BACTEC NAP TB Differentiation Test Kit

0BACTEC NAP TB Differentiation
Test Kit
PRZEZNACZENIE
8
PP119JAA
2010/07
Polski
Test do ró¿nicowania TB NAP BACTEC jest testem ró¿nicuj¹cym kompleks pr¹tka gruŸlicy (Mycobacterium tuberculosis) od innych
pr¹tków. Podstawowe zastosowanie – do aparatu systemu 460TB BACTEC. Zaleca siê stosowanie testu do ró¿nicowania TB NAP BACTEC
(NAP: ρ-nitro-α-acetyloamino-β-hydroksypropiofenon) z po¿ywk¹ 12B BACTEC w celu szybkiego ró¿nicowania kompleksu TB
(M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum i M. microti) od pr¹tków innych ni¿ pr¹tki gruŸlicy (MOTT, mycobacteria other than
M. tuberculosis). Test nale¿y stosowaæ ³¹cznie z okreœlaniem morfologii bakterii w rozmazie i charakterystyki wzrostu w po¿ywce
12B BACTEC.
STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIE
Po¿ywka 12B BACTEC 12B nie umo¿liwia obserwowania morfologii kolonii, jednak wynik mierzony w GI mo¿e byæ charakterystyczny
dla pewnych gatunków pr¹tków. M. tuberculosis i M. bovis wykazuj¹ wzrost powolny, z 2 – 3-krotnym wzrostem dziennego wyniku
GI, podczas gdy inne pr¹tki (bakterie MOTT) mog¹ wykazywaæ a¿ 10-krotny wzrost dzienny. Obserwowany wzrokowo wzrost
M. tuberculosis w po¿ywce 12B BACTEC wygl¹da jak ma³e plamki lub skupiska w przejrzystej po¿ywce. Inne pr¹tki rosn¹ w bardzo
ma³ych grudkach i mog¹ powodowaæ niewielkie zmêtnienie po¿ywki.
Rozmazy wykonane z fiolek o wyniku dodatnim (GI = 100 lub wiêcej) mog¹ dostarczaæ wskazówek na temat typu pr¹tków rosn¹cych
w po¿ywce. Cech¹ M. tuberculosis jest tworzenie wê¿ykowatych nici i grudek (tak¿e M. bovis i M. kansasii mog¹ tworzyæ nici).
Inne pr¹tki maj¹ innego typu charakterystyczn¹ morfologiê, np. M. avium/M. intracellulare tworz¹ rozga³êzienia z d³ugimi
³añcuchami bakterii.
Test NAP BACTEC u³atwia tak¿e szybkie ró¿nicowanie M. tuberculosis – najwa¿niejszego gatunku pr¹tków. Jest to test niezale¿ny od
testu niacynowego. Próbkê aktywnie rosn¹cej hodowli inokuluje siê do fiolki NAP, zawieraj¹cej kr¹¿ek z 5 µg NAP. Fiolkê wraz
z kontrol¹ inkubuje siê i monitoruje siê jej wzrost w obecnoœci NAP w aparacie systemu 460TB BACTEC. Analiza dziennych odczytów
GI w ci¹gu nastêpnych 3 – 5 dni umo¿liwia ró¿nicowanie kompleksu TB od innych pr¹tków.
ZASADY PROCEDURY
NAP (ρ-nitro-α-acetyloamino-β-hydroksypropofenon) – zwi¹zek poœredni w syntezie chloramfenikolu, niemal ca³kowicie hamuje
wzrost pr¹tków nale¿¹cych do kompleksu TB (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum i M. microti), podczas gdy inne pr¹tki wykazuj¹
niewielkie zahamowanie lub nie wykazuj¹ go wcale. Po zahamowaniu wzrostu pr¹tków w obecnoœci NAP zahamowaniu ulega tak¿e
uwalnianie 14CO2, na co wskazuje brak wzrostu lub spadek GI. Ten wp³yw na GI stosuje siê jako narzêdzie do identyfikacji.
ODCZYNNIKI
Fiolki zestawu NAP BACTEC zawieraj¹ kr¹¿ki papierowe z nastêpuj¹cymi sk³adnikami czynnymi:
ρ-nitro-α-acetylamino-β-hydroksypropofenon
5 µg
Ostrze¿enia i œrodki ostro¿noœci
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Produkt zawiera suchy kauczuk naturalny.
W próbkach klinicznych mog¹ byæ obecne drobnoustroje patogenne, takie jak wirusy zapalenia w¹troby i wirus HIV.
Przy kontakcie z ka¿dym materia³em zanieczyszczonym krwi¹ lub innymi p³ynami ustrojowymi nale¿y przestrzegaæ
„Uniwersalnych œrodków ostro¿noœci”1-44 i zaleceñ obowi¹zuj¹cych w danej placówce.
NIE U¯YWAÆ zestawu do ró¿nicowania NAP, je¿eli wykazuje on ewidentnie cechy zanieczyszczenia, zmiany zabarwienia lub je¿eli
nie zawiera kr¹¿ka. Wilgoæ, zw³aszcza w wy¿szej temperaturze, powoduje szybkie pogorszenie jakoœci NAP.
Nale¿y zawsze stosowaæ techniki aseptyczne i ustalone procedury chroni¹ce przed zagro¿eniem mikrobiologicznym5. Zawsze
pracowaæ w komorze laminarnej. Unikaæ wszelkiego kontaktu z kr¹¿kiem. Po u¿yciu pojemniki na próbki i inne zanieczyszczone
materia³y nale¿y wyja³owiæ w autoklawie.
Przed u¿yciem ka¿da fiolka powinna byæ zbadana pod k¹tem œladów zniszczenia.
Fiolki z cechami uszkodzenia nale¿y wyrzuciæ przed inokulacj¹. W rzadkich przypadkach szyjka fiolki mo¿e byæ pêkniêta i mo¿e
od³amaæ siê podczas zdejmowania pokrywki albo w czasie obs³ugi. Tak¿e w rzadkich przypadkach fiolka mo¿e nie byæ zamkniêta
wystarczaj¹co szczelnie. W obu przypadkach zawartoœæ fiolki mo¿e wyciekaæ lub rozlaæ siê, zw³aszcza przy odwróceniu fiolki do góry
dnem. Jeœli fiolka by³a inokulowana, materia³, który wyciek³ lub rozla³ siê, nale¿y traktowaæ z ostro¿noœci¹, poniewa¿ mo¿e on zawieraæ
patogenne drobnoustroje/czynniki. Przed utylizacj¹ nale¿y wysterylizowaæ wszystkie inokulowane fiolki w autoklawie.
Fiolki z hodowl¹, która da³a wynik dodatni, do podhodowli, barwienia itd.: Przed pobraniem próbki nale¿y wypuœciæ gaz, który
czêsto jest wytwarzany w wyniku metabolizmu bakterii. Nale¿y zawsze stosowaæ techniki aseptyczne i ustalone procedury chroni¹ce
przed zagro¿eniem mikrobiologicznym. Procedury nale¿y prowadziæ w odpowiedniej komorze laminarnej, w pomieszczeniu
z odpowiednim systemem wentylacji, zgodnie z zaleceniami CDC5. Przy pracy z próbkami i hodowlami potencjalnych czynników
patogennych stosowaæ odpowiedni¹ odzie¿ ochronn¹, maskê i rêkawiczki. Stosowaæ siê do zaleceñ CDC i OSHA.
W celu zminimalizowania mo¿liwoœci wycieku w czasie inokulacji stosowaæ strzykawki z ig³ami umocowanymi na sta³e lub mocno
przytwierdzonymi zakoñczeniami Luer-Lok.
Nie badano toksycznoœci zwi¹zku. Przy jego u¿ywaniu nale¿y stosowaæ siê do odpowiednich procedur, aby unikn¹æ ekspozycji.
Instrukcja przechowywania
Fiolki NAP BACTEC nale¿y przechowywaæ w lodówce, w temperaturze 2 – 8°C, nie nara¿aj¹c ich na bezpoœrednie dzia³anie œwiat³a
s³onecznego. Nie nara¿aæ na dzia³anie ciep³a (wysokiej temperatury), poniewa¿ NAP jest termolabilny.
Data wa¿noœci odnosi siê do nieotwartej fiolki, przechowywanej zgodnie z zaleceniami.
POBIERANIE PRÓBKI
Do wykonania testu NAP mo¿na wykorzystaæ aktywnie rosn¹ce hodowle na po¿ywce 12B BACTEC. Hodowla testowa powinna byæ
czysta i wolna od zanieczyszczenia drobnoustrojami innymi ni¿ pr¹tki.
PROCEDURY
Dostarczone materia³y: Dziesiêæ fiolek, z których ka¿da zawiera kr¹¿ek z NAP.
Materia³y wymagane, ale niedostarczane: Aparat 460TB BACTEC, po¿ywka 12B BACTEC, strzykawka tuberkulinowa z ig³¹ przymocowan¹ na sta³e,
roztwór œrodka odka¿aj¹cego, wacik z alkoholem, p³yn do rozcieñczania BACTEC.
Szczegó³y mo¿na znaleŸæ w podrêczniku procedury i produktu dotycz¹cym systemu 460TB BACTEC (MA-0029).
Gdy wartoœæ GI fiolki z po¿ywk¹ 12B BACTEC wynosi 10 lub wiêcej, fiolkê badaæ codziennie do momentu, gdy wartoœæ GI osi¹gnie
50 – 100. Sprawdziæ, ¿e hodowla nie jest zanieczyszczona, wykonuj¹c barwienie metod¹ Grama lub podhodowlê. Hodowlê
homogenizowaæ strzykawk¹ tuberkulinow¹ (z ig³¹ przymocowan¹ na sta³e) i t¹ sam¹ strzykawk¹ aseptycznie przenieœæ 1 mL do fiolki
z NAP. Wierzcho³ek fiolki z NAP i kontroli (hodowla pierwotna) przetrzeæ odpowiednim œrodkiem odka¿aj¹cym i nastêpnie oczyœciæ
wacikiem nas¹czonym alkoholem. Obie fiolki natychmiast zbadaæ na aparacie BACTEC, aby oczyœciæ je 5 – 10% CO2. Odczytów nie braæ
pod uwagê. Inkubowaæ w temperaturze 37°C ±1°C lub w temperaturze optymalnej i badaæ codziennie przez nastêpne 2 – 6 dni.
Odnotowywaæ codzienn¹ wartoœæ GI fiolki z NAP i fiolki pierwotnej, s³u¿¹cej za kontrolê.
Je¿eli wartoœæ GI wyniesie ponad 100, hodowlê nale¿y w nastêpuj¹cy sposób rozcieñczyæ przez inokulacj¹ fiolki z NAP:
GI 50–100
bez rozcieñczenia
GI 101–200
0,8 mL do fiolki ze œwie¿¹ po¿ywk¹ 12B BACTEC
GI 201–400
0,6 mL do fiolki ze œwie¿¹ po¿ywk¹ 12B BACTEC
GI 401–600
0,4 mL do fiolki ze œwie¿¹ po¿ywk¹ 12B BACTEC
GI 601–800
0,3 mL do fiolki ze œwie¿¹ po¿ywk¹ 12B BACTEC
GI 801–999
0,2 mL do fiolki ze œwie¿¹ po¿ywk¹ 12B BACTEC
GI 999 wiêcej
0,1 mL do fiolki ze œwie¿¹ po¿ywk¹ 12B BACTEC
ni¿ 1 dzieñ
Nie dopuszczaæ do wzrostu hodowli po osi¹gniêciu szczytowej wartoœci GI (999). W przypadku przerostu hodowli wykonaæ
podhodowlê w fiolce z po¿ywk¹ 12B BACTEC, inkubowaæ i badaæ codziennie a¿ do uzyskania po¿¹danej wartoœci GI.
Je¿eli ma byæ badany wzrost w po¿ywce sta³ej, wykonaæ zawiesinê, zeskrobuj¹c kilka reprezentatywnych kolonii i emulguj¹c je
w probówce z ja³ow¹ wod¹ lub p³ynem do rozcieñczania BACTEC. Skorygowaæ mêtnoœæ zawiesiny, tak aby by³a porównywalna
z wzorcem nr 1 McFarlanda. Inokulowaæ 0,1 mL tej zawiesiny do fiolki z po¿ywk¹ 12B BACTEC. Inkubowaæ i badaæ codziennie na
aparacie systemu 460TB BACTEC. Po uzyskaniu wartoœci GI 50 – 100 postêpowaæ zgodnie z powy¿szym opisem.
KONTROLA JAKOŒCI
W ka¿dej partii badanej powinny znajdowaæ siê nastêpuj¹ce kontrole dodatnie i ujemne, aby zapewniæ dok³adnoœæ procedury testu.
M. tuberculosis, H37Rv
Nr ATCC 27294
M. kansasii
Nr ATCC 35775
M. intracellulare
Nr ATCC 13950
M. avium
Nr ATCC 35717
*Szczegó³y – zob. podrêcznik procedury i produktu dotycz¹cy systemu 460TB BACTEC (MA-0029).
NIE U¯YWAÆ fiolek do hodowli po up³ywie ich daty wa¿noœci.
NIE U¯YWAÆ fiolek hodowlanych, które wykazuj¹ pêkniêcia lub defekty; utylizowaæ fiolkê w odpowiedni sposób.
Z zestawem NAP dostarczane s¹ certyfikaty kontroli jakoœci. W certyfikatach kontroli jakoœci podane s¹ nazwy drobnoustrojów
u¿ywanych do danego typu produktu.
W ramach codziennej kontroli nale¿y badaæ na aparacie BACTEC fiolki do testów wydajnoœci (zestaw do testów wydajnoœci BACTEC).
Uzyskanie niskich odczytów przy prawid³owym badaniu fiolek do badania wydajnoœci oznacza mo¿liwoœæ awarii aparatu (zob. ulotkê
do opakowania PTK BACTEC-PP-046JAA).
Nale¿y postêpowaæ zgodnie z obowi¹zuj¹cymi wymogami kontroli jakoœci, wynikaj¹cymi z przepisów miejscowych, krajowych i (lub)
federalnych, wymogami akredytacji i rutynowymi procedurami kontroli jakoœci w danym laboratorium. U¿ytkownikowi zaleca siê
zapoznanie z odpowiednimi procedurami kontroli jakoœci, zawartymi w zaleceniach NCCLS i przepisach CLIA.
2
INTERPRETACJA WYNIKÓW
Codzienna wartoœæ GI kontroli (pierwotna fiolka kontrolna) bêdzie siê zwiêkszaæ. W fiolce testowej z NAP spadek lub wzrost tej
wartoœci zale¿y od gatunku znajduj¹cych siê w fiolce pr¹tków. Spadek lub brak zmiany GI wskazuje na kompleks TB, natomiast
wzrost GI na bakterie MOTT. Do niemal wszystkich pr¹tków w fiolce NAP odnosz¹ siê nastêpuj¹ce kryteria:
M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum)
Kompleks TB (M
• dwukrotnie stwierdzony znacz¹cy spadek GI po inokulacji
• niewielki, nieistotny wzrost w pierwszych dwóch dniach i nastêpnie spadek lub brak wzrostu GI
Bakterie MOTT
• dzienny odczyt GI wzrasta do ponad 400 w ci¹gu czterech dni
• niewielki spadek lub brak wzrostu w pierwszych 1 – 3 dniach po inokulacji, a w kolejnych dwóch dniach po dniu 2 istotny wzrost
„Istotny” wzrost lub spadek oznacza zmianê o 20% lub wiêcej z dnia na dzieñ.
OGRANICZENIA PROCEDURY
Oddzielenie kompleksu TB od MOTT w teœcie do ró¿nicowania TB NAP BACTEC jest mo¿liwe tylko przy zastosowaniu izolowanych,
czystych hodowli. U¿ycie mieszanej hodowli kompleksu TB i bakterii MOTT spowoduje zwiêkszenie GI, co jednak wskazuje tylko
na obecnoœæ bakterii MOTT. Zanieczyszczenie bakteriami innymi ni¿ pr¹tki mo¿e tak¿e spowodowaæ fa³szywe zwiêkszenie GI,
gdy czynnik zanieczyszczaj¹cy wykorzystuje substrat. Fiolki z NAP nale¿y oceniæ wzrokowo pod k¹tem ewentualnego ewidentnego
zanieczyszczenia i (lub) zmêtnienia. W przypadku wzrostu GI potwierdzenie obecnoœci bakterii MOTT i TB lub bakterii
zanieczyszczaj¹cych u³atwia rozmaz na AFB z fiolki NAP.
Niekiedy pojawiaj¹ce siê szczepy M. kansasii mog¹ ulegaæ zahamowaniu przez NAP w takim stopniu, ¿e powoduje to uzyskanie
nieprawdziwych wyników. Nale¿y podj¹æ dalsze dzia³ania w kierunku ustalenia gatunku innymi metodami.
Z powodu charakteru materia³u biologicznego zawartego w pod³o¿ach i naturalnej ró¿norodnoœci organizmów u¿ytkownik
powinien zdawaæ sobie sprawê z potencjalnej ró¿norodnoœci wyników przy wzroœcie niektórych drobnoustrojów.
OCZEKIWANE WARTOŒCI
Czas oczekiwania na wyniki waha siê od 2 do 6 dni w zale¿noœci od gatunku pr¹tków. Wyniki nale¿y podawaæ dopiero po osi¹gniêciu
wyraŸnego trendu. Je¿eli GI pozostaje niezmienione, nie nale¿y interpretowaæ wyniku jako obecnoœci kompleksu TB przed up³ywem
4 dni. Opisywano, ¿e œredni czas ukoñczenia testu NAP wynosi 4 dni6,7-11.
Wynik testu NAP nale¿y potwierdziæ charakterystyk¹ wzrostu i morfologii AFB lub rozmazem barwionym na obecnoœæ
drobnoustrojów kwasoopornych. Rozmaz mo¿e równie¿ wykazaæ obecnoœæ kultur mieszanych lub zanieczyszczenia.
CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŒCIOWA
Chocia¿ wiêkszoœæ testów NAP jest ³atwa do zinterpretowania, niektóre wymagaj¹ dodatkowego czasu inkubacji, aby dowieœæ
wyraŸnego trendu. Ma to najwiêksze znaczenie w przypadku pr¹tków czêœciowo hamowanych przez NAP i wykazuj¹cych powolny lub
opóŸniony wzrost GI lub d³u¿sz¹ fazê utajenia w obecnoœci NAP (np. pewne szczepy M. kansasii, M. gastri, M. szulgai, M. terrae
i M. triviale). Wszystkie bakterie MOTT, badane w okresie oceniania testu NAP, wykazywa³y wzrost GI w ci¹gu 5 – 6 dni5,7. Niekiedy
jednak spotyka siê szczepy M. kansasii, które ulegaj¹ wiêkszemu ni¿ zwykle zahamowaniu przez NAP i mog¹ zostaæ w tym teœcie
b³êdnie zidentyfikowane. W celu uzyskania prawid³owych wyników konieczna jest inkubacja w optymalnej temperaturze. Pr¹tki takie
jak M. chelonae i M. marinum, rosn¹ce w temperaturze ni¿szej ni¿ 37°C, i M. xenopi, rosn¹cy w temperaturze wy¿szej, mog¹ przy
badaniu w temperaturze 37°C daæ niew³aœciwe wyniki. Je¿eli optymalna temperatura inkubacji nie jest pewna, test nale¿y wykonywaæ
w wiêcej ni¿ jednej temperaturze. W uprzednich badaniach ca³kowit¹ czu³oœæ i swoistoœæ testu szacowano na 98 – 99%7,10.
DOSTÊPNOŒÆ
Nr kat.
442103
442004
Opis
Zestaw do ró¿nicowania TB NAP BACTEC, 5 µg NAP na fiolkê, 10 fiolek na opakowanie
Po¿ywka 12B BACTEC, 4 mL, 100 na opakowanie
PIŒMIENNICTWO
1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from
occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa.
2. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services,
Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol.
17:53-80.
3. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication
(CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.
4. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from
risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive
89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.
5. Kent, P.T. et al. Public health mycobacteriology, a guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Division of
Laboratory Training and Consultation. Atlanta, GA, 1985.
3
6.
Gross, W.M. et al. Radiometric selective inhibition tests for differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis,
and other mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 21:565-568, 1985.
7. Laszlo, A. et al. Evaluation of a rapid radiometric differentiation test for the Mycobacterium tuberculosis complex by selective
inhibition with ρ-nitro- α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenone. J. Clin. Microbiol., 19:694-695, 1984.
8. Libonati, J.P. et al. Identification and direct drug susceptibility testing of mycobacteria by the radiometric method. Abstract C300,
A.S.M. Meeting, St. Louis, MO 1984.
9. Morgan, M.A. et al. Evaluation of the ρ-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenone differential test for identification of
Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin. Microbiol., 21:634-635, 1985.
10. Siddiqi, S.H. et al. Rapid radiometric methods to detect and differentiate Mycobacterium tuberculosis / M. bovis from other
mycobacterial species. Amer. Rev. Respir. Dis., 130:634-640, 1984.
11. Stager, C.E. et al. Identification of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast smear-positive specimens by direct inoculation of
the BACTEC NAP Test. Abstract C267, A.S.M. Annual Meeting, Las Vegas, NV, 1985.
4
5
%
O
Becton, Dickinson and Company
7 Loveton Circle
Sparks, MD 21152 USA
800-638-8663
www.bd.com/ds
$
Benex Limited
Rineanna House
Shannon Free Zone
Shannon, County Clare, Ireland
ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection.
BD, BD Logo, BACTEC and Luer-Lok are trademarks of Becton, Dickinson and Company. © 2010 BD.