedemdziesiątych. Wtedy teŜ po raz pierwszy uŜyto terminu apoptoza (w języku greckim
oznacza on opadanie liści z drzew lub płatków kwiatów).
Apoptoza jako śmierć czynna, wymagająca w swym przebiegu syntezy RNA i białek,
jest alternatywną formą śmierci w stosunku do martwicy (nekrozy), która jest śmiercią
przypadkową – bierną. Apoptoza zwana teŜ fizjologiczną lub programowaną śmiercią
komórki, występuje podczas całego rozwoju organizmu. Za jej pomocą organizm pozbywa się
nadmiaru niepotrzebnych komórek, a takŜe eliminuje zainfekowane, uszkodzone lub
zmutowane komórki. Ostatecznie zatem o liczbie komórek w organizmie decyduje
równowaga pomiędzy ich proliferacją i śmiercią, regulowana przede wszystkim przez
gospodarkę hormonalną ustroju, dostępność czynników wzrostowych oraz substancji
odŜywczych.
Apoptoza leŜy u podstaw procesu nowotworzenia. Obecnie uwaŜa się, Ŝe powstawanie
i rozwój nowotworu to nie tylko wynik nagromadzenia się mutacji w poszczególnych klasach
genów komórki. Równie istotnym czynnikiem w tych procesach jest równieŜ zdolność
komórek nowotworowych do wyłączenia mechanizmu samozniszczenia. MoŜe to prowadzić
do nieprawidłowego zwiększenia Ŝywotności komórek, wydłuŜania ich Ŝycia, utrwalania juŜ
zaistniałych mutacji, zakłóceń w przebiegu cyklu komórkowego oraz wystąpienia oporności
komórek na działanie cytostatyków. Ograniczenie zjawiska apoptozy prowadzi równieŜ do
powstania szeregu złośliwych chorób proliferacyjnych oraz autoagresji układu
odpornościowego [Arends M. J., 1991].
2. Zmiany w morfologii komórki umierającej na drodze apoptozy
Komórki umierające w wyniku apoptozy wykazują szereg charakterystycznych,
morfologicznych zmian. Komórka apoptotyczna z reguły oddziela się od pozostałych. Na
skutek utraty wewnątrzkomórkowej wody i elektrolitów dochodzi do jej obkurczenia, zmiany
kształtu, wielkości oraz zagęszczenia cytoplazmy. Powierzchnia takiej komórki ulega
charakterystycznemu pofałdowaniu. Jednocześnie dochodzi do zmian w chromatynie
jądrowej. Ulega ona zagęszczeniu i początkowo gromadzi się w pobliŜu błony jądrowej.
Następnie wypełnia ona całe jądro, które staje się pyknotyczne. Organella są gęsto
upakowane w cytoplazmie i nie wykazują znaczących zmian morfologicznych. Cechą
charakterystyczną dla apoptozy jest równieŜ fragmentacja jądra komórkowego oraz
powstawanie tzw. ciałek apoptotycznych w późniejszych stadiach tego procesu. W przypadku
apoptozy zawartość komórki nie wydostaje się na zewnątrz i nie dochodzi do powstania
odczynów zapalnych. Dzieje się tak dzięki tworzeniu się nierozpuszczalnej osłony
stabilizującej integralność całej komórki apoptotycznej, a w późniejszym etapie równieŜ
ciałek apoptotycznych. Jest to efekt tworzenia się dodatkowych wiązań pomiędzy białkami
błonowymi. W warunkach fizjologicznych, komórki podlegające apoptozie są fagocytowane
przez makrofagi lub sąsiadujące komórki. W hodowli zaś, wobec braku komórek
fagocytujących, komórki apoptotyczne ulegają wtórnej martwicy [Sikora E., 1994].
Rys. 1. Zmiany morfologiczne zachodzące w komórce apoptotycznej. A - kondensacja chromatyny,
której towarzyszy obkurczenie komórki i zagęszczenie cytoplazmy; B - fragmentacja jądra
komórkowego; C – fagocytoza [na podstawie www.mol.uj.edu.pl - zmienione].
3. Zmiany biochemiczne zachodzące w komórce umierającej na drodze apoptozy
Zmiany zachodzące w błonie plazmatycznej komórki podczas procesu apoptozy
Cechą charakterystyczną procesu apoptozy są zmiany zachodzące w budowie błony
komórkowej. Dochodzi wówczas do zaburzenia asymetrii w rozmieszczeniu fosfolipidów
błonowych. W normalnej komórce na powierzchni błony przewaŜają fosfolipidy obojętne, do
których zalicza się: sfingomielinę i fosfatydylocholinę. W warstwie wewnętrznej zaś
dominują fosfolipidy anionowe, takie jak fosfatydyloseryna.
W komórkach apoptotycznych fosfatydyloseryna jest eksponowana w zewnętrznej
warstwie błony komórkowej. Zjawisko to wykorzystuje się do znakowania komórek
apoptotycznych za pośrednictwem aneksyny V, która ma zdolność do preferencyjnego
wiązania się z ujemnie naładowanymi fosfolipidami, takimi jak fosfatydyloseryna
[DarŜynkiewicz Z. i wsp., 1996].
Rys. 2. Zmiany zachodzące w budowie błony komórkowej we wczesnych fazach apoptozy
[DarŜynkiewicz Z. i wsp., 1996 - zmienione].
Zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów
Apoptoza jest ściśle kontrolowana na poziomie mitochondriów. Jednym z kluczowych
parametrów, określających zaburzenie funkcji tych organelli podczas apoptozy, jest spadek
potencjału elektrochemicznego (∆Ψm) na wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Następuje on
przed pojawieniem się fragmentacji DNA i charakterystycznych dla apoptozy zmian
w morfologii komórki. Spadek potencjału ∆Ψm poniŜej krytycznej wartości tzw. potencjału
bramkującego, sprzyja otwieraniu tzw. megakanałów mitochondrialnych, co nieodwracalnie
prowadzi do apoptozy. W wyniku otwarcia tychŜe megakanałów dochodzi do uwolnienia
z przestrzeni międzybłonowej mitochondriów do cytoplazmy szeregu białek apoptogennych,
takich jak cytochrom c, czynnik indukujący apoptozę (AIF) oraz prokaspazy 2, 3 i 9 [Green
D. i Reed J. C., 1998].
Fragmentacja DNA
Kolejnym, charakterystycznym znacznikiem procesu apoptozy jest degradacja DNA,
przebiegająca w kilku następujących po sobie etapach. W pierwszym z nich powstają duŜe
fragmenty DNA (HMW, ang. high molecular DNA), osiągające wielkość od 300 do 50
tysięcy par zasad. W kolejnym etapie, DNA moŜe ulec fragmentacji do krótkich odcinków,
będących wielokrotnością około 200 par zasad. Stosując technikę elektroforezy w Ŝelu
agarozowym moŜna rozdzielić DNA podegradowane na mono- i oligonukleosomy.
Fragmenty te układają się na elektroforegramie w charakterystyczną „drabinkę”. Do
fragmentacji DNA dochodzi w wyniku aktywacji specyficznych endonukleaz, takich jak DFF40/CAD
oraz endonukleaza G, czy lizosomalna DNaza II [Peitsch M. C. i wsp., 1994].
Aktywacja specyficznych enzymów proteolitycznych – kaspaz
Kaspazy to specyficzna klasa enzymów będących protezami cysteinowymi, które
przecinają łańcuch polipeptydowy na reszcie argininy w określonej sekwencji
aminokwasowej. Enzymy te syntetyzowane są w postaci nieaktywnego zymogenu, a ich
funkcje fizjologiczne w normalnej komórce nie są znane. Zostały one podzielone na dwie
grupy: kaspazy inicjatorowe i kaspazy egzekutorowe. W początkowej fazie apoptozy
aktywowane są kaspazy inicjatorowe, a dopiero później kaspazy egzekutorowe, których
substratami są róŜne białka komórkowe (np. PARP, kinaza DNA – PK, topoizomeraza II,
aktyna, gelsolina, lamina B) [Grądzka I., 2000].
4. Wykonanie ćwiczenia
Zadaniem studentów będzie przygotowanie dwóch róŜnych preparatów komórkowych,
pozwalających zaobserwować zmiany w morfologii komórek (w szczególności jądra
komórkowego), wynikających z uruchomienia apoptozy w tychŜe komórkach.
Barwienie róŜnicowe komórek z zastosowaniem jodku propidyny oraz di octanu fluoresceiny
Jednym z podstawowych testów wykorzystywanych do odróŜnienia komórek
martwych od Ŝywych jest tzw. barwienie róŜnicowe za pomocą dwóch barwników
fluorescencyjnych, takich jak jodek propidyny (PI) oraz dioctan fluoresceiny (FDA). Dioctan
fluoresceiny jest nie polarną i nie fluoryzującą pochodną fluoresceiny, która posiada zdolność
do przenika przez błonę komórkową. Po wniknięciu do komórki, FDA jest hydrolizowany
przez wewnątrzkomórkowe esterazy do fluoresceiny – związku wykazującego właściwości
fluoryzujące. Komórki Ŝywe, przejawiające duŜą aktywność esteraz, kumulują znaczne ilości
fluoresceiny, co w konsekwencji powadzi do otrzymania intensywnej fluorescencji zielonej.
Komórki apoptotyczne i martwe, cechujące się mniejszą aktywnością esteraz oraz słabiej
zachowaną integralnością błony komórkowej, słabiej akumulują produkt hydrolizy FDA, co
oznacza mniejsze wartości zielonej fluorescencji tychŜe komórek [Dębowska R. i inni, 2007].
Jodek propidyny, ze względu na posiadany ładunek elektryczny, nie przenika przez
nieuszkodzoną błonę komórek Ŝywych i wczesnoapoptotycznych. Barwi on jednak na
czerwono komórki z uszkodzoną błoną cytoplazmatyczną, a więc nekrotyczne lub znajdujące
się w późnych fazach apoptozy.
W celu wykonania tej części ćwiczenia naleŜy do 1 ml dostarczonej przez
prowadzącego zawiesiny komórek (2 x 106 komórek) dodać 2 µl roztworu dioctanu
fluoresceiny (roztwór FDA w acetonie o stęŜeniu 1 mg/ml), a następnie barwić całość przez
15 minut w temperaturze 37°C. W dalszej kolejności naleŜy dodać do zawiesiny komórek
20 µl roztworu jodku propidyny (roztwór PI w wodzie o stęŜeniu 1 mg/ml) i po upływie około
1 minuty przygotować preparat mikroskopowy. Przygotowany w ten sposób preparat
oglądamy w mikroskopie fluorescencyjnym przy wzbudzeniu światłem niebieskim.
Barwienie utrwalonego preparatu komórkowego
Podstawowym i najprostszym sposobem identyfikacji procesu apoptozy jest zbadanie
zmian w morfologii jąder komórkowych przy uŜyciu barwnika fluorescencyjnego DAPI,
który silnie wiąŜe się do DNA (dwuniciowego) na zasadzie interkalacji. Utrwalone za pomocą
etanolu komórki, ekstrahujemy w buforze fosforanowym z dodatkiem kwasu cytrynowego
w celu usunięcia z komórek umierających na drodze apoptozy pofragmentowanego DNA
(fragmenty DNA znajdujące się w cytoplazmie mogą przeszkadzać w odróŜnieniu komórek
normalnych od apoptotycznych). Następnie komórki barwimy fluorochromem DAPI
(wybarwia jądro komórkowe) oraz barwnikiem barwiącym białka – w tym przypadku
sulforodaminą 101 (wybarwia przede wszystkim cytoplazmę).
W celu wykonania tej części ćwiczenia naleŜy do 1 ml zawiesiny komórek (1 x 106
komórek) dodać 5 ml 70%, zimnego etanolu i inkubować w lodzie przez 30 minut. Następnie
całość wirować w następujących warunkach: 4°C/5 min./1000 rpm. Po wirowaniu zawiesić
komórki w 5 ml roztworu soli fizjologicznej (PBS) i ponownie odwirować w podanych
powyŜej warunkach. Nadsącz odrzucić, a osad komórek zawiesić w 1 ml PBS – u
z dodatkiem 1 ml buforu fosforanowego z dodatkiem kwasu cytrynowego (bufor
otrzymujemy poprzez zmieszanie 60 µl 0,1 M kwasu cytrynowego i 1440 µl 0,2 M fosforanu
sodu Na2HPO4). Ekstrahować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. W dalszej kolejności
zawiesinę komórek naleŜy zwirować i osad zawiesić w 1 ml buforu barwiącego, w skład
którego wchodzą: 10 mM bufor PIPES (pH 6,8), 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,1% Triton
X-100, 1 µg DAPI, 20 µg sulforodamina 101. Całość barwić przez 5 minut w temperaturze
pokojowej. Tak przygotowany preparat odwirować przy pomocy cytowirówki (CytoFuge 2)
(4 min./700 rpm) w celu osadzenia komórek na szkiełku podstawowym, a następnie
prowadzić obserwacje w mikroskopie fluorescencyjnym przy wzbudzeniu światłem UV.
4. Opracowanie wyników
Sprawozdanie z wykonania ćwiczenia powinno zawierać:
- zwięzły opis jego przebiegu wraz z wyjaśnieniem zasad postępowania,
- opisać róŜnice w morfologii komórek normalnych i apoptotycznych po zastosowaniu
róŜnych metod barwienia,
- napisać, która z zastosowanych podczas ćwiczenia metod barwienia bardziej nadaje
się do odróŜnienia komórek normalnych od komórek apoptotycznych (wybór uzasadnić).
5. Literatura
1. Arends M.J., Wyllie A.H.: Apoptosis: mechanism and roles in pathology, Int. Rev. Exp.
Path. 1991; 32: 223 – 254,
2. Sikora E.: Mechanizmy śmierci
Post. Bioch. 1994; 40 (3): 150 – 159,
programowanej
komórek
(apoptozy),
3. DarŜynkiewicz Z., Gorczyca W., Ardelt B., Halicka D., Juan G., Traganos F.:
Cytometria apoptozy i martwicy, Central European J. Immunol. 1996;
21: 156 – 170,
4. Green D., Reed JC.: Mitochondria and apoptosis, Science 1998; 281: 1309 – 1311,
5. Peitsch MC., Mannherz HG., Tscgopp J.: The apoptosis endonukleases: cleaning up
after cell death?, Trends Cell Biol. 1994; 4: 37-41,
6. Dębowska R., Bazela K., Eris I.: Apoptoza i ochronne działanie kwasu foliowego,
Dermatologia estetyczna 2007; 9 (2): 83-90.