docAutoreferat - Wydział Biologii UW
download 
Reklamacja Transkrypt
Autoreferat - Wydział Biologii UW
Bożena Szal 2 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) Autoreferat 1. Imię i Nazwisko Bożena Szal 2. Posiadane stopnie naukowe Doktor nauk biologicznych, 2003, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego. Tytuł rozprawy: Metabolizm oksydacyjny w siewkach jęczmienia (Hordeum vulgare L.) po okresie anaerobiozy. Magister biologii, 1998, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego. Tytuł pracy dyplomowej: Skład fosfolipidowy błon komórek korzeni fasoli w warunkach deficytu fosforu. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych od 1. 10. 2003 – adiunkt w Zakładzie Bioenergetyki Roślin (od 2012 r. w Zakładzie Anatomii i Cytologii Roślin) Instytutu Biologii Eksperymentalnej i Biotechnologii Roślin Wydziału Biologii UW 1. 10. 1998 – 10. 06. 2003 - studia doktoranckie na Wydziale Biologii UW 1. 01. 1998 – 30. 09. 1998 - referent techniczny w Zakładzie Bioenergetyki Roślin Instytutu Biologii Eksperymentalnej Roślin Wydziału Biologii UW 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) tytuł osiągnięcia naukowego MITOCHONDRIA JAKO ORGANELLA ODPOWIEDZIALNE ZA UTRZYMANIE HOMEOSTAZY OKSYDOREDUKCYJNEJ KOMÓREK LIŚCI b) publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego (IF zgodny z rokiem opublikowania pracy) 1. Szal B, Dąbrowska Z*, Malmberg G, Gardeström P, Rychter AM (2008) Changes in energy status of leaf cells as the consequence of mitochondrial genome rearrangement. Planta 227: 697-706 (IF = 3, 088; cytowań 16) Wkład habilitantki - 70%. Autor korespondencyjny. Zaplanowanie doświadczeń, wykonanie większości doświadczeń laboratoryjnych, czynna opieka nad oznaczeniami wykonanymi przez studenta (wyniki zamieszczone na Rys. 1), interpretacja wyników, napisanie manuskryptu. Bożena Szal 3 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) 2. Szal B, Łukawska K#, Zdolińska I*, Rychter AM (2009) Chilling stress and mitochondrial genome rearrangement in the MSC16 cucumber mutant affect the alternative oxidase and antioxidant defense system to a similar extent. Physiologia Plantarum 137: 435-445 (IF = 2,708; cytowań 8) # autorzy równorzędni Wkład habilitantki - 40%. Autor korespondencyjny. Zaplanowanie doświadczeń, wykonanie doświadczeń laboratoryjnych których wyniki zawierają się w Fig. 1,2,7 oraz Tab. 1, czynna opieka nad oznaczeniami wykonanymi przez studenta (część wyników w Tab.1), pozyskanie finansowania dla części badań (projekt badań własnych w 2004 r.), interpretacja wyników, zaproponowanie schematu ilustrującego funkcje mtROS, współtworzenie manuskryptu. 3. Szal B, Jastrzębska A*, Kulka M*, Leśniak K*, Podgórska A*, Pärnik T, Ivanova H, Keerberg O, Gardeström P, Rychter AM (2010) Influence of mitochondrial genome rearrangements on cucumber leaf carbon and nitrogen metabolism. Planta 232: 1371-1382 (IF = 3,098; cytowań 2) Wkład habilitantki - 60%. Autor korespondencyjny. Koncepcja pracy, zaplanowanie doświadczeń, wykonanie części doświadczeń laboratoryjnych, nawiązanie współpracy z grupą Prof. O. Keerberga i uzgodnienie zakresu wykonanych doświadczeń przez współautorów z Estonii, czynna opieka nad oznaczeniami wykonanymi przez studentów, interpretacja wyników, pozyskanie finansowania dla części badań (projekty badań własnych w 2006 i 2007r.), napisanie manuskryptu. 4. Podgórska A, Gieczewska K, Łukawska-Kuźma K, Rasmusson AG, Gardeström P, Szal B, 2013, Long-term ammonium nutrition of Arabidopsis increases the extrachloroplastic NAD(P)H/NAD(P)+ ratio and mitochondrial reactive oxygen species level in leaves but does not impair photosynthetic capacity. Plant, Cell and Environment, 36: 2034–2045 (IF = 5,135; cytowań 1) Wkład habilitantki - 55%. Autor korespondencyjny. Koncepcja pracy, zaplanowanie doświadczeń, pozyskanie finansowania (grant MNiSW/NCN) wykonanie części doświadczeń laboratoryjnych, czynna opieka nad oznaczeniami wykonanymi przez doktorantkę (habilitantka jest promotorem pomocniczym mgr A. Podgórskiej), interpretacja wyników, napisanie większości tekstu manuskryptu. 5. Podgórska A, Ostaszewska M, Gardeström P, Rasmusson AG, Szal B, 2014, In comparison with nitrate nutrition, ammonium nutrition increases growth of the frostbite1 Arabidopsis mutant. Plant, Cell and Environment, DOI: 10.1111/pce.12404 (IF2013 = 5,135; cytowań 0) Wkład habilitantki - 50%. Autor korespondencyjny. Koncepcja pracy, zaplanowanie doświadczeń, pozyskanie finansowania (grant MNiSW/NCN) wykonanie części doświadczeń laboratoryjnych, czynna opieka nad oznaczeniami wykonanymi przez doktorantkę (habilitantka jest promotorem pomocniczym mgr A Podgórskiej), interpretacja wyników, napisanie większości tekstu manuskryptu * studenci wykonujący prace dyplomowe w Zakładzie Bioenergetyki Roślin IBEBR Łączny IF publikacji wchodzących w skład osiągnięcia: 19,164; punkty MNiSW (wg punktacji z 2013 roku): 205 Bożena Szal 4 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) c) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Dwa główne procesy, które w znacznym stopniu wpływają na stan oksydoredukcyjny komórek roślinnych to metabolizm węgla oraz metabolizm azotu. Przyjmuje się, że za utrzymanie równowagi oksydoredukcyjnej komórek roślinnych odpowiedzialne są głównie mitochondria (Noctor i wsp. 2007). Mitochondrialny łańcuch oddechowy (mtETC) oprócz dużych kompleksów białkowych występujących w łańcuchu oddechowym innych organizmów (Kompleksów I-IV) zawiera dodatkowe białka: zewnętrzne i wewnętrzne dehydrogenazy NAD(P)H (odpowiednio NDex i NDin) oraz oksydazę alternatywną (AOX) (Møller 2001, Rasmusson i wsp. 2008). Ponieważ przepływ elektronów przez dodatkowe komponenty mtETC nie jest sprzężony z transportem protonów (syntezą ATP), przypuszcza się, że wzrost udziału tzw. szlaków alternatywnych w oddychaniu sprzyja bilansowaniu stanu redoks komórek roślinnych. Stan redoks komórki może zostać zaburzony poprzez działanie stresowych czynników środowiskowych lub poprzez dysfunkcje szlaków metabolicznych komórki. W warunkach nadmiernego zredukowania przekaźników elektronów w mtETC mitochondria są również ważnym źródłem reaktywnych form tlenu (ROS). Funkcjonowanie mtETC może więc pełnić zarówno rolę prooksydacyjną jak i w przypadku działania szlaków alternatywnych obniżać wytwarzanie ROS. W badaniach roli mitochondriów w utrzymaniu homeostazy oksydoredukcyjnej można zaproponować dwa modele doświadczalne: a) badania z wykorzystaniem roślin z dysfunkcją szlaków metabolicznych jako materiału doświadczalnego lub też b) badania z wykorzystaniem roślin dzikich poddanych działaniu czynnika stresowego, który powoduje zmianę równowagi oksydoredukcyjnej komórek. W pracach 1-3 wymienionych w punkcie 4b autoreferatu wykorzystano pierwszy z modeli doświadczalnych natomiast w pracy 4 wykorzystano model drugi. Praca 5 wymieniona w punkcie 4b autoreferatu łączy oba modele doświadczalne. i) Changes in energy status of leaf cells as the consequence of mitochondrial genome rearrangement Materiałem doświadczalnym w pracy był ogórek (Cucumis sativus) linii MSC16 (mosaic cucumber), którego nasiona otrzymano z pracowni Prof. S. Malepszego (SGGW) (Malepszy i wsp. 1996). Linia MSC16 posiada rearanżacje genomu mitochondrialnego (Bartoszewski wsp. 2004), w konsekwencji których w linii tej stwierdzono obniżoną aktywność Kompleksu I w mtETC (Juszczuk i wsp. 2007). W badaniach z wykorzystaniem ekstraktów tkankowych uzyskanych z liści linii MSC16 nie stwierdziłam istotnego wpływu dysfunkcji Kompleksu I mtETC na stan oksydoredukcyjny tkanek. Podjęłam jednak próbę oznaczenia stanu redoks i statusu energetycznego poszczególnych kompartmentów komórkowych. Badania takie wykonałam w laboratorium szwedzkim, jednym z kilku na świecie dysponujących odpowiednią do tego celu aparaturą. W badaniach z wykorzystaniem szybkiego frakcjonowania protoplastów wg metody opisanej przez Gardeström i Wigge (1988) stwierdziłam, że obniżenie aktywności Kompleksu I w linii MSC16 znacznie modyfikuje stan redoks i status energetyczny poszczególnych organelli. W linii MSC16 stwierdziłam znacznie zwiększony stosunek NADH/NAD+ na terenie cytozolu równocześnie z istotnym obniżeniem tego stosunku w mitochondriach. Ponadto zaobserwowałam obniżenie stężenia NADP(H) połączone z wzrostem stopnia zredukowania ufosforylowanych nukleotydów pirydynowych oraz obniżenie stężenia ATP na terenie chloroplastów. Co ciekawe, udokumentowałam Bożena Szal 5 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) wpływ dysfunkcji Kompleksu I mtETC na obniżona aktywność kinazy NAD +. Ponieważ dokładne molekularne podłoże zmian w aktywności Kompleksu I w linii MSC16 nie jest znane (Bartoszewski i wsp. 2004, Juszczuk i wsp. 2007) równocześnie prowadziłam badania na linii tytoniu CMSII (cytoplasmic male sterile) otrzymanej z pracownie Prof. R. DePaepe (Université Paris-Sud). W tytoniu CMSII brak aktywności Kompleksu I jest wynikiem delecji w mitochondrialnym genie NAD7 (Guttierres i wsp. 1997). Moje badania potwierdziły wcześniejsze wyliczenia teoretyczne (Vidal et al. 2007), które wskazywały na to, że u tytoniu CMSII wzrost aktywności oksydazy cytochromu c (COX) (Priault i wsp. 2007) kompensuje obniżenie wydajności fosforylacyjnej mitochondriów spowodowanej brakiem Kompleksu I mtETC. Powoduje to, że rośliny CMSII nie wykazują deficytu energii, typowego dla roślin z dysfunkcją Kompleksu I mtETC (Juszczuk i wsp. 2012). Podsumowując, zastosowanie przeze mnie techniki szybkiego frakcjonowania protoplastów pozwoliło określić zmiany w statusie oksydoredukcyjnym występujące w poszczególnych kompartymentach komórkowych pomimo braku istotnych różnic w stężeniu NAD(H) w ekstraktach tkankowych. Jest to chyba jedyna opublikowana praca opisująca szczegółowo, na poziomie wewnątrzkomórkowym, wpływ dysfunkcji Kompleksu I na stan redoks. Wyniki tych eksperymentów podkreśliły równocześnie konieczność badań na poziomie subkomórkowym dla prawidłowego zrozumienia metabolizmu komórek roślinnych. II. Chilling stress and mitochondrial genome rearrangement in the MSC16 cucumber mutant affect the alternative oxidase and antioxidant defense system to a similar extent W pracy tej kontynuowałam badania z wykorzystaniem linii MSC16 ogórka. Ogórek MSC16 został poddany stresowi chłodu i odpowiedź systemu antyoksydacyjnego została porównana do zmian wywołanych tym stresem u roślin dzikich. Przeprowadziłam szczegółową charakterystykę izolowanych i oczyszczonych mitochondriów. Stwierdziłam m.in., że pojemność drogi alternatywnej, AOX, odpornej na cyjanek nie zmienia się lub obniża się u roślin MSC16 pod wpływem chłodu natomiast pojemność tego szlaku znacznie wzrasta u roślin dzikich. Potwierdzają to również przeprowadzone przeze mnie badania immunoznakowania z użyciem przeciwciał anty-AOX. W eksperymentach wykonanych wspólnie z doktorantką K. Łukawską (autor równorzędny publikacji) stwierdziłyśmy, że rośliny MSC16 reagują inaczej na stres chłodu niż rośliny dzikie. Udokumentowałyśmy, że aktywacja enzymatycznego systemu antyoksydacyjnego u roślin MSC16 hodowanych w warunkach optymalnych powoduje, że rośliny są bardziej odporne działanie środowiskowego czynnika stresowego, podobnie do innych roślin z udokumentowaną dysfunkcją Kompleksu I (Juszczuk i wsp. 2012). Nowatorskim ujęciem tematu było doświadczalne ukazanie mitochondriów jako producentów ROS oraz przedyskutowanie roli mitochondrialnych ROS (mtETC) w metabolizmie komórki. Wiadomo ze ROS mogą być produkowane w mtETC w kierunku macierzy mitochondrialnej lub w kierunku przestrzeni międzybłonowej (Møller 2001). Wyniki przeprowadzonych przeze mnie eksperymentów pokazały, że w warunkach optymalnych do wzrostu w mitochondriach roślin kontrolnych ok. 50% mtROS jest produkowane do przestrzeni międzybłonowej natomiast u roślin MSC16 ok. 90% mtROS jest produkowane w tym kierunku. Wyniki analiz biochemicznych potwierdzono metodami mikroskopowymi. Po działaniu stresu chłodu wytwarzanie mtROS wzrasta w obu genotypach przy czym zarówno u roślin dzikich jak i roślin MSC16 ok. 80% mtROS jest produkowane do przestrzeni międzybłonowej. Biorąc pod uwagę wykazany przez nas wzrost wytwarzania ROS do przestrzeni międzybłonowej (więc na zewnątrz mitochondriów) oraz to, że w Bożena Szal 6 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) równocześnie prowadzonych badaniach nie stwierdzono oksydacyjnych uszkodzeń makromolekuł znajdujących się na terenie mitochondriów (Juszczuk i wsp. 2008) zaproponowałam model, w którym w zależności od miejsca produkcji w łańcuchu oddechowym mtROS mogą pełnić różną funkcję. W modelu tym, mtROS wytwarzane do przestrzeni międzybłonowej miałyby głównie rolę sygnalizacyjną (retrograde signalling). Podsumowując, praca Szal i wsp. (2009) wpisała się w nurt prac charakteryzujących wpływ dysfunkcji mitochondrialnej na działanie systemu antyoksydacyjnego całej komórki, a przez to warunkujących odporność na czynniki stresowe (np. chłodu). W pracy tej szczególnie podkreślono dwojaką rolę jaka mogą pełnić mtROS: rolę sygnalizacyjną i role oksydacyjną prowadzącą do uszkodzeń struktur komórkowych. III. Influence of mitochondrial genome rearrangements on cucumber leaf carbon and nitrogen metabolism W badaniach z wykorzystaniem ogórka linii MSC16 określono wpływ dysfunkcji Kompleksu I na metabolizm węgla i azotu w komórkach liści w warunkach oświetlenia i ciemności. Stwierdzono, że dysfunkcja Kompleksu I nie ma istotnego wpływu na fotosyntetyczną asymilację CO2 (badania izotopowe wykonane w laboratorium estońskim przez grupę badawczą Prof. O. Keerberga, z którym nawiązałam współpracę). Poza tym u ogórka MSC16 stwierdzono obniżone oddychanie mitochondrialne (tzw. oddychanie ciemniowe) oraz zaburzenia w działaniu cyklu Krebsa. Jednocześnie stwierdziliśmy, że dysfunkcja Kompleksu I inaczej wpływa na stężenie metabolitów związanych z metabolizmem węgla i azotu w zależności od pory fotoperiodu. Wprawdzie liściach ogórka MSC16 występuje znaczne nagromadzenie cukrów, zarówno rozpuszczalnych jak i nierozpuszczalnych, jednak różnice pomiędzy mutantem a roślinami dzikimi były znacznie większe w okresie ciemności niż na świetle. Ponadto zaobserwowaliśmy, że u roślin dzikich na świetle wzrasta stężenie pirogronianu, co jest wynikiem obniżonego oddychania mitochondrialnego typowego dla metabolizmu roślin na świetle (Tovar- Méndez i wsp. 2003). Natomiast w roślinach MSC16 poziom pirogronianu był porównywalny na świetle i w ciemności. Stwierdziliśmy również, że w warunkach dnia stężenie dwóch kwasów organicznych: cytrynianu i 2-oksoglutaranu u ogórka MSC16 było istotnie niższe u roślin MSC16 w porównaniu do roślin dzikich. Ponadto wykazałam, że mitochondria izolowane z liści roślin MSC16, które przebywały w ciemności przez 8 godz. mają wyższą aktywność i/lub poziom białka kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej, syntazy cytrynianowej, akonitazy i NAD +-zależnej dehydrogenazy izocytrynianowej. Jednocześnie wykazaliśmy, że w tkankach liści roślin MSC16 następuje nagromadzenie jonów amonowych oraz aminokwasów przy jednoczesnym obniżeniu stężenia azotanów oraz niższej aktywności reduktazy azotanowej. Podsumowując, w pracy tej wykazaliśmy, że zaburzenie homeostazy NAD(P)(H) komórek (wyniki publikacji nr 1) na skutek obniżonej aktywności mitochondrialnego Kompleksu I i wewnętrznych dehydrogenaz NADH typu II (wyniki w publikacji nr 2 autoreferatu oraz Juszczuk i wsp. 2007) ma duży wpływ na inne elementy metabolizmu oksydoredukcyjnego. Wiadomo, że czynnikiem limitującym szybkość redukcji azotanów jest dostępność NADH (Kaiser i wsp. 2000). U roślin MSC16 wzrost stężenia NADH na terenie cytozolu (wyniki w publikacji 1 autoreferatu) powoduje wzrost szybkości redukcji NO3-, a w konsekwencji wzrost stężenia zarówno NH4+ jak i nagromadzenie aminokwasów. Jednocześnie, stwierdzone zaburzenie działania cyklu Krebsa, może potwierdzać sygnalizacyjną rolę mtROS (wyniki Bożena Szal 7 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) publikacji nr 2 autoreferatu), gdyż enzymy tego szlaku są kodowane przez genom mitochondrialny. IV. Long-term ammonium nutrition of Arabidopsis increases the extrachloroplastic NAD(P)H/NAD(P)+ ratio and mitochondrial reactive oxygen species level in leaves but does not impair photosynthetic capacity Kontynuując moje zainteresowania dotyczące metabolizmu oksydoredukcyjnego komórek liści w ostatnich latach rozpoczęłam cykl badań wykorzystując jako materiał doświadczalny rośliny rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana), zmiana materiału doświadczalnego była podyktowana względami praktycznymi – dostępne są kolekcje mutantów rzodkiewnika. W pracy Podgórska i wsp. (2013) rośliny dzikie rzodkiewnika hodowane były w kulturach hydroponicznych przez 8 tyg. na pożywce zawierającej jony azotanowe lub amonowe jako źródło azotu. Poprzez działanie czynnikiem stresowym (jonami amonowymi) chcieliśmy wpłynąć na wewnątrzkomórkową homeostazę redoks. Rośliny hodowane na jonach amonowych wykazywały zahamowanie wzrostu typowe dla tzw. syndromu amonowego (Szal i Podgórska 2012, Rychter i Szal 2014). W tkankach liści roślin hodowanych na jonach amonowych stwierdziłam znaczny wzrost stosunku NAD(P)H/NAD(P)+ oraz deficyt energii. Wykorzystując technikę szybkiego frakcjonowanie protoplastów (Gardeström i Wigge 1988) stwierdziłam, że wzrost stopnia redukcji nukleotydów pirydynowych dotyczył głównie frakcji pozachloroplastowej natomiast deficyt energii występował w chloroplastach. W wyniku nawiązanej przeze mnie współpracy z dr K. Gieczewską wyjaśniliśmy, że deficyt energii nie jest wynikiem zaburzenia funkcjonowania chloroplastowego ETC. Wykazałam natomiast, że długotrwała hodowla na jonach amonowych jest ściśle związana z wzrostem aktywności lub/i poziomu białka enzymów cyklu syntetazy glutaminy-aminotransferazy glutamina:2oksoglutaran (GS-GOGAT). W przeprowadzonej przeze mnie szczegółowej charakterystyce mitochondriów stwierdziłam m. in. wzrost aktywności mitochondrialnych wewnętrznych dehydrogenaz NADH (Kompleksu I oraz NDin), wzrost aktywności NDex oraz wzrost pojemności i poziomu białka AOX w warunkach żywienia amonowego. W badaniach na poziomie ekspresji genów stwierdziliśmy, że za wzrost poziomu białka AOX odpowiada głównie wzrost ekspresji AOX2. W tkankach liści roślin hodowanych na różnych źródłach azotu oznaczyliśmy również parametry związane z metabolizmem ROS. Stwierdziliśmy, że hodowla roślin na jonach amonowych powoduje występowanie stresu oksydacyjnego. Świadczą o tym: zwiększone stężenie H2O2, uszkodzenia biomolekuł (zwiększona peroksydacja lipidów oraz wzrost stopnia utlenienia białek rozpuszczalnych) oraz zwiększenie stopnia utlenienia drobnocząsteczkowych antyutleniaczy w ekstraktach z liści hodowanych na jonach amonowych. Analizę metabolizmu ROS przeprowadziliśmy również wykorzystując jako materiał izolowane organella. Wykazaliśmy, ze długotrwała hodowla na jonach amonowych nie powoduje uszkodzeń struktur chloroplastowych. W mitochondriach tych roślin stwierdziliśmy natomiast wzrost peroksydacji lipidów oraz aktywację enzymatycznego i nieenzymatycznego systemu antyoksydacyjnego. Z wykorzystaniem technik mikroskopowych jako pierwsi pokazaliśmy również, że w warunkach żywienia amonowego następuje istotny wzrost produkcji ROS w mtETC. Podsumowując, w pracy Podgórska i wsp. (2013) wykazaliśmy, że warunkach stresowych powodujących wzrost stopnia redukcji tkanek (jakim jest żywienie amonowe) mitochondria pełnią ważną funkcję. Jako pierwsi, doświadczalnie udokumentowaliśmy, że wzrost stopnia zredukowania nukleotydów pirydynowych w warunkach żywienia amonowego dotyczy nie Bożena Szal 8 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) chloroplastów a przestrzeni pozachloroplastowej. Wzrost stosunku NADPH/NADP + w cytozolu powoduje z uruchomienie szlaków alternatywnych w mtETC, głównie wzrost aktywności/pojemności NDex i AOX, co umożliwia utlenienie nadmiaru siły redukcyjnej. Pokazaliśmy również, że mitochondria w warunkach żywienia amonowego produkują zwiększoną ilość ROS, głównie do przestrzeni międzybłonowej (Podgórska i Szal 2014) co potwierdza udział mtROS w warunkach żywienia amonowego w sygnalizacji retrograde. Wzrost poziomu białka AOX oraz ekspresji AOX2 świadczy o tym, że oksydaza alternatywna w warunkach żywienia amonowego pełni funkcję swego rodzaju modulatora w sygnalizacji retrograde, jak postulowano wcześniej w odniesieniu do innych warunków stresowych (Vanlerberghe i wsp. 2009) V. In comparison with nitrate nutrition, ammonium nutrition increases growth of the frostbite1 Arabidopsis mutant Materiałem doświadczalnym w pracy był rzodkiewnik frostbite1 (fro1) uzyskany z ekotypu C24, który posiada punktową mutację w genie kodującym podjednostkę 18-kDa mitochondrialnego Kompleksu I (Lee i wsp. 2002). W badaniach biochemicznych udokumentowałam, że w mitochondria izolowane z roślin fro1 nie posiadają aktywności Kompleksu I. Pokazaliśmy również, że brak podjednostki 18-kDa uniemożliwia składanie Kompleksu I. Wykazałam, że brak głównej oksydoreduktazy NADH: UQ w mitochondriach roślin fro1 jest kompensowany wzrostem aktywności zewnętrznych i wewnętrznych dehydrogenaz typu II oraz oksydazy cytochromu c. Wykazaliśmy, że rośliny fro1 w odróżnieniu od pozostałych roślin nie wykazują typowych objawów syndromu amonowego. Pomimo, w porównaniu do roślin dzikich mniejszej biomasy rozet, mutant fro1 rośnie znacznie lepiej na jonach amonowych niż na jonach azotanowych. Aktywność NDex (prawdopodobnie głównie produktu genu NDB4) w mitochondriach mutanta fro1 (hodowanego zarówno na jonach azotanowych jak i amonowych) jest porównywalna do aktywności NDex stwierdzonej roślin dzikich hodowanych na jonach amonowych, i jednocześnie znacznie wyższa niż w roślinach dzikich hodowanych na jonach azotanowych. Równocześnie rośliny fro1 mają znacznie wyższą pojemność AOX, która tylko w nieznacznym stopniu jest modulowana przez jony amonowe. U roślin dzikich ekotypu C24 podobnie jak w ekotypie Col-0 (wyniki publikacji 4 autoreferatu) poziom białka AOX wzrasta kilkukrotnie w warunkach żywienia amonowego. U roślin fro1 nie stwierdziłam typowych zmian metabolicznych obserwowanych w odpowiedzi na żywienie amonowe: wzrostu stopnia redukcji nukleotydów pirydynowych oraz deficytu energii. Mutant nie wykazywał również istotnych zmian ani w stężeniu drobnocząsteczkowych przeciwutleniaczy ani też transkryptów genów kodujących enzymów antyoksydacyjnych świadczących o tym, że w warunkach żywienia amonowego następuje wzmożona produkcja ROS. Jednak, u fro1 zarówno w warunkach żywienia azotanowego jak i amonowego zaobserwowaliśmy znacznie podwyższony poziom transkryptu białka UPOX (up-regulated by oxidative stress), świadczący o tym, że w tych roślinach niezależnie od warunków hodowli występuje stres oksydacyjny. Wydaje się, że ekspresja genu kodującego białko UPOX może być zwiększona na skutek zwiększonej produkcji ROS w przestrzeni apoplastycznej. Metodami mikroskopowymi pokazaliśmy nagromadzenie H2O2 w przestrzeni pozakomórkowej u roślin fro1 hodowanych na jonach azotanowych, podobne do tego jakie zaobserwowaliśmy u roślin dzikich w warunkach żywienia amonowego. Bożena Szal 9 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) W pracy tej pokazaliśmy, że zmiany metaboliczne, szczególnie zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów wywołane brakiem mitochondrialnego Kompleksu I powodują, że rośliny nie wykazują typowych objawów syndromu amonowego. Jest to wynik unikatowy, dotychczas, wg mojej wiedzy nie wykazano takiego efektu u innej rośliny. Przy czym wydaje się, że nie jest to prosty efekt zwiększenia substratu dla zewnętrznych dehydrogenaz typu II, a przez to zwiększenia produkcji energii. Wyniki wykonanych przez nas analiz transkryptomicznych wskazują, że zmiany w funkcjonowania mitochondriów mają nie tylko duży wpływ na stan oksydoredukcyjny komórek (co dokumentowaliśmy również wcześniej wynikami publikacji 14 autoreferatu) ale również są kluczowym czynnikiem wpływającym na stan redoks apoplastu. W konsekwencji stan redoks frakcji apoplastowej może determinować ograniczenie wzrostu (Potters i wsp. 2000) w warunkach żywienia amonowego. PODSUMOWANIE W publikacjach wchodzących w skład Osiągnięcia skupiałam się na relacji między funkcjonowaniem mitochondriów a stanem oksydoredukcyjnym komórek liści. W pracach przedstawionych do oceny jako Osiągnięcie przedstawiłam doświadczalnie wykazanie, że dysfunkcja fragmentu mitochondrialnego łańcucha oddechowego powoduje zmiany stanie redoks poszczególnych organelli wpływając na metabolizm oksydacyjny komórek liści, w tym metabolizm węgla i azotu. Z drugiej strony pokazałam, że modyfikacje wewnątrzkomórkowego stanu redoks spowodowane przez zróżnicowane żywienie azotowe wywołują zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów pozwalające na uzyskanie nowej homeostazy redoks komórek. Ponadto, w przedstawionych pracach zarówno przy wykorzystaniu roślin z dysfunkcja mitochondrialną jako materiału badawczego jak i przy wykorzystaniu roślin dzikich poddanych działaniu stresu środowiskowego, wykazałam że mitochondria są ważnymi producentami ROS. Uzyskane przeze mnie wyniki sugerują, że obu tych modelach doświadczalnych mtROS wytwarzane na do przestrzeni międzybłonowej mogą być zaangażowane w sygnalizację retrograde. Piśmiennictwo Bartoszewski G, Malepszy S, Havey MJ (2004) Mosaic (MSC) cucumbers regenerated from independent cell cultures possess different mitochondrial rearrangements. Curr Gen 45: 45-53. Gardeström P, Wigge B (1988) Influence of photorespiration on ATP/ADP ratios in the chloroplast, mitochondria and cytosol, studied by rapid fractionation of barley (Hordeum vulgare) protoplasts. Plant Physiol 88: 69-76. Gutierres S, Sabar M, Lelandais C, Chétrit P, Diolez P, Degand H, Boutry M, Vedel F, De Kouchkovsky Y, De Paepe R (1997) Lack of mitochondrial and nuclear-encoded subunits of complex I and alteration of the respiratory chain in Nicotiana sylvestris mitochondrial deletion mutants. Proc Natl Acad Sci USA 94: 3436-3441. Juszczuk IM, Tybura A, Rychter AM (2008) Protein oxidation in the leaves and roots of cucumber plants (Cucumis sativus L.), mutant MSC16 and wild type. J Plant Physiol 165: 355 – 365. Juszczuk IM, Flexas J, Szal B, Dąbrowska Z, Ribas-Carbo M, Rychter AM (2007) Effect of mitochondrial genome rearrangement on respiratory activity, photosynthesis, photorespiration and energy status of MSC16 cucumber (Cucumis sativus) mutant. Physiol Plant 131: 527-541. Bożena Szal 10 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) Juszczuk IM, Szal B, Rychter AM (2012) Oxidation–reduction and reactive oxygen species homeostasis in mutant plants with respiratory chain complex I dysfunction. Plant Cell Environ 35: 296-307. Kaiser WM, Kandlbinder A, Stoimenova M, Glaab J (2000) Discrepancy between nitrate reduction rates in intact leaves and nitrate reductase activity in leaf extracts: What limits nitrate reduction in situ. Planta 210: 801-807. Lee BH, Lee H, Xiong L, Zhu JK (2002) A mitochondrial complex I defect impairs coldregulated nuclear gene expression. Plant Cell 14: 1235-1251. Malepszy S, Burza W, Śmiech M (1996) Characterization of a cucumber (Cucumis sativus L.) somaclonal variant with paternal inheritance. J App Gen 37: 65-78. Møller IM (2001) Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover and metabolism of reactive oxygen species. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52: 561-591 Noctor G, De Paepe R, Foyer CH (2007) Mitochondrial redox biology and homeostasis in plants. Trends Plant Sci 12: 125-134. Podgórska A, Szal B (2014) The role of reactive oxygen species under ammonium nutrition. W: Reactive Oxygen and Nitrogen Species Signaling and Communication in Plants Edytorzy: Gupta KJ i Igamberdiev AU. Springer, praca zaakceptowana do druku Potters G, Horemans N, Caubergs RJ, Asard H (2000) Ascorbate and dehydroascorbate influence cell cycle progression in a tobacco cell suspension. Plant Physiol 124: 17-20 Prilaut P, Vidal G, De Paepe R, Ribas-Carbo M (2007) Leaf age-related changes in respiratory pathways are dependent on complex I activity in Nicotiana sylvestris. Physiol Plant 129: 152-162 Rasmusson AG, Geisler DA, Møller IM (2008) The multiplicity of dehydrogenases in the electron transport chain of plant mitochondria. Mitochondrion 8: 47-60. Rychter AM, Szal B (2014) Alternative pathways under phosphate and nitrogen nutrition. W: Alternative Respiratory Pathways in Higher Plants. Edytorzy: Gupta KJ, Mur LAJ, Neelwarne B. Willey-Blackwell, w druku. Szal B, Podgórska A (2012) The role of mitochondria in leaf nitrogen metabolism. Plant Cell Environ 35: 1756-1768. Tovar-Méndez A, Miernyk JA, Randall DD (2003) Regulation of pyruvate dehydrogenase complex activity in plant cells. Eur J Biochem 270: 1043-1049. Vanlerberghe GC, Cvetkovska M, Wang J (2009), Is the maintenance of homeostatic mitochondrial signaling during stress a physiological role for alternative oxidase? Physiol Plant 137: 392–406. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych Na mój dorobek naukowy składa się 11 prac naukowych, 2 monografie (dodatkowo jedna zaakceptowana do druku w czerwcu 2014 do druku) oraz 34 doniesień zjazdowych. W 11 manuskryptach pełnię rolę autora korespondencyjnego. Łączny Impact Factor moich prac wynosi 35,007 (po uzyskaniu stopnia doktora 31, 626), indeks Hirscha – 7, cytowania (bez autocytowań) 102, punkty MNiSW (wg punktacji z 2013 r.) – 425. W latach 2009-2012 byłam kierownikiem projektu finansowanego przez MNiSW/NCN. Od 2009 roku jestem opiekunem naukowym, a od 2013 roku promotorem pomocniczym rozprawy doktorskiej mgr Anny Podgórskiej. Bożena Szal 11 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) Moje zainteresowania naukowe od początku skupiały się na szeroko pojętej bioenergetyce komórki. W 1998 r. dołączyłam do zespołu badawczego kierowanego przez Panią prof. dr hab. A.M. Rychter, który ma duże osiągnięcia w zakresie badań związanych z metabolizmem mitochondriów. Moja praca magisterska wykonana w Zakładzie Bioenergetyki Roślin dotyczyła metabolizmu fosfolipidów w roślinach fasoli w warunkach deficytu fosforu. Wyniki pracy dyplomowej zostały włączone do publikacji Gniazdowska i wsp. (1999, Acta Physiol Plant). W trakcie studiów doktoranckich podjęłam próbę określenia roli mitochondrialnej oksydazy alternatywnej (AOX) w warunkach anerobiozy oraz w okresie następującym po anaerobiozie (post-hipoksji). Udokumentowałam, że warunkach hipoksji poziom białka AOX drastycznie się obniża, prawdopodobnie ze względu na niskie powinowactwo tego enzymu do tlenu. Wykazałam również, że AOX w siewkach jęczmienia warunkach post-hipoksji występuje stres oksydacyjny a AOX jest ważnym elementem zapobiegającym wytwarzaniu reaktywnych form tlenu w mitochondriach w okresie następującym po anerobiozie. Wyniki uzyskane trakcie wykonywania pracy doktorskiej, której promotorem była prof. dr hab. A.M. Rychter, zostały opublikowane w publikacjach Szal i wsp. (2003, Physiol Plant) oraz Szal i wsp. (2004, J Plant Physiol). Od 2003 r. jestem zatrudniona na stanowisku adiunkta najpierw w Zakładzie Bioenergetyki Roślin a po rozwiązaniu tego Zakładu w związku z przejściem Pani prof. dr hab. A.M. Rychter na emeryturę, w Zakładzie Anatomii i Cytologii Roślin (od 2012 r.). Od 2004 r. uczestniczyłam jako główny wykonawca w realizację projektu finansowanego przez KBN/MNiI dotyczącego metabolizmu oksydacyjnego ogórka linii MSC16, którego kierownikiem była prof. A.M. Rychter. Oprócz zadań przewidzianych w ramach projektu (opublikowanych m. in. w pracy Juszczuk i wsp. 2007), prowadziłam również badania nad metabolizmem ogórka MSC16 w aspektach, które nie były ujęte w projekcie. Moje zainteresowania naukowe dotyczące metabolizmu węgla, azotu oraz roli prooksydacyjnej mitochondriów, w tym udziału mtROS w sygnalizacji retrograde stanowią przedmiot Osiągnięcia przedstawionego do oceny (publikacje 1-3) i zostały szczegółowo omówione w punkcie 4c (podpunkty I-III). W ramach prowadzonych przeze mnie badań nawiązałam współpracę z prof. P. Gardeströmem (Umea Plant Science Centre-Umea University, Szwecja) oraz z grupą prof. O. Keerberga (Estonian University of Life Sciences, Harku, Estonia). W latach 2007-2008, odbyłam roczny staż finansowany przez The Kempe Foundation. W ramach projektu stażowego przeprowadzałam badania w Umea Plant Science Centre (w grupie badawczej Prof. Gardeströma) oraz w laboratorium INRA-Wersal (w grupie badawczej dr C. Masclaux-Daubresse). Projekt dotyczył wpływu żywienia azotowego na indukowane ciemnością starzenie się liści. Materiałem badawczym projekcie było 5 linii rzodkiewnika z wyciszoną ekspresją jednego z genów cytozolowej izoformy syntetazy glutaminy (GS1.1GS1.5). Moje zainteresowanie białkiem GS1 trwa do dzisiaj, m. in. w 2013 była opiekunem licencjackiej dotyczącej roli tego białka, ze szczególnym uwzględnieniem żywienia amonowego. Współpracuję również z Instytutem Ogrodnictwa w Skierniewicach, w badaniach z zakresu upraw ekologicznych. W ramach projektu współfinansowanego przez EU prowadziłam badania dotyczące metabolizmu oksydacyjnego, w tym roli AOX w owocach jabłoni przechowywanych w zróżnicowanych warunkach chłodniczych. Uczestniczyłam również w badaniach określających wpływ nawożenia preparatami pochodzenia roślinnego (tzw. biopreparatami) na stan oksydoredukcyjny tkanek truskawki (wyniki zaprezentowane zostały jako doniesienie konferencyjne). Nawiązana w ramach tego projektu współpraca z dr hab. E. Bożena Szal 12 Załącznik 2. Autoreferat (jęz. polski) Malusa (IO w Skierniewicach) będzie kontynuowana, w przygotowaniu jest projekt grantu który będzie zgłoszony w najbliższej edycji programu LIFE+. W latach 2009-2012 byłam kierownikiem projektu finansowanego przez MNiSW/NCN dotyczącego wpływu żywienia amonowego na metabolizm oksydacyjny siewek rzodkiewnika, wyniki uzyskane w ramach projektu stanowią przedmiot Osiągnięcia przedstawionego do oceny (punkt 4c, podpunkty IV-V). W 2009 r. nawiązałam współpracę z Prof. AG Rasmussonem (Lund University, Szwecja). W ramach współpracy do prowadzonych przeze mnie badań włączyłam linie transgeniczne rzodkiewnika posiadające dysfunkcje alternatywnych szlaków w mtETC oraz rośliny z nadekspresją AOX. Uzyskane wyniki są obecnie opracowywane a badania z wykorzystaniem roślin z wyciszoną ekspresją i nadekspresja AOX są kontynuowane w ramach wykonywanej pod moja opieką pracy magisterskiej. Jako opiekun naukowy, a od roku 2013 jako promotor pomocniczy rozprawy doktorskiej mgr Anny Podgórskiej uczestniczyłam w planowaniu i nadzorowałam badania dotyczące: a) wpływu krótkotrwałego żywienia amonowego na metabolizm rzodkiewnika oraz b) zmian w stanie oksydoredukcyjnym rzodkiewnika podczas hodowli na pożywce, w której cyklicznie zmieniano źródło azotu. Badania prowadzone były w ramach grantu Preludium. Wyniki są obecnie opracowywane przez doktorantkę, obrona doktoratu zaplanowana jest na 2014 r. W ramach współpracy z grupą badawczą Prof. Y. Jolivet (Université de Lorrainne, Nancy, Francja) przeprowadzałam badania dotyczące metabolizmu węgla, ze szczególnym uwzględnieniem działania szlaków alternatywnych w procesie glikolizy w warunkach żywienia amonowego. Uzyskane wyniki są przygotowywane do druku. Ponadto kontynuuję badania dotyczące różnych aspektów metabolizmu oksydacyjnego w warunkach żywienia amonowego. Wyniki uzyskane w pracy Podgórska i wsp. (2013) skłoniły mnie do podjęcia badań wyjaśniających rolę chloroplastowej izoformy dehydrogenazy jabłczanowej zależnej od NADP+ (NADP+-MDH) warunkach żywienia amonowego – badania z wykorzystaniem mutantów insercyjnych prowadzone są w ramach pracy magisterskiej wykonywanej pod moja opieką. Ponadto, bazując na wynikach uzyskanych w pracy Podgórska i wsp. (2014) pokazujących wpływ żywienia amonowego na metabolizm ROS w apoplaście złożyłam w NCN projekt grantu (VII edycja programu Opus), w ramach którego badania te będą kontynuowane.
