Lab 3

Ćwiczenie 3: Morfologia drobnoustrojów
I. Obserwacja wzrostu mikroorganizmów, morfologia kolonii różnych gatunków na
podłożach stałych.
a) podłoże MacConkeya (E. coli lac+, E. coli lac-, Serratia marcescens, Proteus vulgaris)
b) podłoże Chapmana (Staphylococcus, Micrococcus sp.)
c) podłoże Sabourauda (Saccharomyces cerevisiae, E. coli)
d) agar wzbogacony (Saccharomyces cerevisiae, E. coli , Serratia marcescens, Proteus
vulgaris, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca, inne)
Każdy student samodzielnie dokonuje opisu wyglądu kolonii bakteryjnych, z uwzględnieniem
ich: zabarwienia; wielkości, kształtu (okrągły, nieregularny, owalny); brzegu kolonii (gładki,
falisty, poszarpany); przekroju, wzniesienia, profilu (płaska, stożkowa, wypukła); powierzchni
(lśniąca, matowa, pomarszczona, grudkowata); konsystencji (miękka, sucha, śluzowata);
zapachu (gnilny, ziemisty, słodki, kwaśny).
II. Przygotowywanie preparatów mikroskopowych. Metody barwienia mikroorganizmów.
1. Barwienie złożone-metodą Grama.
a) Bakterie nanieść na szkiełko podstawowe (każdy student przygotowuje preparat dla innego
gatunku bakterii).
• W przypadku wykonywania preparatu z hodowli płynnej, nanieść ezą na szkiełko kroplę
hodowli i rozprowadzić zawiesinę na powierzchni szkiełka.
• W przypadku wykonywania preparatu z podłoża stałego, pobrać materiał ezą, zawiesić
bakterie w kropli soli fizjologicznej (0,85% NaCl).
b) Po wyschnięciu, preparat utrwalić poprzez przeciągnięcie szkiełka podstawowego nad
płomieniem palnika. Nie trzymać szkiełka w płomieniu!
c) Na utrwalony preparat nanieść fiolet krystaliczny tak, aby całkowicie pokrył powierzchnię z
bakteriami. Barwnik pozostawić przez 2 minuty.
d) Zmyć fiolet krystaliczny wodą destylowaną.
e) Nanieść płyn Lugola i pozostawić przez 1 minutę. Spłukać wodą destylowaną.
f) Spłukać obficie alkoholem etylowym (odbarwianie), a następnie wodą destylowaną.
g) Nanieść roztwór fuksyny zasadowej i pozostawić na 40 sekund. Spłukać wodą i pozostawić
preparat do wyschnięcia.
2. Barwienie proste-błękitem metylenowym.
a) Preparat nanieść na szkiełko podstawowe.
b) Po wyschnięciu, preparat utrwalić poprzez przeciągnięcie szkiełka podstawowego nad
płomieniem palnika. Nie trzymać szkiełka w płomieniu!
c) Nanieść roztwór błękitu metylenowego i pozostawić na 5 minut.
d) Delikatnie spłukać wodą destylowaną i pozostawić preparat do wyschnięcia.
3. Barwienie otoczek Klebsiella sp.- metoda Manevala.
a) Na szkiełku podstawowym zmieszać 1 kroplę odczynnika A (1% roztwór czerwieni Kongo)
z 1 kroplą hodowli badanych bakterii . Całość rozprowadzić równomiernie na powierzchni
szkiełka.
b) Pozostawić preparat do wyschnięcia. Nie utrwalać nad płomieniem palnika.
c) Następnie nakropić na szkiełko odczynnik B (5% roztwór wodny fenolu, 20% kwas octowy,
30% chlorek żelazowy, 1% kwaśna fuksyna) i pozostawić na 5 minut.
d) Preparat spłukać wodą i pozostawić do wyschnięcia.
4. Barwienie przetrwalników Bacillus subtilis- metoda Wirtza.
a) Bakterie nanieść na szkiełko podstawowe.
b) Po wyschnięciu, preparat utrwalić poprzez przeciągnięcie szkiełka podstawowego nad
płomieniem palnika. Nie trzymać szkiełka w płomieniu!
c) Na utrwalony preparat nanieść zieleń malachitową tak, aby całkowicie pokryła
powierzchnię z bakteriami, a następnie podgrzewać trzykrotnie w płomieniu palnika aż do
ukazania się pary.
d) Zmyć zieleń malachitową wodą destylowaną.
e) Nanieść roztwór safraniny i pozostawić przez 1 minutę.
f) Preparat spłukać wodą i pozostawić do wyschnięcia.
III. Obserwacja mikroskopowa preparatów barwionych.
Barwione preparaty bakterii oglądamy stosując obiektywy immersyjne.
a) Na szkiełko nanosimy kroplę olejku immersyjnego.
b) Preparat umieszczamy na stoliku i zanurzamy obiektyw mikroskopu w olejku. Olejek,
wypełniający przestrzeń pomiędzy preparatem a obiektywem mikroskopu, zapewnia lepsze
warunki oświetlenia preparatu, gdyż jego współczynnik załamania światła jest zbliżony do
współczynnika szkła.
c) Ustawiamy ostrość przy użyciu śruby makrometrycznej, a następnie mikrometrycznej.
d) Po zakończeniu pracy, obiektyw mikroskopu należy przetrzeć bibułką, nasączoną
alkoholem etylowym.
NA NASTĘPNE ZAJĘCIA STUDENCI PRZYNOSZĄ PRÓBKĘ WODY I GLEBY
______________________________________________________________________________
Zagadnienia teoretyczne.
Wielkość komórek bakteryjnych, kształty komórek bakteryjnych, układy komórek. Budowa komórki
bakteryjnej. Różnica pomiędzy organizmami prokariotycznymi a eukariotycznymi. Nukleoid i organelle
cytoplazmatyczne. Błona cytoplazmatyczna i jej funkcje. Osłony komórki bakterii gramdodatnich i
gramujemnych: budowa ściany komórkowej bakterii G(+)/G(-), błona zewnętrzna, endotoksyna, przestrzeń
peryplazmatyczna, warstwa S. Muramidaza, lizozym, protoplast, sferoplast. Bakteryjne formy L. Dlaczego
bakterie G(-) są oporne na penicylinę? Otoczki. Postacie przetrwalne bakterii / bakterie wytwarzające
przetrwalniki
Przygotowanie preparatów mikroskopowych i barwienie bakterii – dlaczego barwi się bakterie w celu
przygotowania preparatów? Barwienie proste, złożone; pozytywne, negatywne, pozytywno-negatywne. Jakie
sposoby barwienia stosuje się w celu uwidocznienia komórek bakteryjnych, przetrwalników oraz otoczek? Na
czym polega barwienie metodą Grama? Gram-chwiejność. Kwasooporność
Obserwacja mikroskopowa preparatów – rodzaje mikroskopów, budowa mikroskopu świetlnego,
powiększenie mikroskopu, obiektyw imersyjny