Monoclonal Mouse Anti-Epstein-Barr Virus, LMP Klon CS.1

Monoclonal Mouse
Anti-Epstein-Barr Virus, LMP
Klon CS.1-4
Nr kat. M 0897
Wydanie 24.03.03
Przeznaczenie
Do diagnostyki in vitro.
Monoclonal Mouse Anti-Epstein-Barr Virus, LMP, klon CS.1-4, jest przeznaczone do stosowania w
immunocytochemii. Przeciwciało znakuje komórki zainfekowane wirusem Epstein-Barr wykazujące ekspresję
ukrytego białka błonowego (LMP), i jest pomocnym narzędziem do identyfikacji komórek guza w związanej z
infekcją wirusem Epstein-Barr chorobą Hodgkina (1-3) i rakiem nosogardzieli (4). Identyfikacja różnicowa
dokonywana jest w oparciu o wyniki uzyskane dla panelu przeciwciał. Interpretacja musi być dokonana przez
wykwalifikowanego patologa w kontekście historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Wprowadzenie
Wirus Epstein-Barr (EBV) jest ludzkim wirusem opryszczki, normalnie występującym jako szeroko
rozpowszechniona bezobjawowa infekcja ponad >95% światowej populacji osób dorosłych będących przez całe
swoje życie nosicielami infekcji. Genom wirusa jest dwułąńcuchową cząsteczką DNA o około 172 kD kodującą co
najmniej 80 białek. Dwa występujące szczepy EBV mają identyczną przeważającą część genomu (5, 6).
Zainfekowane EBV komórki i nowotwory zwykle wykazują jeden z trzech różnych modeli ekspresji genów
związanych związanych z okresem utajenia. W utajeniu typu I tylko zakodowany antygen jądrowy EBV 1 (EBNA-1)
wykazuje ekspresję łącznie z dwoma małymi poliadenylowanymi jądrowymi RNA (EBER 1 i 2) występującymi w
chłoniaku Burkitta. W utajeniu typu II obserwowana jest dodatkowa ekspresja trzech ukrytych białek błonowych,
LMP-1, LMP-2A i LMP-2B, widoczna w chorobie Hodgkina i raku nosogardzieli. Utajenie typu III występuje w
chorobach limfoproliferacyjnych rozwijających się u osób z obniżoną odpornością i EBV-transformowaną linią
komórek limfoidalnych. W tej grupie obserwowana jest ekspresja wszystkich sześciu EBNA (EBNA1/2/3A/3B/3C/LP), wszystkich trzech LMP i dwóch EBER (6).
Integralne białko błonowe, LMP-1, zakodowane jest przez gen BNRF1 i zawiera 386 aminokwasów o masie
cząsteczkowej 63 kDa. Jest ono uważane za białko onkogenne mające ostatecznie znaczenie w czterech szlakach
transkrypcyjnych czynników sygnalizacyjnych i indukuje ekspresję wielu markerów powierzchniowych komórek oraz
komórkowych molekuł adhezyjnych (4, 5). EBV związany jest z pewnymi guzami typu limfoidalnego i
nabłonkowego, włączając chłoniak Burkitta (BL), chłoniak immunoblastyczny (IBL), chłoniak T-komórkowy,
chorobę Hodgkina (HD), rak nosogardzieli (NPC) i rak żołądkowy. Sytuacja, kiedy zachodzi tylko pełna replikacja
wirusa zwykle obserwowana jest w włochatej leukoplakii, łagodnym nowotworze języka często spotykanym u
pacjentów z AIDS (5, 6).
Odczynnik dostarczony
Mieszanina czterech mysich przeciwciał monoklonalnych dostarczona w formie płynnej jako nadsącz hodowli
komórkowej dializowanej wobec 0.05 mol/L Tris/HCl, pH 7.2, zawierający 15 mmol/L NaN 3.
Klon: CS.1, CS.2, CS.3 i CS.4 (7). Izotyp: IgG1, kappa.
Stężenie mysiej IgG : Patrz etykietka na fiolce.
Immunogen
Połączone w wyniku rekombinacji białko zawierające sekwencję bakteryjnej beta-galactozydazy i karboksylową
połowę EBV-zakodowanego LMP (7).
Swoistość
W Western-blottingu lizatów EBV-transformowanych komórek linii limfoidalnych przeciwciało znakuje główne
pasmo 57-66 kDa w zależności od izolowanego wirusa, czasami łącznie z mniejszym pasmem 50-55 kDa co
odpowiada postaci LMP w pełnej długości i z odciętymi końcami. Przeciwciało rozpoznaje 20 geograficznie
odmiennych wyizolowanych EBV (7). Przeciwciało reaguje krzyżowo z 43-44 kDa dubletem niecharakterystycznych
prawidłowych białek komórek w ekstraktach komórkowych, również tych z kontrolnych linii komórek EBVujemnych (7).
Przeciwciało znakuje prawidłowe EBV-dodatnie komórki linii limfoblastycznej powstałe w wyniku infekcji
prawidłowych spoczynkowych komórek B wirusem B95.8, podczas gdy linia komórek BL2, uzyskana od rzadkich,
sporadycznie EBV-ujemnych BL-pacjenta, jak również inne nie mające związku izolaty komórkowe, uwzględniając
migdałkowe limfocyty B i T, płodową wątrobę i grasicę, hodowle płodowych fibroblastów, linie komórkowe ludzkiej
białaczki HSB2 i K562 i 7 EBV-ujemnych linii komórek B wykazują brak znakowania, z wyjątkiem komórkowego
dubletu białek (7).
Środki ostrożności
1. Do stosowania przez osoby przygotowane zawodowo.
2. Produkt zawiera azydek sodowy (NaN3), odczynnik chemiczny silnie toksyczny w czystej postaci. W stężeniu
obecnym w produkcie, chociaż nie klasyfikowanym jako niebezpieczne, azydek sodowy może reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, tworząc silnie wybuchowe pochodne lub azydki tych
metali. Przy usuwaniu odpadów przepłukać spływ dużą ilością wody, aby uniknąć tworzenia się azydków.
3. Jak w przypadku każdego materiału biologicznego należy stosować odpowiednie procedury.
Przechowywanie
(112019-002)
Przechowywać w temp. 2-8oC. Nie używać po upływie daty ważności wskazanej na opakowaniu. Jeśli produkt
był przechowywany w warunkach innych niż wskazane, użytkownik musi sprawdzić jakość produktu. Brak jest
widocznych oznak wskazujących na niestabilność niniejszego odczynnika. Dlatego kontrola pozytywna i
negatywna powinna być wykonywana równocześnie z próbkami pacjentów. Jeżeli uzyskuje się nieoczekiwane
wyniki bez zmiany procedur laboratoryjnych i można podejrzewać, że dzieje się to z winy przeciwciała, należy
skontaktować się z serwisem technicznym firmy Dako.
M 0897/PL/SUA/24.03.03 s. 1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Przygotowanie próbek
Skrawki parafinowe: Przeciwciało może być zastosowane do znakowania tkanki utrwalonej w formalinie i
zatopionej w parafinie. Wymagane jest wstępne opracowanie tkanek przy użyciu proteinazy K lub termiczna
indukcja epitorów dająca optymalne rezultaty przy użyciu Dako Target Retrieval Solution nr kat.S 1700, Dako
Target Retrieval Solution, High pH, nr kat. S 3308, 10 mmol/L bujforu cytrynianowego o pH 6.0 lub 10 mmol/L
buforu Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 9.0. Skrawki tkankowe nie powinny wyschnąć podczas wstępnego traktowania
lub podczas następującej procedury barwienia. Jeżeli stabilność rozcieńczonego przeciwciała i kontroli
negatywnej nie została określona w aktualnej procedurze barwienia, zaleca się rozcieńczanie tych odczynników
bezpośrednio przed użyciem, lub rozcieńczanie w Dako Antibody Diluent, nr kat. S 0809. Kontrola pozytywna i
negatywna powinny być wykonywane równocześnie z próbkami pacjentów.
Mrożone skrawki tkankowe i preparaty komórkowe: Przeciwciało może być stosowane do znakowania
utrwalonych acetonem, mrożonych skrawków tkankowych i preparatów komórkowych (1, 7).
Procedura barwienia
Rozcieńczenie: Monoclonal Mouse Anti-Epstein-Barr Virus, LMP, nr kat. M 0897, może być rozcieńczane w
zakresie od 1:100 do 1:200 jeżeli jest stosowane wobec skrawków ludzkiej EBV-pozytywnej okrężnicy
utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, po 20 minutach indukowanego termicznie odzyskiwania
epitopów przy użyciu Dako Target Retrieval Solution, nr kat. S 1700 i 30 minutach inkubacji z pierwotnym
przeciwciałem w temperaturze pokojowej. Optymalne warunki reakcji, zmienne w zależności od rodzaju
preparatu i sposobu jego przygotowania, powinny być ustalone niezależnie dla każdego laboratorium. Zalecaną
kontrolą negatywną jest Dako Mouse IgG1, nr kat. X 0931, rozcieńczone do uzyskania takiego samego
stężenia mysiej IgG jakie wykazuje stosowane pierwotne przeciwciało.
Wizualizacja: DAKO LSAB™+/HRP kit, nr kat. K 0679 oraz DAKO EnVision™+/HRP kits, nr kat. K 4004 i K
4006 są zalecane. Dla mrożonych skrawków tkankowych i preparatów komórkowych dobrą alternatywą jest
Dako APAAP kit, nr kat. K 0670 jeżeli nie ma znaczenia wybarwienie związane z endogenna peroksydazą.
Postępowanie zgodne z opisem procedury załączonym do wybranego zestawu wizualizacyjnergo.
Szczególne ograniczenia
W przypadku mrożonych skrawków tkankowych odnotowano słabą reakcję krzyżową w komórkach mięśni gładkich
oraz niewielkiej liczbie komórek plazmatycznych (1). Zaobserwowano także reaktywność w przypadku
obwodowej tkanki nerwowej (8). W skrawkach utrwalonych formaliną i zatopionych w parafinie wykryto słabą
reakcję krzyżową w warstwie trzeciej i czwartej kory mózgowej, w nerwach obwodowych oraz w podstawnej
warstwie komórek prawidłowej skóry. Komórki mięśniowo-nabłonkowe oraz komórki mięśni gładkich także
wykazują słabą reakcję krzyżową (8). W przypadku B oraz T komórkowych chłoniaków nie będących
chłoniakiem Hodgkina mrożone skrawki wydają się lepiej wybarwiać aniżeli skrawki utrwalane formaliną i
zatopione w parafinie (8).
Charakterystyka wyników
Komórki wyznakowane przeciwciałem wykazują cytoplazmatyczny i błonowy model wybarwienia.
Prawidłowe tkanki: Przeciwciało nie znakuje ani prawidłowej błony śluzowej nosogardzieli, ani nacieczonego
limfocytami, włókniejącego zrębu i prawidłowego nabłonka okrywającego w pierwotnych preparatach nosogardzieli
(4). Przeciwciało nie wykazuje znakowania w obrębie jelita grubego, wyrostka robaczkowego oraz trzustki (8). Silne
znakowanie prawidłowych wczesnych prekursorowych komórek mieloidalnych i erytroidalnych można
zaobserwować pomimo stwierdzonego metodą PCR całkowitego braku dowodów obecności EBV (9).
Patologiczne tkanki: W mrożonych skrawkach 84 przypadków choroby Hodgkina 40/84 wykazywało silnie
wyznakowane przeciwciałem komórki Hodgkina oraz Reed-Sternberga. Proporcja ta zmieniała się w zależności
od podtypu histologicznego, gdzie wybarwienie wykazano w 1/10 podtypie z przewagą limfocytów, 16/52
podtypach włókniejących oraz 23/24 podtypach mieszanokomórkowych (1). Przeciwciało znakowało 22/46
zatopione w parafinie tkanki przypadków choroby Hodgkina z 1/12 przewagą limfocytów, 12/24 włóknieniem,
6/7 typem mieszanokomórkowym oraz 3/3 podtypy z nadmierną utratą limfocytów (2) W innych badaniach
obejmujących 47 chłoniaków Hodgkina 32/47 były wyznakowane przeciwciałem, w tym 28/42 przypadki
podtypu włókniejącego oraz 4/5 podtypu mieszanokomórkowego (3). Wśród 51 raków nosogardzieli
przeciwciało znakowało 40/51, w tym 8/10 raków płaskonabłonkowych rogowaciejących, 7/12 raków
płaskonabłonkowych nierogowaciejących oraz 25/29 raków niezróżnicowanych (4).
Literatura
(112019-002)
1.
Pallesen G, Hamilton-Dutoit SJ, Rowe M, Young LS. Expression of Epstein-Barr virus latent gene
products in tumour cells of Hodgkin’s disease. Lancet 1991;337:320-2.
2.
Murray PG, Young LS, Rowe M, Crocker J. Immunohistochemical demonstration of the Epstein-Barr
virus-encoded latent membrane protein in paraffin sections of Hodgkin’s disease. J Pathol 1992;166:1-5.
3.
Engel M, Essop MF, Close P, Hartley P, Pallesen G, Sinclair-Smith C. Improved prognosis of EpsteinBarr virus associated childhood Hodgkin’s lymphoma: study of 47 South African cases. J Clin Pathol
2000;53:182-6.
4.
Vera-Sempere FJ, Burgos JS, Botella MS, Cordoba J, Gobernado M. Immunohistochemical expression
of Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein (LMP-1) in paraffin sections of EBV-associated
nasopharyngeal carcinoma in Spanish patients. Oral Oncol, Eur J Cancer 1996;32B:163-8.
5.
Baumforth KRN, Young LS, Flavell KJ, Constandinou C, Murray PG. The Epstein-Barr virus and its
association with human cancers [review]. J Clin Pathol: Mod Pathol 1999;52:307-22.
6.
Cruchley AT, Williams DM, Niedobitek G, Young LS. Epstein-Barr virus: biology and disease [review].
Oral Diseases 1997;3 Suppl 1: S156-63.
7.
Rowe M, Evans HS, Young LS, Hennessy K, Kieff E, Rickinson AB. Monoclonal antibodies to the latent
membrane protein of Epstein-Barr virus reveal heterogeneity of the protein and inducible expression in
virus-transformed cells. J Gen Virol 1987;68:1575-86.
8.
Jiwa NM, Oudejans JJ, Dukers DF, Vos W, Horstman A, van der Valk P, et al. Immunohistochemical
demonstration of different latent membrane protein-1 epitopes of Epstein-Barr virus in lymphoproliferative
diseases. J Clin Pathol 1995:48:438-42.
9.
Leong ASY, Cooper K, Leong FJWM. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. Oxford
University Press; 199. p. 162.
M 0897/PL/SUA/24.03.03 s. 2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Objaśnienia symboli
(112019-002)
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Numer serii
Sprawdź w instrukcji
stosowania
Zużyć przed
Producent
M 0897/PL/SUA/24.03.03 s. 3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17