Przepis do_wiadczenia - izolacja DNA Przepis do_wiadczenia
Transkrypt
Przepis do_wiadczenia - izolacja DNA Przepis do_wiadczenia
Przepis do_wiadczenia - izolacja DNA 1. Podpisa_ (np. swoimi inicja_ami) wszystkie puste probówki znajduj_ce si_ w!statywie, na wieczku i z boku probówki – pozwoli to unikn__ pomylenia próbek. 2. Steryln_ pa_eczk_ do wymazów pobiera si_ próbk_ komórek z nab_onka jamy ustnej. Ze wzgl_du na wysok_ czu_o__ techniki PCR nie mo_na dopu_ci_ do zanieczyszczenia pa_eczki innymi _ród_ami DNA! 3. Natychmiast po pobraniu wymazu nale_y odci__ fragment pa_eczki z próbk_ i umie_ci_ j_ w zielonej probówce, w której znajduje si_ roztwór lizuj_cy (oparty na SDSie). 4. Prowadz_cy dodaj_ do ka_dej zielonej probówki z próbk_ DNA 20 _l (0,02 ml) proteinazy K (z grzyba Tritirachium album limber). 5. Dobrze zamkn__ (SDS si_ bardzo pieni!)! Delikatnie wymiesza_. 6. Inkubowa_ przez 20 minut w 37°C, od czasu do czasu mieszaj_c. 7. W_o_y_ kolumienk_ do probówki 2ml. Roztwór z probówki nanie__ ostro_nie na kolumienk_ do oczyszczania DNA. Uwa_a_ _eby nie dotkn__ ko_cówk_ bia_ego z_o_a! 8. Wirowa_ przez 1 minut_ przy 12 tys. obrotów. 9. Wyla_ zawarto__ dolnej probówki i w_o_y_ do niej ponownie kolumienk_. 10. Doda_ 500 _l roztworu p_ucz_cego A1 (czerwona probówka – napisy si_ _cieraj_!). 11. Wirowa_ przez 1 minut_ przy 12 tys. obrotów. 12. Wyla_ zawarto__ spodniej probówki i w_o_y_ do niej ponownie kolumienk_. 13. Doda_ 500 _l roztworu p_ucz_cego A1. 14. Wirowa_ przez 2 minuty przy 12 tys. Obrotów 15. Wyrzuci_ doln_ probówk_, a kolumienk_ umie_ci_ w NOWEJ, bia_ej, uprzednio podpisanej probówce 1,5 ml z oberwanym _epkiem. 16. Sprawnie i ostro_nie doda_ na „dno” kolumienki 50 _l wody o temperaturze 75°C. 17. Inkubowa_ 3 minuty w temperaturze pokojowej. 18. Wirowa_ przez 1 minut_ przy 12 tys. obrotów. 19. Kolumienk_ wyrzuci_, wodny roztwór DNA znajduj_cy si_ na dnie probówki zachowa_, zakrywaj_c wieczkiem. Przepis do_wiadczenia - PCR 1. Otrzyman_ probóweczk_ do PCR ( z mieszanin_ reakcyjn_ bez DNA) szybko podpisa_ i najszybciej, jak to mo_liwe, umie_ci_ w lodzie. W probówce s_ ju_: bufor, jony magnezu, deoksynukleotydy (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), startery, polimeraza, woda. 2. Do probówki do PCR doda_ 5 _l DNA, probówk_ zamkn__ i do momentu umieszczenia jej w aparacie do PCR trzyma_ w lodzie. Przepis do_wiadczenia – elektroforeza w _elu agarozowym 1. Do probówki z produktem PCR i doda_ do niej 4 _l barwnika i!rozmiesza_ go a_ do uzyskania jednolitego zabarwienia roztworu. 2. Je_li próbka rozmaza_a si_ po _ciankach probówki – króciutko zwirowa_. 3. Ostro_nie i z wyczuciem na_o_y_ 12 ml próbki z!barwnikiem do studzienki, zapisuj_c, do której studzienki na_o_y_o si_ próbk_. 4. W__czy_ pr_d - napi_cie!!! 5. Po up_ywie min. 30 min. wy__czy_ pr_d, _el wraz z saneczkami W!R_KAWICZKACH przenie__ i!obejrze_ w _wietle UV. standard wielko_ci – uk_ad i d_ugo__ pr__ków Volume 15 _l for 20 probes: Woda 2,3 46 Bufor 10x 1,5 30 MgCl2 1,2 24 dNTP 2,5mM 1,5 30 Startery 5mM 1,5+1,5 30+30 DNA 5 - Taq 1u/ml 0,5 10