streszczenie(PL)

Strukturalne aspekty miRNA swoistych dla guzów mózgu
Agnieszka Belter
Kierując się chęcią zrozumienia molekularnych podstaw nowotworów glejowych
mózgu, w oparciu o analizę mikromacierzową, określiłam profil miRNA w tkankach
GBM. Jest on istotnie zmieniony w porównaniu z profilem miRNA w komórkach
zdrowych pochodzenia mózgowego. Wytypowałam miRNA, miR-21, miR10b, miR15b, miR-93 oraz miR-296, których poziom jest znacząco wyższy w tkankach guza w
porównaniu ze zdrową kontrolą. Próbując zrozumieć wielofunkcyjność, a zarazem
specyficzność ich działania, z wykorzystaniem metod biochemicznych oraz
spektroskopii NMR, UV oraz CD określiłam ich strukturę. Po raz pierwszy pokazałam,
że miR-21, miR-93, miR-296, miR-10b oraz miR-15b przyjmują strukturę
drugorzędową, miR-21, miR-93 oraz miR-296 zarówno strukturę spinki do włosów jak i
dupleks, miR10b i miR-15b w badanych warunkach jedyne homodupleksy. Spinki do
włosów oraz dupleksy miR-21, miR-93 oraz miR-296 współistnieją w warunkach
wykonanych eksperymentów, a równowaga między tymi formami zależy od stężenia
RNA, temperatury oraz siły jonowej badanego roztworu RNA. Biorąc pod uwagę fakt,
że stężenie pojedynczego miRNA w komórce z reguły jest niższe niż 200 pM postuluję,
że spinka do włosów miRNA jest dominującą w komórce.
Do niedawna uważano, że miRNA funkcjonują jedynie w kompleksie RISC.
Pokazałam, że miRNA mogą występować w komórce w postaci spinki do włosów i/lub
dupleksu, co może przekładać się na ich właściwości, dostępność i funkcje. Istnieje
zależność między trwałością miRNA przyjmujących strukturę spinki do włosów, a
energią tych spinek. Struktura miRNA chroni je przed działaniem nukleaz
komórkowych, w efekcie odgrywa istotną rolę w regulacji poziomu miRNA w
komórce. Ponad to, struktura miRNA wpływa na termodynamikę oddziaływań mRNAmiRNA, w efekcie na zależną od miRNA regulację ekspresji genów. Motyw spinki do
włosów znany jest jako miejsce kontaktu RNA z innymi kwasami nukleinowymi i
białkami. Zaobserwowałam podobieństwo sekwencji miRNA i innych krótkich RNA
których funkcja determinowana jest przez ich strukturę, m.in. tRNA, minihelis tRNA,
aptamerów RNA. Na tej podstawie zasugerowałam, że spinki do włosów miRNA,
podobnie jak wspomnaine RNA, mogą bezpośrednio, niezależnie od kompleksu RISC,
oddziaływać z białkami. Potwierdziłam to eksperymentalnie. Sugeruje to nowy
mechanizm działania miRNA i jest krokiem do zrozumienia zależnych od miRNA
mechanizmów regulacji komórkowej oraz patogenezy chorób, w tym nowotworów
glejowych mózgu, u podłoża których leżą te krótkie niekodujące RNA.
Dodatkowo, w odpowiedzi na brak skutecznych metod leczenia nowotworów
glejowych mózgu, ich oporności na konwencjonalne metody leczenia, zaprojektowałam
katalityczne kwasy nukleinowe, rybozymy typu hammerhead oraz DNAzymy,
skierowane zarówno na pre-miRNA jak i ich formy dojrzałe. Precyzyjnie, z
dokładnością do 1 nt, i wydajnie rozpoznają one oraz hydrolizują swoje cele. Ich
skuteczność potwierdziłam w warunkach komórkowych. Otrzymane wyniki wskazują,
że dojrzałe miRNA są łatwiejszym celem działania dla katalitycznych kwasów
nukleinowych niż pri- i pre-miRNA. Uzyskany poziom wyciszenia miRNA jest
sumarycznym efektem działania katalitycznych kwasów nukleinowych na poziomie
miRNA i ich prekursorów. Obrazuje to przewagę narzędzi anty-miRNA działających
zarówno na poziomie dojrzałych miRNA i ich prekursorów nad tymi, które hydrolizują
jedynie pre- i/lub pre-miRNA. Efektywność i precyzja działania katalitycznych kwasów
nukleinowych oraz łatwość ich dostarczenia do komórek z użyciem kationów
lipidowych świadczą dużym potencjale aplikacyjnym tych narzędzi w terapii chorób
związanych z zaburzeniami poziomu miRNA.