cwiczenie 1

Specjalność: TECHNOLOGIA ZYWNOŚCI
III rok studiów, studia stacjonarne
Ćwiczenia: GOSPODARKA ENERGETYCZNA, WODNA I ŚCIEKOWA
MIKROBIOLOGIA
Ćwiczenie 1.
Temat: Charakterystyka mikroorganizmów wodnych (cz. I)
Czas trwania: 1, 5 godz.
Część teoretyczna
1) Grupy organizmów wodnych
2) Charakterystyka mikroorganizmów wodnych (cz. I – bakterie i grzyby)
3) Grzyby wodne – suplement (dołączony do konspektu)
Część praktyczna
1) Izolacja, hodowla i identyfikacja różnych grup fizjologicznych bakterii wodnych
2) Izolacja i hodowla grzybów wodnych na podłożach sztucznych
3) Oznaczenie ilości grzybów mikroskopowych
4) Obserwacje mikroskopowe grzybów wodnych (z uwzględnieniem grzyba patogennego
Candida albicans) wyhodowanych na podłożach sztucznych zestalonych agarem
1) Izolacja, hodowla i identyfikacja różnych grup fizjologicznych bakterii wodnych
Materiał: woda rzeczna i źródlana;
A. Wykrywanie bakterii amonifikacyjnych
Azot występuje w wodach zanieczyszczonych i ściekach m.in. w postaci białka.
Bakterie amonifikacyjne są grupą drobnoustrojów heterotroficznych, mających
zdolność enzymatycznego rozkładu organicznych związków azotu, zwłaszcza
aminokwasów, z wytworzeniem amoniaku (dezaminacja).
Ich działalność w wodach powierzchniowych lub urządzeniach do biologicznego
oczyszczania ścieków świadczy o zachodzącej mineralizacji organicznych
połączeń azotowych.
Wykonanie oznaczenia:
1. Jałową pipetą (1cm3) zaszczepić nierozcieńczoną wodą probówki z
pożywka dla amonifikatorów, w której jedynym źródłem azotu jest
pepton.
2. Po posiewie, w każdej probówce należy umieścić jałowy papierek
wskaźnikowy nasycony odczynnikiem Krupa.
3. Po włożeniu papierków zabezpieczyć korki z waty kapturkami z folii
aluminiowej i recepturkami.
4. Inkubować w temp. 26˚C przez 7 dni.
5. Aby stwierdzić obecność wytworzonego amoniaku, będącego
dowodem rozwoju bakterii amonifikacyjnych, bierze się pod uwagę
zmianę barwy papierka wskaźnikowego na kolor różowy lub
intensywnie czerwony oraz zmętnienie pożywki.
1
Specjalność: TECHNOLOGIA ZYWNOŚCI
III rok studiów, studia stacjonarne
Ćwiczenia: GOSPODARKA ENERGETYCZNA, WODNA I ŚCIEKOWA
MIKROBIOLOGIA
B. Wykrywanie bakterii denitryfikacyjnych
Bakterie denitryfikacyjne wykorzystują azotany jako akceptory wodoru
i elektronów, dzieki czemu redukują je enzymatycznie do azotynów, amoniaku, a
nawet wolnego azotu. Należą one do bezwzględnych lub względnie beztlenowych
heterotrofów. Przedstawicielami tej grupy są m.in. Thiobacillus denitryficans,
Pseudomonas fluorescens oraz Micrococcus denitryficans.
Azotany (NO3 –) są bezpośrednio użyteczne jako pożywka dla roślin wodnych.
Wysoki ich poziom może podwyższyć stopień eutrofizacji wody.
Wykonanie oznaczenia:
1. Przed wykonaniem posiewu należy rozpuścić zestalone w probówkach
podłoża bulionowe z azotanami i ułożyć w pólskosy.
2. Po zastygnięciu podłoża dokonać posiewu i inkubować w temp. 28˚C przez
7 dni.
3. Po okresie inkubacji na powierzchnię badanej hodowli nanieść 0,2-0,3 cm3
odczynnika Griessa
4. Czerwone zabarwienie występuje w ciągu 1-5 min. Oznacza wynik dodatni
i świadczy o obecności azotynów. Ujemny wynik testu nie zawsze
dowodzi nieobecności bakterii denitryfikacyjnych, gdyż redukcja
azotanów mogła już doprowadzić do powstania amoniaku lub nawet azotu
elementarnego. Potwierdzeniem takiego przypuszczenia jest zanik
azotanów dodanych do pożywki.
5. W celu sprawdzenia dalszej obecności lub braku azotanów, należy z
prób, w których stwierdzono ujemny wynik testu, przenieść do czystej,
porcelanowej parowniczki nieco zawartości probówki i dodać odrobinę
sproszkowanego cynku, Pojawienie się czerwonego zabarwienia świadczy
o obecności w pożywce nie rozłożonych azotanów (potwierdzenie wyniku
ujemnego). Brak zabarwienia świadczy o wyniku dodatnim.
C. Wykrywanie bakterii asymilujących wolny azot
Bakterie asymilujące wolny azot są grupą heterotrofów wykorzystujących różne
substraty organiczne jako źródła węgla i energii: cukry, wyższe alkohole, skrobię
i kwasy organiczne. Zródlem azotu jest azot atmosferyczny, w związku, z czym
rosną one na pożywakch bezazotanowych. Bakterie te są przeważnie
bezwzględnymi tlenowcami. Przedstawicielami są m.in. Azotobacter i Azomonas
agilis.
Wody zawierające azot mogą być wykorzystywane do nawożenia.
Wykonanie oznaczenia:
1. Posiewać nierozcieńczone próbki (1 cm3) do probówek zawierających po
10 ml płynnego podłoża z mannitolem.
2. Inkubować w temp. 28-30˚C przez 7 dni.
3. Wyniki odczytywać na podstawie zmętnienia.
2
Specjalność: TECHNOLOGIA ZYWNOŚCI
III rok studiów, studia stacjonarne
Ćwiczenia: GOSPODARKA ENERGETYCZNA, WODNA I ŚCIEKOWA
MIKROBIOLOGIA
2) Izolacja i hodowla grzybów na podłożach sztucznych
Materiał: woda rzeczna i źródlana;
Wykonanie oznaczenia
1. Wykonać oznaczenia metodą płytkową Kocha, stosując posiew
powierzchniowy (na podłoże agarowe wg Sabourauda) wody pobranej z
odpowiedniego źródła.
2. Podpisać płytki Petriego (data, nr grupy, nr podgrupy, rodzaj badanego
materiału, rozcieńczenie)
3. Posiewy wykonać z prób nierozcieńczonych oraz z rozcieńczeń 10−1.
4. Inkubacje prowadzić w temp. 26˚C w ciągu 7 dni.
3) Oznaczenie ilości grzybów mikroskopowych
Materiał: hodowle wyizolowanych grzybów pleśniowych (wyrosłych na podłożu wg
Sabourauda);
Wykonanie oznaczenia:
1. Po okresie inkubacji policzyć kolonie grzybów wyrosłe na podłożu wg
Sabourauda. Do określenia liczby kolonii wybrać płytki, na których
wyrosło od 10 do 50 kolonii.
2. Wyniki badań wpisać do tabeli 1. W przypadku próbki rozcieńczonej,
średnią liczbę grzybów w 1 cm3 badanej wody uzyskuje się po
wymnożeniu liczby kolonii wyrosłych na plytce przez odwrotność
rozcieńczenia.
3. Wyciągnąć wnioski.
Tabela 1. Zestawienie wyników analizy mikrobiologicznej wody − liczba grzybów
mikroskopowych
Badana próba: ……………………………………………
Oznaczenie
Warunki hodowli
Liczba kolonii w ilości badanej
próby (cm3)
próba
rozcieńczenie
Podłoże
temp.
i
czas nierozcieńczona …………
inkubacji
26˚C
Ogólna
liczba agarowe
7 dni
wg
grzybów
mikroskopowych Sabourauda
Średnia
liczba
grzybów
w 1 cm3
Wnioski:
…………………………………………………………………………………………………...
3
Specjalność: TECHNOLOGIA ZYWNOŚCI
III rok studiów, studia stacjonarne
Ćwiczenia: GOSPODARKA ENERGETYCZNA, WODNA I ŚCIEKOWA
MIKROBIOLOGIA
4) Obserwacje mikroskopowe grzybów wodnych pleśniowych i drożdżopodobnych
(z uwzględnieniem grzyba patogennego Candida albicans) wyhodowanych na
podłożach sztucznych zestalonych agarem
Materiał: kliniczne hodowle grzyba drożdżopodobnego Candida albicans oraz hodowle
wyizolowanych grzybów pleśniowych (wyrosłych na podłożu wg Sabourauda);
Wykonanie oznaczenia:
1. W przypadku C. albicans wykonać barwienie fioletem krystalicznym. Na
odtłuszczonym szkiełku podstawowym wykonać rozmaz hodowli
badanych drobnoustrojów. Preparat wysuszyć w powietrzu i utrwalić
przeciągając szkiełko w płomieniu palnika. Powierzchnie preparatu zalać
barwnikiem na 2 minuty. Po zlaniu fioletu preparat płukać bieżącą wodą.
Preparat po wysuszeniu bibułą oglądać pod immersją. Wynik barwienia:
komórki grzyba fioletowe.
Ocenę preparatu C. albicans przeprowadzić przy zastosowaniu
obiektywu immersyjnego mikroskopu.
2. W przypadku grzybów pleśniowych otworzyć płytkę Petriego i za pomocą
lupy lub binokularu obserwować powierzchnię grzybów wyrosłych na
zestalonych podłożach odżywczych.
3. Przygotować preparat mokry z kolonii grzybów pleśniowych. Na
odtłuszczone szkiełko przedmiotowe nanieść kroplę płynu fizjologicznego,
a następnie za pomocą ezy niedużą ilość grzybni wraz z zarodnikami
(czynności te należy prowadzić bardzo delikatnie!), dodając 2 krople płynu
Lugola.
Po nakryciu szkiełkiem nakrywkowym obserwować pod małym,
a następnie średnim powiększaniem.
4. Wyniki obserwacji wpisać do tabeli 2.
Tabela 2. Zestawienie wyników analizy obserwacji mikroskopowych grzybów wodnych
wyhodowanych na podłożach sztucznych zestalonych agarem
Rodzaj grzyba
mikroskopowa
Charakter
Barwa grzybni
Kształt,
wodnego
grzybni
rozmieszczenie Budowa grzyba
(pow. mikroskopu)
(schematyczny
zarodników
rysunek)
charakter grzybni: zwarta, puszysta, filcowata, zamszowa, pojedyncze kolonie o
postrzępionym brzegu, pojedyncze kolonie o gładkim brzegu itp.
4
Specjalność: TECHNOLOGIA ZYWNOŚCI
III rok studiów, studia stacjonarne
Ćwiczenia: GOSPODARKA ENERGETYCZNA, WODNA I ŚCIEKOWA
MIKROBIOLOGIA
Grzyby wodne – suplement do części teroretycznej
Część teoretyczna
1) Zagrożenia dla człowieka wynikające z obecności grzybów patogennych.
Grzyby (Mycota) jest to zróżnicowana grupa organizmów. Nie można przeprowadzić
wyraźnej granicy między grzybami wodnymi a lądowymi. W środowisku wodnym
występują w postaci wegetatywnej plechy lub w postaci zarodników lub form
przetrwanych.
Grzyby pasożytnicze są często wprowadzane do naturalnych zbiorników wodnych wraz
ze ściekami bytowo-gospodarczymi. Mogą atakować rośliny (także glony), zwierzęta,
oraz stanowią zagrożenie dla człowieka.
Wybrane grzyby chorobotwórcze dla człowieka
Grzyby drożdżopodobne
Candida albicans
Jest to grzyb wywołujący kandydozę (bielnicę). Choroba ta, powodująca zakażenie błon
śluzowych oraz skóry, może przebiegać bezobjawowo. Obniżenie odporności ustroju lub
intensywne leczenie antybiotykami, powoduje nasilenie rozwoju grzyba i powstanie
widocznych gołym okiem zmian w błonie śluzowej jamy ustnej i gardła, zakażenie narządów
wewnętrznych prowadząc do poważnych komplikacji. Szczególnie niebezpieczne jest
zakażenie u pacjentów hospitalizowanych oraz noworodków.
Grzyby pleśniowe
Patogenność grzybów jest wielokierunkowa. Mogą zakażać narządy wewnętrzne, skórę
i paznokcie. Mają zdolność przenikania do tkanek narządów gospodarza (aspergilloza płuc).
Mogą wystąpić wewnątrz oskrzeli lub w jamach pogruźliczych, powodując tzw. grzybniak
płuc. Pewne grzyby działają jako czynnik alergizujący, odgrywając istotną rolę w patogenezie
części przypadków dychawicy oskrzelowej, czy zapalenia skóry. Dokładna diagnostyka
wymaga zróżnicowania grzybów pleśniowych na podstawie m.in. obserwacji cech
morfologicznych w makro- i mikrohodowlach (określenie charakteru grzybni i narządów
owocowania).
5
Specjalność: TECHNOLOGIA ZYWNOŚCI
III rok studiów, studia stacjonarne
Ćwiczenia: GOSPODARKA ENERGETYCZNA, WODNA I ŚCIEKOWA
MIKROBIOLOGIA
Grzyby pleśniowe wywołują:
•
•
•
grzybice głębokie (narządowe, systemowe); do grzybów tych zaliczyć można:
Aspergillus flavus, A. nidulans, A. niger, Rhizopus oryzae, Mucor sp.;
zmiany skórne; do grzybów tych zaliczyć można: Cladosporium sp, Cephalosporium sp.,
Fusarium sp., Trichoderma sp., Aspergillus sp., Pecnicillium sp.;
zatrucia powodowane przez toksyny grzybów (mykotoksyny)-może pojawić się masowa
ekspansja grzybów pleśniowych w silosach w wyniku niedostatecznie regulowanych
warunków temperatury i wilgotności produktu i otoczenia. Znanych jest kilkaset
mykotoksyn. W Polsce największe znaczenie ze względu na częstotliwość występowania
i możliwość spowodowania zatruć maja aflatoksyny, ochratoksynaA, cytrynina oraz
patulina.
Przegląd wybranych mykotoksyn
Aflatoksyny to metabolity pleśni Aspergillus flavus. Pod względem chemicznym są
związkami zawierającymi pierścień laktozowy połączony pierścieniem benzenowym z 2
pierścieniami furanowymi o masie ok. 300 Da. Rozpuszczalne są w roztworach wodnych,
dyfundują przez błony biologiczne tkanek roślinnych i zwierzęcych (śluzówka,
powierzchnia skóry), akumulują się w organizmie powodując jego zaburzenia oraz
choroby wątroby, zatrucia nerek, krwawe wylewy do płuc i mózgu, a także choroby
nowotworowe.
OchratoksynaA jest metabolitem pleśni Aspergillus, zaś cytrynina pleśni Penicillium.
Obie toksyny należą do nefrotoksyn, tj. związków uszkadzających nerki. Często
pojawiają się na ziarnach zbóż (żyta, pszenicy) i w ich przetworach (mąka, kasza,
pieczywo). Rozwijają się w środowisku wilgotnym, a zatem nie należy przechowywać
ziaren w pomieszczeniach o zawartości wody większej niż 13%.
Patulina wytwarzana jest przez wiele gatunków pleśni z rodzaju Penicillim, Aspergillus,
czy Byssochlamys (saprofity występujące na owocach, warzywach, mięsie, serach, ziarnie
zbóż i pieczywie). Łatwo reagują z białkami i kwasami nukleinowymi, są podatne na
działanie enzymów trawiennych, co zmniejsza niebezpieczeństwo zatrucia
pokarmowego. Wykazują działanie rakotwórcze dla człowieka, powodują zmiany w
wątrobie, nerkach i w korze mózgowej.
6